專利名稱：鑒定抗蟲雜交棉“蘇雜3號”品種純度的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明鑒定抗蟲雜交棉"蘇雜3號"真實性和/或品種純度的SSR標(biāo)記方法，對棉 花F,雜交品種"蘇雜3號"的種子進行真?zhèn)舞b別和/或品種純度鑒定，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
優(yōu)良品種是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)，品種混雜和純度降低則會明顯降低產(chǎn)量?？焖贉?zhǔn)確 地鑒定品種和進行純度分析對于種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛均 有重要作用。目前，我國種子生產(chǎn)和經(jīng)營管理還不太規(guī)范，不合格的種子屢屢混入市 場并用于生產(chǎn)，造成減產(chǎn)和經(jīng)濟損失，因此品種純度鑒定顯得尤為重要(吳敏生，王 守才，戴景瑞.DNA指紋圖譜技術(shù)在品種鑒定和純度分析上的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué) 報，1998， 6(1): 51-56;王忠華DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2006， 4 (3): 425-430.)。目前生產(chǎn)上大多數(shù)高優(yōu)勢雜交棉品種均是通 過人工去雄制種。制種過程中，母本去雄不徹底或漏去雄，而形成的自交鈴會嚴(yán)重影 響雜交種純度。如不及時有效地鑒定雜交種純度，則會給棉花生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。因 此，對棉花雜交種進行快速、準(zhǔn)確而高效的純度鑒定，對雜交棉品種的推廣應(yīng)用具有 重要的現(xiàn)實意義。傳統(tǒng)的棉花品種純度的檢測方法有多種種子形態(tài)學(xué)方法、幼苗鑒 定、蛋白質(zhì)電泳方法以及田間小區(qū)種植鑒定等(高翔，查春宏，艾克拜爾，等.棉花種子 純度鑒定技術(shù)[J].種子科技，2006 (3): 52-53.)。相比較而言，以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo) 記技術(shù)如簡單重復(fù)序列(SSR)等，具有檢測位點數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受 環(huán)境條件影響等優(yōu)點，已在棉花品種鑒定、種子純度檢測和品種親緣關(guān)系及分類等方 面得到應(yīng)用，并發(fā)揮著越來越重要的作用。
蘇雜3號(原名寧雜602、 SGKz9)是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所與中 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所合作選育的國產(chǎn)高強纖維雙價抗蟲雜交棉，品種親本來源 為TB005/SGK321。 2004年12月獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因作物安全證書，2005年4月通過國 家農(nóng)作物品種審定委員會審定。蘇雜3號突出的表現(xiàn)是纖維強力佳、品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高、 綜合抗病蟲性狀好。為保證該優(yōu)良品種產(chǎn)生最大的經(jīng)濟效益，需要一種權(quán)威、準(zhǔn)確、穩(wěn) 定檢測方法對其商品種子的真?zhèn)渭捌浼兌冗M行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是找到鑒定抗蟲雜交棉"蘇雜3號"真實性和/或品種純度的SSR標(biāo) 記的方法，此方法具有多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，可以彌補現(xiàn)有 純度檢測工作的不足，從而為其種子真?zhèn)舞b別和純度的快速鑒定建立起高效準(zhǔn)確的質(zhì)量
控制方法。
技術(shù)方案
1、鑒定抗蟲雜交棉"蘇雜3號"品種純度的SSR標(biāo)記方法，包括以下步驟
(1) 提取抗蟲雜交棉"蘇雜3號"子葉基因組DNA; 以基因組DNA為模板，選用2對SSR引物同時進行PCR擴增，2對SSR引物序列 力
引物JZSSSR259
F: TGAAGATTTGGAGGCAATTG R: GAAATCAAGCCTCAATTCGG 和引物JZSSSR413
F: CCTCCCTCACTTAAGGTGCA R: ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC;
(2) 對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳；
(3) 對電泳結(jié)果進行分析，其中
