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單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法

文檔序號:5998057閱讀:164來源:國知局
專利名稱:單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒,同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧 化酶活性濃度的方法,屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
單胺氧化酶(MAO)測定可分為化學(xué)分光光度法、熒光法、免疫抑制法及 現(xiàn)在申請專利的酶法。 一般多用化學(xué)分光光度法,單胺氧化酶反應(yīng)底物以芐 胺(Benzylamine)和對苯甲胺-3 -偶氮萘酚,也可應(yīng)用單胺氧化酶催化胺類 釋放出的HA氧化發(fā)色劑,如10-N-甲基氨基甲?;?3, 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外,單胺氧化酶反應(yīng)底物還有丁基胺(butylamine)、 戊基胺(amylamine)、 0 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-對羥基苯乙胺 3-parahdroxyphenylethylamine ) 、 5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等,丁基胺、戊基胺、3-苯乙基胺約為3-對羥基 苯乙胺活性的30%,通常應(yīng)用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要 高。目前單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲胺-e-偶氮萘酚為底物,但對苯 甲胺-e-偶氮萘酚芐胺法需要用環(huán)乙烷提取,限制了該方法的實用性,且不 能應(yīng)用全自動生化儀分析;芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成 芐醛,然后在強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng),生成醛苯腙,在 生化儀上測定也較困難。
熒光法檢測單胺氧化酶是以P-苯乙胺作為底物,其在10 100mg時Km 最大,高于芐胺和5-羥色胺的Km值。
4免疫學(xué)方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng),作用后進行
單胺氧化酶同工酶測定。目前應(yīng)用較多的單克隆抗體是MA0-A3C9、MA0-A4F10、
MAO-A7B10、 MA0-A7E10和MAO-B1C2等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),連續(xù)監(jiān)測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340mn波長處吸光度的變化,得以測定單 胺氧化酶活性濃度的方法,同時,本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的單胺氧 化酶診斷試劑盒,采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動 生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定,而且測定速度快、準(zhǔn)確度高, 因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+
過氧化氫
過氧化氫+氨+ 2-酮戊二酸谷氨酸氧化酶谷氨酸+氧+水 谷氨酸+輔酶谷氨酸合成酶谷氨酰胺+ 2-酮戊二酸酯+
還原型輔酶
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase; EC 1.4.3.4; EC 1.4.3.6) 酶(偶)聯(lián)谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、谷氨酸 合成酶(glutamate synthase; EC 1.4丄13)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶 酶解胺類化合物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫及氨,再通過(偶)聯(lián)合谷氨酸氧化酶、 谷氨酸合成酶的作用,最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度,通過測量340nm處吸光度上升的速度,可以測算單胺氧化酶 的活性濃度大小。
實驗表明,從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮,無 論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷試劑較為 理想
緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
谷氨酸合成酶 8000 U/L
胺類化合物 10 mmol/L
酮戊二酸 12 mmol/L
本發(fā)明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑,包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、
酮戊二酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試 劑,直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶。 輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使
用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸合成酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶。
輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、酮戊二酸在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水 溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法,其 輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑,包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
谷氨酸合成酶 8000 U/L胺類化合物 10mmol/L 酮戊二酸 12mmol/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用前, 加入純凈水,復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時間10分鐘,起始吸光度 《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測單胺氧化酶樣品與試劑 的體積比例為1/25,反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng)),延遲時間大約l分鐘左 右,檢測時間2分鐘左右,理論K值4180。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下,檢測主波長340mn吸光度上升的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。 實施例二
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑,包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶
胺類化合物 酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
簡mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L谷氨酸合成酶
8000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時間10分鐘,起始吸光度
《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測單胺氧化酶樣品與試劑
1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng)),延遲時間大
約1分鐘左右,檢測時間2分鐘左右,理論K值2170。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃
度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑,包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
胺類化合物 1Ommol/L 酮戊二酸 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液
腦mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
谷氨酸合成酶
8000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液
100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L
谷氨酸氧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時,在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反 應(yīng)時間10分鐘,起始吸光度《0.1,測試主波長340nm,測試副波長405nm, 被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng) 方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng)),延遲時間大約1分鐘左右,檢測時間2分鐘左右, 理論K值2170。
加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀 下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃 度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證,采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達 到本發(fā)明的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉。
總之,實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0002;吸光 度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直線上升;試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達500 U/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度,其相對偏差不超過士3%;試劑測試的精密度(重 復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑在2—8"C下保存,活性可以穩(wěn)定一年;
——本發(fā)明靈敏度高、精確度好,線形范圍寬廣,穩(wěn)定期長,足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法,其方法原理如下胺類化合物+水+氧單胺氧化酶 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫過氧化氫+氨+2-酮戊二酸 谷氨酸氧化酶 谷氨酸+氧+水谷氨酸+輔酶 谷氨酸合成酶 谷氨酰胺+2-酮戊二酸酯+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度上升的速度,測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒,主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/L谷氨酸合成酶 1000——80000 U/L胺類化合物 1——50 mmol/L酮戊二酸 1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍;在此范圍內(nèi)效果較好,在此范 圍外,試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也 可以配制成液體試劑,直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒,其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、 酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒,其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、酮戊二酸組成雙劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、 酮戊二酸組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成 酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、酮戊二酸在 試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒,其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶、胺類化合物、 酮戊二酸組成多劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、 酮戊二酸組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸合成酶組成;試劑3, 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶組成。輔酶、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合 成酶、胺類化合物、酮戊二酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒,其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l""4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷試劑盒,同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、酮戊二酸、谷氨酸氧化酶、谷氨酸合成酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度上升的速度,從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N21/25GK101609037SQ200810122859
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司
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