專利名稱：：凝集抑制測定法以及凝集抑制測定用試劑的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種利用(載體)顆粒的凝集抑制反應來測定試樣中的測定對象即配體的方法以及用于該方法的試劑。尤其涉及預先負載有配體的不溶性載體顆粒、配體特異性的游離態(tài)的受體以及負載有配體特異性受體的不溶性載體顆粒所形成的凝集被樣品中的配體抑制的凝集抑制測定法以及凝集抑制測定用試劑。
背景技術(shù)：
：利用不溶性載體顆粒產(chǎn)生顆粒的凝集或者產(chǎn)生凝集抑制，從而對配體進行定性、定量的測定方法既簡單又具有高靈敏度，結(jié)合反應等的配體-受體反應原理的各種測定試劑。凝集法是一種測定凝集程度的方法，所述凝集程度是受體致敏的載體顆粒因?qū)ο笈潴w介導的交聯(lián)反應而凝集的凝集程度，在需要以高靈敏度測定微量物質(zhì)的背景下，許多測定項目已實用化。另一方面，凝集抑制法是一種測定凝集被測定對象即配體抑制的比例的方法，所述凝集為事先用配體或者配體樣物質(zhì)致敏的載體顆粒與受體所發(fā)生的凝集；凝集法中，除了特殊的配體外，還必須具備2種以上特異性受體，與此相對，凝集抑制法最大特征在于只需1種特異性受體即可構(gòu)建測定體系。此外，就免疫反應來說，凝集抑制法雖具有不會引起鉤狀效應(hookeffect)(由于抗原過量而造成的表觀上的反應減少的現(xiàn)象)這個優(yōu)點，但迄今為止的應用中，大部分的場合都以半抗原這樣的低分子配體也就是無法利用2種以上受體的配體作為測定對象。作為凝集抑制法應用受限的理由，可舉出與凝集法相比測定濃度范圍的調(diào)整較為困難這一點。凝集法中，由于凝集的進行與配體量成比例，因此例如涉及膠乳增強免疫凝集法(latex-enhancedimmuno-agglutinationmethod)的專利文獻l所示那樣，能夠僅通過增強高濃度區(qū)域的靈敏度增加，而容易地擴大測定范圍。另一方面，關于與配體量成比例地進行凝集抑制反應的凝集抑制法的測定范圍，配體高濃度區(qū)域的測定上限值基本上依賴于初始凝集(配體量為零時的凝集)的大小，配體低濃度區(qū)域的測定下限值依賴于凝集抑制反應的敏感性，因此有必要綜合考慮這兩個因素。作為增強凝集抑制法的初始凝集的方法，例如可舉出專利文獻2中所述的方法，即在半抗原的測定中利用非特異性的促凝物質(zhì)的方法。根據(jù)該方法，能夠進行直至高濃度區(qū)域的配體的測定，能夠擴大測定上限值，但是由于凝集增強是與配體和受體間的特異反應無關的，因此對凝集抑制反應的敏感性降低，結(jié)果低濃度區(qū)域的檢測能力顯著惡化。另夕卜，專利文獻3中示出了利用單一的單克隆抗體致敏載體和抗原致敏載體的凝集抑制法。該方法利用了分別負載有配體和受體的載體顆粒，通過增加光學靈敏度的變化量來提高低濃度區(qū)域的檢測能力，且不損害對凝集抑制反應的敏感性。但是由于該方法并不是增強抗原和抗體間的反應本身，因此看不到擴大測定范圍這一效果。同樣，專利文獻4提出的利用抗原致敏膠乳、抗體以及抗體特異性受體的凝集抑制法，其僅通過抗體和抗原、抗體和受體的特異反應來增強凝集，因此與以往方法相比，可實現(xiàn)擴大測定范圍。但是實施例中作為受體示出的蛋白A由于對所有抗體(IgG)都具有反應性，因此在含有IgG的血清或血漿試樣的測定中是不適合的，另外，還要考慮到如下情況，即，抗小鼠IgG大鼠單克隆抗體不是通常使用的材料，有時不易得到。另外還要考慮到測定原理自身是通過抗原-抗體、抗體-受體這才羊的二相反應(biphasicreaction),因此存在測定儀器、方法導致性能不良的可能性。如上所述，兼具初始凝集強、且同時對于凝集抑制反應的敏感性也高這樣相反特性的凝集抑制測定法以及凝集抑制測定用試劑尚未確立，目前的測定法對于通常的配體、例如具有2個以上受體結(jié)合部位的配體而言，處于難以高靈敏度且廣范圍、重復性良好地進行測定的困境。專利文獻l:日本特開2004-191332號7>才艮專利文獻2:日本特公開05-000665號公報專利文獻3:日本特開昭59-173760號公報專利文獻4:日本特開2001-337092號7>才良
