專利名稱：一種向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法及其專用裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法及其專用裝置。
背景技術(shù)：
光合同化物的分配和運輸是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，因而研究同化物 在庫組織中的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)移過程就成為一個重要的研究領(lǐng)域。關(guān)于有重要經(jīng)濟(jì)性狀的 庫中的同化物代謝的研究，已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但是同化物從篩分子卸出到庫細(xì)胞 及其后的一系列過程，至今還不清楚。 一個重大的障礙就是庫中維管束深埋在組織 內(nèi)部，同庫組織在結(jié)構(gòu)上很難分離，致使活體卸載體系很難建立。
5 (6) CF (Carboxyfluorescein， 5， 6碳氧羧基熒光素)是5-和6-羧基代替 的熒光素混合物，對細(xì)胞無毒，化學(xué)惰性且量子產(chǎn)率高，可長距離運輸，是一個比 較理想的共質(zhì)體標(biāo)記物。這在一年生作物庫器官同化物卸載研究上已成功應(yīng)用。作 物類果實同化物卸載的研究一般可以從葉片引入CF，例如通過摩擦葉片表皮或通過 葉片壓力注射等將CF引入葉片韌皮部，然后隨著韌皮部流進(jìn)入果實，進(jìn)而實時追 蹤模擬同化物在果實內(nèi)的卸載和運輸情況。熒光素結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡的使 用，大大推進(jìn)了作物、蔬菜和草本類果樹果實同化物運輸和卸載的研究。但木本果 樹像蘋果、棗、核桃等，葉肉細(xì)胞小而緊密，細(xì)胞間隙小，而且葉表皮上面有一層 蠟質(zhì)，通過葉片很難將熒光素物質(zhì)引入。另外，由于木本果樹代謝復(fù)雜，韌皮部流 相對于一年生作物要緩慢得多，導(dǎo)致熒光素因長時間引入而淬滅，從而影響同化物 的追蹤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于引入熒光示蹤劑的裝置。 本發(fā)明所提供的一種用于引入熒光示蹤劑的裝置，包括針、用于輸導(dǎo)示蹤溶液
的具有吸水性質(zhì)的線、用于吸附示蹤溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料
的底部密封的容器；
所述具有吸水性質(zhì)的線的一端穿過所述針的針孔，所述針連帶所述具有吸水性 質(zhì)的線穿過所述容器底部，所述具有吸水性質(zhì)的線的另一端纏繞在所述吸水性材料 上，所述吸水性材料設(shè)于所述容器底部。其中，所述容器的頂部可以設(shè)有帶有通氣孔的蓋。 所述針要細(xì)，以免造成枝或柄劈裂或者傷及其木質(zhì)部。
所述具有吸水性質(zhì)的線具體可為棉線。棉線的粗細(xì)以緊密穿過枝或柄的韌皮部 但不劃傷其木質(zhì)部為宜。
所述吸水性材料是用于吸附示蹤溶液，以持續(xù)地緩慢地為植物提供熒光示蹤 劑?，F(xiàn)有的吸水性材料均可，如各種棉制品，具體可如脫脂棉或海棉等。
所述容器具體可為離心管。
所述吸水性材料具體可占據(jù)所述容器體積的2/3。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用上述任一種裝置向木本植物中引入熒光 示蹤劑的方法。
本發(fā)明所提供的利用上述任一種裝置向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法，包
括如下步驟
1 )利用上述任一種裝置的所述針帶著所述具有吸水性質(zhì)的線穿過木本植物的 靠近待檢測器官的枝或柄的韌皮部；
