專利名稱：肌酐診斷/測定試劑(盒)及肌酐濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定肌酐主要有化學(xué)測定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法 等。 化學(xué)測定法成本低廉，操作簡便，是目前國內(nèi)測定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。 高效液相層析法(HPLC)，肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過陽離子交換層析柱 可與其他成分很好分離，在234nm測定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法 不適于大批量臨床標(biāo)本分析，通常作為肌酐測定的參考方法，用于評價市售肌酐測定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?0106198. 0、申請日為1990. 12. 18的中國專利 申請公開了用高效液相色譜直接測定人尿中假尿嘧啶核苷(簡稱假尿苷)，再通過分光光 度法同時測出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標(biāo)志物。(這個專利 和我們的無關(guān)) 毛細(xì)管電泳法，血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速離心，除去有形 成分，上清液用膠束動電毛細(xì)管電泳分離后測定235nm處吸光度。本法測定線性范圍寬，操
作較為簡便，但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。 酶學(xué)測定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類。 檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?2139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利申請公開了應(yīng)用 酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測定試劑。該發(fā)明所指的酶法測定試劑并不加入測 定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類 似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過在試劑內(nèi)形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類氧化型輔酶或其類似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類似物達(dá)到一定的濃度時，該發(fā) 明所指的酶法試劑就可達(dá)到測定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測試提供一個內(nèi)源合成 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為，這個系統(tǒng)在生成反 應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二
4是，該試劑在正式測試前必須事先反應(yīng)一段時間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶， 這樣一來就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測試帶來很大的不便。 據(jù)申請?zhí)枮?2139298. 6、申請日為2002. 11. 15的專利介紹，該系統(tǒng)由于不斷生成 測定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其 實(shí)在試劑中加入NADH或NADra的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問題，反而比在試劑中 增加一個反應(yīng)系統(tǒng)要經(jīng)濟(jì)得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定肌酐濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn) 該方法的肌酐診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進(jìn)行肌酐濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。 本發(fā)明肌酐濃度測定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲某海因+氨 氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根 谷氨酰胺+2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸合成酶谷氨酸+ 輔酶這種方法應(yīng)用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶
(偶)聯(lián)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ;EC 6. 3. 1. 2)、谷氨酸合成酶
(glutamatesynthase ;EC 1.4.1.13)酶促反應(yīng)比色法。肌酐脫亞胺酶酶解肌酐反應(yīng)產(chǎn)生
氨，再通過(偶)聯(lián)合谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm
處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm
處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算肌酐的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷/測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L還原型輔酶0. 25,1/L肌酐脫亞胺酶6000U/L谷氨酰胺合成酶8000U/L谷氨酸合成酶10000U/L谷氨酸12mmol/L腺苷三磷酸4mmol/L2-酮戊二酸15mmol/L本發(fā)明的肌酐診斷,"則定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2_酮戊二酸。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2_酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷
酸、2-酮戊二酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用
前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2_酮戊二酸。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶。 還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷 酸、2-酮戊二酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定肌酐濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的肌酐診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L










穩(wěn)定劑
還原型輔酶
肌酐脫亞胺酶
谷氨酰胺合成酶
谷氨酸合成酶
500,1/L
0. 25,1/L
6000U/L
8000U/L
10000U/L
12mmol/L
腺苷三磷酸
2-酮戊二酸
4mmol/L 15mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈
水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的肌酐診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 谷氨酸 12,1/L
腺苷三磷酸 4mmol/L
2-酮戊二酸 15mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
肌酐脫亞胺酶 6000U/L
谷氨酰胺合成酶 8000U/L
谷氨酸合成酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的肌酐診斷/i則定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L還原型輔酶0. 25,1/L谷氨酸12mmol/L腺苷三磷酸4mmol/L2-酮戊二酸15mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑500,1/L谷氨酰胺合成酶8000U/L
谷氨酸合成酶 10000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 肌酐脫亞胺酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定肌酐濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間IO分鐘，起始
吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測肌酐樣品與試劑1、試劑2、試
劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約0分鐘左右，
檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0006 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下 降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)2mmol/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確度， 其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈 敏度可達(dá)O. 2±0. 1 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏 度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐濃度測定方法，其方法如下肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根谷氨酰胺+2-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸合成酶谷氨酸+ 輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出肌酐的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種肌酐診斷緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶肌酐脫亞胺酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶J定試劑(盒)，主要成分包括-50mmol/X -50mmol/L -50mmol/L腺苷三磷酸2-酮戊二酸 1-試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨 酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還 原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二 酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2_酮戊二酸 組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶組成。還原 型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨 酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成 酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶組成。還原型輔酶、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰 胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、2-酮戊二酸、肌酐脫亞胺酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出肌酐的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101750342SQ20081023569
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司