專利名稱：：一種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中一種生物樣本的檢測方法，主要是一種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，適用于從生物樣本中其他目的基因在單細(xì)胞中的絕對表達(dá)量的檢測。
背景技術(shù)：
：自1993年Lee首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)具有時(shí)序調(diào)控作用的miRNA以來，miRNA的表達(dá)調(diào)控作用已得到人們的廣泛認(rèn)可。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是miRNA檢測技術(shù)的不斷更新，如克隆技術(shù)、芯片技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)。目前miRNA的定量檢測以及功能研究已成為該領(lǐng)域的熱門。然而要從數(shù)據(jù)中如實(shí)的還原raiRNA的原始表達(dá)水平，可靠而穩(wěn)定的均一化方法對于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析是至關(guān)重要的。當(dāng)前傳統(tǒng)的均一化方法主要是利用內(nèi)源性看家基因作為內(nèi)參照，在定量過程中，一般選擇e-actin(e-肌動(dòng)蛋白)或GADffl(磷酸甘油醛3脫氫酶)等看家基因作為mRNA(信使RNA)的內(nèi)參，而選擇U6(小核RNA)或5SrRNA(核糖體RNA)等非編碼RNA作為miRNA的內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)則用2-AACT進(jìn)行均一化處理。然而這種均一化方法只能反應(yīng)靶基因在不同時(shí)期表達(dá)的變化情況，但不能反應(yīng)變化的絕對拷貝數(shù)。miRNA是一類具有時(shí)序表達(dá)調(diào)控功能的小分子RNA，其表達(dá)量會隨著調(diào)控的需要在生物體發(fā)育和成熟的不同時(shí)期發(fā)生變化，而"看家基因"在不同生長時(shí)期或經(jīng)受不同環(huán)境脅迫后，其表達(dá)量也會發(fā)生變化，這就決定了用看家基因作為內(nèi)參的傳統(tǒng)均一化方法只能體現(xiàn)目的基因在不同時(shí)期具有相對差異，而不能如實(shí)反映目的基因在各個(gè)時(shí)期的絕對表達(dá)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)的缺陷，而提供一種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，檢測生物樣本中每個(gè)細(xì)胞所表達(dá)miRNA的絕對拷貝數(shù)，同時(shí)為miRNA在生物體發(fā)育過程的調(diào)控功能研究奠定理論基礎(chǔ)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)縝密，實(shí)驗(yàn)過程簡單便捷，所得結(jié)果真實(shí)可靠。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。這種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，包括以卜步驟:1)材料選擇8周齡與40周齡的小鼠(C57BL/6)腦組織；2)總RNA的提取150mg小鼠腦組織研磨充分后加入1.5mL細(xì)胞裂解液研磨至勻漿，取20化用于DNA定量，在剩下的勻漿中加入TrizoL,繼續(xù)研磨后取0.8mL勻漿至1.5mL離心管中，同時(shí)在勾漿中加入不同拷貝數(shù)的spikeRNA(外源性RNA)，用氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙|洗滌，DEPC水(1%。的焦碳酸二乙酯)溶解后，使用NanoDropND-1000(微量紫外分光光度計(jì))檢測總RNA的含量及純度，甲醛變性凝膠檢測總RNA的質(zhì)量及完整性。3)RT(反轉(zhuǎn)錄)-熒光定量PCR以總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，spikeRNA、小鼠腦組織中表達(dá)的miRNA為耙基因，在5PL反應(yīng)體系中加入反應(yīng)試劑并設(shè)置反應(yīng)參數(shù)得到cDNA(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，再以此cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,反應(yīng)結(jié)束后在60-95°C間做溶解曲線檢測反應(yīng)特異性，同時(shí)取5"L反應(yīng)液，2.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。