2)將熒光示蹤劑注入上述任一種裝置的所述容器中，同時將所述容器用避光 性材料包好。
為了對穿過所述韌皮部的線進(jìn)行固定，可以將穿過所述韌皮部的線纏繞于所述 枝或柄四周。
為了防止胼胝質(zhì)的形成而阻塞篩板進(jìn)而阻礙運輸，在本發(fā)明方法中，用所述針 帶著所述具有吸水性質(zhì)的線穿過所述枝或柄的韌皮部后，在所述針穿過的所述枝或 柄的韌皮部孔內(nèi)滴加EDTA。
為了防止熒光示蹤劑流失，在本發(fā)明方法中，用所述針帶著所述具有吸水性質(zhì) 的線穿過所述枝或柄的韌皮部后，在所述枝或柄上針穿出的部位涂抹凡士林。
為了便于熒光示蹤劑的流動，最好將所述容器豎直放置。
所述引入的時間一般為24-72小時，可以根據(jù)具體的植物的特性而定。
上述任一種方法在檢測植物內(nèi)同化物卸載中的應(yīng)用。
所述應(yīng)用具體可以為檢測木本植物果實內(nèi)的同化物卸載；所述木本植物具體可 為蘋果、核桃、葡萄、冬棗或梨棗。
在實際應(yīng)用中，可以根據(jù)植物自身特點及實驗?zāi)康倪x擇引入部位，如當(dāng)要檢測 果實內(nèi)同化物卸載時，可以選擇在果柄或者靠近果柄的短枝上進(jìn)行引入，具體可如
4蘋果或葡萄、核桃果柄較長、韌性較好，可以作為引入的操作點，而冬棗、梨 棗果柄很短、質(zhì)脆、易斷裂和落果， 一般選擇靠近果柄的短枝作為引入的操作點。
本發(fā)明的用于引入熒光示蹤劑的裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，操作方便。本發(fā)明 的向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法，是用"穿針引線法"把熒光染料引入，克 服了由于木本植物器官中維管束深埋在組織內(nèi)部，同庫組織在結(jié)構(gòu)上很難分離的障 礙，也克服了木本植物由于葉肉細(xì)胞小而緊密、細(xì)胞間隙小，而無法通過葉片細(xì)胞 間隙引入熒光素物質(zhì)的限制，實現(xiàn)了木本植物中熒光物質(zhì)的引入，同時本發(fā)明方法 通過柄或枝引入，大大縮短了引入時間。
本發(fā)明方法與激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，可實現(xiàn)木本植物內(nèi)同化物卸 載路徑的熒光示蹤檢測，標(biāo)記效果好，可信度高，掃描得到的圖像能實時地反映同 化物在果實內(nèi)的卸載情況。


圖1為在短枝處引入熒光示蹤劑的示意圖。
圖2為蘋果果實內(nèi)一個分支的維管束韌皮部中熒光分布圖及透射圖，a為熒光 分布圖，b為投射圖。
圖3為核桃果皮和種皮中韌皮部中熒光分布圖。
圖4為冬棗果實發(fā)育后期內(nèi)一個縱切的維管束韌皮部中熒光分布圖及透射圖， a為熒光分布圖，b為投射圖。
具體實施例方式
下述實施例中用到的熒光素CFM (5， 6-碳氧羧基熒光素酯)購自Sigma公司。
下述實施例中用到的引入熒光示蹤劑的裝置，包括針、棉線(棉線粗度以緊密 穿過柄或枝的韌皮部但不使韌皮部斷裂且不劃傷其木質(zhì)部為宜)、脫脂棉和1.5ral Eppendorf微量離心管；其中，Eppendorf管的蓋上打一小孔，使之與外界大氣壓 相通，便于液體流動；
棉線的一端穿過針的針孔，將針連帶棉線穿過1. 5 ml Eppendorf微量離心管 底部，棉線的另一端纏繞在所述脫脂棉周圍5-6圈，脫脂棉位于1. 5 ml Eppendorf 微量離心管底部，占據(jù)管體積的2/3。
下面以用該裝置檢測木本植物的果實內(nèi)同化物卸載為例，闡明本發(fā)明的向木本 植物中引入熒光示蹤劑的方法。
實施例l、蘋果果實內(nèi)同化物卸載的熒光示蹤檢測
配制熒光素CFDA母液用丙酮溶解熒光素CFDA,使得熒光素CFDA母液的濃度為25mg/mL。貯存在-20°C。
稀釋母液用含有5mM Mes-Tris和300mM山梨醇、pH值為5. 5的溶液稀釋熒 光素母液，使熒光素的濃度為lmg/mL，得到熒光素稀釋液，備用。其中山梨醇可以 調(diào)節(jié)滲透壓、維持細(xì)胞膨壓。
