專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)豆薯層銹菌和疣頂單胞銹菌的噬菌體展示植物防御肽的制作方法
針對(duì)豆薯層銹菌和疣頂單胞銹菌的噬菌體展示植物防御肽相關(guān)申請(qǐng)
本申請(qǐng)是2001年4月10日遞交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/829,549的部分繼續(xù)申請(qǐng)，并要求于2000年4月10日遞交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/195,785的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)還要求于2005年8月2日遞交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)第60/704,933號(hào)的權(quán)益。所有上述申請(qǐng)以參考的方式引入本文。
序列表
本申請(qǐng)附有準(zhǔn)確再現(xiàn)本文描述的序列的計(jì)算機(jī)可讀的形式的序列表。
背景技術(shù)：
本公開(kāi)涉及使用噬菌體展示技術(shù)來(lái)鑒別與病原真菌類(lèi)結(jié)合的肽，更具體地，與疫霉菌(Phytophthora)屬、層銹菌(Phakapsora)屬和單孢銹菌(Uromyces)屬的病原真菌類(lèi)結(jié)合的肽。使用簡(jiǎn)并寡核苷酸構(gòu)建隨機(jī)肽噬菌體展示庫(kù)。在其表面表達(dá)肽的噬菌體與不同生命階段的真菌相接觸，并且分離、擴(kuò)增結(jié)合的噬菌體并鑒別肽。 一旦鑒別出，可基于抗真菌活性篩選肽并用于鑒別和表征在真菌上的結(jié)合位點(diǎn)。
疫霉菌在美國(guó)是經(jīng)濟(jì)上重要的致病有機(jī)體，其導(dǎo)致很多農(nóng)事上重要的農(nóng)作物品種的巨大損失。大豆疫霉菌CP/^o/ /^oraj6y'"e)是美國(guó)大豆的第二重要的病原體(Doupnik,P/a"fD". 77:1170-1171， 1993)。辣椒疫霉菌(尸/^op/^ora ca;^c/)具有廣泛的宿主范圍并最顯著地限制高價(jià)值、茄屬的蔬菜作物的生產(chǎn)。控制病原體特別困難，通常需要用殺生化合物處理整個(gè)區(qū)域。雖然有效，但對(duì)這種處理方法的環(huán)境成本和經(jīng)濟(jì)成本日益增長(zhǎng)的關(guān)注需要其它替代的控制方法。
疫霉菌類(lèi)CP/^叩/^ora)是適應(yīng)于在宿主植物不存在的情況下長(zhǎng)期存活于土壤中的專(zhuān)性寄生物。卵孢子或厚垣孢子低密度地存在于土壤中并使病原體能夠存活。在易受感染的植物存在下，病原體通過(guò)一系列產(chǎn)生感染和疾病周期的、精細(xì)調(diào)節(jié)的發(fā)育步驟快速發(fā)育。通過(guò)游動(dòng)孢子的釋放、成嚢、萌芽和感染，由卵孢子或厚垣孢子開(kāi)始的病原體發(fā)育最初看起來(lái)顯得直接了當(dāng)。但生命階段的進(jìn)程是受環(huán)境信號(hào)的精細(xì)調(diào)節(jié)的，尤其是那些來(lái)自于宿主植物的信號(hào)。
游動(dòng)孢子是擴(kuò)散至根部感染部位最重要的生命階段。主要易感部位位于根部的頂端分生組織，細(xì)胞在此處伸長(zhǎng)。從伸長(zhǎng)的細(xì)胞釋放出
的流出物作為引導(dǎo)游動(dòng)孢子向該部位趨化性移動(dòng)的信號(hào)(Carlile, in
浙夢(mèng)、為、類(lèi)夢(mèng)、在夢(mèng)和病理夢(mèng)乂 Erwin et al.， eds., APS Press, 1983;Deacon and Donaldson, Mycol Res. 97:1153-1171, 1993)。游動(dòng)孢子的趨化性反應(yīng)隨根部流出物的組成變化并且是種特異性的。例如，辣椒疫霉菌、惡疫霉菌(P ca"owm)和其它種的游動(dòng)孢子被吸引到糖和氨基酸的陣列中(Hickman,尸/^o; a"o/ogy, 60:1128- 1135， 1970; Khew andZentmyer，尸Ay,o; a^o/ogy， 63:1511-1517， 1973)，但大豆疫霉菌的游動(dòng)孢子被吸引到特定異黃酮化合物中(Norris et al., Plant Physiol，117:1171-1178， 1998)。雖然化學(xué)吸引的確切機(jī)理是未知的，但是，Deacon和Donaldson (Mycol. Res.， 97:1153-1171, 1993)以及Carlile (in尸一op禍ora.-加歷o/ogy, !Tajcowom_y,五co/ogy awd i^/ o/ogy, Erwin et al"eds., APS Press, 1983)概括了試驗(yàn)，表明了在游動(dòng)孢子表面的化學(xué)受體的參與。
游動(dòng)孢子在響應(yīng)環(huán)境信號(hào)而接近根部表面時(shí)是被包在嚢內(nèi)的。棕櫚疫霉菌CR / a/mzVora)和其它疫霉菌類(lèi)的游動(dòng)孢子的包嚢形成，例如，可能受局部鈣離子濃度的影響(Griffith et al.，爿rcA. M/craWo/，149:565-571, 1988; Warburton and Deacon, Fwwga/ Gewe"cs 5z'o/，25:54-62, 1998)。包嚢形成還可被高濃度的化學(xué)引誘劑或被根細(xì)胞壁成分引起。例如，大豆疫霉菌的游動(dòng)孢子在高濃度的大豆異黃酮化合物存在下被包在嚢內(nèi)(Morris and Ward, P/y^'o/ Mo/尸/awf尸a"o/， 40:17-22,1992)。與此對(duì)比，瓜果腐霉菌(尸;^A/i/附a/7/^mWwm^i/m)游動(dòng)孢子在與水芽根部細(xì)胞表面的巖藻糖基和半乳糖基殘基接觸時(shí)被包在嚢內(nèi)
6(Longman and Callow,尸—》/ Mo/尸ta ~Ao/， 30:139-150， 1987; Estrada-Garcia et al.， 41 :693-699， 1990)。 Deacon和
Donaldson (Myco/i d， 97:1153-1171, 1993)指出，在高濃度引誘劑存在 下的包嚢形成對(duì)侵染力是有害的，并因此隨時(shí)間的推移而不被選擇。 然而，他們建議，可充分濃縮根部表面的引誘物以在接觸根部表面殘 基后使游動(dòng)孢子傾向于形成包嚢。
當(dāng)與根部接觸時(shí)，游動(dòng)孢子以特定方向形成包嚢，所以，朝著根 部方向形成了芽管。如果游動(dòng)孢子在與根部接觸前形成包嚢，芽管會(huì) 在任<可方向上形成，而為了定位才艮部并感染該植物必須重新定向。在 芽管上的細(xì)胞表面的受體被認(rèn)為與此根部定向過(guò)程有關(guān)。例如，Morris 等人(尸/fl"f117:1171-1178, 1998)說(shuō)明了大豆疫霉菌幼體生長(zhǎng) 對(duì)源自大豆疫霉菌的異黃酮化合物的低濃度、無(wú)毒的定向響應(yīng)。 Zentmyer 133:1595-1596, 1961)報(bào)導(dǎo)了樟疫霉菌CP cz"wawo脂)
朝著宿主根部方向的菌絲定向，但對(duì)引誘化合物的特性沒(méi)有說(shuō)明。
感染后，菌絲穿過(guò)植物組織在細(xì)胞間和/或細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，其取決于 病原體的種類(lèi)(Stossel et al.， Can. J. Bot.， 58:2594-2601， 1980; Coffey and Wilson, 尸/^鄉(xiāng)級(jí)ora, 加 Wo/ogy, rox:owo附乂 ￡co/ogy awd 尸a/Z(o/ogy， Erwin et al., eds" APS Press, 1983; Enkerli et al., Ca". , 75:1493-1508， 1997; Hardham and Mitchell, Fimga/ Ge". 5zo/" 24:252-284, 1998; Murdoch and Hardham,尸ra鄉(xiāng)toma, 201:180-193， 1998)。通過(guò)某些疫霉菌類(lèi)，包括致病疫霉(Coffey and Wilson, z>z 尸/^鄉(xiāng)涵orfl:加5z'o/ogy, 7io;o"omy,五co/ogy fl"d尸滅o/ogy， Erwin et al.， eds" APS Press, 1983)、辣椒疫霉菌(Jones et al.,,鄉(xiāng)^ /柳 64:1084-1090, 1974)和大豆疫霉菌 (Stossel et al., 丄5o,，
58:2594-2601,1980),形成吸器。菌絲和吸器都與宿主細(xì)胞壁和細(xì)胞膜 形成緊密的接觸。雖然缺乏直接的證據(jù)，但據(jù)推測(cè)，細(xì)胞表面的受體 對(duì)于感知植物信號(hào)很重要。細(xì)胞表面受體的間接證據(jù)來(lái)自于觀(guān)察到諸 如于吸器末梢部分出現(xiàn)的泡嚢(Coffey and Wilson, z'w尸/^top/^/jora:
7io:owomy五co/ogy朋d ^fW/zo/ogy, Erwin et al.， eds.， APS Press, 1983)。 Heath (Om.J.5o/" 73(Suppl.):S131-S139, 1995)論述了真菌菌絲末端生長(zhǎng)的可能事件，包括通過(guò)離子通道和泡嚢功能與周?chē)h(huán)境的通 訊。
如上所述，證據(jù)指向了細(xì)胞表面受體對(duì)觸發(fā)疫霉的行為和發(fā)育步 驟的突出物。因此，細(xì)胞表面受體可提供破壞病原體發(fā)育以及由此的 感染性的方法。由于游動(dòng)孢子僅有有限的時(shí)間來(lái)定位、接觸和穿入隨 生長(zhǎng)的根部末端有效移動(dòng)的感染部位，因此發(fā)育的延遲或破壞會(huì)具有 很大影響。此時(shí)間限制來(lái)源于根部組織易感染性的改變，因?yàn)?，?dāng)在
伸長(zhǎng)區(qū)域的成熟組織時(shí)，其變得明顯不易受感染影響(English and Mitchell, P/^o/ W/io/ogy, 78:1478-1483, 1988)。
"融合噬菌體"是絲狀的細(xì)菌噬菌體載體，其中，外來(lái)肽和蛋白被 克隆到噬菌體外殼基因中并作為部分噬菌體外殼蛋白而被展現(xiàn)。常用 的產(chǎn)生融合噬菌體的外殼基因?yàn)閜VIII基因和pIII基因。約3900拷貝
的pvm組成管狀病毒體蛋白質(zhì)外殼的主要部分。各pvni外殼蛋白與
病毒體長(zhǎng)軸成低角度，其C-端埋在靠近DNA的內(nèi)部而其N(xiāo)-端暴露于 外部環(huán)境。pIII外殼蛋白的5個(gè)拷貝位于每一病毒體的末端并且參與 將噬菌體附到大腸桿菌的pIII上以及在感染和復(fù)制之后對(duì)病毒的重新
組裝。作為部分pvm展示的肽被限制于其在病毒體外殼上展示的基 質(zhì)中。相反，由于pin.蛋白的末端位置，作為部分pin展示的肽更具
有柔韌性性。特定噬菌體可構(gòu)建為展示為6至15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽。
將隨機(jī)的或簡(jiǎn)并寡核苷酸插入外殼蛋白基因使之能夠產(chǎn)生展示隨機(jī)肽
庫(kù)的噬菌體。典型的展示庫(kù)包含多如108個(gè)隨機(jī)序列肽的10至100個(gè)
拷貝。因此，噬菌體展示對(duì)篩選具有所需結(jié)合特征的稀有肽是有幫助 的。
噬菌體展示的隨機(jī)肽庫(kù)已用于分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞上的細(xì)胞表面受 體的配體。例如，已從噬菌體展示庫(kù)將肽分離出來(lái)，該噬菌體展示庫(kù) 與跨膜整合素糖蛋白結(jié)合并涉及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作
用(O'Neil et al, Pra&z7w, 14:509-515, 1992; Smith et al.， 《/5zW C7^m,， 269:32788- 32795, 1994; Healy et al.， 5zoc/^附z^o;， 34:3948-3955， 1995)。噬菌體展示的肽特異地阻斷細(xì)胞與定義的細(xì)胞外分子及其它細(xì) 胞的粘附(Koivunen et al" ■/編CA亂，268:20205-20210， 1993;Koivunen et al.， / Ce〃所o/， 124:373-380， 1994; Healy et al.， 5z'o由mz'欲j;, 34:3948-3955, 1995; Pasqualini et al" 7V齒re Wo化cA., 15: 542-547， 1997)。噬菌體展示的隨機(jī)肽庫(kù)也已^皮用于選擇區(qū)分腦組織和 腎組織的肽(Pasqualini and Ruoslahti, A^wre， 380:364-366， 1996)。在體 內(nèi)，噬菌體展示的隨機(jī)肽的親和力選擇性也已被用于選擇與特異腫瘤 組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇性結(jié)合的肽(Pasqualini et al.， AA^ww所o"c/l， 15: 542-547, 1997)。當(dāng)這些肽與抗癌藥融合并凈皮注射到荷瘤小鼠時(shí)， 這些肽成功地將藥物靶向腫瘤血管并阻止進(jìn)展期的腫瘤發(fā)育(Arap et al., S"置e， 279:377-380， 1998)。
噬菌體展示方法僅在有限的情況下應(yīng)用于植物病原體。噬菌體展 示方法幾乎已專(zhuān)用于鑒別植物病毒診斷的抗體(Susi et al., 尸一，,/jo/ogy, 88:230-233, 199& Ziegler et al.,尸一o; ^o/ogy, 88:1302-1305， 1998; Griep et al.， J Plant Pathol., 105:147-156 1999; Toth et al., P/^o/ fl"o/ogy, 89:1015-1021, 1999)。噬菌體展示用于選擇在病 疫疫霉(P/^o; /^ora Zw/es^^)的幼體和孢子上與表面暴露的抗原表位 有親合性的抗體的單 一 情況(Gough et al.，丄/附w頭o/. M&Ao&， 228:97-108, 1999)。對(duì)分離的噬菌體展示的、單鏈可變區(qū)片段(Fv)的 抗體片段未進(jìn)行評(píng)價(jià)，因?yàn)槠淇赡苡绊戞咦踊蛴左w行為。對(duì)抗體對(duì)于 孢子嚢的抗真菌活性進(jìn)行測(cè)試，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其可檢測(cè)到的抗真菌活 性。
