專(zhuān)利名稱(chēng)：基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，以及用該 傳感器作為電化學(xué)發(fā)光分析探針的免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
半導(dǎo)體納米晶體(NCs)由于其獨(dú)特的熒光特性而廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記與免疫分析 中。近幾年來(lái)，半導(dǎo)體納晶的電致化學(xué)發(fā)光(ECL)研究引起了人們極大的興趣。較之 熒光分析，半導(dǎo)體納晶的ECL通過(guò)電化學(xué)控制，不需激發(fā)光源，背景小，靈敏度高，線 性范圍寬，在ECL生物傳感器和免疫分析中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是到目前為止，基 于半導(dǎo)體納晶的ECL進(jìn)行生物分子的檢測(cè)還很少有報(bào)道，可能是由于半導(dǎo)體納晶的ECL 強(qiáng)度不如傳統(tǒng)的發(fā)光試劑如魯米諾和Ru(bpy)^+。因此，發(fā)展新的半導(dǎo)體納晶材料以及 提高半導(dǎo)體納晶的ECL強(qiáng)度成為研制ECL生物傳感器的當(dāng)務(wù)之急。[參見(jiàn)(a) Constantine， C. A.; Gattas-AsfUra， K. M.; Mello， S. V.; Crespo, G.; Rastogi， V.; Cheng， T. C.; DeFrank， J. J.; Leblanc， R. M. / P/z". C/ie/n. 5 2003, 707， 13762-13764. (b) Constantine, C. A.; Gattas-Asfiira， K. M.; Mello， S. V.; Crespo， G.; Rastogi， V.; Cheng, T. C.; DeFrank， J. J.; Leblanc, R. M. iawgw"z> 2003， 79, 9863-9867. (c) Goldman, E. R.; Balighian， E. D.; Mattoussi， H.; Kenneth Kuno， M.; Mauro, J. M.; Tran， P. T.; Anderson, G. P.j附.G/iew. Soc. 2002,"《6378-6382. (d) Goldman, E. R.; Clapp, A. R.; Anderson, G. P.; Uyed4 H. T.; Mauro， J. M.; Medintz, I. L.; Mattoussi, H. ^wa/. CZie附.2004， 76， 684-688.]最近的研究表明，納晶薄膜技術(shù)為研制ECL傳感器提供了一種有效的方法，向CdSe 或CdSe/CdS納晶膜施加負(fù)電位能極大地提高發(fā)光強(qiáng)度。CdSe NCs因其具有優(yōu)良的光學(xué) 特性而成為ECL研究的熱門(mén)材料。碳納米管(CNTs)由于具有良好的導(dǎo)電性能夠極大地 提高半導(dǎo)體納米晶體的ECL強(qiáng)度。此外，殼聚糖(CHIT)具有極好的成膜能力和生物相 溶性，碳納米管溶于殼聚糖已廣泛用于生物傳感器中。CdSe NCs/CNT-CHIT納米復(fù)合 物具有很強(qiáng)的ECL，良好的生物相溶性，極好的穩(wěn)定性，是用于研制ECL生物傳感器的 良好的納米材料，在免疫生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)學(xué)等研究中將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。[參見(jiàn):(e) Jie， G.; Liu, B.; Pan, H.; Zhu， J. J.; Chen, H. Y. J"a/. C/ww. 2007， 79， 5574-5581. (f) Poznyak， S. K.; Talapin, D. V.; Shevchenko， E. V.; Weller， H. Mwo丄e比2004，《693-698. (g) Weller， H. Awgew. C//ew. /"A 1993， 32， 41-53. (h) Murray, C. B.; Norris， D丄； Bawendi， M. G. J. J附.C/ie/n. Soc. 1993， //5， 8706-8715.目前，基于納晶復(fù)合物的電化學(xué) 發(fā)光免疫傳感器用作免疫分析探針還未見(jiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器， 以及用該傳感器作為電化學(xué)發(fā)光分析探針的免疫檢測(cè)方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，它是在金電極表面上覆蓋有 CdSe納晶-碳納米管-殼聚糖復(fù)合物膜，并用硅烷偶聯(lián)劑處理后固定抗體的電化學(xué)發(fā)光免 疫傳感器。一種制備上述基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方法，它由下列步 驟組成步驟l.將一定量殼聚糖溶于含有0.05MHC1的熱水(80-90 °C)中，得到0.50%的殼 聚糖溶液，然后過(guò)濾得到無(wú)色的濾液，多壁碳納米管在混酸(硫酸與硝酸的體積比為3:1) 中超聲氧化4小時(shí)，離心后用二次水洗滌，直至pH值為 7,然后將純化處理后的多壁碳 納米管分散于殼聚糖溶液(0.50 mg mL")超聲15分鐘，得到一均勻的黑色CNT-CHIT復(fù)合 溶液，步驟2.