SSR引物JZSSSR259產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR2592Q5條帶大小為205bp，產(chǎn)生的 父本特異標(biāo)記JZSSSR259245條帶大小為245bp;
SSR引物JZSSSR413產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR413125條帶大小為125bp，產(chǎn)生的 父本特異標(biāo)記JZSSSR413ns條帶大小為135bp。
通過應(yīng)用2個特征引物對雜種單株幼苗的標(biāo)記基因型進行分析，只有同時具有親本 特異條帶的單株才為真正的"蘇雜3號"雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假 雜種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即"蘇雜3號"品種種子的純度。
其中棉花基因組DNA的提取方法將1片拇指蓋大小的新鮮棉花子葉放入1.5 ml 的離心管中，加入0.6ml提取緩沖液，電轉(zhuǎn)磨碎。10,000 rpm離心10min，棄上清；于 沉淀中加入0.6ml65'C預(yù)熱的裂解緩沖液，并用牙簽攪拌混勻，65'C水浴30min;加入 0.6ml的氯仿異戊醇，其體積比為24: 1，翻轉(zhuǎn)50次以上，12,000 rpm離心15min; 將上清轉(zhuǎn)入另一新的1.5 ml的離心管中，加入0.6ml的氯仿異戊醇，其體積比為24: 1，翻轉(zhuǎn)50次以上，12,000 rpm離心15min ;加0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次， -20°。放置30min， 10,000rpm離心5min，棄上清；力卩0.5 ml 70%乙醇洗DNA， 10,000rpm 離心5分鐘，棄上清，自然通風(fēng)干燥DNA;加100pl滅菌、pH 8.0的TE緩沖液溶解 DNA，瓊脂糖凝膠檢測質(zhì)量后，保存于4'C或-2(TC備用。
PCR擴增反應(yīng)及凝膠電泳步驟包括SSR反應(yīng)體系為10ul，其中含基因組DNA 10~30ng， Mg2+2.5mmol.L-1， dNTPs 0.2mmo七-1 ，引物0.6pmoH/1, 0.3U Taq DNA聚合 酶。PCR擴增反應(yīng)在PCR基因擴增儀上上進行，擴增程序為95°C 2min; 94°C 40s， 57°C 45s， 72°C lmin， 30個循環(huán)；72°C 7min;擴增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的雙垂直板 非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，120V穩(wěn)壓電泳1.2 1.5h，電泳結(jié)束后凝膠用蒸餾水
稍沖洗后，進行固定12 15min;銀染12min;顯色；最后用0.75%碳酸鈉水溶液終止顯 色，在可見燈箱下觀察拍照。 有益效果
本發(fā)明從所用的大量引物中篩選出能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生具有父、母本特異標(biāo) 記條帶，而且?guī)颓逦?、重?fù)性好、可靠性強的引物JZSSSR259和JZSSSR413作為 抗蟲雜交棉"蘇雜3號"種子真?zhèn)魏图兌辱b定的特征引物。
本發(fā)明引物的應(yīng)用，具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件及發(fā)育時期的影響、 統(tǒng)計簡便，可以快速、準(zhǔn)確地檢測棉花品種種子的真?zhèn)巍?br> 本發(fā)明引物均能鑒定出具有父母本特異互補條帶。2個共顯性標(biāo)記的SSR引物(附 圖)，在多次重復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，可有效用于鑒別棉花雜交種種子的真?zhèn)魏图兌?，并且?以相互驗證，有利于棉花商品種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快了棉花商品種子的質(zhì)量檢 測進程。


附圖為抗蟲雜交棉"蘇雜3號"種子檢測特征引物的SSR-PCR電泳圖譜。 Pi:"蘇雜3號"母本；P2:"蘇雜3號"父本；F,:"蘇雜3號"Fi雜交種L:50bp 分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭分別代表親本間的特異標(biāo)記。
具體實施例方式
下面通過基于PCR技術(shù)的SSR標(biāo)記分析實施例進一步說明本發(fā)明。
本實施例的實驗材料為抗蟲雜交棉"蘇雜3號"商品種子及其親本材料種子。在室 內(nèi)采用沙床25-3(TC條件下培育幼苗5-7天，取其新鮮子葉。
方法提取棉花子葉的DNA，采用SSR分子標(biāo)記進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行 凝膠電泳，統(tǒng)計結(jié)果并篩選特征引物。 1.棉花基因組DNA提取
