專利名稱：：用于檢測(cè)分析物的光譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，所述方法包括提供分析物與銪(europium)(或4戈(terbium))穴合物(cryptate)熒光團(tuán)的接合物以及指定量的對(duì)分析物特異的抗體，和指定量的對(duì)銪(鋱)穴合物熒光團(tuán)特異的抗體，以及光譜法測(cè)定在添加分析物時(shí)所發(fā)生的熒光猝滅(quenching)。此外，本發(fā)明涉及分析物與銪(鋱)穴合物熒光團(tuán)的接合物，也涉及一種含有檢測(cè)一種或一種以上分析物所需的組分的試劑盒(kit)。
背景技術(shù)：
：已知使用特異性抗體來檢測(cè)不同分析物的各種方法。舉例來說，EP0343346B描述了一種熒光免疫分析法。US4,261,968描述了一種使用抗體和熒光猝滅劑來檢測(cè)分析物的方法，其中熒光摔滅的程度與待測(cè)定的分析物的量直接相關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種可普遍應(yīng)用于任何物質(zhì)的檢測(cè)的簡(jiǎn)單方法，以及旨在提供適用于所述方法的化合物。所述目的是通過本發(fā)明獨(dú)立項(xiàng)的技術(shù)教示來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的其他有利實(shí)施例由附屬項(xiàng)、描述以及實(shí)例產(chǎn)生。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供以下三種組分分析物與銪穴合物萸光團(tuán)的接合物，對(duì)分析物特異的抗體，以及對(duì)銪穴合物熒光團(tuán)特異的抗體，其中分析物與銪穴合物焚光團(tuán)的接合物僅允許同時(shí)結(jié)合一種單一抗體，b)添力口分析物，以及c)光譜法測(cè)量銪穴合物炎光團(tuán)的熒光。同樣，可使用鋱代替銪，因此在本文中給出的任何詳述對(duì)銪和鋱都是適用的。因此，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供以下三種組分分析物與鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，對(duì)分析物特異的抗體，以及對(duì)鋱穴合物熒光團(tuán)特異的抗體，體，合一種單一抗b)添加分析物，以及c)光譜法測(cè)量鋱穴合物熒光團(tuán)的熒光。對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的方法來說需要三種組分第一，待檢測(cè)的物質(zhì)(即分析物)與熒光團(tuán)的接合物，以及第二，對(duì)待判定的物質(zhì)特異的抗體，以及第三，對(duì)熒光團(tuán)特異的第二抗體。過氧化氫為第四優(yōu)選組分。所述組分的功能更詳細(xì)地描述于下文中。其存在或其濃度有待測(cè)定的分析物可被視為另一組分。然而，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的分析也可用于檢測(cè)某一分析物的不存在，所以所述組分并非強(qiáng)制性的。圖1:檢測(cè)針對(duì)TBP銪穴合物的血清抗體對(duì)TBP銪穴合物的結(jié)合圖3:檢測(cè)分析物結(jié)合抗體對(duì)熒光團(tuán)結(jié)合抗體的置換、、I圖4:免疫血清對(duì)[EuL]-BSA接合物熒光的猝滅圖5:4全測(cè)利用抗P0D血清對(duì)與Eu(NHj-P0D形成4建結(jié)的G24-BA9的置換圖6:檢測(cè)利用結(jié)合POD的單克隆抗體對(duì)與Eu(NH2)-P0D形成鍵結(jié)的G24-BA9的置換圖7:在焚光猝滅免疫分析中測(cè)定生物素(維生素H)濃度圖8:利用過氧化氫增加TBP銪穴合物的發(fā)光圖9:測(cè)試免疫血清猝滅[EuL]-BSA接合物發(fā)光的特性具體實(shí)施方式如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"熒光"或"熒光猝滅，，旨在描述任何發(fā)光效應(yīng)；因此其包含磷光，因此術(shù)語(yǔ)"熒光，，或"熒光猝滅"也包括"磷光"或"磷光猝滅"。一般來說，可使用目前所有類型的抗體，諸如多克隆抗體(polyclonalantibody)、單克隆抗體(monoclonalantibody)、人源化抗體(humanizedantibody)、人類抗體(humanantibody)、嵌合抗體(chimericantibody)、重組抗體(recombinantantibody)、雙特異性抗體(bispecificantibody)以及抗體片^殳(antibodyfragment),其中優(yōu)選單克隆抗體。可使用抗體片段、適體(aptamer)、模擬表位(mimotope)、fab片段、fc片段、肽(peptide)、凝集素(lectin)、核苷酸(nucleotide),肽才莫擬物(peptidomimetic)、gapraer、核糖酶(ribozyme)、CpG-寡聚物(CpG-oligomer)、DM酶(DNAzyme)、核糖開關(guān)(riboswitche)'或脂質(zhì)(lipid)來代替抗體。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知制備所述化合物(尤其抗體以及單克隆抗體)的方法。優(yōu)選以限定且已知比率使用對(duì)分析物特異的抗體(分析物特異性抗體)和對(duì)分析物與熒光團(tuán)的接合物特異的抗體(熒光團(tuán)特異性抗體)。術(shù)語(yǔ)分析物特異性抗體描述與分析物特異性結(jié)合的抗體，其中，關(guān)于所述^:結(jié)，無^r分析物是完全或僅部分地被抗體結(jié)合，或無論連接基團(tuán)及/或焚光團(tuán)的一部分也被抗體結(jié)合，或無論甚至連接基團(tuán)及/或熒光團(tuán)完全牽涉進(jìn)鍵結(jié)中，都沒有關(guān)系。唯一重要的方面在于，結(jié)合應(yīng)以使第二分析物特異性抗體或熒光團(tuán)特異性抗體均不能結(jié)合的方式發(fā)生。類似地，關(guān)于熒光團(tuán)特異性抗體來說，無論所述抗體是完全或僅部分地結(jié)合焚光團(tuán)，且無論連接基團(tuán)及/或分析物是完全或部分地牽涉進(jìn)鍵結(jié)中，都沒有關(guān)系。熒光團(tuán)特異性抗體也應(yīng)以使分析物特異性抗體或另一熒光團(tuán)特異性抗體均不能結(jié)合的方式結(jié)合。因此，抗體鍵結(jié)類型不是本發(fā)明的實(shí)質(zhì)方面，只要其他抗體不同時(shí)發(fā)生結(jié)合即可。設(shè)計(jì)分析物/熒光團(tuán)接合物使得僅一種單一抗體可同時(shí)與其結(jié)合。因此，兩種分析物特異性抗體或兩種熒光團(tuán)特異性抗體或一種分析物特異性抗體與一種熒光團(tuán)特異性抗體的同時(shí)結(jié)合被排除。此外，本發(fā)明是基于以下原則分析物熒光團(tuán)接合物的焚光不受分析物特異性抗體結(jié)合顯著影響，而熒光團(tuán)特異性抗體的結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅或至少熒光可測(cè)量地降低。如果提供所迷三種組分(即接合物和分析物特異性抗體和焚光團(tuán)特異性抗體)的溶液，那么溶液中的接合物是由兩種抗體中的一者結(jié)合；因此，(例如)其在50%的程度上是由分析物特異性抗體結(jié)合，且在約50%的程度上是由熒光團(tuán)特異性抗體結(jié)合。