豆薯層銹菌(尸/^&o/wora ; ac/z,/^/)是產(chǎn)生大豆(4魯豆，Gfyc/wes max)銹病的真菌。該病原體已從亞洲傳播到世界上所有其它大豆生產(chǎn) 區(qū)域。在2004年秋季期間，豆薯層銹菌到達(dá)美國(guó)。目前，在任何大豆 品種中都沒(méi)有已知的持久抗性。疣頂單胞銹菌(C/ram_yc&s a/ ; ew&cM/齒s)是在豆類(lèi)(菜豆，尸Aeaseo/ws vw/gan、)上產(chǎn)生銹病的真 菌。育種家正努力識(shí)別大豆中可控制為銹病抗性的基因。由于在巴西 已報(bào)導(dǎo)出現(xiàn)了豆薯層銹菌，產(chǎn)生大豆銹病的真菌，美國(guó)大豆生產(chǎn)者已 預(yù)料到它的到來(lái)。在去年秋天到達(dá)美國(guó)的豆薯層銹菌終結(jié)了這種預(yù)料， 并且，目前農(nóng)場(chǎng)主必須對(duì)這種新疾病可能每年出現(xiàn)的情況作出反應(yīng)。 農(nóng)場(chǎng)主的擔(dān)心是基于在沒(méi)有成功實(shí)施控制措施時(shí)，世界上其它區(qū)域10%至80%的損失的報(bào)導(dǎo)。
因?yàn)樵跍y(cè)試了超過(guò)18,000個(gè)美國(guó)大豆品種后還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)銹病持 久的、天然的抗性，大豆生產(chǎn)者已經(jīng)在擔(dān)心了，并且，病原體，豆薯 層銹菌，可能潛在地感染產(chǎn)出的任何栽培種。在對(duì)銹病病原體到來(lái)的 預(yù)期中，已進(jìn)行了大量的研究以確定有效的殺真菌劑，并且已獲得了 用于大豆的緊急政府許可。傳統(tǒng)的篩選和育種方法已#皮確定對(duì)上述病 原體沒(méi)有主要的抗性基因，并且尤其是疣頂單胞銹菌(t/. ap; e"c^cM/ato )和豆薯層銹菌的情況。
抗真菌劑將可能是多年的防衛(wèi)前線(xiàn)，直到新的抗性基因或其它形 式的抗性被確定之前。
傳統(tǒng)上，抗真菌劑還沒(méi)有用在大部分的大豆生產(chǎn)。因此，關(guān)于此 疾病管理實(shí)踐的成本及其可能的經(jīng)濟(jì)活力只有有限的信息。在密蘇里 州及其它州，這些問(wèn)題已導(dǎo)致對(duì)于可將大豆替換為備選農(nóng)作物的面積 不確定的估計(jì)。
為了保護(hù)大豆農(nóng)場(chǎng)主以及保證產(chǎn)品滿(mǎn)足國(guó)家的需要，必須盡快開(kāi) 發(fā)出替代的抗真菌劑。本公開(kāi)提出了基于生物技術(shù)的新型銹病抗性。 該技術(shù)包括轉(zhuǎn)基因植物中防御肽的開(kāi)發(fā)和部署，例如大豆。該技術(shù)同 .樣影響了重要領(lǐng)域豆類(lèi)(菜豆)銹病病原體，.疣頂單胞銹菌。
作為誘導(dǎo)銹病的真菌，疣頂單胞銹菌和豆薯層銹菌屬于擔(dān)子菌 (Basidiomycetes )綱中的銹菌(Uredinales)目。疣頂單胞銹菌在單一宿 主植物上產(chǎn)生5個(gè)孢子階段。豆薯層銹菌主要通過(guò)單一宿主植物上的 夏孢子(uredospores)而復(fù)制。夏孢子負(fù)責(zé)快速傳播真菌。除了大豆，豆 薯層銹菌可感染許多豆類(lèi)。
疣頂單胞銹菌的夏孢子通過(guò)葉子的氣孔口穿透。豆薯層銹菌的不 同之處在于發(fā)芽的夏孢子直接通過(guò)葉子表皮細(xì)胞層穿透。通常，落在 葉子表面的夏孢子發(fā)芽以產(chǎn)生附著在表面的感染墊(附著胞)。在這兩 種類(lèi)型中，附著胞都產(chǎn)生穿透植物的菌絲突。穿入后，各真菌發(fā)育成 通過(guò)葉組織在細(xì)胞間生長(zhǎng)的線(xiàn)狀結(jié)構(gòu)(菌絲)。菌絲在不殺死宿主細(xì)胞 的情況下進(jìn)入宿主細(xì)胞。在那里，它們形成球形結(jié)構(gòu)(吸器)，從活著 的葉細(xì)胞中吸取營(yíng)養(yǎng)。感染后不久，各真菌形成產(chǎn)生額外孢子的夏孢子堆。
組合的噬菌體展示庫(kù)提供大量的隨機(jī)肽陣列，并由其選擇針對(duì)感
興趣的蛋白質(zhì)的配體(O'Neiletal., 1992)。噬菌體展示肽庫(kù)是絲狀噬菌 體克隆的混合物，其每一個(gè)在病毒體表面上展示單一外來(lái)肽序列 (Cwirla, 1990; Scott and Smith, 1990)。展示的肽與該噬菌體基因組中的 其編碼DNA物理連接。因此，肽可容易地且快速地被鑒別并被轉(zhuǎn)移 至其它載體系統(tǒng)或展示系統(tǒng)。典型的庫(kù)包含109種隨機(jī)肽變體。
隨機(jī)肽庫(kù)可用于分離對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面分子重要的配 體。例如，通過(guò)針對(duì)純化的分子進(jìn)行生物淘洗，與跨膜醣蛋白，整合 素，有親和力的肽已被從庫(kù)中分離出(O.Neil et al., 1992; Smith et al., 1994;Healyeta1.， 1995)。有些肽^皮發(fā)現(xiàn)阻斷細(xì)胞與定義的細(xì)胞外分子 及其它細(xì)胞的粘附。肽的結(jié)合與抑制的有效性對(duì)肽序列基序是特異的 (Koi雨en et al" 1993; Koivunen et al" 1994; Healy et al" 1995; Pasqualini et al.， 1995),并且選擇的有效性對(duì)特定器官組織是特異的 (Pasqualini and Ruoslahti， 1996)。
因此，需要篩選與植物病原體特異結(jié)合的肽的快速且有效的方法。 一旦鑒別出，肽可進(jìn)一步被評(píng)價(jià)其預(yù)防病原體感染植物的能力，并且， 合適的肽可直接用于植物、用于處理土壤，或者，任選地，可將編碼 肽的序列引入植物中以使植物對(duì)病原體具有免疫性或抗性。在此情況 下，可開(kāi)發(fā)出控制植物病原體的經(jīng)濟(jì)的并且對(duì)環(huán)境安全有效的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)f
本領(lǐng)域技術(shù)。 一方面，使大豆對(duì)目前沒(méi)有持久抗性的大豆銹病有抗性。 在另 一 實(shí)例中，相同的常用技術(shù)可提供對(duì)常見(jiàn)銹病有抗性的菜豆。
在一實(shí)例中，鑒別對(duì)植物病原體的表面具有親和力的肽的方法。 在此方法中，通過(guò)提供編碼肽的簡(jiǎn)并寡核苷酸構(gòu)建了包含隨機(jī)肽的庫(kù)。 將該寡核苷酸插入到合適的載體中，所述載體在其表面表達(dá)編碼的肽 并能夠轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞用載體轉(zhuǎn)染而擴(kuò)增感染形式的栽體以 在載體上產(chǎn)生肽庫(kù)。然后將表達(dá)肽庫(kù)的載體與靶病原體接觸并使其與病原體結(jié)合。除去未結(jié)合的載體并洗脫與病原體結(jié)合的載體。然后將 洗脫的載體在合適的宿主細(xì)胞中擴(kuò)增并分離插入的寡核苦酸。然后通 過(guò)任何合適的方法對(duì)該寡核苷酸測(cè)序，并且，從該寡核苷酸序列推導(dǎo) 出該肽的氨基酸序列。
本公開(kāi)的手段的 一方面涉及作為新型的大豆及豆類(lèi)抗性因子的肽 及其選擇的方法。在無(wú)需知道病原體中特定致病性目標(biāo)的情況下，肽 可被方便地鑒別和選擇。由于事實(shí)上這些肽不是必須存在于天然大豆 或豆類(lèi)中，病原體之前沒(méi)有暴露其中。因此，用于大豆和豆類(lèi)的肽的 有效性可擴(kuò)展至各種病原體種群，且其效力很可能是耐久的。
噬菌體展示肽選擇的傳統(tǒng)方法是基于針對(duì)特異感興趣的純化分子
的庫(kù)的淘洗，如Barbas et al.， 2001所述的實(shí)例。本方法學(xué)與先前4支術(shù) 的不同之處在于針對(duì)全細(xì)胞的庫(kù)篩選無(wú)需預(yù)先知道特定靶標(biāo)或高濃度 的純化靶分子。
在所述的一個(gè)方面中，當(dāng)作為腳手架蛋白的一部分展示時(shí)，稱(chēng)為 肽的小分子可在轉(zhuǎn)化的植物中提供銹病抗性。在一實(shí)例中，可根據(jù)在 此公開(kāi)的手段，通過(guò)對(duì)疣頂單胞銹菌和豆薯層銹菌的幼體(即發(fā)芽的孢 子)的傳染性結(jié)構(gòu)的結(jié)合親和力來(lái)選擇這些肽。此結(jié)合親和力可抑制孢 子的進(jìn)一步發(fā)育和致病。因此，肽表現(xiàn)為抑制這些真菌的致病。在具 體的實(shí)例中，細(xì)胞分裂素氧化酶可被修飾作為展示植物中所選肽的腳 手架蛋白。
經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，病原體種群能夠適應(yīng)所選的賦予抗性的肽的存在。 然而，如果肽的選擇和篩選很方便，可快速選擇新的防御肽以應(yīng)對(duì)改 變病原體種群的挑戰(zhàn)。本公開(kāi)手段的具體優(yōu)勢(shì)包括肽選擇方法和表型 評(píng)價(jià)的快速和簡(jiǎn)單，肽的選擇無(wú)須知道病原體中的致病性靶標(biāo)，有效 肽的高百分率的回收，快速鑒別所需新防御肽的能力，將腳手架肽用 于易感植物組織的能力以及快速修飾所需腳手架肽構(gòu)建體的能力。
另一方面提供了抗真菌組合物，該組合物包含至少一種肽，其選 自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
另一方面是重組核苷酸，其包含編碼肽的序列，所述肽選自 ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
另一方面是重組載體，其包含編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自 ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
還有一方面是用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述載體包含編碼肽的核苷酸 序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24) 、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
在另一方面提供了表達(dá)盒，其包含作為可操作地連接的組分，啟 動(dòng)子；編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31) 、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及 AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4);以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列。
另外的方面提供包含表達(dá)盒的重組體植物，該表達(dá)合包含啟動(dòng)子； 編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、
13ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31) 、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及 AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4);以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列。
該方法包括提供隨機(jī)肽庫(kù)，該肽庫(kù)通過(guò)提供編碼肽的簡(jiǎn)并寡核苷酸
而制成的；將寡核苷酸插入到合適的載體中，所述載體在其表面表達(dá) 所述肽并轉(zhuǎn)染使宿主細(xì)胞；以及用載體轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞而擴(kuò)增感 染形式的載體以在載體上產(chǎn)生肽庫(kù)。
然后將表達(dá)肽庫(kù)的載體與感興趣的植物病原體接觸并使其與該病 原體結(jié)合。結(jié)合后，除去未結(jié)合的載體并將結(jié)合的載體從該病原體洗 脫。將洗脫的載體在合適的宿主細(xì)胞中擴(kuò)增并分離在洗脫的載體中插 入的所述寡核香酸。然后，由該寡核苦酸編碼的肽被制備出，與感興 趣的植物病原體接觸，并被觀(guān)察對(duì)傳染性的影響。在一實(shí)施方案中， 對(duì)該分離的寡核苷酸測(cè)序，從所述核苷酸序列推導(dǎo)出所述肽的氨基酸 序列，并且所述肽通過(guò)化學(xué)合成制備。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)將分 離的寡核苷酸插入用于轉(zhuǎn)化合適宿主細(xì)胞的表達(dá)載體而制備肽。然后 將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞保持在適于肽的表達(dá)的條件下。
為了回收與不確定的表面蛋白的種群相結(jié)合的肽，還針對(duì)全細(xì)胞 篩選了組合庫(kù)。可對(duì)感興趣的表型評(píng)價(jià)通過(guò)這種篩選回收的肽。例如， 我們選擇了與霉菌植物病原體(疫霉)的能動(dòng)的游動(dòng)孢子有親和力的 肽。表型篩選產(chǎn)生了通過(guò)誘導(dǎo)未成熟的包嚢來(lái)破壞孢子正常發(fā)育的肽 的子集(Bishop-Hurleyetal., 2002)。我們還表明了，當(dāng)展示為噬菌體展 示形式或當(dāng)作為自由分子而合成時(shí)，親和力選擇的肽破壞游動(dòng)孢子發(fā) 育(Laskey et al.， 2001; Bishop-Hurley et al.， 2002)。