4)DNA定量勻漿樣品依次經(jīng)37。C保溫，核糖核酸酶A處理，蛋白酶K處理，TE緩沖液(0.05molA三羥甲基氨甲烷緩沖液)稀釋后，取5UL稀釋液加入至96孔板中，同時(shí)加入等體積的熒光染料混合液，入DNA(入噬菌體DNA)稀釋一定梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量過程在熒光定量PCR儀(ABI7300)中進(jìn)行，具體參數(shù)設(shè)置為30°C15分鐘；31°C5秒；3(TC30秒，反應(yīng)最后一步收集熒光信號。5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將5X108拷貝數(shù)的spikeRNA用DEPC水依次稀釋至5Xl(f拷貝數(shù)(稀釋因子為0.1)共7個(gè)濃度濃度。6)數(shù)據(jù)處理由熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA的拷貝數(shù)計(jì)算出在RNA提取過程小RNA的損失率及平均損失率。再分別從DNA與RNA水平上表示原始樣品中細(xì)胞數(shù)，即可計(jì)算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每個(gè)原始細(xì)胞中表達(dá)量。在步驟2)中，提取總RNA時(shí)，在樣品勻漿中加入不同拷貝數(shù)的spikeRNA。在步驟3)中，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA和miRNA的拷貝數(shù)。在步驟4)中，從DNA水平上檢測miRNA在原始細(xì)胞中的表達(dá)量。在步驟5)中，以7個(gè)拷貝數(shù)濃度梯度的spikeRNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。在步驟6)中，在單細(xì)胞水平上處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)。本發(fā)明的有益效果:本技術(shù)通過在樣品勻漿中加入不同濃度的spikeRNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，將實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測到的miRNA熒光信號值轉(zhuǎn)化為在樣品勻漿中的表達(dá)量，把miRNA在勻漿過程的損失量精確的計(jì)算出來，同時(shí)通過DNA與RNA兩個(gè)水平計(jì)算樣品勻漿中的細(xì)胞數(shù)目，如實(shí)地將miRNA的表達(dá)量轉(zhuǎn)換為在原始樣品中的絕對表達(dá)量。彌補(bǔ)了看家基因作為內(nèi)參照只能反映相對差異的缺點(diǎn)，并且從兩個(gè)水平上分析更加真實(shí)可靠。本技術(shù)同時(shí)還適合于檢測其他目的基因在生物樣本中的絕對表達(dá)量。圖l是本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)流程圖2是不同年齡小鼠腦組織總RNA變性電泳結(jié)果示意圖3是SpikeRNA,miRNA以及內(nèi)參照的電泳檢測結(jié)果示意圖4是本發(fā)明DM與RNA水平數(shù)據(jù)均一化的相關(guān)性示意圖；具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)描述圖2中(1%瓊脂糖，37%甲醛變性，lxMOPS緩沖液)，1-2為8周齡小鼠腦組織；3-4為40周齡腦組織；圖3中(2%瓊脂糖，lxTAE緩沖液)M:50bpDNAladder;1-3:spikeRNA1-3;4-9:let-7a，miR-15a,miR-27a,miR-135b,U6ncRNA，miR-221;a-j:miR-9'miR-21，miR-26a,miR-122,miR-132，miR-138,miR-141,miR-]43，miR-153,5SrRNA;圖4中(R=0.923)。這種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，包括以下步驟1.總RNA的提取材料選擇8周齡與40周齡的小鼠(C57BL/6)腦組織；150mg小鼠腦組織研磨充分后加入1.5mL細(xì)胞裂解液繼續(xù)研磨至勻漿，分別取20nL勻漿至3個(gè)0.2mLPCR管中，用于DNA定量；在剩下的勻槳中加入1.46mLTrizoL(RNA裂解液)，繼續(xù)研磨勻漿3分鐘；分別取0.8mL勻漿至1.5mL離心管中，同時(shí)在勻漿中加入不同拷貝數(shù)的spikeRNA,用氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，DEPC水溶解后微量分光光度計(jì)檢測總RNA的含量及純度，甲醛變性膠檢測總RNA的完整性。