存在少量未結(jié)合形式。如果將含有待檢測(cè)物質(zhì)(即分析物)的樣品溶液添加到所述溶液中，那么分析物與含有分析物的接合物竟?fàn)幏治鑫锾禺愋钥贵w上的結(jié)合位點(diǎn)(bondingsite)。因此，與接合物結(jié)合的分析物特異性抗體的部分釋放接合物并與待檢測(cè)物質(zhì)(即分析物)結(jié)合。所述程序?qū)е掠坞x接合物的濃度增加，但是，游離接合物立即被溶液中過量存在的熒光團(tuán)特異性抗體結(jié)合。由于熒光團(tuán)特異性抗體的結(jié)合，熒光被猝滅，這可利用光譜法進(jìn)行測(cè)量。溶液熒光降低指示待檢測(cè)物質(zhì)(分析物)的存在，其中熒光猝滅的程度表明樣品溶液中分析物的量。因此，本發(fā)明的方法是基于以下一般原則在熒光降低與某一分析物的存在以及濃度之間建立關(guān)系。顯然，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)顯而易見，可使用在與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))結(jié)合時(shí)或在與分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))的接合物結(jié)合時(shí)增強(qiáng)或可測(cè)量地增加熒光團(tuán)的熒光的逸些抗體來代替熒光猝滅抗體。表達(dá)"可測(cè)量地增加，，描述能利用光語(yǔ)法清楚測(cè)定且能從背景熒光識(shí)別的增加。在所述的本發(fā)明方法中，熒光增加的程度與待測(cè)量分析物的濃度相關(guān)。因此，本發(fā)明特別涉及能夠與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))及/或分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物焚光團(tuán))的接合物結(jié)合且由于所述鍵結(jié)而能夠猝滅或可測(cè)量地降低焚光團(tuán)焚光的抗體。另一方面，本發(fā)明也涉及能夠與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))及/或分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))的接合物結(jié)合且由于所述鍵結(jié)而能夠增強(qiáng)或可測(cè)量地增加熒光團(tuán)的熒光的抗體。優(yōu)選使用的銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物萸光團(tuán))為在本文中所述的那些。本發(fā)明的抗體是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如)利用雜交瘤4支術(shù)(K5hler和Milstein，Nature1975，256，495—497)，通過^f吏用EpsteinBarr病毒、Xeno小鼠或利用在細(xì)胞培養(yǎng)物中永久存活且產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(Pasqualini和Arap，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004,6，257-259)來制備。此外，抗體可衍生自(例如)利用噬菌體呈現(xiàn)或核糖體呈現(xiàn)或類似技術(shù)所產(chǎn)生的重組抗體庫(kù)。降低螯合物結(jié)合(chelatebound)或穴合物結(jié)合鑭系元素(尤其銪(Eu3+)以及鋱(b3+))的熒光的抗體或增強(qiáng)螯合物結(jié)合或穴合物結(jié)合鑭系元素(尤其銪(Eu3+)以及鋱(b3+))的熒光的抗體可用于建立各種測(cè)量系統(tǒng)。特別是，這關(guān)系到這些抗體在具有所需特異性的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的篩選程序以及相對(duì)于已知抗體的結(jié)合親和力的抗體親和力測(cè)定中的應(yīng)用。類似地，這些抗體可用于發(fā)展基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的免疫分析。在本文中所述的應(yīng)用是針對(duì)在均相分析中在溶液中^f吏用前述抗體。顯然，正如本發(fā)明的抗體，當(dāng)實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)時(shí)，也可使用固相分析(尤其微陣列形式)中的這些抗體。以下才羊品可4爭(zhēng)別用作片羊品溶液唾液才羊品、血液才羊品、尿才羊品、粘液樣品、消化組織樣品、水樣品、廢水樣品、來自化學(xué)生產(chǎn)過程的樣品、提取土壤樣品、食物樣品、來自生物以及生物化學(xué)生產(chǎn)過程的樣品、發(fā)酵溶液以及其類似物。尤其優(yōu)選血清樣品以及前述種類的稀釋樣品或(例如)土壤樣品、粘液樣品、發(fā)酵溶液以及其類似物的稀釋提取物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)顯而易見用于光譜分析方法的適合稀釋溶液的制備。針對(duì)其產(chǎn)生抗體且可與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))結(jié)合的任何分析物可用作待檢測(cè)物質(zhì)。優(yōu)選可能經(jīng)由分析物的連接基團(tuán)與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))形成共價(jià)鍵。連接基團(tuán)位于分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))之間，且可由增加分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))之間距離的任何化學(xué)組分或片段組成，其中所述距離不應(yīng)過大，否則正是由于分析物與銪穴合物菱光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))之間的距離，會(huì)使分析物特異性抗體與熒光團(tuán)特異性抗體的同時(shí)結(jié)合成為可能。可能分析物的實(shí)例包含人類診斷學(xué)分析物病原體病毒例如麻滲(measles)、流感(influenza)、SARS、HIV、肝炎(hepatitis)、皰滲(herpes)、蜱媒腦膜腦炎(tick-bornmeningoencephalitis)等。朊病毒纟田菌如J》口月申纟吉才亥(tuberculosi)、萊姆病(Lymedisease)、霍舌L(cholera)、百曰咳(pertussis)等。寄生蟲侈O口癡疾(malaria)、利4十曼原蟲(leishmania)等。