附圖筒要說(shuō)明
這些以及其它特征、方面和優(yōu)勢(shì)通過(guò)以下說(shuō)明、所附的權(quán)利要求 及附圖將變得更容易理解。其中
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圖1顯示分為6個(gè)家族的f8肽序列的組成。左邊為樹(shù)狀圖，右邊 為肽的名稱(chēng)和序列。
圖2顯示辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子響應(yīng)與給定不同濃度的所述f8噬菌 體展示肽接觸的成嚢作用。百分比值表示兩個(gè)試驗(yàn)的平均值。不包含 噬菌體的對(duì)照游動(dòng)孢子種群的成嚢百分比在0至10%之間變化。
圖3顯示辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子響應(yīng)與給定不同濃度的所述f8及 f88-4噬菌體展示肽接觸的成嚢作用。
圖4顯示所述噬菌體展示肽與辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子的結(jié)合。數(shù)值 表示3個(gè)試驗(yàn)的平均值。
圖5顯示所述噬菌體展示肽與辣椒疫霉菌結(jié)合的特異性。數(shù)值表示 3個(gè)試驗(yàn)的平均值。
圖6是質(zhì)粒pJE-7的圖譜。AOX-P是乙醇氧化酶啟動(dòng)子，Mat-a 是mat-a的分泌序列，CKX1是細(xì)胞分裂素氧化酶1序列，Pc87是示例 的肽，以及AOX-TT是乙醇氧化酶終止序列。圖下面是為編碼Pc87的、 顯示(+)鏈(5' AG CTA GCA GAT AGA CCA TCA ATG TCA CCA ACA TAG T 3'， SEQ ID NO: 46)和(-)鏈(5' CT AGA CTA TGT TGG TGA CAT TGA TGG TCT ATC TGC T 3'， SEQ ID NO: 47)的雙鏈序列。
圖7顯示包含于pJE-7中的示例插入物的^^酸序列(SEQ ID NO: 48),其中，加下劃線(xiàn)的核苷酸是mat-a分泌序歹'J(由Kex2酶的斷裂出現(xiàn) 在最后加下劃線(xiàn)的精胺酸)，接著是細(xì)胞分裂素氧化酶l序列。將兩個(gè)加 雙下劃線(xiàn)的氨基酸(KL)加入以輔助構(gòu)建融合蛋白質(zhì)。示例的肽Pc87的氨 基酸序列用黑體字顯示。
圖8是顯示鑒別植物防御肽的一種方法的方法流程圖，所述肽可用 于轉(zhuǎn)化植物以及對(duì)銹病病原體賦予抗性。
圖9顯示轉(zhuǎn)化的根部頂端區(qū)域附近的游動(dòng)孢子的成嚢作用(左)和在 野生型根尖附近的正常游動(dòng)孢子的成嚢作用模式(右)，該轉(zhuǎn)化的根部分泌 展示親和力選擇的肽的細(xì)胞分裂素氧化酶(CKX)。
圖IO顯示親和力選擇的噬菌體肽克隆19對(duì)疣頂單胞銹菌幼體生長(zhǎng) 的抑制作用(左)，以及在非選擇的噬菌體庫(kù)存在下正常的夏孢子發(fā)芽和生 長(zhǎng)(右)。定義
"分泌序列"是指指引新合成的分泌蛋白或膜蛋白至并且經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)的細(xì)胞膜、或經(jīng)細(xì)菌內(nèi)膜從細(xì)胞質(zhì)至周質(zhì)、或從線(xiàn)粒體基質(zhì)至內(nèi)部 空間、或從葉綠體子座至類(lèi)嚢體的序列。此序列融合至異源宿主中表 達(dá)的基因保證了重組體蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞的分泌。
"幼體"是指具有自然發(fā)生的芽管的新發(fā)芽的包嚢(發(fā)芽后5-8小
時(shí))
"TBS，，是指Tris緩沖鹽水(50 mM Tris-HCl (三羥曱基氨基甲烷鹽酸 鹽)，pH7.5, 150mMNaCl)。
"重組多核苷酸"是指多核苷酸，其不含一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)將天然發(fā) 生的有機(jī)體基因組中多核芬酸側(cè)翼連接的核普酸序列，所述多核苷酸 是衍生自所述有機(jī)體基因組。此術(shù)語(yǔ)包括，例如，并入載體或表達(dá)盒、 自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽⒃松锘蛘婧松锏幕蚪M的DNA的多 核苷酸及其片段，或作為獨(dú)立于其它多核苷酸的單個(gè)分子存在的多核 苷酸及其片段。其還包括作為雜交多核苷酸的一部分的重組多核苷酸， 例如，編碼多肽序列的重組多核苷酸。
"IPTG"是異丙基硫代半乳糖苷。 -
"TU"是指轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。
"NAP緩沖液"是80 mM NaCl、 50 mM NH4H2P04，并用NH4OH調(diào) 節(jié)pH為7.0。
"NZY-Tc"是包含1% NZ胺A(typtone型培養(yǎng)液；Humko-Sheffield Chemical, Norwich, N.Y.)、 0.5%酵母提取物、0.5% NaCl、用NaOH調(diào) 節(jié)pH為7.0的細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)液。
"PCR"是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
此處用到的"多核苦酸"和"寡核普酸"可互換使用并且指的是任意 長(zhǎng)度的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，聚合的(2個(gè)或多個(gè)單 體)形式。雖然核苦酸通常通過(guò)磷酸二酯鍵結(jié)合，所述術(shù)語(yǔ)也包括含有 由氨基乙基甘氨酸單元組成的中性酰胺骨架鍵的多聚核苷酸。所述術(shù)語(yǔ) 僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA。其還包括已知類(lèi)型的修飾，例如，標(biāo)記，曱基化，"帽子"，用類(lèi)似物取 代一個(gè)或多個(gè)天然發(fā)生的核苦酸，核苷酸間修飾，例如，具有不帶電荷 的鍵的修飾(例如，曱基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)， 包含懸掛部分的修飾，如蛋白質(zhì)(包括，例如，核酸酶、毒素、抗體、信
號(hào)肽、聚-L-賴(lài)氨酸等)，具有嵌入劑的修飾(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，含 有螯合劑的修飾(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)，含有烷 化劑的修飾，具有修飾鍵的修飾(例如，a異頭核酸等)，以及多核苷酸未 修飾的形式。多核苷酸既包括有義鏈又包括反義鏈。
"序列"是指單體在聚合物中出現(xiàn)的線(xiàn)性次序，例如，M酸在多肽 中的次序或核苷酸在多核苷酸中的次序。
"肽"、"蛋白質(zhì)"和"多肽"可互換使用并且是指由兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)肽4建 方式連接的氨基酸組成化合物。
"重組體蛋白質(zhì)"是指，不管包含天然的還是變異的一級(jí)氨基酸序列， 通過(guò)表達(dá)細(xì)胞中重組體DNA分子攜帶的基因而獲得的蛋白質(zhì)，該細(xì)胞不 同于基因和/或蛋白質(zhì)被天然發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。換句話(huà)說(shuō)，所述基因與其表達(dá) 的宿主是異源的。應(yīng)理解，基因的任何改變，包括添加編碼親和力純化 片段的多核苷酸，基于此定義的目的使該基因成為非天然，因此，該基 因不能在任何細(xì)胞中"天然地"發(fā)現(xiàn)。 .
"非免疫球蛋白肽"是指不是免疫球蛋白的肽、公認(rèn)的免疫球蛋白區(qū) 域、或包含免疫球蛋白的區(qū)域。例如，免疫球蛋白的單鏈可變區(qū)被排除 在此定義之外。
"基本純的"或"基本純化的"是指物質(zhì)不含其它污染的蛋白質(zhì)、核酸及 其它源自有機(jī)體來(lái)源的生物材料。純度可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，并且常見(jiàn) 為至少約40%純、更常見(jiàn)為至少約50%純、通常為至少約60%純、更通 常為至少約70%純、經(jīng)常為至少約75%純、更經(jīng)常為至少約80%純、典 型地為至少約85%純，更典型地為至少約90%純、優(yōu)選為至少約95%純、 更優(yōu)選為約98%純，且在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中為至少99%純。分析可 為重量或摩爾百分比，通過(guò)例如凝膠染色法、分光光度法或末端標(biāo)記法 等評(píng)價(jià)。發(fā)明詳述
以下提供了詳細(xì)的描述以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明方法。 雖然如此，此詳細(xì)描述不應(yīng)理解為過(guò)度限制本發(fā)明，因?yàn)樵诓黄x本 發(fā)明性的發(fā)現(xiàn)的精神和范疇的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在此討 論的實(shí)施方案中做出修改和改變。
所有在本申請(qǐng)中引用的刊物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、數(shù)據(jù)庫(kù)和其它參 考都在此以參考的方式全部引入，如同各單獨(dú)的刊物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申 請(qǐng)、數(shù)據(jù)庫(kù)和其它參考被特定地且單獨(dú)地表示為通過(guò)參考而引入。
大豆生產(chǎn)者越來(lái)越多的關(guān)注豆薯層銹菌，大豆銹病的起因，在不 久的將來(lái)將進(jìn)入北美的生產(chǎn)區(qū)域并傳播。此關(guān)注起因于在世界上某些
區(qū)域超過(guò)50%的農(nóng)作物損失的估計(jì)。對(duì)于此病的關(guān)注隨著最近在北蟀 5度以上的巴西發(fā)現(xiàn)的銹病真菌而增多。很可能在不久的將來(lái)，豆薯 層銹菌的孢子將通過(guò)盛行的北風(fēng)被帶入美國(guó)(Rizvi， 2004)。因?yàn)闆](méi)有已知 的對(duì)銹病有效的疾病抗性基因，目前的疾病管理計(jì)劃依賴(lài)重復(fù)的保護(hù)殺 菌劑的應(yīng)用。以下的本公開(kāi)提供了另外的選擇，使用新的肽技術(shù)鑒別 和遞送與豆薯層銹菌和相關(guān)銹病病原體的傳染性結(jié)構(gòu)結(jié)合的防御肽以 停止銹病發(fā)展。防御肽可設(shè)計(jì)為在植物中表達(dá)并被遞送至病原體感染 和群集的部位。植物體，例如大豆.和蠶豆，可被設(shè)計(jì)為表達(dá)這些肽以產(chǎn) 生對(duì)銹病具有獨(dú)特抗性的植4朱系。
因此，開(kāi)發(fā)的方案鑒別與傳染性的豆薯層銹菌孢子和幼體結(jié)合的 肽，評(píng)價(jià)結(jié)合的肽抑制孢子發(fā)芽和真菌生長(zhǎng)的有效性，引入并測(cè)試植物 中候選防御肽的抗性潛力。
銹病病原體產(chǎn)生孢子(夏孢子)，感染大豆的葉、莖和籽皮。這些 孢子被風(fēng)吹動(dòng)并落在植物上，它們?cè)谠撝参锷习l(fā)芽以產(chǎn)生穿透植物組 織的芽管(定義為幼體階段)。穿透之后，真菌通過(guò)產(chǎn)生經(jīng)組織在細(xì)胞 間和細(xì)胞內(nèi)蔓延的絲狀生長(zhǎng)而進(jìn)一步發(fā)育(Bonde等，1976; Koch和 Hoppe, 1988)。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，組織群集導(dǎo)致另外傳染性孢子的產(chǎn)生， 這些孢子在風(fēng)中釋放并移動(dòng)到其它植物。
雖然假想了一些對(duì)大豆銹病的抗性基因，但大部分已經(jīng)在野外條 件下或溫室接種試驗(yàn)中失敗了。 一旦病原體到達(dá)新的地理區(qū)域，培育者面臨事實(shí)上在市售大豆品種或育成品系中沒(méi)有可用的完全的銹病抗 性的情況。對(duì)于可預(yù)知的未來(lái)，培育者將需要在每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)期間周 期性地施用殺菌劑。
基因結(jié)合至市售大豆品系中預(yù)期需要很多年。以下的公開(kāi)有利地加快 了這個(gè)過(guò)程。其可能性是從目前的肽技術(shù)、植物轉(zhuǎn)化技術(shù)和分子生物 學(xué)的發(fā)展得到的，將這些技術(shù)組合用于本文公開(kāi)的發(fā)展。組合的肽技 術(shù)能夠?qū)Υ罅康?、多種多樣的肽集合篩選出與植物病原體的傳染性結(jié)構(gòu) 結(jié)合并在植物感染前或感染期間破壞其發(fā)育的肽。分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn) 化的工具能夠構(gòu)建在植物的感染部位表達(dá)這些防御肽的遞送系統(tǒng)。
防御肽可定義為與植物和動(dòng)物病原體的傳染性結(jié)構(gòu)，例如孢子， 相結(jié)合來(lái)破壞該病原體正常發(fā)育的肽。結(jié)合并破壞或阻止病原體功能 的肽是通過(guò)結(jié)合對(duì)調(diào)節(jié)發(fā)育很重要的病原體表面蛋白而得到此效果 的。選作此用途的表面蛋白可以是，例如，細(xì)胞壁形成和才直物生長(zhǎng)所 需的酶，或可能地，控制對(duì)生長(zhǎng)必不可少的礦物的攝取的蛋白質(zhì)。在 此公開(kāi)的方法，示例性地說(shuō)明，可有效篩選針對(duì)包含十億或更多隨機(jī) 肽組合的多種肽集合的病原體。所述技術(shù)特別應(yīng)用于擊敗豆薯層銹菌 及相關(guān)病原體。 . .