(1) 將1片拇指蓋大小的新鮮棉花子葉放入1.5 ml的離心管中，加入0.6ml提取緩沖 液
，電轉(zhuǎn)磨碎。10,000 rpm離心10min，棄上清；
(2) 于沉淀中加入0.6ml 65。C預(yù)熱的裂解緩沖液[1.4MNaCl， 0.1M Tris-HCl (pH8.0), 20mMNa-EDTA(pH8.0), 2%(V/V)CTAB, 2%PVP, l%(V/V)p-Me]，并用牙簽攪拌混 勻，65"C水浴30min;
(3) 加入0.6ml的氯仿異戊醇(24: 1)，翻轉(zhuǎn)50次以上，12,000 rpm離心15min;
(4) 將上清轉(zhuǎn)入另一新的1.5 ml的離心管中，重復(fù)步驟(3)1次后，加0.6倍體積預(yù)冷 的異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次，-201:放置30min, 10，000rpm離心5min，棄上清；
(5) 加0.5 ml 70%乙醇洗DNA， 10，000rpm離心5分鐘，棄上清，自然通風(fēng)干燥DNA;
(6) 加100)al滅菌TE緩沖液(pH8.0)溶解DNA，瓊脂糖凝膠檢測質(zhì)量后，保存于 4'C或-20'C備用。
2、 分子標(biāo)記分析
SSR反應(yīng)體系為10ul，其中含基因組DNA 10~30ng， Mg2+ 2.5mmol'L'1， dNTPs 0.2mmo'i;1，引物0.6nmoH/1， 0.3U Taq DNA聚合酶。PCR擴增反應(yīng)在PCR基因擴增 儀上上進行。擴增程序為95°C 2min; 94°C 40s， 57°C 45s， 72°C lmin， 30個循環(huán)； 72°C 7min。擴增產(chǎn)物在雙垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠(濃度8%)進行電泳，120V 穩(wěn)壓電泳1.2~1.5h。電泳結(jié)束后凝膠用蒸餾水稍沖洗后，進行固定(10%乙醇，0.5%冰 乙酸)12~15min;銀染(0.2%AgNO3水溶液)12min;顯色(1.5%NaOH， 0.4%甲醛)； 最后用0.75%碳酸鈉水溶液終止顯色。在可見燈箱下觀察拍照。
3、 篩選純度鑒定的特征引物
從所用的引物中篩選出能夠在一代雜種中同時產(chǎn)生父、母本特異標(biāo)記條帶，且?guī)颓?晰、重復(fù)性好、可靠性強的引物共2個，分別是JZSSSR259和JZSSSR413，作為抗蟲雜 交棉"蘇雜3號"種子真實性和/或品種純度鑒定的特征引物(附圖)。2對SSR引物序 列為
引物JZSSSR259
F: TGAAGATTTGGAGGCAATTG R: GAAATCAAGCCTCAATTCGG 和引物JZSSSR413
F: CCTCCCTCACTTAAGGTGCA R: ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC;
SSR引物JZSSSR259產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR2592()5條帶大小為205bp，產(chǎn)生的 父本特異標(biāo)記JZSSSR259245條帶大小為245bp; SSR引物JZSSSR413產(chǎn)生的母本特異標(biāo) 記JZSSSR413125條帶大小為125bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記JZSSSR413135條帶大小為 135bp。
4、 用特征引物對進行種子遺傳純度鑒定
應(yīng)用篩選到的2個特征引物，對抗蟲雜交棉"蘇雜3號"進行純度鑒定，步驟同 1-3。只有同時具有親本特異標(biāo)記條帶的單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一個 條帶均被視為假雜種。通過應(yīng)用2個特征引物對雜種單株幼苗的標(biāo)記基因型進行分析， 檢測得到的純度結(jié)果的平均值即可記為雜交種的遺傳純度。這2個SSR標(biāo)記在多次重 復(fù)中表現(xiàn)穩(wěn)定，分析結(jié)果可以相互驗證，可以準(zhǔn)確地鑒定棉花雜交種純度。
其中SSR引物代號JZSSSR259其含義是"JZS"代表經(jīng)濟作物研究所；"SSR "代 表簡單重復(fù)序列標(biāo)記；"259"代表本實驗室棉花SSR引物編號。
權(quán)利要求