腫瘤標(biāo)記腫瘤標(biāo)記的實(shí)例包含P2樣0求蛋白(beta2microglobulin),鐵蛋白(ferritin)、p53、促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotropin)(ACTH)、生長(zhǎng)激素(growthhormone,GH、hGH)、催乳素(prolactin,PRL)、絨毛膜促性&泉激素(chorionicgonadotropin,hCG和CG)、降鈣素(calcitonin,CT)、曱狀腺球蛋白(t'hyroglobulin,tg)、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)、CA抗原125、72-4、15-3以及19—9、a-胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、前列A泉特異性抗原(prostatespecificantigen,PSA)、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶II(galactosyltransferase11)。病原體的實(shí)例包含布魯氏菌(brucella)IgG和IgM;月申炎衣原體(chlamydiapneumonia)IgA、IgG禾口IgM;沙目艮衣原體(chlamydiatrachomatis)IgA、IgG和IgM;CMVIgG和IgM;登革病毒(Denguevirus)IgG和IgM;EBV-VCAIgA、IgG和IgM;幽門螺桿菌(H.pylori)IgA、IgG和IgM;HSV1+2IgG和IgM;麻滲IgG和IgM;腮腺炎(m卿s)IgG和IgM;支原體(mycoplasma)IgG和IgM;風(fēng)滲(rubella)IgG和IgM;沙門氏菌(salmonella)IgG和IgM;弓形蟲(toxoplasma)IgA、IgG和IgM;梅毒螺旋體(treponimapal1idum)IgG和IgM;VZVIgG和IgM;肝炎A、B、C;HIVl、2。藥物例如抗生素(氨芐西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin),青霉素(penici11in)等)細(xì)月包抑制劑(阿霉素(doxorubicin),順鉑(cisplatin)等)精神活性物質(zhì)麻醉劑止痛劑心臟藥物凝結(jié)抑制劑代謝物例如激素(類固醇激素(steroidhormone)、促性A良激素(gonadotropin)等)白細(xì)胞介素與細(xì)胞因子等三碘曱狀腺原氨酸(triiodothyronine)血漿蛋白(plasmaprotein)酶(分泌酶(secretase)、月旨肪酶(1ipase)、磷酸酶(phosphatase)等)脂質(zhì)(膽固醇(cholesterol)等)疾病因子(自體免疫診斷學(xué)(autoimmunediagnostic)等)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)耙標(biāo)興奮劑(安非他明(amphetamine)、生長(zhǎng)激素(growthhormone)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EP0)等)毒品例如海洛因(heroin)、可卡因(cocaine)、LSD等毒素真菌毒素、細(xì)菌毒素霍亂毒素、百曰咳毒素等抗生素、抗真菌素以及抗病毒藥物的實(shí)例包含無環(huán)鳥苷(acyclovir)、氨千西林、阿莫西林、氨基糖苷類、兩性霉素B(amphotericinB)、阿奇審素(azithromycin)、頭孑包峻片木(cefazolin)、頭孑包p比將(cefepime)、頭孑包p塞將(cefotaxime)、頭孑包替iS(cefotetan)、頭孢泊將(cefpodoxime)、頭孢他。定(ceftazidime)、頭孢唑肝(ceftizoxime)、頭孑包曲^公(ceftriaxone)、頭孑包p夫辛(cefuroxime)、頭孑包氨卡(cephalexin)、氯霉素(chloramphenicol)、克霉唾(clotrimazole)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin),克拉霉素(clarithromycin),克林霉素(clindamycin)、氨苯砜(dapsone)、雙氯西林(dicloxaci11in)、多西環(huán)素(doxycycline)、乳糖酸紅霉素(erythromycinlactobionate)、氟康哇(fluconazole)、膦曱酸(foscarnet)、更昔洛韋(ganciclovir)、力口替沙星(gatifloxacin)、亞胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)、異煙耕(isoniazid)、4尹曲康口坐(itraconazole)、酉同康口坐(ketoconazole)、甲硝峻(metronidazole)、萘夫西林(nafcillin)、p夫響妥因(nitrofurantoin),制霉菌素(nystatin)、噴他脒(pentamidine)、青審素、p底4i西;f木(piperacillin)"也峻巴坦(tazobactam)、利S畐平(rifampin)、套奴普丁(quinupristin)/達(dá)福普汀(dalfopristin)、替卡西林(ticarcillin)/克拉維酸鹽(clavulanate)、甲氧卡氨嘧咬-石黃胺甲基異噁口坐(trimethoprimsulfamethoxazole)、伐昔洛韋(valacyclovir)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)。激素的實(shí)例包含ACTH、C-肽、皮質(zhì)醇(Cortisol)、DHEA-S、雌二醇(estradiol),雌三醇(estriol)、睪酮(testosterone),胰島素(insulin)、姨島素原(proinsulin)、孕西同(progestrone)、PTH。白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子的實(shí)例包含促纟工纟田月包生成素、人類生長(zhǎng)5斂素(humangrowthhormone,hGH)、白纟田月包介素1至18、月中瘤壞死因子一a、p(tumornecrosisfactor—，(3，TNF-a、p)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)、4立會(huì)田月包(granulocyte)、巨口藍(lán)纟田月包(macrophage)、斗立纟田月包/巨p藍(lán)纟田月包集落刺激因子(colonystimulatingfactor)(G-CSF、M—CSF、GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血小板生長(zhǎng)因子(plateletgrowthfactor,PGF)、氮氧化物(nitrogenoxide)、白三彿(leukotriene)。血漿蛋白以及其他血漿分子的實(shí)例包含C-反應(yīng)性蛋白(C-reactiveprotein,CRP)、白蛋白(albumin)、凝結(jié)因子(coagulationfactor)、補(bǔ)體因子(complementfactor)、'免疫球蛋白(immunoglobulin)(IgA、IgE、IgG、IgM)、碌月旨酶(phosoholipase)、力口壓素(vasopressin),同型半胱氨酸(homocystein)、肌紅蛋白(myoglobin)、肌鈣蛋白I(troponinI)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)、胰島素、血型鑒定(bloodgroupdetermination)、恒河因子(rhesusfactor)、a淀粉酶(alphaamylase)、膽堿酉旨酶(cholinesterase)、月幾酸激酶(creatinekinase)、y_GT、G0T/ASAT、GPT/ALAT、LDH、胰脂肪酶(pancreaticlipase)、石粦酸酶、膽紅素(bilirubin),葡萄糖(glucose)、月幾酐(creatinine),月旨蛋白(1ipoprotein)。