通過(guò)以下實(shí)例的方式將表明如何鑒別與傳染性豆薯層銹菌孢子和 幼體以及相關(guān)的或類(lèi)似的病原體的孢子相結(jié)合的肽。產(chǎn)生肽的集合并確 認(rèn)與病原體的傳染性孢子或芽管(幼體)相結(jié)合。為了鑒別結(jié)合的肽，將孢 子或幼體與隨機(jī)肽的集合，通常稱(chēng)為庫(kù)，相混合，該隨機(jī)肽在細(xì)菌噬菌
體(病毒)顆粒上展示，例如，如Wilson等，1998所述。通過(guò)此方法，示例 性說(shuō)明，孢子和幼體可暴露于十億隨機(jī)肽中。廣泛的很多種適合的肽庫(kù) 是本領(lǐng)域公知的。在某些庫(kù)中，肽僅包含8個(gè)氨基酸，而在其它庫(kù)中， 每個(gè)肽包含15個(gè)氨基酸。
在混合與適當(dāng)培養(yǎng)的暴露之后，洗滌可除去所有與孢子和幼體粘 合不牢固的肽。可處理所述孢子和幼體以釋放附著的肽，增加其數(shù)量， 并重復(fù)篩選過(guò)程。在幾個(gè)反復(fù)的篩選步驟后，其中，每個(gè)步驟確定了 前一步驟中結(jié)合肽的結(jié)合親和力，回收確定為與蛋白質(zhì)及孢子與芽管表面的其它組分粘合非常牢固的很多種肽。在一個(gè)實(shí)例中，3個(gè)或4 個(gè)連續(xù)篩選步驟是足夠提供此結(jié)果的。
只要肽的結(jié)合親和力如上述方法確定，就可以評(píng)價(jià)結(jié)合肽抑制孢 子發(fā)芽和真菌生長(zhǎng)的有效性。 一旦很多肽被鑒別出來(lái)，就可以選擇對(duì) 病原體功能有影響的肽。尤其感興趣的是阻止孢子發(fā)芽和幼體生長(zhǎng)的 肽。這兩種破壞性行為的任一種都將導(dǎo)致阻止或減少的病原體感染和 疾病。高通量測(cè)定可用于檢測(cè)在疫霉、豆薯層銹菌或類(lèi)似病原體中阻止 或減慢孢子發(fā)芽或植物生長(zhǎng)的能力的大量的肽。經(jīng)驗(yàn)表明很大比例的測(cè) 試的肽可能對(duì)病原體發(fā)育有影響。
一旦鑒別出防御肽，在不被植物的酶降解的情況下將其遞送至植 物內(nèi)的感染處。獲得此遞送的一種方法是將所述肽附在由植物天然產(chǎn) 生的并且在被病原體群集的組織中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)例中， 細(xì)胞分裂素氧化酶已被成功用于此目的。此蛋白質(zhì)是由植物天然產(chǎn)生 的，且其參與植物生長(zhǎng)激素(細(xì)胞分裂素)的調(diào)節(jié)。防御肽可附于此蛋 白質(zhì)上，并且用于改變病原體功能。在一個(gè)實(shí)例中，這已在疫霉中實(shí) 現(xiàn)。
防御肽可與由細(xì)胞天然分泌于細(xì)胞間隙的細(xì)胞分裂素氧化酶及其 它蛋白質(zhì)融合，其中它們能夠與群集的銹病病原體接.觸?；蛘撸巳?合可包括屬于植物細(xì)胞壁組分的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)也被置于細(xì)胞間 和細(xì)胞內(nèi)與病原體互相作用的位置。市售的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)為可用作 CKX替代物的候選肽載體蛋白質(zhì)提供多種多樣的基因序列?？墒褂糜?于防御肽的最佳表現(xiàn)或展示的常規(guī)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組算法分析這些載體蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
候選的蛋白質(zhì)-肽構(gòu)建體可首先在酵母、畢赤酵母中表達(dá)和分泌。 此宿主促進(jìn)濃縮或純化蛋白質(zhì)或多肽，以及測(cè)試它們對(duì)病原體孢子發(fā)芽 或幼體生長(zhǎng)的抑制作用。
只要確定了最好的防御肽以及在載體蛋白質(zhì)上展示的最好的模式 就可確定地在植物，如大豆或蠶豆中，形成遺傳構(gòu)建體。外源基因的 植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
特別惡性的和危險(xiǎn)的病原體，如豆薯層銹菌，是被政府規(guī)章限制的。通過(guò)利用最初的肽選擇方案而釆用銹病病原體的替代物或類(lèi)似物可避免
此危險(xiǎn)以;SJ見(jiàn)章的復(fù)雜性。Hollier和King, 1985已凈艮導(dǎo)了導(dǎo)致南方玉米 銹病的真菌病原體，多堆柄銹菌(A/cc/"/a ;w/"ora)。此病原體沒(méi)有限制 容易獲得，并且可在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)室條件下操作。
在一實(shí)施方案中，通過(guò)將編碼6至15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽的核酸序 列插入到合適的載體中而構(gòu)建肽庫(kù)，盡管可使用為更長(zhǎng)的編碼肽的序 列。被核苷酸編碼的肽事實(shí)上可以是完全隨機(jī)的或者可以限制其組成 以滿(mǎn)足結(jié)構(gòu)上或功能上的需要。例如，而不是限制，半胱氨酸橋可插 入肽中。在一實(shí)施方案中，核酸序列不編碼免疫球蛋白(抗體)或公認(rèn) 的免疫球蛋白區(qū)，如可變區(qū)。可使用表達(dá)插入的寡核苷酸的任一載體。 優(yōu)選使用導(dǎo)致在細(xì)胞或病毒表面的、或在細(xì)胞或病毒的細(xì)胞內(nèi)隔室或 細(xì)胞器表面表達(dá)肽庫(kù)的載體。在此情況下，表達(dá)的肽可用于與潛在的 靶分子或細(xì)胞相互作用，所述分子或細(xì)胞與包含所述肽的表面相接觸。 正如對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，如果肽在細(xì)胞內(nèi)隔室或細(xì)胞 器的表面表達(dá)，所述潛在的靶標(biāo)也必須存在于細(xì)胞內(nèi)，或者細(xì)胞器或 細(xì)胞內(nèi)隔室，必須通過(guò)諸如細(xì)胞的溶解暴露于外部環(huán)境。
產(chǎn)生寡核苷酸并將其插入載體的方法對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公 知的，并僅在此簡(jiǎn)單回顧。最普通地，使用Beaucage和Caruthers的亞 磷酸三酯方法在固相支持物上合成寡核香酸(r"raAMraw丄e仏 22:1859-1862, 1981;同時(shí)參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,973,679和4，458，066)。大量 的固相支持物可用，包括可控孔玻璃珠、聚苯乙烯共聚物、硅膠和纖維 素紙。寡核苦酸的制備開(kāi)始于第一個(gè)核苷酸的3'-羥基基團(tuán)與固相支持物 的鍵合。包含核苷酸的固相支持物是從商業(yè)來(lái)源可得的。寡核苷酸是從 3'位至5'位合成的，并且，鏈通過(guò)在可溶的5'-保護(hù)結(jié)構(gòu)單元的、活化的 3'磷酸酯或亞磷酰胺上固定的寡核苷酸的5'-羥基的親核攻擊而延長(zhǎng)。形 成的中間體二核香亞磷酸酯必須在鏈延長(zhǎng)之前緊接著被氧化為更穩(wěn)定的 磷酸酯。重復(fù)此過(guò)程直到已加入了所需數(shù)量的核苷酸。有市售的自動(dòng)化 設(shè)備來(lái)合成寡核苷酸。此外，很多商戶(hù)提供定制寡核苷酸合成服務(wù)。
任何能夠表達(dá)肽庫(kù)中的肽的載體系統(tǒng)均可用在此處的實(shí)踐中，并且 很多載體系統(tǒng)在本領(lǐng)域是公知的(參見(jiàn)，例如Wilson and Findlay， Om. /Mz'cra&o/, 44:313-329, 1998)。當(dāng)肽作為部分pVIII展示時(shí)，適合的噬菌體 系統(tǒng)包括8型、88型和8+8型。當(dāng)使用pVIII時(shí)，適合的噬菌體系統(tǒng)包 括3型、33型和3+3型。當(dāng)肽^^皮插入pVI中時(shí)，適合的噬菌體系統(tǒng)包括 6型、66型和6+6型。此外，可使用噬菌體T7和噬菌體T8載體系統(tǒng)。 在一優(yōu)選實(shí)施方案中，文庫(kù)中的肽表達(dá)為與絲狀細(xì)菌噬菌體的外殼蛋白 融合，以便所述肽在病毒體表面表達(dá)并可與靶分子或細(xì)胞表面受體相互 作用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了 f8-l文庫(kù)，其中，隨機(jī)8-mer肽與 pVin的外殼蛋白融合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，使用f88-4文庫(kù)，其中， 隨機(jī)15-mer肽與pVIII的外殼蛋白融合。fB8-4文庫(kù)中的噬菌體展示了沒(méi) 有任何M酸存在偏好的肽。f8-l文庫(kù)中的噬菌體是無(wú)偏好的，除了在第 一位的丙氨酸和第二位的四個(gè)殘基之一。所有其它位置都被任意氨基酸 占用。
生產(chǎn)f8-l噬菌體展示肽庫(kù)的方法已在先前描述(參見(jiàn)，Petrenko等， 9:797-801， 1996以及其中引用的參考文獻(xiàn))。所述文庫(kù) 在主要外殼蛋白pVIII的3900個(gè)拷貝的每一拷貝上展示異源肽。肽的表 達(dá)無(wú)須由IPTG的誘發(fā)。用于8-氨基酸插入的簡(jiǎn)并寡核苷酸是GCA GNN (NNN)7，其中N是任一核苷酸。因此，第一氨基酸是丙氨酸(A)且第二氨 基酸是纈氨酸(V)、丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或甘氨酸(G)。肽 中其余的氨基酸完全隨機(jī)排列。
同樣地，生產(chǎn)f88-4噬菌體展示肽庫(kù)的方法也已在先前描述(Zhong 等，丄歷o/. C7z亂269:24183-24188, 1994; Smith和Scott, Me麵s zw 五"2^mo/ogy， 217:228-257， 1993; Smith, 128:1-2， 1993以及其中引用
的參考文獻(xiàn))。此文庫(kù)在主要外殼蛋白pVin的150至300個(gè)拷貝上展示 15-氨基酸異源肽。pVIII亞基的3900個(gè)拷貝的剩余部分源自野生型pVIII。
因此，該噬菌體基因組具有編碼兩種不同類(lèi)型的pvni分子的兩種pvni
基因。 一種pVIlH艮示異源15-mer肽的重組體，而另一種是通常存在 于噬菌體上的野生型pVIII。重組pVin的表達(dá)是由IPTG誘導(dǎo)型tac啟動(dòng) 子/操縱子驅(qū)動(dòng)的。由于兩種pVIII基因的存在，所述f88病毒體是由野生 型和重組pVIII亞基的鑲嵌形式組成的。
用于15-merM酸插入物的寡核苷酉^列是(NNK:h5，其中N為A、T、 C或G且K表示G或T。因此，圍繞該15-mer氨基酸插入物的區(qū)域 是LVPMLSFA(X)15PAEGDDPAKA (SEQ ID NO: 1),其中X是凈皮密碼 子NNK編碼的任何氛基酸。
噬菌體顆?？捎糜诨谄渑c感興趣的化合物及細(xì)胞的結(jié)合能力來(lái)篩 選在病毒體上表達(dá)的隨機(jī)肽。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，噬菌體展示肽庫(kù)用 于篩選與植物病原體結(jié)合的肽。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)肽與病原真 菌類(lèi)的結(jié)合能力進(jìn)行篩選。還有另一優(yōu)選實(shí)施方案，對(duì)噬菌體展示肽與 疫霉菌屬成員結(jié)合的能力進(jìn)行篩選。當(dāng)研究多于單一生命階段的病原體 時(shí)，優(yōu)選研究每個(gè)生命階段，因?yàn)殡S著發(fā)展階段的改變，在數(shù)量、類(lèi)型 和與結(jié)合部位的親和力上可能出現(xiàn)顯著差異。
例如，當(dāng)研究疫霉菌屬的成員時(shí)，將約105至106的有機(jī)體與約108 至109的噬菌體展示肽相混合，并孵育一段足夠使其結(jié)合的時(shí)間。對(duì)于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，取決于諸如病原體、噬菌體和肽的種類(lèi) 的因素，根據(jù)本公開(kāi)可使用有機(jī)體和展示肽的其它濃度。某些情況下， 預(yù)孵育展示肽與相同有機(jī)體的其它生命階段是需要的，目的是鑒別僅與 特定生命階段結(jié)合的肽。孵育后，有機(jī)體經(jīng)過(guò)多次洗滌以除去未結(jié)合的 和不牢固地結(jié)合的肽。對(duì)疫霉游動(dòng)孢子的情況，使用約50 mM的LiCl 溶液進(jìn)行洗滌。洗滌后，洗脫結(jié)合的噬菌體展示肽，優(yōu)選在低pH下，并 且在合適的宿主中擴(kuò)增洗脫的噬菌體。在一實(shí)施方案中，宿主是饑餓的 K91大腸桿菌。在大腸桿菌中擴(kuò)增細(xì)菌噬菌體的方法在本領(lǐng)域是公知的 并可見(jiàn)于，例如，Smith and Scott, Afe/Aoc/s /"五"zy/wo/ogy, 217:228-257， 1993; Ausubel et al. eds.，幼o(hù)W尸rafoco/s Mo/ecw/ar 5z.o/ogy， 2nd ed., Wiley & Sons, 1995; and Sambrook et al., Mo/ea//ar C7o/n."g， CoW ^pn'wg //aA0r丄ak rato7/Ves;y， 1989。在一實(shí)施方案中，至少一次重復(fù)篩選過(guò)程 以使高親和力的噬菌體展示肽富集。在另一實(shí)施方案中，3次重復(fù)篩選過(guò) 程。
一旦鑒別出高親和力的肽展示的噬菌體，擴(kuò)增該噬菌體，優(yōu)選在大 腸桿菌中，并且該噬菌體DNA的分離使用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在以下文獻(xiàn)中 見(jiàn)到的方法Smith and Scott, Afc^o^s 五w^ymo/ogy， 217:228-257, 1993; Ausubel et al. eds.，幼o(hù)W/w Mo/ecw/ar 5/o/ogy， 2nd ed., Wiley &Sons, 1995; and Sambrook et al., Mo/m//ar C7ow/ g， 2wJ Co/d <Spn'wg /fwZw丄W0rato71989。 一旦分離出噬菌體DNA,使用與用于插 入寡核苷酸的相同的限制性?xún)?nèi)切酶將插入的寡核苦酸從DNA裂解，而限 制性?xún)?nèi)切酶的片段則從DNA的剩余物中分離。然后，可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方 法對(duì)寡核苷酸測(cè)序。測(cè)序可通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行，例如，雙脫氧測(cè) 序法(Sanger et al., Prac. A^/.」cc^. C75^, 74:5463-5467， 1977)、化學(xué)測(cè) 序法(Maxam and Gilbert,TVa,/. f/&4， 74:560-564, 1977)或
其任何改變，包括使用自動(dòng)測(cè)序。在一實(shí)施方案中，使用ABI Prism 377 型自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)。 一旦知道了寡核普 酸的序列，使用遺傳密碼可容易地推導(dǎo)出編碼的肽的氨基酸序列。
高親和力的噬菌體展示肽可就其改變病原體的發(fā)育、生長(zhǎng)和/或傳染 性的能力進(jìn)一步篩選。在此實(shí)施方案中，孵育噬菌體展示肽與目標(biāo)病原 體一段足夠使其結(jié)合的時(shí)間。結(jié)合之后，可觀(guān)察到病原體在其發(fā)育或感 染宿主的能力上的改變。在一實(shí)施方案中，約200個(gè)疫霉菌屬成員中的 游動(dòng)孢子與培養(yǎng)皿中的以恒定體積兩倍連續(xù)稀釋的蒸餾水中噬菌體展示 肽結(jié)合。噬菌體的濃度范圍可變化，但通常在1至10xl(f病毒體/Ml之間。 在每一篩選步驟中都包括不包含噬菌體的陰性對(duì)照。在室溫下，通常為 20分鐘的孵育時(shí)間之后，測(cè)定在每個(gè)噬菌體濃度下包在嚢內(nèi)的游動(dòng)孢子
特有的受體介導(dǎo)的功能反應(yīng)的誘導(dǎo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，該功能反應(yīng)如游動(dòng)孢子的
的感染。
本方法還可用于表征在植物病原體表面上結(jié)合受體的肽。在此實(shí)施 方案中，被標(biāo)記的肽展示噬菌體(測(cè)試噬菌體)與不同有機(jī)體的并在不同發(fā) 育階段的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。然后，標(biāo)記的噬菌體的相對(duì)結(jié)合親和力可通過(guò) 竟?fàn)幗Y(jié)合與Scatchard分析進(jìn)行測(cè)定。在竟?fàn)幗Y(jié)合分析中，使恒定濃度的 測(cè)試噬菌體與靶病原體結(jié)合，然后加入一定濃度范圍下的未標(biāo)記的刺激 噬菌體。該刺激噬菌體可與測(cè)試噬菌體相同或不同。然后洗滌靶病原體 以除去非特異地或不牢固地結(jié)合的噬菌體，并通過(guò)測(cè)量存在于靶細(xì)胞上 的標(biāo)記的量來(lái)測(cè)定結(jié)合的測(cè)試噬菌體的量。竟?fàn)幍某潭瓤赏ㄟ^(guò)需要抑制50%的測(cè)試噬菌體的結(jié)合(1(:5。)的刺激噬菌體的濃度來(lái)測(cè)試。竟?fàn)帨y(cè)試的 結(jié)果可用于測(cè)定細(xì)胞表面受體隨時(shí)間的數(shù)量、類(lèi)型和親和力的變化。