2.RT(反轉(zhuǎn)錄)-熒光定量PCR以總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，spikeRNA、小鼠腦組織中表達(dá)的miRNA為靶基因，在5叱反應(yīng)體系中加入0.5叱提取的總RNA溶液，0.75W.DEPC水，70'C保溫5分鐘，冰上放置3分鐘。再依次加入dNTP(脫氧核糖核苷酸)(各10mM，RNase-free)0.5ML、5XM-MuLV(莫洛尼氏鼠白血病病毒)緩沖液1叱、莖環(huán)引物(2PM)0.25叱、RNase(核糖核酸酶)抑制劑(40U/叱)0.25叱、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/叱)0.25ML、DEPC水0.5叱，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為42°C60mim,70°C10分鐘，冰上放置3分鐘。取0.4PLcDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，在IO叱反應(yīng)體系中依次加入2XSYBRGreenI(DNA結(jié)合染料)反應(yīng)緩沖液5叱，TaqDNA聚合酶(94kDa耐熱的重組DNA聚合酶)(5U/叱)0.1叱，前引物(10MM)0.2A，后引物(10湖)0.2PL,雙蒸水4.1叱，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為94°C10分鐘；94°C15秒，62°C30秒，75°C30秒，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后在60-95'C間做溶解曲線檢測反應(yīng)特異性，同時(shí)取5PL反應(yīng)液，2.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。3.DNA定量勻漿樣品依次經(jīng)37'C保溫1h，10mg/mLRNaseA37'C處理30分鐘，20mg/mL的蛋白酶K55°C處理3h。然后用TE緩沖液將反應(yīng)液稀釋100倍，取5uL稀釋液加入至96孔板中，同時(shí)加入等體積的熒光染料混合液，XDNA稀釋一定梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為30°C15分鐘；31°C5秒；30'C30秒.反應(yīng)最后一步收集熒光信號。4.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將5X108拷貝數(shù)的spikeRNA用DEPC水依次稀釋至5XKf拷貝數(shù)(稀釋因子為0.1)共7個(gè)濃度梯度。5.數(shù)據(jù)處理在RNA提取過程小RNA的損失率可表示為-sRNA(小RNA)損失率(i)=(秒i1-秒i2)/秒i1其中秒i1(i=l，2，3)為勻漿中加入spikeRNA的拷貝數(shù)，秒i2(i=l,2，3)為熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA的拷貝數(shù)。同時(shí)RNA的平均損失率為sRNA平均損失率=[sRNA損失率(l)+sRNA損失率(2)+sRNA損失率(3)]/3原始樣品中細(xì)胞數(shù)可從DNA與RNA水平上表示細(xì)胞數(shù)DNA=CX'L/d;細(xì)胞數(shù)RNA:C，XL'/e其中C為勻漿中DNA的含量(ng/VL)，L為勻漿的體積(nL)，d為每個(gè)小鼠細(xì)胞基因組DNA的質(zhì)量(5.0X10—3ngDM/細(xì)胞，在此我們假設(shè)一個(gè)單倍體細(xì)胞具有一套基因組DNA);C'為提取的總RNA的含量(pg/nL),L'為總KNA的體積，e為每個(gè)細(xì)胞所能提取出總RNA的質(zhì)量(15pg總RNA/細(xì)胞)。小RNA在RM水平上每個(gè)原始細(xì)胞中表達(dá)量可以表示為原始單細(xì)胞絕對表達(dá)量RNA=CTR/[(l-sRNA平均損失率)X細(xì)胞數(shù)RNA]其中CTR為熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中小RNA的拷貝數(shù)小RNA在DNA水平上每個(gè)原始細(xì)胞中的表達(dá)量，可通過3條spikeRNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線求得raiRNA在勻漿中的表達(dá)量，再除以勻漿中的細(xì)胞數(shù)即可。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1不同年齡小鼠腦中miRNA的絕對表達(dá)量a:40循環(huán)后無信號:b:正號表示40周齡小鼠腦中miNRA相對于8周齡表達(dá)量為上調(diào)；c:負(fù)號表示40周齡小鼠腦中miNRA相對于8周齡表達(dá)量為下調(diào)。