自體免疫診斷學(xué)的實(shí)例包含ACAIgG、ANAScreenIgG、心磷脂(cardiolipin)IgA、心磷脂IgG、心磷月旨IgM、心磷脂總ab、dsDNAIgG、線粒體(mitochondrial,MA)ab、RNP/SmIgG、Scl-70、SmIgG、SSAIgG、SSBIgG、曱狀腺球蛋白ab、曱狀腺過氧化物酶(thyroidperoxidase,TP0)IgG運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)把標(biāo)興奮劑(安非他明、生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素等)毒品例如海洛因、可卡因、LSD等以及其降解產(chǎn)物毒素真菌毒素、細(xì)菌毒素霍亂毒素、百曰咳毒素等興奮劑的實(shí)例包含合成^i射劑，例如勃4立睪酮(bolasterone)、勃地酮(boldenone)、脫氫氯曱基睪S同(dehydrochloromethyltestosterone)、二氫睪酮(dihydrotestosterone)、氣司關(guān)#凈力(clostebol)、氣甲華酉同(fluoxymesterone)、美華酉同(mesterolone)、美i,酉同(metandienone)、美替i若龍(metenolone)、甲華S同(methyltestosterone)、i若龍(nandrolone)、諾乙雄龍(norethandrolone)、氧雄龍(oxandrolone)、^至甲華酉同(oxymesterone)、#5甲*希龍(oxymetholone);司is口坐酉孚(stanozolol)、睪酮以及化學(xué)或藥學(xué)上相關(guān)的化合物;3-2激動(dòng)劑(beta-2agonist)(例如克倫特羅(clenbuterol));安非他明例如安咪奈丁(amineptine)、《非^也明、*非^f也(amphetamini1)、，非^f也明(benzphetamine)、二曱基安非他明(dimethylamphetamine)、乙基安非他明(ethylamphetamine)、芬乙茶堿(fenety11ine)、芬普雷司(fe叩roporex)、吹芬雷司(furfenorex)、美沙卡伯(mesocarb)、曱氧那明(methoxyphenamine)、曱安一lM也明(methylamphetamin)、口底曱酉旨(methylphenidate)、嗎拉宗(morazone)、匹莫林(pemoline)、苯曱曲秦(phendimetrazine)、口底苯曱醇(pipradol)、p比略戊嗣(pyrovalerone)以及化學(xué)或藥學(xué)上相關(guān)的化合物；用于口服、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)投藥的皮質(zhì)類固醇(corticosteroid);肽激素以及其類似物例如絨毛膜促性腺激素HCG(人類性激素(humansexhormone))、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、生長(zhǎng)激素(HGH、促生長(zhǎng)激素(somatotropin))、促紅細(xì)胞生成素。自上述物質(zhì)釋放的任何相應(yīng)因子同樣被禁止。刺;斂齊寸例^口阿米笨p坐(amiphenazole)、咖p非因(coffein)、去曱^為麻黃威(cathin)、氯苯丁胺(chlorphentermine)、氯千雷司(clobenzorex)、氯丙那林(clorprenaline)、克羅丙胺(cropropamide)、克羅乙胺(crotethamide)、麻黃堿(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、香草二乙胺(etamivan)、芬坎法明(fencamfamin)、美芬雷司(mefenorex)、曱麻黃堿(methylephedrine)、尼可剎米.(nikethamide)、戊四唾(pentetrazole)、笨丙醇胺(phenylpropanolamine)、普羅才木坦(prolintane)、丙己君(propylhexedrine)、士的寧(strychnine)以及化學(xué)或藥學(xué)上相關(guān)的化合物。麻醉劑/止痛劑例如阿法羅定(alphaprodine)、阿尼利定(anileridine)、丁丙諾啡(buprenorphine)、右嗎拉胺(dextromoramide)、右丙氧芬(dextropropoxyphen)、二醋口馬口非(diamorphine)、；也匹口底酉同(dipipanone)、依索庚漆(ethoheptazine)、乙基嗎啡(ethylmorphine)、左p非i若(levorphanol)、美沙、酉同(methadone)、口馬口非(morphine)、纟內(nèi)布口非(nalbuphine),戊峻星(pentazocine)、口底替口定(pethidine)、三曱利定(trimeperidine)以及化學(xué)或藥學(xué)上相關(guān)的化合物。毒品的實(shí)例包含安非他明、巴比妥酸鹽(barbiturate)、苯并二氮卓(benzodiazepine)、大麻素(cannabinoid)、可卡因代謝產(chǎn)物(cocainemetabolite)、可替寧(cotinine)、芬太尼(fentanyl)、氟硝西泮(flunitrazepam)、LSD、曱安非他明、嗎啡、鴉片劑(opiate)、PCP、三環(huán)化合物(tricyclic)。獸醫(yī)學(xué)分析物病原體、藥物、代謝物、興奮劑、毒素等。環(huán)境診斷學(xué)分析物(空氣、水以及土壤分析)有害物質(zhì)農(nóng)藥(PCB、阿特拉津(atrazine)等)殺蟲劑(擬除蟲菊酯(pyrethroid)、蘇蕓金桿菌(bacillusthuringiensis)毒素等)木材防腐劑(林丹(Lindan)等).除草劑(敵草隆(diuron)、滅草隆(monuron)等)殺真菌劑毒素以及爆炸物(例如二惡英(dioxin)、TNT等)色料與清漆環(huán)境污染物、有毒物質(zhì)色料與清漆的實(shí)例包含鄰苯二曱酸鹽(phthalate)、偶氮染料(azodye)、乙二醇酸(glycolether)、乙二醇酉旨(glycolester)、二.惡英。殺蟲劑的實(shí)例包含樂果(dimethoate)、溴氰菊酯(deltamethrin)、除蟲脲(diflubenzuron)、a-氯氰菊酉旨(alpha-cypermethrin)、；-氯氰菊酉旨(zeta—cypermethrin)、苯氧威(fenoxycarb)、p比蟲葛胺(tebufenpyrad)、抗蟲牙威(pirimicarb)、印楝素(azadirachtin)、胡椒基丁醚(piperonylbutoxide)、除蟲菊內(nèi)酯(pyrethrine)、氟鼠靈(flocoumafen)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氣菊酉旨(permethrin)、chalcogran、姿二婦甲酸甲酉旨(decadienecarboxylicacidmethylester)、齒小蠹二烯醇(ipsdienol)、(S)-順-馬鞭草烯醇((S)-cis-verbenol)、曱基丁烯醇(methylbutenol)。農(nóng)藥的實(shí)例包含3，4，5-混殺威(3，4，5-trimethacarb)、3-羥基呋喃丹(3—hydroxycarbofuran)、5_，5基_婦草酉同石風(fēng)(5—hydroxy—clethodimsulfone)、5—^5基p比蟲p林(5—hydroxyimidacloprid)、5—,5基p塞笨p達(dá)峻(5-hydroxythiabendazole),6-氯-3-苯基-。