重組寡核苷酸在公開(kāi)的手段的范圍內(nèi)，其通過(guò)此處所述的方法被發(fā) 現(xiàn)，并編碼具有抗真菌活性的肽。這些重組寡核苷酸可用于產(chǎn)生通常用 作克隆或表達(dá)載體的重組多核苷酸，盡管其它用途是可能的?？寺≥d體 是作為轉(zhuǎn)移DNA片段至宿主細(xì)胞的自我復(fù)制的DNA分子?？寺≥d體的 三種最普通的類(lèi)型是細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體以及其它病毒。表達(dá)載體是經(jīng)設(shè) 計(jì)以便插入在特定部位的編碼序列將被轉(zhuǎn)錄且翻譯為蛋白質(zhì)的克隆栽 體。
克隆載體和表達(dá)載體都包含使載體在一個(gè)或多個(gè)適合宿主細(xì)胞中復(fù) 制的核普酸序列。在克隆載體中，此序列通常是使載體能夠獨(dú)立于宿主 細(xì)胞染色體進(jìn)行復(fù)制，并且還包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。很多細(xì)菌 和病毒的復(fù)制起點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的并包括，但不限于 pBR322質(zhì)粒起點(diǎn)、2jti質(zhì)粒起點(diǎn)以及SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV和 BPV的病毒起點(diǎn)。
本公開(kāi)的寡核苷酸序列可通過(guò)使用含有寡核苷酸序列的重組表達(dá)載 體用于產(chǎn)生抗真菌肽。適合的表達(dá)載體包括染色體的、非染色體的和合 成的DNA序列，例如SV40衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、桿狀病 毒、酵母質(zhì)粒、由質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體、以及病毒DNA， 例如牛痘、腺病毒、雞痘病毒和偽狂犬病毒。此外，可使用任何在宿主 中可復(fù)制且有生存力的其它載體。
通過(guò)多種方法可將感興趣的核苷酸序列插入載體中。在最常見(jiàn)的方 法中，使用通常對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、并在例如以下的文獻(xiàn)中詳 述的方法Sambrook et al.， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, (1989) and Ausubel et al.， Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed" John Wiley & Sons 50 (1992),可將序列插入合 適的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。
在表達(dá)載體中，將感興趣的序列可操作地連接至由宿主細(xì)胞識(shí)別以 指導(dǎo)mRNA合成的適合的表達(dá)控制序列或啟動(dòng)子。啟動(dòng)子是通常位于從 結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子上游的100至lOOO石威基對(duì)(bp)處的非翻譯序列，啟動(dòng)子在在其控制下調(diào)節(jié)核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯。啟動(dòng)子通常分為誘導(dǎo)型的 或組成型的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是這樣的啟動(dòng)子，其作為對(duì)環(huán)境中的某些變 化的反應(yīng)，例如養(yǎng)料的存在或不存在或者溫度的變化，促使在其控制下
引發(fā)DNA轉(zhuǎn)錄水平增加。與此相反，組成型啟動(dòng)子維持相對(duì)恒定的轉(zhuǎn)錄 水平。
當(dāng)核 列處于與另 一核 列的官能關(guān)系時(shí)，其被可操作地連接。 例如，前序列或分泌引導(dǎo)者的DNA與多肽的DNA可操作地連接，如果 該多肽DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白；啟動(dòng)子與編碼序列可操:作地 連接，如果該啟動(dòng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄;或者核糖體結(jié)合部位與編碼序列 可操作地連接，如果該核糖體被置于方便翻譯的位點(diǎn)。通常，可操作地 連接的序列是鄰接的，并且對(duì)于分泌引導(dǎo)者的情況是鄰接的且在閱讀相 中。結(jié)合是通過(guò)在限制性?xún)?nèi)切酶部位的拼接而實(shí)現(xiàn)的。如果沒(méi)有合適的 限制性位點(diǎn)，則可使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的合成寡核苷酸接頭或連 接物(adapter or linker)。 Sambrook et al.， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press, (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed,， John Wiley & Sons (1992)。
用于表達(dá)載體的常見(jiàn)啟動(dòng)子包括，但不限于，LTR或SV40啟動(dòng)子、 大腸桿菌lac或tip啟動(dòng)子以及噬菌體XPL啟動(dòng)子。有效的誘導(dǎo)型植物啟 動(dòng)子包括熱休克啟動(dòng)子(Ou-Lee et al. (1986) Proc. Natl Acad. Set USA 83: 6815; Ainley et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 949)、源自菠菜亞硝酸還原酶 基因的硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Back et al. (1991)Plant Mol Biol. 17: 9)、激素 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozaki et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 905; Kares et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 905)以及與RuBP羧化酶的小亞單 位和LHCP基因家族相關(guān)的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Kuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1 : 471; Feinbaum et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 226: 449; Weisshaar et al. (1991) EMBOJ. 10: 1777; Lam and Chua (1990) Science 248: 471; Castresana et al. (1988) EMBOJ. 7: 1929; Schulze-Lefert et al. (1989) EMBOJ. 8:651)?？墒褂靡阎脑谠嘶蛘婧思?xì)胞中控制基因表達(dá)的、本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體也可包含翻譯起始的核糖體 結(jié)合部位以及轉(zhuǎn)錄終止子。該載體還可包含用于擴(kuò)增基因表達(dá)的序列。表達(dá)載體和克隆載體可以，且通常是，包含選擇基因或選擇標(biāo)志物。 典型地，此基因編碼對(duì)于被載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)必要的蛋
白質(zhì)。適合的標(biāo)志物的實(shí)例包括真核細(xì)胞的二氫葉酸還原酶(DHFR)或新 霉素的抗性以及大腸桿菌對(duì)四環(huán)素或氨千青霉素的抗性。植物中的選擇 標(biāo)志物包括對(duì)博來(lái)霉素、慶大霉素、甘草膦、潮霉素、卡那霉素、氨曱 喋呤、腐草霉素、膦絲菌素(phosphinothricin)、放線(xiàn)壯觀(guān)素、鏈霉素、磺 酰胺和磺酰脲的抗性。Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology 0直 物分子生物學(xué)方法)，Cold Spring Harbor Press, 1995, p. 39。
此外，表達(dá)載體還可包含與蛋白質(zhì)的核苷酸序列可操作地連接的、 為用作標(biāo)志物的編碼其他蛋白質(zhì)的標(biāo)志物序列。其結(jié)果為包含兩個(gè)連接 的且不同的蛋白質(zhì)的雜化或融合蛋白質(zhì)。所述標(biāo)志物蛋白質(zhì)可為由表達(dá) 載體產(chǎn)生的重組體蛋白質(zhì)提供，例如，免疫的或生物酶的標(biāo)志物。合適 的標(biāo)志物包括，但不限于，堿性磷酸酶(AP)、 myc、血凝素(HA)、 j8-葡糖 醛酸糖苷酶(GUS)、熒光酶以及綠色熒光蛋白(GFP)。
本公開(kāi)的多核苷酸序列也可以是表達(dá)盒的部分，該表達(dá)盒至少包括， 可操作地在5'至3'位方向上連接，諸如啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列、編碼本公開(kāi)的 肽的多核苷酸以及在宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列。所述啟動(dòng) 子可以是任何此處所述的類(lèi)型，例如，組織特異性啟動(dòng)子、.種子特異性 啟動(dòng)子、質(zhì)粒特異性啟動(dòng)子等。所述表達(dá)盒可進(jìn)一步包含可操作地連接 的靶向、運(yùn)輸或能夠引導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的傳輸?shù)姆置陔木幋a區(qū)。所述表 達(dá)盒還可進(jìn)一步包含編碼篩選標(biāo)志物和/或純化部分的核苷酸序列。
更具體地，本公開(kāi)包括重組構(gòu)建體，其含有編碼本公開(kāi)的抗真菌肽 的分離的多核苷酸序列。所述構(gòu)建體可包載體，例如質(zhì)粒載體或病毒栽 體，所述序列正向或反向已被插入其中。該重組構(gòu)建體可進(jìn)一步包含調(diào) 節(jié)序列，包括，例如，與序列可操作地連接的啟動(dòng)子。許多適合的載體 和啟動(dòng)子對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的并且是市售的。
本公開(kāi)進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該構(gòu)建 體含有本公開(kāi)的寡核苷酸序列。所述宿主細(xì)胞可以是更高級(jí)的真核細(xì)胞， 例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，或是更低級(jí)的真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞， 或者宿主可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。將所述構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞可通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、 1,5-二曱基-1,5-二氮十一亞曱基聚甲溴化物、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體、直 接顯微注射到細(xì)胞核、刮研裝載以及電穿孔。在植物中，可使用多種不 同的方法將轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體引入到植物原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、葉盤(pán) 等，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。這些方法包括，例如，土i裏桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、 基因槍傳輸、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、脂質(zhì) 體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等(Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 42: 205)。
通過(guò)本公開(kāi)的多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生的肽可通過(guò)以下步驟獲得通過(guò) 任何前述的方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，在適合條件下生長(zhǎng)宿主細(xì)胞；誘導(dǎo)多核 苷酸的表達(dá)以及分離感興趣的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)是保留在宿主細(xì)胞內(nèi) 的，則可通過(guò)宿主細(xì)胞的溶解而獲得該蛋白質(zhì)，而如果蛋白質(zhì)是分泌性 蛋白質(zhì)，則可從培養(yǎng)基中分離。有一些方法可提純蛋白質(zhì)并且對(duì)本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員是公知的。這些方法包括沉淀，例如硫酸銨沉淀或乙醇沉 淀，酸提取，陰離子或陽(yáng)離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層 析，親和層析，羥磷灰石層析，外源凝集素層析，高效液相色譜(HPLC), 天然或變性條件下的電泳，等電聚焦以及免疫沉淀反應(yīng)。
.或者，由本公開(kāi)的多核苷酸編碼的肽可通過(guò)使用固相肽合成或經(jīng)典 的溶液肽合成(也稱(chēng)為液相肽合成)的化學(xué)合成法產(chǎn)生。在寡聚體支持的液 相合成中，生長(zhǎng)的產(chǎn)品附在大的可溶聚合物基團(tuán)上。因此，基于相對(duì)很 大的附于聚合物上的產(chǎn)品與未反應(yīng)的反應(yīng)物在尺寸上的巨大不同，每個(gè) 合成步驟的產(chǎn)品可從未反應(yīng)的反應(yīng)物中分離。這樣使反應(yīng)能夠在均相的 溶液中發(fā)生，并且消除了與傳統(tǒng)液相合成相關(guān)的繁瑣的純化步驟。寡聚 物支持的液相合成還可適應(yīng)肽的自發(fā)液相合成。
對(duì)于固相肽合成，此過(guò)程引起適合的氨基酸的順序裝配為所需序列 的肽，而生長(zhǎng)的肽的末端與不溶載體相連接。通常，肽的羧基端與聚合 物相連接，并在解離劑處理時(shí)可從所述聚合物釋放。在常見(jiàn)方法中，氨 基酸與樹(shù)脂顆粒結(jié)合，并且，通過(guò)逐步添加保護(hù)的氨基酸以產(chǎn)生氨基酸 鏈的步進(jìn)式產(chǎn)生肽。通常使用由Merrifield描述的修改的此技術(shù)(參見(jiàn)， 例如，Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96: 2989-93, 1964)。在自動(dòng)固相法中，通過(guò)將羧基端的氨基酸裝載到有機(jī)連接劑(例如，PAM， 4-氧代曱基苯基 乙酰胺曱基)上而合成肽，所述有機(jī)連接被共價(jià)地連接到與二乙烯基苯交 聯(lián)的不溶聚苯乙烯樹(shù)脂上的。通過(guò)用叔丁氧羰基來(lái)阻擋可保護(hù)末端氨。 羥基和M基團(tuán)通?？赏ㄟ^(guò)利用O-千基基團(tuán)來(lái)阻擋得到保護(hù)。在自動(dòng)肽 合成器中完成合成，有很多市售的合成器。合成后，可從樹(shù)脂上脫去產(chǎn) 物。通常#4居已有方法(例如，Bergot and McCurdy， Applied Biosystems Bulletin, 1987)使用氫氟酸或三氟曱磺酸脫去保護(hù)基團(tuán)。分離和純化之后， 通常得到約60%至70%的收率。完成產(chǎn)物肽的純化是通過(guò)，例如，從有 機(jī)溶劑例如曱基丁基醚中使肽結(jié)晶，然后溶于蒸餾水，以及使用透析(如 果肽的分子量大于約500道爾頓)或反向高壓液相色i普(例如，使用0.1% 三氟乙酸和乙腈作為溶劑的C18柱)如果肽的分子量小于500道爾頓。純 化的肽可被凍干并以干態(tài)儲(chǔ)存?zhèn)溆?。可使用常?jiàn)的高壓液相色i普(HPLC) 和電噴射質(zhì)譜(ES-MS)分析方法完成所得態(tài)的分析。
