異檸檬酸測定試劑盒及異檸檬酸的濃度測定方法

文檔序號：5909135閱讀：251來源：國知局

專利名稱：異檸檬酸測定試劑盒及異檸檬酸的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法，屬于食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
異檸檬酸isocitricacid是檸檬酸的異構體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC1丄1.41; EC1丄1.42)的作用下變成oc-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase， EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標準，GBT16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D-異檸檬酸的測定方法一紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫氫酶 isocitrate dehydrogenase 有兩禾中類型以 NAD 為輔酶的酶 (EC1. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 42)，兩者催化同一反應。
異檸檬酸+NAD(P)+# ot-酮戊二酸十C02 + NAP(P)H + fT在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP 作用，生成NADH或NADPH的含量，相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶雙倍擴增法 (Enzymatic Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的異檸檬酸測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法原理如下
D-異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+
酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
草酰乙酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l，3-雙磷酸+還原型輔酶這種方法應用異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1丄1.41 ; EC 1丄1.42)酶(偶)聯(lián)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、甘油醛-3陽磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶《足反應速率比色法/終點法。異檸檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸反應產生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，使靈敏度提高二倍，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nm處吸光度上升的程度/速度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明異擰檬酸測定試劑盒較為理想
緩沖液100 mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
異擰檬酸脫氫酶10000U/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶12000U/L
磷酸烯醇式丙酮酸6 mmol/L
甘油醛-3-磷酸20 mmol/L
本發(fā)明的異檸檬酸測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成
液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法，其
輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
磷酸烯醇式丙酮酸 6mmol/L 甘油醛-3-磷酸 20mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；
使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始
吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬
酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延
遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異
檸檬酸的濃度大小.
實施例二
本實施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括:
試劑1
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸
甘油醛-3-磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
20 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
異檸檬酸脫氫酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
500 mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑i、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
10加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異
檸檬酸的濃度大小。
實施例三
本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸甘油醛-3-磷酸試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸—鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L
20 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000 U/L
試劑
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
10000U/L
異擰檬酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化
分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《 0.0020;吸光度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效 (R》0.99)線形范圍可達10.5mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±6%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV) 《3.6 %;試劑的靈敏度可達0.0675±0.034 AA/ mmol /L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
權利要求
1. 一種酶雙倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法原理如下D-異檸檬酸+輔酶 異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 草酰乙酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結果。
2. —種異檸檬酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩(wěn)定劑試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶雙倍擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的異檸檬酸測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸、甘油醛-3-磷酸、異檸檬酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464284SQ20071019143
公開日2009年6月24日申請日期2007年12月19日優(yōu)先權日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司

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