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的問題本發(fā)明是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題，其課題在于提供一種凝集抑制測定法以及一種凝集抑制測定用試劑，其能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域高靈每丈度且廣范圍地測定試樣中的配體，同時還具有良好的測定重復性。用于解決問題的方案本發(fā)明人等專心致力于凝集抑制測定法的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用負載有配體的不溶性載體顆粒和游離態(tài)的特異性受體，以及負載有配體上的結(jié)合部位不同于上述游離態(tài)受體的特異性受體的不溶性載體顆粒，在保持對于凝集抑制反應的敏感性的同時能夠增強初始凝集，而且能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域意外地以高靈敏度、廣范圍地進行測定，同時具有良好的測定重復性，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明包括以下方案。(1)一種凝集抑制測定法，其特征在于，其通過將含有具有兩個以上受體結(jié)合部位的測定對象配體的試才羊與下述(A)(c)混合，來測定顆粒的凝集抑制反應，所述凝集抑制反應反映著試樣中的測定對象配體的量，(A)預先負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒、(B)與上述配體特異性反應的游離態(tài)受體、(C)負載有受體的不溶性載體顆粒，所述受體與上述配體特異性反應、且配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)受體不同。(2)根據(jù)上述(1)所述的凝集抑制測定法，其中，不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。(3)根據(jù)上述(1)或(2)所述的凝集抑制測定法，其中，受體為抗體或者含有其功能性部位的片段，配體為抗原，基于受體和配體的免疫反應來測定顆粒的凝集抑制反應。(4)根據(jù)上述(1)~(3)中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，游離態(tài)受體以及不溶性載體顆粒所負載的受體均為單克隆抗體。(5)根據(jù)上述(1)~(4)中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，測定對象配體為人白蛋白，受體為抗人白蛋白單克隆抗體。(6)根據(jù)上述(1)~(5)中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，負載有受體的不溶性載體顆粒的平均粒徑為負載1/10。(7)—種凝集抑制測定用試劑，其特征在于，含有下述(A)~(C),來測定顆粒的凝集抑制反應，所述凝集抑制反應反映著試樣中的測定對象配體的量，(A)預先負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒、(B)與上述配體特異性反應的游離態(tài)受體、(C)負載有受體的不溶性載體顆粒，所述受體與上述配體特異性反應、且配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)受體不同。(8)根據(jù)上述(7)所述的凝集抑制測定用試劑，其中，不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。(9)根據(jù)上述(7)或(8)所述的凝集抑制測定用試劑，其中，受體為抗體或者含有其功能性部位的片段，配體為抗原，所述試劑為用于基于受體和配體的免疫反應來測定顆粒的凝集抑制反應的試劑。(10)根據(jù)上述(7)~(9)中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，游離態(tài)受體以及配體上的結(jié)合部位不同于上述游離態(tài)受體的受體均為單克隆抗體。(11)根據(jù)上述(7)~(10)中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，負載有受體的不溶性載體顆粒的平均粒徑為負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒的平均粒徑的1/2~1/10。(12)根據(jù)上述(7)~(11)中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，測定對象配體為人白蛋白，受體為抗人白蛋白單克隆抗體。