將0.05 mM的CdSe納晶溶液用鹽酸調(diào)至pH 5.5,然后與上述步驟l得到的 CNT-CHIT復(fù)合溶液以1:3的體積比超聲混合0.5小時(shí)，得到CdSeNCs/CNT-CHIT復(fù)合溶 液，備用，步驟3.將4 mm直徑金電極依次用l.O, 0.3和0.05 的三氧化二鋁拋光粉拋光處 理，再用二次水沖洗干凈，然后將電極置于在0.5MH2SO4溶液中，在-0,2 1.6V下掃 描至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，步驟4.將步驟3的金電極沖洗干凈，待電極干燥后取IO n L步驟2的CdSe NCs/CNT-CHIT混合溶液滴在電極表面于空氣中涼干，然后浸在質(zhì)量百分比濃度為l-3y。的硅垸偶聯(lián)劑KH550的水溶液中0.5-2小時(shí)，二次水沖干凈后浸入2.5-5 %的戊二醛 (GLD)溶液中10-20 min，步驟5.將步驟4的電極沖洗干凈后浸入到0.5-l mg/mL的羊抗人IgG的50 mM磷酸 緩沖溶液(pH7.4)中反應(yīng)12-20小時(shí)，然后用50mM的磷酸緩沖液沖洗干凈，浸入質(zhì)量 百分濃度為2-3%的牛血清蛋白(BSA)中封閉l-2小時(shí)，即制得基于CdSe納晶復(fù)合物的 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。一種采用基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為電化學(xué)發(fā)光分析探針 的免疫檢測(cè)方法，它由下列步驟組成步驟1.將上述方法制得的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗后 再浸入40^L要檢測(cè)的樣品(人的IgG)，在37'C下溫育50分鐘，步驟2.電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫檢測(cè)將步驟l處理后的基于CdSe納晶復(fù)合物的 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗，在含有0.1 M K2S208和0.1 M KC1的0.1 M PBS (pH 7.4) 緩沖液中，進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光的測(cè)試，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品(HIgG)的濃度成線性關(guān)系。所述的電化學(xué)發(fā)光測(cè)試是以修飾好的金電極(基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光 免疫傳感器)為工作電極、Pt電極為對(duì)電極、甘汞電極為參比電極的三電極體系，用 MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光儀，在0到-1.5 V進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，光電倍增管高壓設(shè)為 50(K700V。本發(fā)明中CNT-CHIT比CNTs具有更開(kāi)放的多空結(jié)構(gòu)(掃描電子顯微鏡圖1A， 1B)， 使復(fù)合的CdSeNCs ECL不僅能在修飾電極和溶液界面產(chǎn)生，而且能在膜的內(nèi)部產(chǎn)生， 極大的提高了發(fā)光強(qiáng)度。而且，CdSeNCs/CNT-CHIT具有極好的生物相溶性和穩(wěn)定性， 是組裝ECL免疫傳感器的良好材料。KH550不僅用作ECL傳感器組裝過(guò)程中固定抗體 的偶聯(lián)劑，而且因氨基功能團(tuán)的催化效應(yīng)能夠極大的增強(qiáng)ECL (見(jiàn)圖2)。ECL檢測(cè)表 明抗原濃度在0.02到200 ng/mL范圍內(nèi)，ECL強(qiáng)度隨著濃度的增大而降低，與濃度的 對(duì)數(shù)成線性關(guān)系(見(jiàn)圖2中的插圖)，檢測(cè)限達(dá)到0.001 ng/mL。本發(fā)明的電化學(xué)發(fā)光傳感器表現(xiàn)出了優(yōu)良的準(zhǔn)確性、高靈敏性，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性， 免疫分析檢測(cè)迅速、方便，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明中CNTs (A)與CNT-CHIT (B)的掃描電子顯微鏡(SEM)表征結(jié)果。圖2采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，在檢測(cè)范圍內(nèi)， 一系列不同濃度的人的IgG (0,0.02，0.1， 0.5， 2， 10, 50， 100， 200 ngmU1)的光學(xué)免疫分析結(jié)果，及標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)首先將直徑4mm金電極依次用1.0， 0.3和0.05pm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理， 二次水沖凈后置于在0.5MH2SO4溶液中，在-0.2 1.6丫下掃描至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定。