達(dá)。秦-4-O達(dá)草特代謝物)(6_chloro_3_phenyl_pyridazine-4-(pyridatemetabolite))、乙酰曱胺磷(acephate)、咬蟲咪(acetamiprid)、曱基苯丙漆二峻(acibenz'olar-S-methyl)、苯草醚(aclonifen)、氟丙菊酯(acrinathrin)、曱草胺(alachlor)、弟滅威(aldicarb)、弟滅威亞砜(aldicarbsulfoxide)、氧弟滅威(aldoxycarb)、莠滅凈(ametryn)、酰嘧碌隆(amidosulfuron)、滅害威(aminocarb)、敵菌靈(anilazine)、阿特拉津、阿維菌素Bla(avermectinBla)、阿維菌素Blb、曱基口比口定磷(azamethiphos)、乙基谷硫磷(azi叩hos-ethyl)、曱基谷硫磷(azinphos-methyl)、嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜靈(benalaxyl)、噁蟲威(bendiocarb)、丙石克克百威(benfuracarb)、千嘧磺隆(bensulfuronmethyl)、苯螨特(benzoximate)、曱羧除草醚(bifenox)、聯(lián)苯菊酯(bitertanol)、。定酰菌胺(boscalid)、除草定(bromaci1)、糠菌唾(bromuconazole)、乙嘧紛石黃氛酉旨(bupirimate)、p塞口秦酉同(buprofezin)、丁酉同威(butocarboxim)、丁酉同威亞'石風(fēng)(butocarboximsulfoxide)、丁酉同石風(fēng)威(butoxycarboxim)、炔草隆(buturon)、胺曱萘(carbaryl)、多菌靈(carbendazim)、卡草胺(carbetamide)、克百威(carbofuran)、丁疏克百威(carbosulfan)、萎4秀靈(carboxin)、峻酉同草酉旨(carfentrazone—ethyl)、氣5臭隆(chlorbromuron)、毒蟲畏(chlorfenvinphos)、氟蟲隆(chlorfluazuron)、殺草每文(chloridazon)、纟錄麥隆(chlorotoluron)、^古草隆(chloroxuron)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯磺隆(chlorsulfuron)、蟲螨磷(chlorthiophos)、醚石黃隆(cinosulfuron)、烯草酮(clethodim)、烯草酉同亞胺石風(fēng)(clethodimiminesulfone)、丈希草酉同亞胺亞石風(fēng)(clethodimiminesulfoxide)、,希草酉同石風(fēng)(clethodimsulfone)、歸草酉同亞石風(fēng)(clethodimsulfoxide)、炔草酸(clodinafop-propargyl)、四蟎漆(clofentezine)、廣滅靈(clomazone)、二氣p比口定酉菱(clopyralid)、解毒p套(cloquintocet-mexyl)、蟲亂毒碌(couraaphos)、氛草津(cyanazine)、笨腈膦(cyanofenphos)、氰霜峻(cyazofamid)、環(huán)草特(cycloate)、霜脲氛(cymoxanil)、嘧菌環(huán)胺(cyprodini1)、滅蟲是胺(cyromazine)、丁跣肼(daminozide)、淡氰菊酯(deltamethrin)、曱基內(nèi)吸磷(demeton-s-methyl)、曱基內(nèi)吸磷砜(demeton-s-methyl-sulfone)、甜菜安(desmedipham)、脫曱基曱酰胺基抗蚜威(desmethylformamido-pirimicarb)、脫曱基抗蟲牙.威(desmethyl-pirimicarb)、氯亞胺硫磷(dialifos)、燕麥敵(di-allate)、二漆農(nóng)(diazi廳)、苯氟磺胺(dichlofluanid)、敵敵畏(dichlorvos)、千氯三唑醇(diclobutrazol)、乙霉威(diethofencarb)、苯醚曱環(huán)峻(difenoconazole)、枯莠隆(difenoxuron)、p比氟草胺(diflufenican)、惡峻隆(dimefuron)、二曱草胺(dimethachlor)、二曱酚p塞草胺(dimethe翻id)、樂果、蹄酰嗎啉(dimethomorph)、烯哇醇(diniconazole)、二苯胺(diphenylamine)、乙拌碌(disulfoton)、敵草隆、嗎菌靈(dodemorph)、EPN、氟環(huán)峻(epoxiconazole)、乙硫苯威(ethiofencarb)、乙石克苯威石風(fēng)(ethiofencarbsulfone)、乙疏苯威亞諷(ethiofencarbsulfoxide)、乙石克磷(ethion)、乙嘧酚(ethirimol)、乙吹草黃(ethofumesate)、滅線石粦(ethoprophos)、醚菊酉旨(etofe寧ox)、乙氧口密口定石辟(etrimfos)、惡-口坐菌酉同(famoxadone)、笨纟戔石舞(fenamiphos)、氣笨嗜口定醇(fenarimol)、口全竭酸(fenazaquin)、月青苯口坐(fenbuconazole)、甲吹酰胺(fenfuram)、環(huán)酰菌胺(fenhexamid)、惡唑禾草靈(fenoxaprop-ethyl)、雙氧威(fenoxycarb)、拌種咯(fenpicloni1)、曱氰菊酉旨(fe叩ropathrin)、苯銹口定(fe叩ropidin)、芬普福(fenpropimorph)、哇蟎酉旨(fe叩yroximate)、倍石危石粦(fenthion)、非草隆(fenuron)、麥草氣異丙酉旨(flamprop—isopropyl)、麥草氣甲酉旨(flamprop-methyl)、咬嘧磺隆(flazasulfuron)、雙氟磺草胺(florasulam)、口比氟丁禾靈(fluazifop_butyl)、氣p塞草胺(flufenacet)、氟蟲脲(flufenoxuron)、伏草隆(fluometuron)、乙羧氟草醚(fluoroglycofene—ethyl)、氣p查峻(fluquinconazole)、氣口定酉同(fluridone)、氣草^因(fluroxypyr—meptyl)、p夫草酉同(flurtamone)、氣硅哇(flusilazole)、粉唑醇(flutriafol)、滅菌丹(folpet)、地蟲硫磷(fonofos)、虔唑硫磷(fosthiazate)、麥穗寧(fuberidazole)、吹線威(furathiocarb)、p比氟曱禾靈(haloxyfop-etotyl)、他氟禾草靈(haloxyfop-methyl)、庚烯石壽(heptenophos)、己峻醇(hexaconazole)、3不口秦酉同(hexazinone)、"塞蟲禹酉同(hexythiazox)、4中審口坐(imazalil)、p比蟲啉(imidacloprid)、茚蟲威(indoxacarb)、石典曱磺隆(iodosulfuron-methyl)、異菌脈(iprodione)、異丙菌胺(iprovalicarb)、氯峻磷(isazophos)、異杉p磷(isofenphos)、異丙隆(isoproturon)、惡唑磷(isoxathion)、醚菌酉旨(kresoxim—methyl)、利谷隆(linuron)、馬拉氧磷(malaoxon)、馬拉硫磷(malathion)、MCPA-butotyl、滅坊磷(mecarbam)、滅