發(fā)明效果本發(fā)明的凝集抑制測定法以及凝集抑制測定用試劑能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域高靈敏度且廣范圍地對測定對象配體進行測定，同時具有良好的測定重復性。尤其是利用免疫反應的情況下，由于不產(chǎn)生鉤狀效應這一特征，在可能呈現(xiàn)異常高值的配體測定時，與顆粒凝集法相比，可靠性更高。另外，在本發(fā)明的受體為單克隆抗體的情況下，配體只要殘留著表位即使不是全長也可發(fā)生凝集抑制反應，因此存在片段化的配體也能夠與全長的配體同樣進行測定的可能性。圖l示出了實施例以及比較例中白蛋白濃度-吸光度的反應曲線。具體實施例方式(測定對象試樣)作為含有本發(fā)明的測定對象即配體的試樣，例如可舉出人或者動物的血液、血清、血漿、培養(yǎng)上清、尿、腦脊液、唾液、汗、腹水、或者細胞提取液、組織提取液等。(配體)作為本發(fā)明的測定對象即配體，只要是具有兩個以上受體結(jié)合部位的物質(zhì)，均可作為對象。具體而言，可舉出c反應蛋白(CRP)、FDP、D-二聚體、前列腺特異抗原(PSA)、血紅蛋白Alc、白蛋白、胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶等蛋白質(zhì)，另外還有肽、糖類、核酸、脂質(zhì)、高分子藥劑等。理論上來說，具有兩個以上受體結(jié)合部位的配體(如果配體為抗原，則為具有兩個以上表位(抗原決定蔟)的配體，例如能通過利用兩種以上單克隆抗體的夾層測定進行檢測的配體)均能用作測定對象物質(zhì)。配體樣物質(zhì)是指在與受體的關系中，具有和上述配體同等的、同性質(zhì)的反應性(如果配體為抗原則為抗原性)的物質(zhì)。例如，可舉出將配體(抗原等)分解而得到的片段、通過基因操作所得到的重組配體、與配體構(gòu)造類似的物質(zhì)(配體類似物)等。(受體)作為本發(fā)明所使用的受體，使用與測定對象即配體特異性結(jié)合的物質(zhì)。通?？墒褂脤ν?、綿羊、山羊等免疫測定對象的配體而獲得的抗配體多克隆抗體或抗配體單克隆抗體。其中從特異性的觀點來看，最理想是使用單克隆抗體。使用的抗體也可為根據(jù)常用方法而制備的抗體的片段。此外，根據(jù)配體的種類可以與抗體一并使用外源凝集素、核酸堿基等，或者單獨將它們作為受體。只要本發(fā)明所使用的受體的種類為2種以上即可，此外沒有特別限制，但游離態(tài)受體和固定于載體上的受體需要使用不同受體。即，需要游離態(tài)受體和載體固定化受體為配體上的結(jié)合部位不同的受體。即，只要是滿足各受體不會相互干擾與配體的結(jié)合這樣的關系的受體即可。另外，最理想的是游離態(tài)受體和載體固定化受體均為單克隆抗體。本發(fā)明通過將游離態(tài)受體和載體固定化受體兩者組合使用，可以促進初始凝集，并且還能夠增大高濃度區(qū)域的靈敏度變化，擴大能測定的范圍。受體的種類或含量、存在方式(游離態(tài)或載體負載狀態(tài))可考慮配體的受體結(jié)合部位的數(shù)量、分析所需要的顆粒的凝集程度、作為目的的測定范圍等適當選擇。使用單克隆抗體作為受體的情況下，其選擇例如可按照以下順序進行。首先，通過免疫印跡法(Westernblot)或ELISA法等，來確認以測定對象配體為免疫原而制備的單克隆抗體與配體的反應性，選出2種以上反應性強的抗體。此外，通過夾層ELISA法來確認將選出的這些抗體組合時的反應性。此時，反應性越強，則靈敏度越高、能擴大測定范圍的可能性越高，因此，期望根據(jù)測定對象、要求性能來適當選擇單克隆抗體的組合。將這樣獲得的單克隆抗體的組合中的一方以固定于載體的狀態(tài)供于實際的測定體系，另一方以不固定于載體的游離態(tài)供于實際的測定體系，考慮初始凝集、測定靈敏度、測定范圍、與具有類似于配體結(jié)構(gòu)的測定對象外的物質(zhì)的交差反應性等，來最終判斷哪個組合合適。(載體顆粒)本發(fā)明所使用的負載有配體或受體的不溶性載體顆粒雖無特別限制，但優(yōu)選平均粒徑為50~1000nm的膠乳。膠乳的材質(zhì)只要適合負載配體或受體即可，除了通常使用的以聚苯乙烯為主要成分的膠乳之外，還可舉出苯乙烯-丁二烯共聚物、(曱基)丙烯酸酯類聚合物等。另外，也可使用由金屬膠體、明膠、脂質(zhì)體、微膠嚢、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷或者磁性物質(zhì)等材質(zhì)形成的顆粒。作為將上述配體或者配體樣物質(zhì)以及受體負載于載體顆粒的方法，除了通常使用的物理吸附法之外，還可以使用化學結(jié)合法(chemicalbondingmethods)。