利用上述裝置進(jìn)行實驗的方法如下
因為蘋果的果柄較長、韌性較好，便于操作，因此選擇果柄作為引入熒光素的 操作點。
選取健康向陽樹冠，將果柄沖洗干凈，用針穿過果柄韌皮部，不劃傷木質(zhì)部， 將棉線纏繞于果柄四周對該棉線進(jìn)行固定，迅速在針穿進(jìn)和穿出的部位滴加EDTA
(2.5raM)，防止胼胝質(zhì)形成，阻礙運輸。在針穿出部位涂抹凡士林，防止CFDA溶 液流失。將Eppendorf管固定，保持豎直。向E卯endorf管中注入100吣CFDA稀 釋液，迅速合上蓋子，并用錫箔紙包好，防止CFDA見光分解。處理72小時。
采摘果實，放在冰壺帶回實驗室進(jìn)行徒手切片。用體積百分含量為80%的甘油 封片(既可防止熒光的快速泯滅，同時價格低廉節(jié)省材料)，低溫避光保存。用激 光共聚焦掃描顯微鏡觀察CF熒光并拍照片。
結(jié)果如圖2，熒光物質(zhì)被限制在韌皮部中，沒有卸出，表明蘋果果實內(nèi)同化物 主要采取質(zhì)外體卸載模式。
實施例2、核桃果實內(nèi)同化物卸載的熒光示蹤檢測。
配制熒光素CFDA母液、稀釋母液及制作引熒光裝置的方法同實施例l所述一 致，熒光素稀釋液的濃度為lmg/mL。 利用上述裝置進(jìn)行實驗的方法如下
因為核桃果柄較長、韌性較好，便于操作，因此選擇果柄作為引入熒光素的操 作點。
選取健康向陽樹冠，將果柄沖洗干凈，用針從上向下穿過果柄韌皮部，不劃傷 木質(zhì)部，將棉線纏繞于果柄四周對該棉線進(jìn)行固定，迅速在針穿進(jìn)和穿出的部位滴 加EDTA (2.5mM)，防止胼胝質(zhì)形成，阻礙運輸。在針穿出部位涂抹凡士林，防止 CFDA溶液流失。將Eppendorf管固定，保持豎直。向E卯endorf管中注入200叱CFDA 稀釋液，迅速合上蓋子，并用錫箔紙包好，防止CFDA見光分解。處理24-36小時。
采摘果實，放在冰壺帶回實驗室進(jìn)行徒手切片。用體積百分含量為80%的甘油 封片(既可防止熒光的快速泯滅，同時價格低廉節(jié)省材料)，低溫避光保存。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察CF熒光并拍照片。
結(jié)果如圖3所示，圖3a顯示了在核桃種皮中CF從韌皮部卸出到周圍薄壁細(xì)胞 中，圖3b顯示在果皮中CF被限制在韌皮部中。表明核桃果皮處同化物主要采取質(zhì) 外體卸載模式(即熒光染料被限制在韌皮部中，沒有卸出)，而在種皮處主要采取 共質(zhì)體卸出模式。
實施例3、冬棗果實內(nèi)同化物卸載的熒光示蹤檢測。
配制熒光素CFDA母液、稀釋母液及制作引熒光裝置的方法同實施例1所述一 致，熒光素稀釋液的濃度為10(^g/mL。 利用上述裝置進(jìn)行實驗的方法如下-
因為冬棗或梨棗等的果柄較短、質(zhì)脆、易斷裂造成果脫落，因此選取靠近果柄 的短枝作為引入熒光素的操作點。
選取健康向陽樹冠，將靠近果柄的短枝沖洗干凈，用針從上向下穿過短枝韌皮 部(圖l)，不要劃傷木質(zhì)部，將棉線纏繞于短枝四周對該棉線進(jìn)行固定，迅速在 針穿進(jìn)和穿出的部位滴加EDTA (2.5mM)，防止胼胝質(zhì)形成，阻礙運輸。在針穿出 部位涂抹凡士林，防止CFDA溶液流失。將Eppendorf管固定，保持豎直。向E卯endorf 管中注入200叱CFDA稀釋液，迅速合上蓋子，并用錫箔紙包好，防止CFDA見光分 解。用剪刀剪掉短枝前端的枝條和葉片。處理24-36小時。
采摘果實，放在冰壺帶回實驗室進(jìn)行徒手切片。用體積百分含量為80%的甘油 封片(既可防止熒光的快速泯滅，同時價格低廉節(jié)省材料)，低溫避光保存。用激 光共聚焦掃描顯微鏡觀察CF熒光并拍照片。
因為短枝前端的枝條和葉片，特別是非功能葉片作為庫存在，能和果實競爭而 固定一部分熒光染料，使得果實內(nèi)熒光染料減少，不能達(dá)到最佳效果。如果通過加 大熒光染料用量來實現(xiàn)， 一方面對果實有害，另一方面造成不必要的浪費。所以在 操作時剪掉短枝前端的枝條和葉片的方法來避免這一情況。