;泉4木(mepanipyrim)、曱霜靈(metalaxyl)、笨口秦草S同(metamitron)、口比草胺(metazachlor)、葉菌口生(metconazole)、甲基笨漆隆(methabenzthiazuron)、曱胺磷(methamidophos)、吹菌胺(methfuroxam)、殺樸碌(methidathion)、滅梭威(methiocarb)、滅多威(methomyl)、曱氧蟲酰肼(methoxyfenozide)、溴谷隆(metobromuron)、異丙曱草胺(metolachlor)、磺草口坐胺(metosulam)、曱氧隆(metoxuron)、p秦草酉同(metribuzin)、甲石黃隆(metsulfuron—methyl)、禾草敵(molinate)、久效磷(mo露rotophos)、綠谷隆(monoli匿on)、滅草隆、腈菌峻(myclobutani1)、二溴磷(naled)、敵草胺(napropamide)、草不隆(neburon)、^因口密石黃隆(nicosulfuron)、；):因石咸(nicotine)、氣笨口密口定醇(nuarimol)、呔酰胺(ofurace)、氧樂果(omethoate)、惡霜靈(oxadixyl)、殺線威(oxamyl)、殺線威肘(oxamy卜oxime)、氧化萎銹靈(oxycarboxin)、乙酰曱胺磷(oxydemeton-methyl)、多效峻(paclobutrazol)、曱基對(duì)氧石舞(paraoxon—methyl)、^j"石克石壽(parathion)、曱基只于石克石舞(parathion-methyl)、戊菌。坐(penconazole)、戊菌隆(pencycuron)、二曱戊樂靈(pendimethalin)、甜菜寧(phe鍾dipham)、稻豐散(phenthoate)、曱拌磷(phorate)、甲拌磷亞砜(phoratesulfoxide)、伏殺硫磷(phosalone)、亞胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、辛石危石粦(phoxim)、氟口比醜草胺(picolinafen)、口定氧菌酉旨(picoxystrobin)、抗蚜威、乙基嘧咬磷(pirimiphos-ethyl)、曱基嘧°定石舞(pirimiphos-methyl)、氟嘧碌隆(primisulfuron-methyl)、咪鮮胺(prochloraz)、腐霉利(procymidone)、丙澳石粦(profenofos)、猛殺威(promecarb)、樸草凈(prometryne)、毒草胺(propachlor)、霜霉威(propamocarb)、克蟲葛特(propargite)、胺丙畏(propetamphos)、苯胺靈(propham)、丙環(huán)口坐(propiconazole)、殘殺威(propoxur)、■戊炔草胺(propyzamide)、千草丹(prosulfocarb)、氟磺隆(prosulfuron)、普疏(prothiofos)、口比蟲牙S同(pymetrozine)、口坐菌胺酉旨(pyraclostrobin)、p比n密石壽(pyrazophos)、達(dá)蟲葛酉同(pyridaben)、p達(dá)。秦石克石粦(pyridaphenthion)、口達(dá)草凈爭(zhēng)(pyridate)、口密審胺(pyrimethani1)、p比丙酸(pyriproxyfen)、p奎石克石粦(quinalphos)、p套草酉臾(quinmerac)、滅卩菓酉昆(quinoclamine)、喹氧靈(quinoxyfen)、精喹禾靈(quizalofop-ethyl)、石風(fēng)嘧石黃隆(rimsulfuron)、魚膝S同(rotenone)、西i馬》'聿(simazine)、西草凈(simetryn)、葚孑包菌素(spiroxamine)、》黃醜石黃隆(sulfosulfuron)、'/、臺(tái)蟲冥石粦(sulfotep)、石克丙石壽(sulprofos)、成峻醇(tebuconazole)、蟲耽耕(tebufenozide)、p比蟲葛胺(tebufenpyrad)、斗史草胺(tebutam)、丁p塞隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、特丁硫磷(terbufos)、特丁通(terbumeton)、特丁津(te;rbuthylazine)、特丁凈(terbutryn)、殺蟲畏.(tetrachlorvinphos)、氟醚口坐(tetraconazole)、蓬苯p達(dá)哇(thiabendazole)、漆蟲淋(thiacloprid)、遂蟲口秦(thiamethoxam)、p塞磺隆(thifensulfu醒-methyl)、硫雙威(thiodicarb)、硫伐隆(thiofa麗)、硫伐隆砜(thiofa親sulfone)、硫伐隆亞砜(thiofa麗sulfoxide)、(乙基)疏菌靈(thiophanate(-ethyl))、曱基石克菌靈(thiophanate—methyl)、曱基立^古石粦(tolclofos—methyl)、曱苯氣石黃胺(tolylfluanid)、三泰芬(triadimefon)、三哇乙醇(triadimenol)、醚苯磺隆(triasulfuron)、三峻磷(triazophos)、苯磺隆(tribe麗on-methyl)、三氯磷酸酉旨(trichlorfon)、三賽峻(tricyclazole)、草達(dá)津(trietazine)、將菌酉旨(trifloxystrobin)、氟菌峻(triflumizole)、氟胺磺隆(triflusulfuron-methyl)、滅菌唑(triticonazole)、滅蟲牙石克碌(vamidothion)。有害物質(zhì)以及有毒物質(zhì)的實(shí)例包含1,1,1-三氯乙烷、1，1，2，2-四氯乙烷、1，1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烷、l，l-二氯乙烯、1，2，3，4，6,7,8，9-八氯二苯并呋喃、1，2，3，4,6，7，8-七氯二笨并對(duì)二惡英、1，2,3-三氯苯、1.2,3-三氯丙烷、1，2，4-三氯苯、1，2-二溴-3-氯丙烷、1，2-二溴乙烷、1，2-二氯苯、1，2-二氯乙烷、反-1，2-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、1，2-二苯基肼、1.3,5-三硝基笨、1,3-丁二烯、1，3-二氯笨、順-3-二氯丙烯和反-3-二氯丙烯、1，4-二氯苯、2，3，4，7，8-五氯二苯并呋喃、2，3，5，6-四氯苯酚、2,3,7，8-四氯二苯并呋喃、2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二惡英、2，4，5-三氯笨酚、2,4，6-三氯苯酚、2,4，6-三硝基甲苯、2，4-二氯苯酚、2，4-二曱基笨酚、2，4-二硝基苯酚、2,4-二硝基曱苯、2,6-二硝基曱苯、2-丁酮、2-氯苯胺、2-氯苯酚、2-己酮、2-曱基萘、3，3'-二氯聯(lián)苯胺、4，4'-亞曱基二(2-氯苯胺)、4，6-二硝基-鄰甲酚、4-氨基聯(lián)苯、4-硝基苯酚、苊、丙酮、丙烯醛、艾氏劑(aldrin)、a-六氯、鐵石棉、多氯聯(lián)苯1016、1221、1232、1240、1242、1248、1254、1260、1262、砷酸、石棉、苯、if關(guān)苯胺、苯并(a)蒽、苯并(a)芘、苯并(b或k)熒蒽、苯并熒蒽、苯并芘、二(2-氯乙基)醚、己二酸二(2-乙基己)酯、鄰苯二曱酸二(2-曱氧基乙)酯、溴二氯乙烷、溴仿、鄰苯二曱酸丁芐酯、蘇達(dá)滅(butylate)、砷酸鈣、咔唑、四氯化碳、三石克石岸(carbophenothion)、氣丹(chlordane)、十氣酉同(chlordecone)、氯苯、氯二溴甲烷、氯乙烷、氯曱烷、毒死蜱、屈