取IO u L CdSe NCs/CNT-CHIT混合溶液滴在電極表面于空氣中涼干，然后浸在質(zhì)量百分比濃度為3y。的硅垸偶聯(lián)劑KH550的水溶液中0.5小時(shí)。二次水沖干凈后浸入2.5%的戊 二醛(GLD)中15min。將上述電極洗凈后浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反應(yīng)12小 時(shí)，然后用50 mM的PBS緩沖液沖洗干凈，浸入質(zhì)量百分濃度為2%的牛血清蛋白 (BSA)中封閉1小時(shí)。清洗后再浸入40^L要檢測(cè)的樣品(人的IgG)，在37'C下溫 育50分鐘，抗體與抗原反應(yīng)，完全清洗后的電極可用于電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。 實(shí)施例2.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將硅烷偶聯(lián)劑KH550的濃度改為P/。，制備的其他條件同實(shí)施例l，得到形貌與性 質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例1。 實(shí)施例3.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"浸在質(zhì)量百分比濃度為3%的硅垸偶聯(lián)劑KH550的水溶液中0.5小時(shí)"改為"浸 在質(zhì)量百分比濃度為3%的硅烷偶聯(lián)劑KH550的水溶液中2小時(shí)"，制備的其他條件同 實(shí)施例l，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例4.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中15 min。"改為"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中 20min。"，制備的其他條件同實(shí)施例1,得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。 免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例5.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"浸入2.5%的戊二醛(GLD)中15min。"改為"浸入5%的戊二醛(GLD)中10 min。"，制備的其他條件同實(shí)施例l，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。 免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例6.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)"改為"1 mg/mL的羊抗人IgG (50mMPBS，pH7.4)"，制備的其他條件同實(shí)施例1，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的 免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例7.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS, pH 7.4)反應(yīng)12小時(shí)"改為"浸 入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS, pH 7.4)反應(yīng)16小時(shí)"，制備的其他條件同 實(shí)施例l，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例8.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"浸入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反應(yīng)12小時(shí)"改為"浸 入到0.5 mg/mL的羊抗人IgG (50 mM PBS， pH 7.4)反應(yīng)20小時(shí)"，制備的其他條件同 實(shí)施例l，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例l。實(shí)施例9.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將封閉1小時(shí)改為封閉2小時(shí)，制備的其他條件同實(shí)施例1,得到形貌與性質(zhì)類(lèi)1以 于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例1。 實(shí)施例IO.電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及免疫檢測(cè)將"2%的牛血清蛋白(BSA)"改為"3%的牛血清蛋白(BSA)",制備的其他條 件同實(shí)施例l，得到形貌與性質(zhì)類(lèi)似于實(shí)施例1的免疫傳感器。免疫檢測(cè)結(jié)果同實(shí)施例 1
權(quán)利要求