另外，本發(fā)明所使用的分別負載有配體以及受體的載體顆粒，其材質(zhì)相同或者不同均可。而且，各載體顆粒的粒徑可以選擇適合分析方法或目的的粒徑，但為了充分發(fā)揮本發(fā)明的效果，負載受體的載體顆粒的平均粒徑優(yōu)選為負載配體的載體顆粒的平均粒徑的1/2~1/10。(緩沖液)本發(fā)明中的凝集反應在緩沖液中進行，選擇最適合進行凝集反應的該緩沖液的種類、濃度、pH,可以使用磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、碳酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Good，s緩沖液等。該緩沖液中的緩沖劑的濃度使用5mM500mM左右，pH多使用中性區(qū)域至堿性區(qū)域，通常使用7.0~9.5的范圍。(凝集信號的測定方法)凝集信號的測定只要為通常用于凝集抑制反應測定中所用的方法即可，可舉出利用吸光度比的評價、顆粒數(shù)測定、顆粒大小測定(如果凝集則尺寸增大)、散射光測定或吸收光譜的測定(如果凝集則增大或者發(fā)生移動)等本領域人員能夠使用的方法。此外，在可能的范圍內(nèi)光學檢測也可能被電化學檢測替代。凝集信號的測定有如前所述的各種方法，但是使用膠乳顆粒和通用的生物化學分析裝置的方法較為便利。例如，向含有作為測定對象的配體的試樣中，添加含有負載有與游離態(tài)的受體不同的受體的膠乳、負載有配體的膠乳等不溶性載體顆粒的試劑，在一定溫度下加熱一定時間，測定這期間的吸光度，并檢測吸光度的變化量，根據(jù)以預先已知濃度的標準溶液為試樣時的標準曲線能夠計算待測試樣中的配體的濃度。膠乳凝集抑制法中，通常使用500~900nm的波長的吸光度，一般使用反應時的吸光度的變化量來進行定量。利用本發(fā)明時的測定范圍，可以考慮作為測定對象的配體的種類、與受體的親和性、各受體量的比例等適當設定為所要求的測定范圍。例如，測定對象為尿中的白蛋白的情況下，考慮到在臨床檢測中的使用而優(yōu)選為1lig/mL至lmg/mL的范圍，如后述的實施例所示，才艮據(jù)本發(fā)明能夠準確地進行測定。本發(fā)明的凝集抑制測定用試劑包含(A)預先負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒、(B)與上述配體特異性反應的游離態(tài)受體、(C)負載有受體的不溶性載體顆粒，所述受體與上述配體特異性反應、且配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)受體不同，最理想的是分成含有(B)、(C)的第一試劑和含有(A)的第二試劑。以下，舉出實施例對本發(fā)明進行更詳細的"i兌明，^旦本發(fā)明不限于此。實施例利用凝集抑制測定法測定微量白蛋白(1)受體(抗白蛋白單克隆抗體)的制備將100iig純化人白蛋白(Sigma公司制)用于每一次免疫。初次免疫使用將白蛋白和弗氏完全佐劑等量混合制備而成的200i!L乳濁液，將其注射到BALB/c小鼠的腹腔而進行。加強免疫使用弗氏不完全佐劑，利用與上述同樣制備而成的20OpL乳濁液重復進行3次腹腔注射，每次間隔兩周。通過將純化人白蛋白固相化的ELISA法測定從小鼠眼底靜脈采集的血液中的抗體效價，選擇抗體效價高的小鼠供于細胞融合(另外抗體效價的確認方法與后述的培養(yǎng)上清中的抗白蛋白抗體的存在的確認方法相同)。在距第4次免疫2周后，將1OOpg白蛋白溶解于200pL生理鹽水中，將其注射到小鼠腹腔，3天后取出脾臟。將該取出的脾臟在RPMI1640培養(yǎng)基中打碎，然后以1500rpm離心分離并回收脾細胞。通過將其在不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行3次以上離心、沉淀而進行清洗，之后對于沉淀部分添加2mL含有15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行懸浮，制成脾細胞懸浮液。將脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0-AG14以細胞數(shù)6比1的比例混合之后，在50%聚乙二醇存在下使細胞融合。利用1500rpm的離心分離收集沉淀部分，懸浮于GKN溶液(將葡萄糖2g、氯化鉀0.4g、氯化鈉8g、磷酸氫二鈉1.41g以及磷酸二氫鈉二水合物0.78g溶于1升純化水中而成的溶液)，通過懸浮離心分離進行清洗，之后回收沉淀部分。