結(jié)果如圖4所示，表明熒光染料被限制在韌皮部中，沒有卸出，表明冬棗果實 內(nèi)同化物后期主要采取質(zhì)外體卸載模式。
本實施例的方法同樣適合于葡萄、梨棗果實內(nèi)同化物卸載的熒光示蹤檢測。
權(quán)利要求
1、一種用于引入熒光示蹤劑的裝置，包括針、用于輸導(dǎo)示蹤溶液的具有吸水性質(zhì)的線、用于吸附示蹤溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料的底部密封的容器；所述具有吸水性質(zhì)的線的一端穿過所述針的針孔，所述針連帶所述具有吸水性質(zhì)的線穿過所述容器底部，所述具有吸水性質(zhì)的線的另一端纏繞在所述吸水性材料上，所述吸水性材料設(shè)于所述容器底部。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述容器的頂部設(shè)有帶有通氣 孔的蓋。
3、 一種利用權(quán)利要求1或2所述裝置向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法， 包括如下步驟1) 利用權(quán)利要求1或2所述裝置中所述針帶著所述具有吸水性質(zhì)的線穿過木 本植物的靠近待檢測器官的枝或柄的韌皮部；2) 將熒光示蹤劑注入權(quán)利要求1或2所述裝置的所述容器中，同時將所述容 器用避光性材料包好。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于將穿過所述韌皮部的線進(jìn)行固定。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，用所述針帶 著所述具有吸水性質(zhì)的線穿過所述枝或柄的韌皮部后，在所述針穿過的所述枝或柄 的韌皮部孔內(nèi)滴加EDTA。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法中，用所述針帶 著所述具有吸水性質(zhì)的線穿過所述枝或柄的韌皮部后，在所述針穿出的部位涂抹凡 士林。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述容器豎直放置。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:所述引入的時間為24-72 小時。
9、 權(quán)利要求3-8中任一所述方法在檢測木本植物的同化物卸載中的應(yīng)用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為檢測木本植物果實 內(nèi)的同化物卸載；所述木本植物為蘋果、核桃、冬棗或梨棗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法及其專用裝置。本發(fā)明所提供的用于引入熒光示蹤劑的裝置，包括針、用于輸導(dǎo)示蹤溶液的具有吸水性質(zhì)的線、用于吸附示蹤溶液的吸水性材料和用于盛放所述吸水性材料的底部密封的容器；所述具有吸水性質(zhì)的線的一端穿過所述針的針孔，所述針連帶所述具有吸水性質(zhì)的線穿過所述容器底部，所述具有吸水性質(zhì)的線的另一端纏繞在所述吸水性材料上，所述吸水性材料設(shè)于所述容器底部。本發(fā)明的用于引入熒光示蹤劑的裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，操作方便。本發(fā)明的利用向木本植物中引入熒光示蹤劑的方法，實現(xiàn)了木本植物中引入熒光物質(zhì)，且操作簡單、耗時短，具有較大的實際應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/48GK101435817SQ20081011708
公開日2009年5月20日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者張凌云, 聶配顯 申請人:北京林業(yè)大學(xué)