上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求1、一種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)材料選擇8周齡與40周齡的小鼠腦組織；2)總RNA的提取150mg小鼠腦組織研磨充分后加入1.5mL細(xì)胞裂解液研磨至勻漿，取20μL用于DNA定量，在剩下的勻漿中加入RNA裂解液1.46mL，繼續(xù)研磨后取0.8mL勻漿至1.5mL離心管中，同時(shí)在勻漿中加入不同拷貝數(shù)的spikeRNA，用氯仿抽提，異丙醇沉淀，75％乙醇洗滌，DEPC水溶解后微量紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的含量及純度，甲醛變性膠檢測總RNA的完整性；3)RT-熒光定量PCR以總RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，外源性RNA、小鼠腦組織中表達(dá)的miRNA為靶基因，在5μL反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)結(jié)束后在60-95℃間做溶解曲線檢測反應(yīng)特異性，同時(shí)取5μL反應(yīng)液，2.0％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物；4)DNA定量勻漿樣品依次經(jīng)37℃保溫，核糖核酸酶A處理，蛋白酶K處理，0.05mol/L三羥甲基氨甲烷緩沖液稀釋后，取5μL稀釋液加入至96孔板中，同時(shí)加入等體積的熒光染料混合液，λ噬菌體DNA稀釋一定梯度作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體參數(shù)設(shè)置為30℃15min；31℃5s；30℃30s，反應(yīng)最后一步收集熒光信號；5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將5×108拷貝數(shù)的spikeRNA用1‰的焦碳酸二乙酯依次稀釋至5×102拷貝數(shù)，稀釋因子為0.1，共7個(gè)濃度梯度；6)數(shù)據(jù)處理由熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA的拷貝數(shù)計(jì)算出在RNA提取過程小RNA的損失率及平均損失率，再分別從DNA與RNA水平上表示原始樣品中細(xì)胞數(shù)，即可計(jì)算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每個(gè)原始細(xì)胞中表達(dá)量。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于在步驟2)中，提取總RNA時(shí)，在樣品勻漿中加入不同拷貝數(shù)的spikeRNA。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于在步驟3)中，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA和miRNA的拷貝數(shù)。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于在步驟4)中，從DNA水平上檢測miRNA在原始細(xì)胞中的表達(dá)量。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于在步驟5)中，以7個(gè)拷貝數(shù)濃度梯度的spikeRNA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，其特征在于在步驟6)中，在單細(xì)胞水平上處理實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)。全文摘要本發(fā)明涉及一種生物樣本中miRNA絕對表達(dá)量的檢測方法，包括以下步驟1)材料選擇8周齡與40周齡的小鼠腦組織；2)總RNA的提取3)RT(反轉(zhuǎn)錄)-熒光定量PCR；4)DNA定量；5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；6)數(shù)據(jù)處理由熒光定量PCR檢測到提取的總RNA中spikeRNA的拷貝數(shù)計(jì)算出在RNA提取過程小RNA的損失率及平均損失率，再分別從DNA與RNA水平上表示原始樣品中細(xì)胞數(shù)，即可計(jì)算出小RNA在DNA水平和RNA水平上每個(gè)原始細(xì)胞中表達(dá)量。本發(fā)明的有益效果通過DNA與RNA兩個(gè)水平計(jì)算樣品勻漿中的細(xì)胞數(shù)目，如實(shí)地將miRNA的表達(dá)量轉(zhuǎn)換為在原始樣品中的絕對表達(dá)量；彌補(bǔ)了看家基因作為內(nèi)參照只能反映相對差異的缺點(diǎn)，并且從兩個(gè)水平上分析更加真實(shí)可靠。文檔編號G01N21/00GK101363057SQ20081012086公開日2009年2月11日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者丁先鋒,徐根明,王鳳軍,郭江峰申請人:浙江理工大學(xué);丁先鋒