將該沉淀部分懸浮于30mL含有15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基而成的液體，每孔分注100jiL，向同一孔中每孔分注200pL含有2.5x106個/mL作為飼養(yǎng)細胞的BALB/c小鼠胸腺細胞的HAT培養(yǎng)基。分注于3個96孔微孔板，于37。C下在5。/。二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過將純化人白蛋白固相化的ELISA法確認培養(yǎng)上清中的抗白蛋白抗體的存在。培養(yǎng)10天后，在全部孔中都看到了融合細胞的增殖?？拱椎鞍卓贵w的存在確認方法的詳細情況如下。首先，將100pL含有10ng/mL的白蛋白以及150mM氯化鈉的10mM磷酸緩沖液(pH7.2;以下簡稱為PBS)分注于96孔微孔板，于4。C下放置一晚。接著，將其用300(iL含有0.05。/o吐溫20以及1%牛血清白蛋白的PBS清洗3次后，以50pL/孔添加進行了培養(yǎng)的3個96孔微孔板各孔的培養(yǎng)上清，于室溫下放置l小時。之后，用含有0.05。/。吐溫20的PBS清洗3次后，以50jiL/孔添加過氧化物酶標記的抗小鼠抗體(第一化學藥品公司制)，于室溫下放置l小時。將其用含有0.05。/。吐溫20的PBS清洗3次后，以50pL/孔添加含有0.2%鄰苯二胺以及0.02%過氧化氬的檸檬酸緩沖液(pH5)，于室溫下放置15分鐘后，以50pL/孔添加4.5N硫酸使反應停止，測定波長492nm處的吸光度。測定的結(jié)果，選擇吸光度高的孔作為抗白蛋白抗體存在(即，存在產(chǎn)生抗白蛋白抗體的融合細胞)的孔(陽性孔)。通過有限稀釋法進行單克隆化。即，將作為飼養(yǎng)細胞的BALB/c小鼠的胸腺細胞以每孔106個分注于96孔微孔板，將陽性孔中的融合細胞稀釋成10個/mL后，將其向上述微孔板中每孔分注0.1mL。培養(yǎng)基方面，初次時使用HT培養(yǎng)基，第二次以后使用含有15。/。胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37°。下在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。把上述利用將純化人白蛋白固相化的ELISA法來選擇陽性孔以及利用有限稀釋法的單克隆化操作各重復3次，獲得30種產(chǎn)生抗白蛋白單克隆抗體的細胞。將約105個各細胞給予到實施了姥鮫烷預處理的小鼠腹腔，分別采集生成的腹水。通過離心分離從采集的各腹水中除去不溶物質(zhì)，并添加等量的飽和硫酸銨溶液，一邊攪拌并放置l晚后，利用離心分離回收沉淀。將回收的沉淀溶解于20mMTris緩沖液(pH8),用同樣的緩沖液進行透析。使各透析內(nèi)含物分別吸附于用同樣的緩沖液平衡后的DEAE-瓊脂糖柱，之后分別將在同樣的緩沖液中的0~300mM的氯化鈉濃度梯度下洗脫得到的IgG級分用50mM甘氨酸緩沖液透析，從由此得到的30種純化抗體中選擇在夾層法中可獲得最高靈敏度的2種抗體的組合(抗體l-8和抗體3-8)。(2)白蛋白測定用膠乳試劑的制備向含有2.8mg/mL選出的2種抗白蛋白單克隆抗體中的抗體3-8的20mMTris緩沖液(pH8.5)3mL中添加3mL平均粒徑為50nm的4。/。膠乳(積水化學工業(yè)公司制)懸浮液，于4。C下攪拌2小時。向其中添加6mL含有0.4o/。牛血清白蛋白的20mMTris緩沖液(pH8.5)，于4。C下攪拌1小時。離心分離后，將沉淀用5mMMOPS緩沖液(pH7.0)重懸，以使波長600nm處的吸光度為40mOD,制備抗白蛋白抗體3-8致敏膠乳?；旌嫌坞x態(tài)的抗體l-8和抗體3-8致敏膠乳從而制備第一試劑。接著，使用3mL含有0.5mg/mL人血清白蛋白的10mMCHES緩沖液(pH5.5),添加3mL平均粒徑為300nm的0.5。/o膠乳(積水化學工業(yè)公司制)懸浮液，于4。C下攪拌1小時。離心分離后除去上清，將沉淀用5mMMOPS緩沖液(pH7.0)重懸，以使波長600nm處的吸光度為2.15OD，制備第二試劑，即白蛋白致敏膠乳溶液。(3)白蛋白的測定使用通用型的日立7170型自動分析裝置測定各濃度的白蛋白試樣，確認測定靈壽丈度。具體而言，向IOOiiL第一試劑中分別添加3pL含有各濃度的白蛋白的試樣溶液并進行攪拌，之后于37。C下加熱5分鐘，再添加100pL第二試劑，于37。C下測定5分鐘的主波長570nm/副波長800nm處的吸光度變化量。