通常，包含含有本公開(kāi)多核苷酸的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)任何前 述方法生產(chǎn)；篩選在選擇性培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；使已被轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞再生以產(chǎn)生分化的植物；以及選擇轉(zhuǎn)化的植物，其以所需水平表 達(dá)由本公開(kāi)的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)化多種雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基 因植物的具體方法在文獻(xiàn)中很好的記錄了 (Gasser and Fraley， Science 244:1293, 1989; Fisk and Dandekar, Scientia Horticulture 55:5， 1993;及其 引用的文獻(xiàn))。
轉(zhuǎn)化和植物再生已在多種單子葉植物中獲得成功。具體實(shí)例如下 ,夢(mèng)(As/ ara， Oj^dwafc; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345)、大麥(i/o^fewm vw/garae; Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37)、玉米(Zea map; Rhodes et al. (1988) Science 240: 204; Gordon-Ka匪et al. (1990) Plant Cell 2: 603; Fro醒et al. (1990) Bio/Technology 8: 833; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11: 194)、燕麥 (^ve"fl sa"ra; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10: 1589)、野茅(￡^6^/& g/omerato; Horn et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 469)、大米((9，a她va， including indica and japonica varieties; Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 10; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 379; Luo andWu (1988) Plant Mol， Biol Rep. 6: 165; Zhang and Wu (1988) Theor. Appl. Genet. 16: 835; Christou et al, (1991) Bio/Technology 9: 957)、黑麥(Seca/e cerea/e; Dela Pena et al. (1987) Nature 325: 274)、高粱(Sorg/zwm Cassas et al. (1993) Proc. Natl Acad. Scl USA 90: 11212)、甘蔗CSaccAan/m ■sp/ .; Bower and Birch (1992) Plant J. 2: 409)、 高羊茅(Fe她ca anm&"ac叫 Wang et al. (1992) Bio/Technology 10: 691)、草沖草(v4gms^ / a/^^^; Zhong et al. (1993) Plant Cell Rep. 13: 1)以及小麥(7W"cwm aeWvw附；Vasil et al. (1992) Bio/Technology 10: 667; Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102: 1077; Becker et al. (1994) Plant J. 5: 299)。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，采用編碼本公開(kāi)的抗真菌肽的重組多核苷酸 轉(zhuǎn)化植物，其中該多核普酸形成由植物分泌的肽。在另一優(yōu)選實(shí)施方案 中，轉(zhuǎn)基因植物的根分泌出抗真菌的肽。分泌抗真菌肽的植物可通過(guò)上 述方法構(gòu)建，使用了將指引肽分泌的分泌序列引入的表達(dá)盒?；蛘?，可 采用核普S吏序列轉(zhuǎn)化植物，該核苷酸序列編碼由本公開(kāi)的抗真菌肽及通 常被植物分泌的蛋白質(zhì)構(gòu)建的融合蛋白質(zhì)。例如，在抗真菌肽和細(xì)胞分 裂素氧化酶可產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)。細(xì)胞分裂素氧化酶是表現(xiàn)為降解可干擾 植物生長(zhǎng)控制的外源細(xì)胞分裂素的防衛(wèi)性酶。通過(guò)將抗真菌肽與控制分 泌的細(xì)胞分裂素氧化酶基因區(qū)域融合，抗菌素肽將被轉(zhuǎn)化植物分泌出， 從而提供免受病原體真菌的保護(hù)。
在融合蛋白質(zhì)用于轉(zhuǎn)化植物之前，可使用本公開(kāi)的噬菌體展示的方 法對(duì)包含抗真菌肽的融合蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行篩選。通常，融合蛋白可以 是包含以下的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)抗真菌肽；蛋白質(zhì)的分泌控制部分，例如細(xì) 胞分裂素氧化酶；以及pVIII或pIII噬菌體外殼蛋白。然后，可使用本公 開(kāi)的方法篩選如此構(gòu)建的噬菌體展示融合蛋白質(zhì)以選擇那些與靶病原體 真菌結(jié)合并且導(dǎo)致限制致病性的變化的融合蛋白質(zhì)。
實(shí)施例
以下實(shí)施例的目的是提供本公開(kāi)的應(yīng)用的說(shuō)明。以下實(shí)施例不是為 了完全定義或用其它方式限制本發(fā)明的范圍。
30實(shí)施例l:真菌種類(lèi)和游動(dòng)孢子的產(chǎn)生
使用的真菌菌抹為辣椒疫霉菌(尸.ca戸/ci)(ATCC 15399)、大豆疫霉菌 (尸.so力e)(菌才朱7-6-1,類(lèi)別25) (A. F. Schmitthe皿er, Ohio State University) 和寄生疫霉(P/^o/ /^ora / araw'"ca)。所有培養(yǎng)物都作為菌絲體保持在 15 °C下的利馬豆瓊脂平澤反(大豆疫霉菌)或玉米4分瓊脂平斧反(Difco， USA) (辣椒疫霉菌和寄生疫霉)上。通過(guò)將菌絲栓(5 mmx5 mm)轉(zhuǎn)移至包含澄清 的10% V8⑧蔬菜汁(Campbe11 Soup Co.， USA)的瓊脂平板上制得菌絲體拷 貝。每個(gè)板上有3個(gè)栓在25 。C下生長(zhǎng)3至6天。通過(guò)修整所述平板并在 25。C、光照下培養(yǎng)，在辣#^疫霉菌中可引起孢子嚢的產(chǎn)生。l至2天后， 通過(guò)無(wú)菌水沖洗所述平板20至30分鐘可引發(fā)游動(dòng)孢子的釋放。寄生疫 霉游動(dòng)孢子的產(chǎn)生與辣#^疫霉菌的產(chǎn)生相同，除了在25。C、光照下培養(yǎng) 前用無(wú)菌水洗滌所述平板2分鐘。從大豆疫霉菌孢子嚢中引發(fā)游動(dòng)孢子 的釋放是通過(guò)用無(wú)菌水以30分鐘的間隔沖洗平板4次。游動(dòng)孢子在2至 4小時(shí)內(nèi)釋放。在其釋放之后，通過(guò)4層粗濾布過(guò)濾游動(dòng)孢子以除去孢子 嚢殼以及菌絲體碎片。懸浮液的樣品渦流30秒以引發(fā)成嚢，然后在顯樣史 鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)包嚢計(jì)數(shù)。
實(shí)施例2:.作為轉(zhuǎn)換單位的饑餓的K91kan大腸桿菌細(xì)胞和Titerinz噬菌 體的制備
在文庫(kù)篩選前，才艮據(jù)開(kāi)的方法(Smith & Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993; Yu and Smith, Methods in Enzymology, 267:3_27, 1996)，將噬菌體作為饑餓的KWBluKan (卡那霉素抗性)大腸桿 菌中的四環(huán)素轉(zhuǎn)換單位(TU)進(jìn)行濃度測(cè)定。轉(zhuǎn)換單位是測(cè)量噬菌體傳染 性的有效方法，并通常表示為噬菌體的TU/ml。簡(jiǎn)言之，K91BluKan細(xì) 胞在20 ml的超級(jí)肉湯(superbroth)中、37 。C、激烈搖動(dòng)(約170 rpm) 下(Smith and Scott， Methods in Enzymology, 217:228-257， 1993)生長(zhǎng)為中 期指數(shù)階段(OD,約0.45)。然后將該細(xì)胞在輕柔搖動(dòng)下培養(yǎng)另外的5分 鐘以使任何修剪過(guò)的F pill再生。在4 。C下的Sorvall SS34轉(zhuǎn)子中，將該 細(xì)胞在無(wú)菌的50 ml圓底旋蓋(Oak Ridge)管中以2，200 rpm離心分離10 分鐘。傾倒出上清液，然后將該細(xì)胞再懸浮于20 ml的80 mM NaCl中，置于125 ml培養(yǎng)并瓦并在70 rpm、 37 °C下輕柔搖動(dòng)45分鐘。然后如上離 心分離該細(xì)胞并再懸浮于l ml冷N(xiāo)AP緩沖溶液中。饑餓的細(xì)胞在4 。C 下保存且保持傳染性3至5天。
將噬菌體作為在大腸桿菌K91BluKan中饑餓細(xì)胞(如上制備)的轉(zhuǎn)換 單位(TU)進(jìn)行濃度測(cè)定。使用TBS/凝膠作為稀釋劑對(duì)噬菌體進(jìn)行分析測(cè) 定。10微升的各噬菌體稀釋物以液滴形式沉積在與水平面成10。角i殳置 的15ml無(wú)菌一次性管的內(nèi)壁上。將IO微升饑餓的大腸桿菌K91BluKan 細(xì)胞加入各噬菌體液滴并在室溫下將其培養(yǎng)10分鐘以允許噬菌體感染濃 縮的細(xì)胞的時(shí)間。IO分鐘后，將包含0.2 mg/ml四環(huán)素的1 ml超級(jí)肉湯 加入至所述細(xì)胞并在搖動(dòng)下、37 。C培養(yǎng)20至40分鐘。為了 f88-4/15 mer 噬菌體的擴(kuò)增，該超級(jí)肉湯還包含1 mM IPTG以誘導(dǎo)重組體pVIII的表 達(dá)。然后將感染的細(xì)胞在包含40 mg/ml四環(huán)素的Luria-Bertani (LB)平板 上展開(kāi)(200 ml每個(gè)平板)。然后在37 °C培養(yǎng)該平板約24小時(shí)。
實(shí)施例3:結(jié)合噬菌體的游動(dòng)孢子的選擇
將f8-l文庫(kù)中10U轉(zhuǎn)換單位(TU)的等分試樣(Petrinko et al., Protein Engineering, 9:797-801， 1996)在室溫下加入至4 ml的50 mM LiCl中106 新釋放的辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子中，然后在室.溫、輕柔攪拌下培養(yǎng)30分鐘。 除了使用大豆疫霉菌的游動(dòng)孢子的情況(Soj克隆)，對(duì)fB8-4文庫(kù)使用相 同的方法。用150 pd的50 mL LiCl洗滌包含結(jié)合噬菌體的游動(dòng)孢子10 次，然后以1000xg離心分離45秒鐘以除去未結(jié)合的噬菌體。IO次洗滌 后，用200 j[d的洗脫緩沖液(O.l NHCl，足夠使pH為2.2的甘氨酸，1 mg/ml 牛血清清蛋白)洗脫結(jié)合的噬菌體。通過(guò)感染如上所述的饑餓的大腸桿菌 K91BluKan細(xì)胞將洗脫的噬菌體擴(kuò)增。然后通過(guò)如下所述的與聚乙二醇 沉積的方法純化該擴(kuò)增的噬菌體，并如Smith和Scott所述的方法將其再 懸浮于TBS緩沖液中(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993)。純化 噬菌體小份等分試樣隨后再用于新釋放的游動(dòng)孢子中，如上所述用于總 共3次親和力純化和2次擴(kuò)增步驟。如Smith和Scott所述(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993),通過(guò)計(jì)算每一輪選擇后的百分收率監(jiān)測(cè) 結(jié)合游動(dòng)孢子的噬菌體的選擇性富集。該計(jì)算是通過(guò)計(jì)算用于游動(dòng)孢子
32的總噬菌體(表示為轉(zhuǎn)換單位)以及測(cè)量從游動(dòng)孢子再生的噬菌體(作為轉(zhuǎn) 換單位)的總產(chǎn)量來(lái)進(jìn)行，并以百分比表示該結(jié)果。每一輪的篩選后從游
動(dòng)孢子中洗脫的噬菌體的收率是在10"V。至1(rV。之間，表明所述方法在 篩選與游動(dòng)孢子結(jié)合的噬菌體上是成功的。洗滌步驟后游動(dòng)孢子是完好 無(wú)缺的、球形的，表明在篩選過(guò)程期間幾乎沒(méi)有出現(xiàn)成嚢。
實(shí)施例4:噬菌體純化
-故噬菌體感染的大腸桿菌K91BluKan細(xì)胞在20 ml超級(jí)肉湯(含有40 mg/ml的四環(huán)素)中、37。C、 170rpm下過(guò)夜生長(zhǎng)。將該培養(yǎng)液在SS34轉(zhuǎn) 子中以5，000x g離心分離IO分鐘以沉淀該大腸桿菌細(xì)胞(含噬菌體)。移 除上清液并將其置于新的圓底旋蓋管中，然后以150 l每ml上清液的比 例加入PEG/NaCl (16.7%聚乙二醇/3.3 M NaCl)以沉積噬菌體。在4 。C下 將噬菌體過(guò)夜沉積，然后通過(guò)在SS34轉(zhuǎn)子的50 ml圓底旋蓋管中以 10,000 ipm離心分離20分鐘來(lái)沉淀。將沉淀噬菌體再懸浮于1 ml的Tris 緩沖生理鹽水(TBS)中。通過(guò)加入150 ml的PEG/NaCl將其再次沉積并 在4 。C下過(guò)夜。通過(guò)在臺(tái)式離心機(jī)上的離心分離將噬菌體沉淀并將此沉 淀再懸浮于TBS中。
實(shí)施例5: DNA分離、測(cè)序和分析
才艮據(jù)Smith和Scott的方法(Methods in Enzymology， 217:228- 257, 1993)將用于測(cè)序的DNA從單獨(dú)的噬菌體克隆中分離。使用ABI Prism 377型自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems， Foster City, Calif.)按照廠(chǎng)商方案對(duì) 單鏈DNA從3'端進(jìn)行測(cè)序。用于f8克隆的引物是5'-GGAGCCTTTAATTGTATCGG-3' (SEQ ID NO: 2)。用于f88克隆的引物 是5'-AGT AGC AGA AGC CTG AAG A-3' (SEQ ID NO: 3)。
使用ExPASy分子生物學(xué)服務(wù)器(網(wǎng)址http:〃www.expasv,ch/)的"翻 譯"程序?qū)NA序列進(jìn)行翻譯。使用標(biāo)準(zhǔn)算法(即)FASTA (Lipman and Person, Science, 227:1435-1441, 1985)和BLAST (Altschul et al.， J. Molecular Biol., 215:403-410， 1990)命令對(duì)序列與存儲(chǔ)于序列數(shù)據(jù)庫(kù) (GenBank， EMBL， dbEST， SwissProt， PIR)的核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。使用ClustalW (Thompson et al., Nuc. Acid Res" 22:4673-4680， 1994)以及 PAM250重量表對(duì)肽序列進(jìn)行比對(duì)，并使用TreeView (Page, Computer Applic. Biosci.， 12:357-358, 1996)對(duì)觀(guān)察樹(shù)狀圖。獲得的f8-merDNA序列 編碼19個(gè)預(yù)期的肽序列(表1)。多數(shù)的肽包含預(yù)期為強(qiáng)a-螺旋形成者(即 Glu、 Ala和Leu)和a-螺旋破壞者(即Gly和Pro)的氨基酸殘基。盡管缺少 共用基序，ClustalW多序列比對(duì)程序用于將類(lèi)似的肽以樹(shù)狀圖的形式簇 集。由匹配的肽構(gòu)建的樹(shù)狀圖表明f8-mer肽序列可分組為6個(gè)主要的家 族群，如圖1和表1所示。由f88-4/15 mer文庫(kù)挑選的序列如表2所示。
實(shí)施例6:成嚢檢測(cè)