1.一種基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是它是在金電極表面上覆蓋有CdSe納晶-碳納米管-殼聚糖復(fù)合物膜，并用硅烷偶聯(lián)劑處理后固定抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
2. —種制備權(quán)利要求1所述的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的方 法，其特征是它由下列步驟組成步驟l.將一定量殼聚糖溶于含有0.05 M HCl的80-90 。C的熱水中，得至ij0.50。/o的殼聚 糖溶液，然后過(guò)濾得到無(wú)色的濾液，多壁碳納米管在3份硫酸與1份硝酸組成的混酸中超 聲氧化4小時(shí)，離心后用二次水洗滌，直至pH值為 7，然后將純化處理后的多壁碳納米 管分散于0.50mg/mL的殼聚糖溶液超聲15分鐘，得到一均勻的黑色碳納米管-殼聚糖復(fù) 合溶液，步驟2.將0.05mM的CdSe納晶溶液用鹽酸調(diào)至pH5.5，然后與上述步驟l得到的碳 納米管-殼聚糖復(fù)合溶液以l:3的體積比超聲混合0.5小時(shí)，得到CdSe NCs/CNT-CHIT復(fù) 合溶液，備用，步驟3.將4 mm直徑金電極依次用l.O, 0.3和0.05 pm的三氧化二鋁拋光粉拋光處 理，再用二次水沖洗干凈，然后將電極置于0.5MH2SO4溶液中，在-0.2 1.6V下掃描 至循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定，步驟4.將步驟3的金電極沖洗干凈，待電極干燥后取IO p L步驟2的CdSeNCs/CNT-CHIT混合溶液滴在電極表面于空氣中涼干，然后浸在質(zhì)量百分比濃度為 l-3。/。的硅烷偶聯(lián)劑KH550的水溶液中0.5-2小時(shí)，二次水沖干凈后浸入2.5-5 %的戊二醛 溶液中10-20min，步驟5.將步驟4的電極沖洗干凈后浸入到0.5-l mg/mL的羊抗人IgG的50 mM磷酸 緩沖溶液(pH7.4)中反應(yīng)12-20小時(shí)，然后用50mM的磷酸緩沖液沖洗干凈，浸入質(zhì)量 百分濃度為2-3%的牛血清蛋白(BSA)中封閉l-2小時(shí)，即制得基于CdSe納晶復(fù)合物的 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
3. —種采用權(quán)利要求1所述的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器作為 電化學(xué)發(fā)光分析探針的免疫檢測(cè)方法，其特征是它由下列步驟組成步驟1.將上述方法制得的基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗后 再浸入40pL要檢測(cè)的樣品(人的IgG)，在37'C下溫育50分鐘，步驟2.電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫檢測(cè)將步驟l處理后的基于CdSe納晶復(fù)合物的 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器清洗，在含有0.1MK2S2Os和O.lMKCl的0.1 M磷酸緩沖、液 中，pH7.4,進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光的測(cè)試，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品(HIgG)的濃度成線性關(guān)系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫檢測(cè)方法，其特征是所述的電化學(xué)發(fā)光測(cè)試是以基 于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器為工作電極、Pt電極為對(duì)電極、甘汞電極 為參比電極的三電極體系，用MPI-A型電致化學(xué)發(fā)光儀，在O到-1.5 V進(jìn)行循環(huán)伏安 掃描，光電倍增管高壓設(shè)為500 700V。
全文摘要
一種基于CdSe納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，其特征是它是在金電極表面上覆蓋有CdSe納晶-碳納米管-殼聚糖復(fù)合物膜，并用硅烷偶聯(lián)劑處理后固定抗體的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。將本發(fā)明的傳感器完全清洗后再浸入40μL不同濃度的待測(cè)樣品(HIgG)中，在37℃下溫育50分鐘，然后進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光的測(cè)試，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品(HIgG)的濃度成線性關(guān)系。本發(fā)明公開(kāi)了基于納晶復(fù)合物的電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制法。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101251535SQ20081002450
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月25日
發(fā)明者接貴芬, 朱俊杰 申請(qǐng)人:南京大學(xué)