1、鑒定抗蟲雜交棉“蘇雜3號”品種純度的SSR標(biāo)記方法，包括以下步驟(1) 提取抗蟲雜交棉“蘇雜3號”子葉基因組DNA；以基因組DNA為模板，選用2對SSR引物同時進行PCR擴增，2對SSR引物序列為引物JZSSSR259FTGAAGATTTGGAGGCAATTGRGAAATCAAGCCTCAATTCGG和引物JZSSSR413FCCTCCCTCACTTAAGGTGCARATGTTGTAAGGGTGCAAGGC；(2) 對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳；(3) 對電泳結(jié)果進行分析，其中SSR引物JZSSSR259產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR259205條帶大小為205bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記JZSSSR259245條帶大小為245bp；SSR引物JZSSSR413產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR413125條帶大小為125bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記JZSSSR413135條帶大小為135bp。通過應(yīng)用2個特征引物對雜種單株幼苗的標(biāo)記基因型進行分析，只有同時具有親本特異條帶的單株才為真正的“蘇雜3號”雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假雜種，檢測得到的純度結(jié)果的平均值即“蘇雜3號”品種種子的純度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒定抗蟲雜交棉"蘇雜3號"品種純度的SSR標(biāo)記方法，其中 棉花基因組DNA的提取、PCR擴增反應(yīng)及凝膠電泳步驟，包括棉花基因組DNA的提取將1片拇指蓋大小的新鮮棉花子葉放入1.5 ml的離心管 中，加入0.6ml提取緩沖液，電轉(zhuǎn)磨碎。10,000 rpm離心10min，棄上清；于沉淀中加入 0.6ml65'C預(yù)熱的裂解緩沖液，并用牙簽攪拌混勻，65'C水浴30min;加入0.6ml的氯仿 異戊醇，其體積比為24: 1，翻轉(zhuǎn)50次以上，12,000 rpm離心15min;將上清轉(zhuǎn)入另一 新的1.5ml的離心管中，加入0.6ml的氯仿異戊醇，其體積比為24: 1，翻轉(zhuǎn)50次以 上，12,000 rpm離心15min ;加0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次，-2(TC放置30min， 10，000rpm離心5min，棄上清；力Q 0.5 ml 70%乙醇洗DNA， 10,000rpm離心5分鐘，棄 上清，自然通風(fēng)干燥DNA;力口100pl滅菌、pH 8.0的TE緩沖液溶解DNA，瓊脂糖凝膠 檢測質(zhì)量后，保存于4'C或-2(TC備用。PCR擴增反應(yīng)及凝膠電泳SSR反應(yīng)體系為10ul，其中含基因組DNA 10~30ng， Mg2+2.5mmol'L-1， dNTPs 0.2mmo丄"，引物0.6nmol'L-1， 0.3U Taq DNA聚合酶。PCR擴 增反應(yīng)在PCR基因擴增儀上上進行，擴增程序為95。C2min; 94°C 40s， 57°C 45s， 72°C lmin， 30個循環(huán)；72°C 7min;擴增產(chǎn)物在質(zhì)量體積比濃度為8%的雙垂直板非變性聚丙 烯酰胺凝膠上進行電泳，120V穩(wěn)壓電泳1.2 1.5h，電泳結(jié)束后凝膠用蒸餾水稍沖洗后， 進行固定12 15min;銀染12min;顯色；最后用0.75%碳酸鈉水溶液終止顯色，在可見 燈箱下觀察拍照。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定抗蟲雜交棉“蘇雜3號”真實性和/或品種純度的SSR標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以商品抗蟲雜交棉“蘇雜3號”及其雙親的DNA為模板，進行SSR分子標(biāo)記的篩選，鑒定出能夠同時區(qū)分父本、母本和雜交種的2個SSR標(biāo)記。SSR引物JZSSSR259產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR259₂₀₅條帶大小為205bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記JZSSSR259₂₄₅條帶大小為245bp；SSR引物JZSSSR413產(chǎn)生的母本特異標(biāo)記JZSSSR413₁₂₅條帶大小為125bp，產(chǎn)生的父本特異標(biāo)記JZSSSR413₁₃₅條帶大小為135bp。這2個SSR標(biāo)記可有效用于鑒定棉花雜交種種子的純度，辨別種子的真?zhèn)?，同時還可以相互驗證，利于棉花雜交種種子高效準(zhǔn)確的質(zhì)量控制，加快棉花商品種子的質(zhì)量檢測進程，鑒定體系能夠在短時間內(nèi)對大量樣品進行快速鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號G01N27/447GK101104869SQ20071002478
公開日2008年1月16日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者劉劍光, 吳巧娟, 殷劍美, 狄佳春, 肖松華, 許乃銀, 陳旭升 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院