(chrysene)、溫石棉、順氯丹、煤焦雜酚油、對(duì)曱酚、甲酚、氰化物、環(huán)三亞曱基三硝胺(RDX)、o,p,-或p,p'-ddd、p，p,-dde、o，p'-或p,p'-ddt、鄰苯二曱酸二(2-乙基己)酯、二嗪農(nóng)、二苯并(a，h)蒽、(氯化)二笨并呋喃、二苯并噻吩、二溴氯丙烷、二氯苯、二氯乙烷、二氯丙烷(dichloroprop)、敵敵畏、三氯殺螨醇(dicofol)、狄氏劑(dieldrin)、樂果、二曱基曱酰胺、二曱基次胂酸、鄰苯二曱酸二正丁酯、二硝基曱苯、乙拌磷、(a-;e-)硫丹(endosulfan)(硫酸鹽)、異狄氏劑(endrin)(醛；S同)、滅克磷(ethoprop)、乙醚、乙基苯、熒蒽、曱醛、Y—六氯、谷石克石舞(guthion)、七氯(heptachlor)、環(huán)氧七氯、七氯聯(lián)苯、七氯二笨并呋喃、七氯二苯并對(duì)二惡英、六氯苯、六氯丁二烯、a-、、S-、Y-六氯環(huán)己烷、六氯環(huán)戊二烯、六氯二苯并呋喃、六氯二苯并對(duì)二惡英、六氯乙烷、肼、氰化氫、茚并(l，2，3-cd)芘、曱氧氯(methoxychlor)、曱基異丁基酮、曱基對(duì)硫磷、二氯曱烷、曱基汞、二溴磷、萘、n-亞硝基二曱基胺、n-亞硝基二正丙基胺、n-亞硝基二苯基胺、鄰曱酚、氧氯丹(oxychlordane)、對(duì)石克磷、五氯苯、五氯聯(lián)苯、五氯丁二烯、五氯二苯并呋喃、五氯二苯并對(duì)二惡英、五氯苯酚、菲、苯酚、甲拌磷、釙-210、多溴化聯(lián)苯、多氯化聯(lián)苯、多環(huán)芳香族烴、對(duì)二曱笨、芘、除蟲菊(pyrethrum)、s，s，s-三丁基三硫石癢酸酯、氯化+>節(jié)油(strobane)、笨乙烯、四氯聯(lián)苯、四氯二苯并對(duì)二惡英、四氯乙烷、四氯乙烯、四氯苯酚、碌u氰酸酯、曱苯、毒殺芬(toxaphene)、反式氯丹、三丁基錫、三氯苯、三氯乙烷、三氯乙烯、三氯氟乙烷、氟樂靈(trifluralin)、氯乙烯。農(nóng)林學(xué)分析物植物以及動(dòng)物病原體、真菌毒素、環(huán)境污染物等工藝工程/食品技術(shù)/生物技術(shù)/化妝品分析物化學(xué)以及生物技術(shù)合成產(chǎn)物(包含主要產(chǎn)物、中間產(chǎn)物、副產(chǎn)物以及降解產(chǎn)物)，諸如維生素、香料、藥物、毒素、脂質(zhì)、氨基酸、甘油酯、碳水化合物、纖維、甜味劑、著色劑、防腐劑、多糖、真菌毒素等食品添加劑的實(shí)例包含:安賽蜜K.(acesulfamK)、乙?；趸矸?、乙?；矸?、乙酰化二淀粉己二酸酯、乙?；矸哿姿狨?、-秀惑紅(alluraredAC)、a-生育酚、鋁漆、石克酸鋁鈉、莧菜紅、氨法焦糖色素、亞石克酸銨焦糖色素、胭脂樹紅(annatto)、花青素、蘋果酸、抗壞血酸、天冬氨醜笨丙氛酸甲酉旨(aspartame)、偶氛玉紅(azorubine)、《甘菜才艮紅(beetrootred)、膨潤(rùn)土、苯甲酸、千醇、琥珀酸、8'-胡蘿卜素醛、0-阿樸-8'-胡蘿卜素酸乙酯、環(huán)糊精、蜂蠟(白和黃)、聯(lián)苯、胭脂樹橙(bixin)、硼酸、棕色FK、棕色HAT、亮藍(lán)FCF、亮黑BN、丁二烯-苯乙烯共聚物、丁基羥基苯曱醚(BHA)、丁基化羥基曱苯(BHT)、5'-核糖核苷酸4丐、角黃素(canthaxanthin)、辣椒紅素(capsanthin)、辣椒玉紅素(capsorubin)、尿素、羧曱基纖維素、巴西棕櫚蠟、胡蘿卜素(混合胡蘿卜素、13胡蘿卜素)、卡拉膠(carrageenan)、纖維素(微晶纖維素、纖維素粉末)、喹啉黃、葉綠素、葉綠酸、胭脂蟲紅A(cochenilleredA)、酶水解羧曱基纖維素、赤蘚紅(erythrosin)、Y-生育酚、日落黃S、結(jié)冷膠(gellan)、綠色S(greenS)、羥丙基纖維素、羥丙基二淀粉磷酸酯、羥丙基曱基纖維素、羥丙基淀粉、靛藍(lán)I(indigotinl)、轉(zhuǎn)化酶、葉綠素的含銅絡(luò)合物、葉綠酸的含銅絡(luò)合物、姜黃素(curcumin)、淀粉磷酸單酯、羧曱基纖維素鈉、新橙皮苦DC(neohesperidinDC)、乳酸鏈J求菌素(nisin)、降胭脂樹橙(norbixin)、氧化淀粉、專利藍(lán)V、果膠類(果膠、酰胺化果膠)、磷酸化二淀粉磷酸酯、磷酸、葡聚糖、聚乙二醇6000、氧化聚乙烯蠟、無分枝脂肪酸C2-C18的聚乙烯酯、聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、核黃素(riboflavin),核黃素5'-磷酸鹽、紅色2G、糖精以及其Na鹽、K鹽和Ca鹽(糖精、糖精鈉、糖精鈣、糖精鉀)、乙酸異丁酸蔗糖酯、失水山梨醇單月桂酸酯、失水山梨醇單油酸酯、失水山梨醇單棕櫚酸酯、失水山梨醇單硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、辛烯基琥珀酸淀粉鈉、丹寧酸(tannin)、檸檬黃(tartrazine)、甜味蛋白(tha麗Un)、黃芪膠、力口工過的鹿其應(yīng)卑菜屬海條(processedeucheumaseaweed)、交4關(guān)叛甲基纖維素鈉、黃原膠?；瘖y品的實(shí)例包含PEG和PEG衍生物、曱醛樹脂、麝香化合物、表面活性劑(tenside)、石蠟、芳香族胺、對(duì)羥基苯曱酸甲酯、對(duì)羥基苯曱酸丁酯、對(duì)羥基苯曱酸乙酯、對(duì)羥基苯曱酸丙酯、對(duì)羥基苯曱酸異丁酯、伯洛沙姆184(poioxa阻184)、7瞎彈性蛋白(hydrolyzedelastine)、尿嚢素(allantoin)、乳酸酶、黃原膠在文獻(xiàn)中，已知具有各種陽(yáng)離子的各種螯合物為熒光團(tuán)。甚至具有一定量芳香族基團(tuán)的蛋白質(zhì)或抗體也可充當(dāng)熒光團(tuán)。尤其證明銪穴合物熒光團(tuán)和鋱穴合物熒光團(tuán)對(duì)本發(fā)明是極有利的，因?yàn)樗鰺晒鈭F(tuán)具有可與其他組分(諸如待測(cè)量樣品中所存在的蛋白質(zhì))的可能熒光良好分離的特征性發(fā)光光諳。銪穴合物熒光團(tuán)與鋱穴合物熒光團(tuán)的特征在于由穴合物有機(jī)部分引起的光吸收以及對(duì)銪離子的直接能量轉(zhuǎn)移。銪離子是以氧化態(tài)3+存在。鋱離子也是以氧化態(tài)3+存在。優(yōu)選利用氮分子激光器在337nm的波長(zhǎng)下激發(fā)銪穴合物焚光團(tuán)。在620nm下測(cè)量發(fā)射(而在鋱的情況下，在545nm下測(cè)量)。與所測(cè)量樣品的其他萸光團(tuán)或其他熒光組分的焚光相比，銪穴合物熒光團(tuán)與鋱穴合物熒光團(tuán)的熒光顯著更長(zhǎng)，因此盡管可能存在由其他組分或其他熒光團(tuán)所產(chǎn)生的背景熒光，但仍可良好且精確地測(cè)定銪穴合物焚光團(tuán)或鋱穴合物熒光團(tuán)的焚光。除所謂"小分子"(即，可直接或經(jīng)由連接基團(tuán)與銪穴合物焚光團(tuán)(或鋱穴合物菱光團(tuán))結(jié)合的小化學(xué)分子，諸如藥理成分或毒素)之外；也可能將大分子與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物焚光團(tuán))結(jié)合。焚光團(tuán)特異性抗體也與由大分子和銪穴合物焚光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))組成的接合物結(jié)合，因此本文中所述的方法也可用于檢測(cè)大分子。