根據(jù)Sm池和Scott的方法分離挑選的噬菌體克隆(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993)，并除了噬菌體再懸浮于蒸餾水中而不是 TBS，如上所述使用聚乙二醇對(duì)其進(jìn)行兩次純化。通過(guò)在八269測(cè)量吸光 度計(jì)算該病毒體的濃度(Smith and Scott, Methods in Enzymology， 217:228-257, 1993)。將包含約400個(gè)新釋放的游動(dòng)孢子的約20 jtd的水滴 與噬菌體培養(yǎng)，該噬菌體經(jīng)兩倍連續(xù)稀釋以便其包含含有肽的噬菌體濃 度為lx1010、 5xl09、 2.5xl()9或1.25xl()9病毒體/i^水滴。陰性對(duì)照沒(méi)有 得到噬菌體并用于監(jiān)測(cè)在游動(dòng)孢子種群中自發(fā)成嚢的量。室溫下培養(yǎng)20 分鐘后，使用100x放大率的顯微鏡對(duì)成嚢的游動(dòng)孢子的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。 根據(jù)Smith和Scott (Methods in Enzymology, 217:228-257， 1993)計(jì)算噬菌 體的病毒體濃度。
f8肽誘導(dǎo)未成熟包嚢的效力隨著序列家族以及噬菌體濃度而變化(圖 2)。濃度為^101()病毒體//|1(64]1^)時(shí)，很多肽的家族對(duì)誘導(dǎo)包嚢是有效 的。然而，濃度為2.5乂109病毒體時(shí)，在產(chǎn)生高水平成嚢作用(Pc42、 Pc78、 Pc87和Pc64)的肽與產(chǎn)生低水平成嚢作用(Pcl5B、 Pc56和Pc45)的肽間具 有3至5倍的差別。濃度為1.25xl09 (8 /iM)時(shí)，所有肽的家族都對(duì)誘導(dǎo) 成嚢作用具有最低限度的效力。野生型噬菌體也對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子 產(chǎn)生成嚢作用；然而，在所有試驗(yàn)中，由選擇的噬菌體產(chǎn)生成嚢的游動(dòng) 孢子的部分大于由野生型噬菌體的成嚢的部分2至7倍。辣;f權(quán)疫霉菌選 擇的、含肽的噬菌體未成熟地將游動(dòng)孢子包在嚢內(nèi)的能力對(duì)辣椒疫霉菌
34是特有的。當(dāng)大豆疫霉菌與寄生疫霉游動(dòng)孢子與lxl(T病毒體/zil的含肽 噬菌體培養(yǎng)時(shí)，幾乎沒(méi)有觀(guān)察到成嚢，其中所述濃度對(duì)辣椒疫霉菌游動(dòng) 孢子產(chǎn)生幾乎100%的成嚢。對(duì)于f88-4 15mer肽得到相似的結(jié)果。有代 表性的15mer肽產(chǎn)生未成熟成嚢的能力與f-8克隆Pc87的比較如圖3所 示。
實(shí)施例7:結(jié)合特異性
比較具有高和低成嚢誘導(dǎo)能力的噬菌體展示肽的結(jié)合辣椒疫霉菌游 動(dòng)孢子的能力。隨機(jī)選擇噬菌體克隆Pc87和Pc45作為分別誘導(dǎo)高和低 水平的成嚢作用的代表性克隆(圖2)。引入噬菌體載體作為對(duì)照處理。噬 菌體克隆通過(guò)大腸桿菌感染擴(kuò)增并如上所述被純化。對(duì)于每個(gè)結(jié)合反應(yīng)， 5xl01G TU的噬菌體與200,000的辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子一起培養(yǎng)。如實(shí)施 例3中的噬菌體選擇進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)和洗滌。對(duì)從游動(dòng)孢子種群洗脫的噬 菌體在大腸桿菌K91BluKan細(xì)胞中進(jìn)行濃度測(cè)定并作為全部轉(zhuǎn)換單位來(lái) 表示。使用類(lèi)似的過(guò)程確定選擇的噬菌體是否與辣椒疫霉菌包嚢結(jié)合。
噬菌體載體與克隆Pc45和Pc87不同地結(jié)合辣椒疫霉菌游動(dòng)孢子。 30分鐘的孵育之后，超過(guò)107 TU的噬菌體Pc87從游動(dòng)孢子上被洗脫， 而只有約50,000 TU的噬菌體Pc45或噬菌體載體^M目同條件下被洗脫(圖 4)。此外，結(jié)合對(duì)游動(dòng)孢子的階段時(shí)特有的少于1(^Pc87TU從包嚢上 被洗脫-在對(duì)照載體噬菌體觀(guān)察到大約相同的背景結(jié)合(圖5)。
實(shí)施例8:分泌融合蛋白的構(gòu)建
通過(guò)將合成的寡核苦酸連接至載體pJE-6的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)， HindIII和Xbal,構(gòu)建羧基末端的DNA融合來(lái)編碼感興趣的肽。質(zhì)粒載 體pJE-6是由源于質(zhì)粒pPICZ-alpha (Invitrogen， Carlsbad, Calif.)的尸/c/n'a ; flWo〃's表達(dá)構(gòu)建體pROM-46構(gòu)建的，如前述(Cregg et al.， Bio/Technology: 11: 905-910， 1993; Rosenfeld, Methods in Enzymology， 306:154-169， 1999)。 質(zhì)粒pROM-46用限制性?xún)?nèi)切核酸酶(Hindin)消化，用Klenow酶和dNTP's 補(bǔ)平，用T4DNA連接酶再連接。這些步驟消除了存在于pPICZ-alpha質(zhì) 粒序列內(nèi)的HindIII限制性位點(diǎn)，并且質(zhì)粒^皮指定為pJE-4。通過(guò)PCR將在編碼序列3'端的序列突變以采用限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)HindIII取代終止密碼 子。此質(zhì)粒指定為pJE-6。編碼代表性的肽(Pc87， ADRPSMSPT, SEQ ID NO: 8)的合成寡核苷酸與用HindIII和Xbal消化的質(zhì)粒pJE-6連接。此質(zhì) 粒指定為pJE-7 (圖6)。對(duì)pJE-7質(zhì)粒測(cè)序以確定插入，并且結(jié)果如圖7 所示。
表1
家族克隆氨基酸序列SEQ ID NO
1Pc56AAPDLQDAM4
2APcl9ADRLNSDAG5
Pc36ADRPSTTSL6
Pc78ADPPRTVST7
Pc87ADRPSMSPT8
PcllADRTSNAST9
2BPc76ADKSYIPSS10
Pc65AVRNPSHHS1
Pc44ADPTPRGHS12
Pc58ADPTRQPHS13
3AP.c45AEHQNSAGP14
Pcl4ADARSAGAIS15
Pc39ADSKNAGPM16
Pc53AETKFSGSA17
Pcl5AADPKGSGVT18
3BPcl5BA饑TSPNDM19
Pc43/PC64ADITDPMGA20
4PC29BAVGTHTPDS21
Pcl2/Pc42AVSPNVHDG22表2
氨M岸歹'廠(chǎng)— ■ SEQIDNO.
如上所述，蛋白質(zhì)腳手架可設(shè)計(jì)為在肽轉(zhuǎn)化入植物時(shí)展示所述肽。. 出于說(shuō)明的目的，細(xì)胞分裂素氧化酶(CKX)可用作肽傳輸腳手架。源自玉 米的CKX家族的成員(Moms， 1997)可以，例如，用作傳輸分子。CKX 是內(nèi)源性地產(chǎn)生的，具有從細(xì)胞分泌的肽信號(hào)序列，并且在蛋白酶存在 于細(xì)胞間區(qū)域的情況下被充分糖基化以提供穩(wěn)定性(Moms et al.， 1999)。
基于已知的CKX的三維結(jié)構(gòu)，如Malito et al., 2004報(bào)導(dǎo)，可將CKX 工程化為在暴露的C-末端展示肽。例如，可表達(dá)腳手架構(gòu)建體并從酵母 中將其分泌出。在最初的試驗(yàn)中，所選肽的抑制能力是顯著的，并獲得 80%至90%的游動(dòng)孢子成嚢。在水的對(duì)照組中，疫霉菌游動(dòng)孢子成嚢為 250/?；蚋?Fangeta1.，2004)。例如，可利用這種構(gòu)建體產(chǎn)生番茄發(fā)根， 并且在這種情況下，發(fā)現(xiàn)腳手架蛋白被分泌至根際，其中，腳手架蛋白 在其于根部表面聚集之前在所述根際誘導(dǎo)游動(dòng)孢子成嚢，因此阻止了感 染。如圖9所示。
除了以上的工作但通過(guò)相同技術(shù)的擴(kuò)展，從與疣頂單胞銹菌的夏孢
37
VAAFSLVWATHLMLS 23
LTRCLVSTEMAARRP 24
SAPYLPYFDLLHFPI 25
PSSYEASRRPEHWXF 26
SATDTTLP廳TAIRS 27
TRLSPMESXAMLLAP 28
LLPVSPPFAPNASST 29
MSNFPTSHAPCPVEI 30
EFRXNYPSAAPLIPR 31
PXVHGSIPLTPPLGF 32
LFXCYPPCTYSYCLS 33
MSNFPTSHAPCPVXI 34
PEWKSSWSPCTPRCP 35
AMSRWLRPRE(M/I)NAPP 36
THTTFXVTVXLHEPP 37
MTSPRNSQLIVPFCL 38
PTLGRFNRPSCSIIV 39
APQCHPHLPFDMIHV 40
NHNSLPAQYLVXILR 41
DdPCTPSPDVSFYRS 42
VAAPSHWLKPSLDCF 43
肌YKNPPPRVAMCL 44
LIFRYAPPPLFLRPP 45子牢固結(jié)合的組合文庫(kù)中選擇15-mer的肽。此真菌用作豆薯層銹菌的替 代物或是經(jīng)選擇的類(lèi)似物，其中，接近豆薯層銹菌之處被嚴(yán)密控制以 保留此病原體。此篩選鑒別出很多在最初的孢子發(fā)芽后抑制生長(zhǎng)的肽， 例如，如圖10所示。所述肽在微摩爾級(jí)的濃度是有效的。防御肽在 CKX中的發(fā)育可使其能夠傳輸至穿入葉子細(xì)胞間的真菌菌絲的表面。
實(shí)施例9:肽選擇方法學(xué)
圖8是表明肽選擇的方案800的方法流程圖。首先，起始的噬菌體 展示肽庫(kù)可在步驟802與植物提取物混合以除去與植物蛋白質(zhì)及其它因 子發(fā)生作用的肽。如此除去肽的產(chǎn)物^皮指定為子庫(kù)1。
子庫(kù)i與發(fā)芽的夏孢子或幼體通過(guò)公知的生物淘洗技術(shù)混合804。
結(jié)合的噬菌體展示肽從幼體中回收806。各回收的噬菌體展示肽的濃 度通過(guò)大腸桿菌中的擴(kuò)增808而增加。噬菌體展示肽擴(kuò)增后回收再生 810并與植物提取物混合812以再次確保除去與植物蛋白質(zhì)和其它因 子發(fā)生作用的肽。如此除去肽的產(chǎn)物被指定為子庫(kù)2。
步驟814確定是否以上步驟已進(jìn)行了足夠的次數(shù)以保證選擇候選 植物防御肽的嚴(yán)緊性。從子庫(kù)2開(kāi)始，子庫(kù)3、 4和5是通過(guò)重復(fù)步驟 806至步驟812的n次連續(xù)反復(fù)產(chǎn)生的。在使用生物淘洗的情況下， 每次反復(fù)使最新產(chǎn)生的子庫(kù)，例如，子庫(kù)2，與發(fā)芽的夏孢子或幼體 混合。結(jié)合的噬菌體展示庫(kù)從幼體中回收。每次回收的噬菌體展示肽 的濃度通過(guò)在大腸桿菌中擴(kuò)增而增加。
根據(jù)處理過(guò)程設(shè)計(jì)， 一旦所述過(guò)程已重復(fù)了 n次，可對(duì)從子庫(kù)n 中(或從任一其它的n個(gè)子庫(kù)中)隨機(jī)選擇的噬菌體克隆測(cè)試816其抑 制幼體(即發(fā)芽的夏孢子)生長(zhǎng)的能力。表現(xiàn)出成功抑制作用的候選肽 可作為將植物防御肽與植物表面蛋白基因(例如CKX)結(jié)合的融合基因 構(gòu)建體而提供818，在中間宿主(例如Pichia)中被擴(kuò)增820，以及最終用 于轉(zhuǎn)化822大豆或^H也蠶豆以賦予銹病抗性。
前述方法的具體實(shí)施方案可按5個(gè)部分來(lái)描述，A至E。
部分A涉及通過(guò)除去與植物組分發(fā)生作用的肽而制備子庫(kù)1。將 3.0 g的斑豆葉與7 ml緩沖液(20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA， pH 7.0)混合，然后將此混合物磨碎以提供勻漿。在2ml微管中，將0.9ml該勻 漿與O.l ml 10"噬菌體(f88-4/15-mer)合并以提供總計(jì)1013的病毒體。在 約23 。C的室溫下，將所得混合物在軌道式震蕩器(約500 rpm)孵育30分 鐘。使用常規(guī)的離心機(jī)在高速下將孵育的混合物離心5分鐘。將上清液 回收、保存、然后再次離心。該上清液用于噬菌體擴(kuò)增。
部分B涉及第一輪的生物淘洗。來(lái)自所選病原體約1.5百萬(wàn)孢子在 20C下、0.01。/。吐溫20和25ppmB-紫羅酮中培養(yǎng)5小時(shí)。加入1012 TU 噬菌體。將該混合物分到總體積為3 ml的2個(gè)微管中。將包含孢子/噬菌 體混合物的微管在約23 。C的室溫下、在軌道式震蕩器上(約500 rpm)孵 育30分鐘。離心分離孵育的混合物；除去上清液；加入0.5ml的水；以 及將剩余物合并到一個(gè)微管中。將合并的物質(zhì)離心分離；除去上清液； 以及用lml水洗滌該沉淀物。將此上清液去除的離心分離步驟和洗滌重 復(fù)10次。將150 |il的洗脫i爰沖液加入包含噬菌體和孢子的所述沉淀物11 中。將所述洗脫緩沖液混合均勻并在室溫下靜置該混合物5分鐘。然后 將該混合物離心分離并保存上清液。將75 pl洗脫緩沖液加入并混合以進(jìn) 行如前所述的另外的離心分離。合并所有上清液。使用210 ial洗脫緩沖 液進(jìn)行重復(fù)。加入44 pl的1 M Tris-HCl (pH 9.0)以中和洗脫的上清液。 將中和的上清液擴(kuò)增以產(chǎn)生子庫(kù)1。
部分C涉及制備子庫(kù)2。使用部分B中第一輪生物淘洗的擴(kuò)增的子 庫(kù)1產(chǎn)生子庫(kù)2。其完成是通過(guò)使用子庫(kù)1而不是部分A中最初的 f88-4/15-mer庫(kù)，但在其它方面仿效部分A的方案。
部分D涉及通過(guò)使用包括2、 3和4輪的更多生物淘洗輪次產(chǎn)生其他 的子庫(kù)。部分B纟皮重復(fù)3次
1. 對(duì)第2輪生物淘洗，使用來(lái)自第2子庫(kù)的4.2xlO"TU噬菌體以 產(chǎn)生子庫(kù)3;
2. 對(duì)第3輪生物淘洗，使用從第2次生物淘洗擴(kuò)增的5.6xl()UTU 噬菌體以產(chǎn)生子庫(kù)4;以及
3. 對(duì)第4輪生物淘洗，使用從第3次生物淘洗擴(kuò)增的5.1xl()HTU 噬菌體以產(chǎn)生子庫(kù)5。
將來(lái)自第4輪生物淘洗的菌落采集、測(cè)序并測(cè)試其對(duì)幼體生長(zhǎng)的抑制。部分E涉及測(cè)試對(duì)夏孢子生長(zhǎng)的抑制。將3 x 1012的30 pl發(fā)芽的孢 子(約250)在20 C過(guò)夜孵育。評(píng)價(jià)真菌胚芽管生長(zhǎng)(即幼體生長(zhǎng))并與作為 對(duì)照的水和f88，即沒(méi)有任何展示肽的單獨(dú)的噬菌體，進(jìn)行比較。
實(shí)施例10:通過(guò)阻止幼體(發(fā)芽的孢子)發(fā)育抑制疣頂單胞銹菌生長(zhǎng)的肽 對(duì)病原體疣頂單胞銹菌可重復(fù)實(shí)施例9的方法學(xué)。表3和表4顯示 可用于抑制從這些病原體發(fā)芽的夏孢子(幼體)生長(zhǎng)的肽。
表3
顯示對(duì)疣頂單胞銹菌的生長(zhǎng)很強(qiáng)抑制作用的肽
噬菌體肽克隆 序列 序列ID號(hào):
Pp 15 ADPCHMPPRMPPLPI 49
Pp 19 NHVSTLKTRHRLIPF 50
Pp 18 SSNAPPLSYPPIXVP 51
Pp31 TMARPIPTFLPPPSL 52
Pp 6 TVAPTTHRHYVWSMD 53
Pp 16 VFTPMNLSPPFMQPP 54
顯示對(duì)疣頂單胞銹菌的生長(zhǎng)中等抑制作用的肽:
噬菌體肽克隆序列序列ID號(hào):
Pp55AAGPNIPPPHRASTW55
Pp28AHLYSGASLYRVYRS56
Pp56GPPSILLAIGTLSLT57
Pp50LSSPYACALFVVKGA58
Pp39RGWSVSHHSLLMPVP59
Pp21RSTASPQALNPLVAS60
Pp53SLFFEVSRMLVRIXS61
Pp2SRWWRCVTMTQPCTT62
Pp37WAL證GWSPLRPPG63
實(shí)施例11:使用細(xì)胞分裂素氧化酶作為蛋白質(zhì)腳手架以傳輸所選肽至疣 頂單胞銹菌感染豆類(lèi)(菜豆)組織的部位
將CKX如上述修飾以融合表3和表4中的防御肽。進(jìn)行土壤桿菌國(guó)介導(dǎo)的菜豆的轉(zhuǎn)化以提供表達(dá)每種肽的植物。轉(zhuǎn)化的植物暴露于疣頂單 胞銹菌中。感染的比例和嚴(yán)重程度與對(duì)照植物比較以確定防御肽針對(duì)病 原體的效力。
實(shí)施例12:使用細(xì)胞分裂素氧化酶作為蛋白質(zhì)腳手架以傳輸所選肽至豆 薯層銹菌感染大豆(櫓豆)組織的部位
將CKX如上述修飾以融合表3和表4中的防御肽。進(jìn)行土壤桿菌-介導(dǎo)的大豆的轉(zhuǎn)化以提供表達(dá)每種肽的植物。轉(zhuǎn)化的植物暴露于豆薯層 銹菌中。感染的比例和嚴(yán)重程度與對(duì)照植物比較以確定防御肽針對(duì)病原 體的效力。
結(jié)論