首先，白蛋白濃度為Ojxg/mL時的初始凝集示于表l。再測定含有5、12.5、25、50、100、200、400、800pg/mL的白蛋白的各^式才羊測定時初始凝集后的吸光度變化量，白蛋白濃度-(負)吸光度(以下相同)的反應曲線以實線示于圖1。基于該反應曲線的形狀由0、5、25、100、400、800pg/mL這6點制成標準曲線，將各濃度的白蛋白試樣的吸光度變化量換算成白蛋白濃度的測定值示于表2。(4)比較例作為比較例制備下述(A)~(E)5種第一試劑，并使其與實施例中的最終的抗體濃度相同。(A)單獨含有游離態(tài)的抗體l-8的第一試劑(B)單獨含有抗體l-8致敏膠乳的第一試劑(C)含有游離態(tài)的抗體l-8和抗體l-8致敏膠乳兩者的第一試劑(D)含有游離態(tài)的抗體l-8和游離態(tài)的抗體3-8兩者的第一試劑(E)含有抗體l-8致敏膠乳和抗體3-8致敏膠乳兩者的第一試劑說明書第14/16頁組合上述(A)~(E)的各第一試劑和(2)中制備的第二試劑，根據(jù)(3)的方法進行測定。與實施例同樣將初始凝集的結(jié)果示于表l，將白蛋白濃度-吸光度的反應曲線示于圖l,基于各比較例的反應曲線的形狀由0~800fig/mL的范圍選出最佳的濃度點制成標準曲線，將各濃度的白蛋白試樣的吸光度變化量換算成白蛋白濃度的測定值示于表2。(5)結(jié)果如表l所示，相對于實施例的初始凝集(吸光度)，比較例A、B、C只獲得約一半的初始凝集，比較例D只獲得2/3左右的初始凝集，可以容易地推測出比較例的試劑在凝集抑制法中基本的測定性能差。另一方面，比較例E中獲得比實施例更大的初始凝集。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>單位(mAbs)根據(jù)圖l的白蛋白濃度-(負)吸光度的反應曲線，實施例(-_)凝集抑制反應的敏感性高，在白蛋白低濃度區(qū)域(5~50jig/mL)顯示大的靈敏度(-吸光度)變化的同時，在白蛋白高濃度區(qū)域(100~800|ig/mL)也顯示明確的靈壽文度變化，因此可確認能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域廣范圍地且精度良好地測定白蛋白。另一方面，由于比較例A(-口-)、比較例C(-A-)在白蛋白低濃度區(qū)域幾乎無法確認靈敏度變化，因此不能準確測定低濃度區(qū)域。另外，雖然比較例D(-X-)中白蛋白濃度-吸光度的反應曲線的形狀與實施例近似，但初始凝集和靈敏度變化自身相對于實施例而言較小，測定精度成為問題。比較例B(-o-)、比較例E(—-)中雖然在白蛋白低濃度區(qū)域顯示大的靈敏度變化，但由于在高濃度區(qū)域無靈敏度變化，因此不能廣范圍地測定低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域。如表2所示，實施例中從低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域獲得了與理論值基本相同的測定值。比較例A、C不能準確測定含有0pg/mL白蛋白的低濃度區(qū)域。另外，比較例B、E不能準確測定高濃度區(qū)域。比較例D中在任何濃度下均與理論值背離較大，因此可確認所有測定值的準確性均存在問題。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>單位(Ag/ml)對于上述實施例以及比較例，在相同條件下進行同時重復性試驗(simultaneousreproducibilitytest)(n=5)。結(jié)果示于表3。如表3所示，實施例從低濃度至高濃度的重復性良好，可以得到變異系數(shù)為6%以下的值，測定平均值也得到與白蛋白濃度水平同等的測定值。比較例A、C、D重復性差，尤其是低濃度的變異系數(shù)有超過20%的情況。比較例B、E雖然可以重復性良好地測定，但是在高濃度區(qū)域的測定平均值與白蛋白濃度水平背離，準確性低。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種凝集抑制測定法以及一種凝集抑制測定用試劑，其能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域高靈敏度且廣范圍地對測定對象配體進行測定，同時還具有良好的測定重復性。尤其是利用免疫反應的情況下，由于不產(chǎn)生鉤狀效應這一特征，測定值的可靠性高，另外，在測定具有可能呈現(xiàn)異常高值的配體的情況下，能夠提供比顆粒凝集法更為準確的測定方法。權(quán)利要求1.一種凝集抑制測定法，其特征在于，其通過將含有具有兩個以上受體結(jié)合部位的測定對象配體的試樣與下述(A)～(C)混合，來測定顆粒的凝集抑制反應，所述凝集抑制反應反映著試樣中的測定對象配體的量，(A)預先負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒、(B)與上述配體特異性反應的游離態(tài)受體、(C)負載有受體的不溶性載體顆粒，所述受體與上述配體特異性反應、且配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)受體不同。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的凝集抑制測定法，其中，不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凝集抑制測定法，其中，受體為抗體或者含有其功能性部位的片段，配體為抗原，基于受體和配體的免疫反應來測定顆粒的凝集抑制反應。4.根據(jù)權(quán)利要求l~3中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，游離態(tài)受體以及不溶性載體顆粒所負載的受體均為單克隆抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求l~4中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，測定對象配體為人白蛋白，受體為抗人白蛋白單克隆抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求l~5中任意一項所述的凝集抑制測定法，其中，負載有受體的不溶性載體顆粒的平均粒徑為負載有配體7.—種凝集抑制測定用試劑，其特征在于，含有下述(A)~(C),并且測定顆粒的凝集抑制反應，所述凝集抑制反應反映著試樣中的測定對象配體的量，(A)預先負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒、(B)與上述配體特異性反應的游離態(tài)受體、(C)負載有受體的不溶性載體顆粒，所述受體與上述配體特異性反應、且配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)受體不同。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的凝集抑制測定用試劑，其中，不溶性載體顆粒為膠乳顆粒。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的凝集抑制測定用試劑，其中，受體為抗體或者含有其功能性部位的片段，配體為抗原，所述試劑為用于基于受體和配體的免疫反應來測定顆粒的凝集抑制反應的試劑。10.根據(jù)權(quán)利要求7~9中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，游離態(tài)受體以及配體上的結(jié)合部位不同于上述游離態(tài)受體的受體均為單克隆抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求7~IO中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，負載有受體的不溶性載體顆粒的平均粒徑為負載有配體或者配體樣物質(zhì)的不溶性載體顆粒的平均粒徑的1/2~1/10。12.根據(jù)權(quán)利要求7ll中任意一項所述的凝集抑制測定用試劑，其中，測定對象配體為人白蛋白，受體為抗人白蛋白單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明的課題在于提供一種凝集抑制測定法及凝集抑制測定用試劑，其能夠在低濃度區(qū)域至高濃度區(qū)域高靈敏度且廣范圍地測定試樣中的配體，同時，還具有良好的測定重復性。本發(fā)明提供的凝集抑制測定法及凝集抑制測定用試劑，使用負載有配體的不溶性載體顆粒和游離態(tài)的特異性受體、以及負載有配體上的結(jié)合部位與上述游離態(tài)的受體不同的特異性受體的不溶性載體顆粒。文檔編號G01N33/544GK101517412SQ200780035440公開日2009年8月26日申請日期2007年7月23日優(yōu)先權(quán)日2006年7月24日發(fā)明者吉田忠晃,高橋弘至申請人:積水醫(yī)療株式會社