根據(jù)本發(fā)明的詳細(xì)描述以及上述實(shí)施例，可理解，已實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明 的幾個(gè)方面。
應(yīng)理解，通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例已詳細(xì)描述了本發(fā)明，目的是使本領(lǐng)域 其他技術(shù)人員熟悉本發(fā)明、其原理以及其實(shí)際應(yīng)用。本發(fā)明具體的制劑 和方法并不限于提出的具體實(shí)施方案的描述，而寧可說(shuō)是根據(jù)所附權(quán)利 要求書(shū)及其等價(jià)物看待這些描述和實(shí)施例。當(dāng)以上的某些實(shí)施例和描述 包含某些關(guān)于本發(fā)明可能起作用的方式的結(jié)論時(shí)，本發(fā)明者并不意欲受 那些結(jié)論和作用約束，而僅作為可能的解釋將其提出。
應(yīng)進(jìn)一步理解，本發(fā)明提出的具體實(shí)施方案并不意味著是無(wú)遺漏的 或者限制本發(fā)明的，而根據(jù)前述實(shí)施例和詳細(xì)描述，其很多替換、修飾 和變化對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明的意圖是 包括所有那些落在以下權(quán)利要求的精神和范疇內(nèi)的替換、修飾和變化。
41參考文獻(xiàn)
以下文獻(xiàn)以引用的方式并入本文，如同本文將其全部?jī)?nèi)容公開(kāi)的程
度一樣
Barbas， C.F.， III. Burton, D.R,， Scott, J.K.， Silverman, GJ. (2001). Phage Display (喧菌體展示).A Laboratory Manual. Cold Spring harbor Laboratory Press.
Bishop-Hurley, S. L.， Schmidt, FJ" Erwin， A丄.，and Smith, A,L, (2005). Peptides Selected for Binding to a Virulent Strain of Haemophilus influenzae by Phage Display Are Bactericidal (為了通過(guò)喧菌體展示選 擇的結(jié)合流感嗜血桿菌的有毒菌林的肽是殺菌性的).Antimicrob. Agents Chemother. 49 2972-2978.
Bishop-Hurley, S., Schmidt, FJ" Smith, G.P.， Morris, R.O.， Elder, J" Roop, P.: and English, J.T. 2002. Phage display peptides that disrupt life-stage progression in Phytophthora (破壞疫霉菌屬生命階段進(jìn)展的噬菌體展 示肽).App. Env. Micro. 68:3315-3320.
Bonde, M.R., Melching, J.S., and Bromfield, K.R. 1976. Histology of the suscept- pathogen relationship between Glycine max and Phakopsora pachyrhizi， the cause of soybean rust 0魯豆和豆薯層4秀菌之間的感病體 -病原體關(guān)系的組織學(xué)，大豆銹病的根源).Phytopathology 66:1290-1294.
Cwirla， S.E.， Peters, E. A., Barrett, R. W.， and Dower， WJ. (1990). Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands (嗟菌體上的 肽鑒別配體的大量肽庫(kù)).Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382.
Fang, Z， Mounter, S. Simon, M., Schmidt, FJ" and English, J.T. (2004).
Protein scaffold design for delivery of peptides that induce encystment of Phytophthora capsici zoospores (傳輸"i秀導(dǎo)l束對(duì)杈疫霉菌游動(dòng)孢子成嚢的 蛋白質(zhì)腳手架設(shè)計(jì)).Abstract presented at the NSF Phytophthora Molecular Genetics Workshop. New Orleans, LA.
Healy, J.M" Murayama， O.， Maeda， T" Yoshino， K" Sekiguchi， K., and Kikuchi， M. (1995). Peptide ligands for integrin V3 selected fromrandom phage display libraries (選自隨4幾噬菌體展示庫(kù)的整合素V3的 肽配體).Biochemistry 34:3948-3955.
Hollier， C.A.， and King. S.B. 1985. Effects of temperature and relative humidity on germinability and infectivity of Puccinia polysora uredospores (溫度和相對(duì)濕度對(duì)多堆柄銹菌夏孢子的發(fā)芽力和傳染性 的影響).Plant Dis. 69:937-939.
Koch, E., and Hoppe， H.H. 1988. Development of infection structures by the direct- penetrating soybean rust fbngus (Phakopsora pachyrhizi Syd.) On artificial membranes (在人工膜上直接滲透大豆秀菌(豆薯層銹菌)的感 染結(jié)構(gòu)的開(kāi)發(fā)).J. Phytopathol. 122:232-244.
Koivunen, E., Gay, D. A., Ruoslahti, E. (1993). Selection of peptides binding to the 51 integrin from phage display library (乂人嗟菌體展示庫(kù)選擇與51 整合素結(jié)合的肽).J. Biol. Chem. 268:20205-20210
Koivunen, E.， Wang， B.， and Ruoslahti, E. (1994). Isolation of a highly
specific ligand for the 51 integrin from phage display library (從嗟菌體 展示庫(kù)分離51整合素的高特異性配體).J. Cell Biol. 124:373-380.
Laskey， J.T.， Bishop-H;urley， S.， Mounter, S.A.， English, J.T.， and Schrpidt， F丄(200). Phage國(guó)display peptides that disrupt developmental progression of Phytophthora species (破壞疫霉菌屬發(fā)育進(jìn)行的噬菌體展示肽). Phytopathology 91: S53.
Morris, R.O. 1997. Hormonal regulation of seed development (種子發(fā)育的激 素調(diào)節(jié))，ppl 17-149 in: Larkins， B.A., and Vasil, I.K., eds. Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publ., Boston.
Morris R.O" Bilyeu K.D.， Laskey J.G., Cheikh N.N. (1999) Isolation of a gene encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize (從玉米中 分離糖基化細(xì)胞分裂素氧化酶編碼基因).Biochemical & Biophysical Research Communications 255: 328-333.
O'Neil, K.T.， Hoess， R.H.， Jackson. S.A., Ramachandmn, N.S.， Mousa， S.A.， and DeGrado, W.F. (1992). Identification of novel peptide antagonistsfor GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage display library (從構(gòu)象上約束的噬菌體展示庫(kù)鑒別新的GPIIb/IIIa肽拮抗劑). Proteins 14:509-515.
Pasqualini, R.， Koivunen, E., Ruoslahti, E. (1995). A peptide isolated from phage display libraries is a structural mimic of an RGE-binding site on integrins (從噬菌體展示庫(kù)分離的肽是整合素上結(jié)合RGE部位的結(jié)構(gòu) 模擬物).j. Cell Biol. 130:1189-1196.
Pasqualini, R.， and Ruoslahti, E. 1996. Organ targeting in vivo using phage display peptide libraries (使用喧菌體展示肽庫(kù)的體內(nèi)器官耙向). Nature. 380:364-366.
Rizvi, A. 2004. Soybean Rust Colloquium, Annual Meeting of the Southern Soybean Disease Workers, St. Louis, MO.
Scott, J.K., and Smith, G.P. (1990). Searching for peptide ligands with an epitope library (利用表位庫(kù)篩選肽配體).Science 249:386-390.
Smith, J.W., Hu, D., Satterthwait, A., Pinz-Sweeney, S.， and Barbas III， CF. (1994). Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins (建鳥(niǎo)作為整合素的粘附配體的合成抗體),J. Biol. .Chem. 269:32788-32795.
Wilson, D.R" and Finlay, B.B. 1998. Phage display: applications, innovations: and issues in phage and host biology (喧菌體展示在喧菌體和宿主生物中 的應(yīng)用、新方法和問(wèn)題).Can. J. Microbiol. 44:313-329.
4權(quán)利要求
1. 鑒別對(duì)真菌表面有親和力的非免疫球蛋白肽的方法，其包括(a)通過(guò)以下構(gòu)建肽庫(kù)，(i)制備隨機(jī)寡核苷酸；(ii)將所述寡核苷酸插入適合的載體，所述載體在它的表面表達(dá)由所述隨機(jī)寡核苷酸編碼的肽并能夠轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(iii)用所述載體轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞來(lái)擴(kuò)增感染形式的所述載體以在所述載體表面上產(chǎn)生肽庫(kù)；(b)將表達(dá)所述肽庫(kù)的所述載體與靶真菌接觸并除去未結(jié)合的載體；(c)從所述真菌洗脫結(jié)合的載體；(d)擴(kuò)增所述結(jié)合的載體；(e)對(duì)包含于所述洗脫的載體中的寡核苷酸測(cè)序；(f)推導(dǎo)被包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸編碼的肽的氨基酸序列；以及(g)選擇非免疫球蛋白肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法， 一次。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法,
4. 如權(quán)利要求1所述的方法， 白的部分而表達(dá)。進(jìn)一步包括重復(fù)步驟(b)至(d)至少其中所述載體是融合噬菌體載體。 其中所述肽作為所述載體的外殼蛋
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括疫霉菌屬 (P一op禍ora)的成員。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括辣椒疫霉菌
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括豆薯層銹菌
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括疣頂單胞銹菌
9. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述靶真菌包括銹病病原體。
10. 重組多核苷酸，其包含編碼植物防御肽的序列，所述肽選自 SEQIDNO:49、 SEQIDNO:50、 SEQIDNO:51、 SEQIDNO:52、 SEQ ID NO: 53 、 SEQ ID NO: 54及其組合。
11. 如權(quán)利要求10所述的重組多核苷酸，進(jìn)一步編碼附于所述植物 防御肽的植物多肽以將植物防御肽提呈至靶病原體。
12. 如權(quán)利要求10所述的重組多核苷酸，其中所述植物多肽包括 CKX。
13. 權(quán)利要求10所述的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
14. 包含編碼肽的核苷酸序列的重組載體，所述肽選自SEQ ID NO: 55、 SEQ ID NO: 56、 SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 58、 SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60、 SEQ ID NO: 61 、 SEQ ID NO: 62、 SEQ ID NO: 63及其組合。
15. 權(quán)利要求14所述的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物。
16. 如權(quán)利要求14所述的重組多核苷酸，進(jìn)一步編碼附于所述植物防御肽的植物多肽以提呈所述植物防御肽至靶病原體。
17. 如權(quán)利要求18所述的重組多核苷酸，其中所述植物多肽包括CKX。
18. 基于影響真菌發(fā)育的能力來(lái)篩選肽的方法，其包括(a) 通過(guò)以下構(gòu)建肽庫(kù)，(i) 制備隨機(jī)寡核苷酸；(ii) 將所述寡核苷酸插入適合的載體，所述載體在其表面表達(dá) 由所述隨機(jī)寡核苷酸編碼的肽并能夠轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；(iii) 用所述載體轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞而擴(kuò)增感染形式的所述 載體以在所述載體上產(chǎn)生肽庫(kù)；(b) 將表達(dá)所述肽庫(kù)的所述載體與靶真菌接觸并除去未結(jié)合的載體；(c) 從所述真菌洗脫結(jié)合的載體；(d) 擴(kuò)增所述結(jié)合的載體；(e) 分離包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸；(f) 產(chǎn)生由包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸編碼的肽；.(g) 將所述肽與靶真菌接觸；以及(h) 測(cè)定所述肽對(duì)所述真菌的影響。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，進(jìn)一步包括至少一次地重復(fù)步驟(b) 到d)。
全文摘要
本發(fā)明提供了鑒別與真菌表面有親和力的肽的方法，同時(shí)也是鑒別能夠影響真菌發(fā)育的肽的方法。還提供了包含使用本發(fā)明方法鑒別的肽的組合物。此外，提供了能夠表達(dá)根據(jù)本發(fā)明方法鑒別的肽的分離的多核苷酸、載體、表達(dá)盒以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101473226SQ200680036777
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2006年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日
發(fā)明者加里·斯泰希, 弗朗西斯·J·施米特, 方志偉, 詹姆士·T·英格利希 申請(qǐng)人:密蘇里大學(xué)管委會(huì)