待提及的大分子特別包含多核香酸(polynucleotide),寡核苷酸(oligo露leotide)、腿片段、RM片段、蛋白質(zhì)、糖蛋白(glycoprotein)、脂蛋白(lipoprotein),多糖(polysaccharide)、DNA、RNA、才莫擬表位、fab片^殳、fc片段、肽、凝集素、肽模擬物、gapmer、核糖酶、CpG寡聚物、DNA酶、核糖開關(guān)、,、聚合物、，素、纟，生素、碳水化合物甘油酯或」旨質(zhì)。(complex)之間的接合物。根據(jù)本發(fā)明，也可能將來自相同分析物的兩個(gè)分子與銪穴合物焚光團(tuán)分子結(jié)合，或分別將來自兩個(gè)不同分析物的一個(gè)分子與銪穴合物熒光團(tuán)結(jié)合。另一方面，也有可能使兩個(gè)相同或甚至不同的銪穴合物熒光團(tuán)分子與分析物分子結(jié)合。這對(duì)于增加某一分析物的檢測(cè)精度或允許同時(shí)檢測(cè)數(shù)種分析物來說可能是有利的。此外，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見可提供兩種以上分析物分子及/或銪穴合物焚光團(tuán)分子的接合物，諸如三種相同或不同分析物分子與一或兩種或兩種以上銪穴合物熒光團(tuán)分子的接合物。這也適用于鋱。所用優(yōu)選穴合物為環(huán)狀化合物，并且尤其為雙環(huán)化合物。此外優(yōu)選穴合物具有氮橋頭(bridgehead)原子。此外穴合物優(yōu)選含有一個(gè)或一個(gè)以上吡啶(pyridine)殘基或吡啶組分，且尤其優(yōu)選聯(lián)吡啶(bipyridine)殘基或聯(lián)吡啶組分或聯(lián)吡啶片段。因此，尤其優(yōu)選具有兩個(gè)氮橋頭原子的雙環(huán)穴合物。此外，吡啶組分優(yōu)選存在于環(huán)狀中，尤其雙環(huán)系統(tǒng)中。優(yōu)選的穴合物具有以下通式S、S'、因"彼此獨(dú)立地表示烷基(alkyl)殘基、烯烴(alkene)殘基、芳基(aryl)殘基、雜芳基(heteroaryl)殘基、烷芳基(alkylaryl)殘基、雜芳基烷基(heteroarylalkyl)殘基、環(huán)基(cyclyl)殘基、雜環(huán)基(heterocyclyl)殘基，且尤其包括亞曱基(methylene)、乙烯基(ethylene)、乙歸氧基(ehthyleneoxy)、亞乙辨基(ethenylene)、亞烴基氛基(alkyleneamino)、亞烴基氧基(alkyleneoxy)、苯基(phenyl)、耳關(guān)笨基(biphenyl)、p比口定基(pyridyl)、4關(guān)口比口定基(bipyridyl)、笨并p比口定基(benzopyridyl)、笨并耳關(guān)p比口定基(benzobipyridyl)、口米峻基(imidazole)、p比口各淋基(pyrrolinyl)及/或p比口各步克基(pyrrolidinyl)。尤其優(yōu)選具有16至20個(gè)原子尺寸的環(huán)，優(yōu)選17至19個(gè)原子尺寸的環(huán)。在此上下文中，環(huán)尺寸意思是僅考慮形成接近銪或鋱的最短環(huán)的那些原子。具有前述尺寸的環(huán)的環(huán)狀以及尤其雙環(huán)環(huán)系統(tǒng)特別適合并入Eu3+(或Tb3+)。尤其優(yōu)選三聯(lián)吡"定基(tris-bipyridyl)穴合物、吡啶基二聯(lián)吡啶基(pyridyldibypyirdyl)穴合4勿以及二p比"定基耳關(guān)p比"定基(dipyridylbipyridyl)穴合物，即具有6、5或4個(gè)p比咬基環(huán)的穴合物。在下文中，展示具有或不具有E,或Tb"的潛在穴合物的一些實(shí)例，其中可使用lV+來代替Eu3+。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>分析物可利用離子、共價(jià)或親脂相互作用，通過插入或并入以及經(jīng)由氬4建與穴合物結(jié)合，其中優(yōu)選共價(jià)鍵。因此，也優(yōu)選穴合物在至少一個(gè)環(huán)上帶有官能基，而且分析物可直接或經(jīng)由連接基團(tuán)間接與所述官能基結(jié)合。以下為特別適合的官能基卣素(halogen)、羥基(hydroxy),羧酸酉旨基(carboxylate)、羰基(carbony1)、疏醇基(thiol)、氨基(amino)、氰酸酯基(cyanate)、異氰酸酯基(isocyanate)。與分析物的4定合優(yōu)選借助于亞胺(imine)鍵、酰胺(amide)鍵、酉旨(ester)鍵、醚(ether)4建、醇趁力口成(aldoladdition),《宿酉同(ketal)4建、鄉(xiāng)宿搭(acetal)4建、親核取代(micleophilicsubstitution)、碳酸酉旨(carbonate)鍵、氨基甲酸酯(urethane)4建、碌J旨(thioester)4建、辟u醚(thioether)4建或脲(urea)一建實(shí)現(xiàn)。以下結(jié)構(gòu)說明優(yōu)選實(shí)例。其中羧基或殘基R表示與分析物分子的可能結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，待檢測(cè)物質(zhì)的僅一個(gè)單一分子與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))的分子結(jié)合。此外，實(shí)質(zhì)上對(duì)本發(fā)明來說，由銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))以及分析物組成的接合物的每個(gè)分子僅結(jié)合一個(gè)單一抗體。因此，可能使用的連接基團(tuán)不應(yīng)太長(zhǎng)，否則就會(huì)使銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))與分析物之間的距離變得足以引起熒光團(tuán)特異性抗體與分析物特異性抗體發(fā)生結(jié)合。正是由于空間效應(yīng)，兩個(gè)抗體與一個(gè)接合物的結(jié)合被排除。上述物質(zhì)可能作為分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物焚光團(tuán))結(jié)合。如果與本文中所述的穴合物一起使用，那么Eu"以及TV+允許熒光的時(shí)間分辨測(cè)量(時(shí)間分辨焚光(timeresolvedfluorescence,TRF))，并因此允許所測(cè)量信號(hào)與背景信號(hào)之間的清楚區(qū)別。本發(fā)明的另一實(shí)施例旨在檢測(cè)由生物體形成并且針對(duì)某一分析物的抗體，而非檢測(cè)分析物自身。在所述實(shí)施例中，分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))的接合物是與熒光團(tuán)特異性抗體組合使用，且當(dāng)添加樣品溶液時(shí)測(cè)定熒光增加，這是因?yàn)橛捎诜治鑫锾禺愋钥贵w與熒光團(tuán)特異性抗體的同時(shí)結(jié)合被排除，因此待檢測(cè)分析物特異性抗體至少部分置換復(fù)合物中的焚光團(tuán)特異性抗體與接合物。本文中所述的方法允許分析物的定性以及特別是定量測(cè)量。此外，本發(fā)明方法的有利之處在于所有常規(guī)免疫分析(尤其所有非均相免疫分析，諸如ELISA)都可能適用于本發(fā)明的方法。因此，操作過程會(huì)相當(dāng)便利，因?yàn)楸景l(fā)明方法是均相分析，即使用者僅需要將其樣品與測(cè)量樣品混合，且隨后測(cè)定其焚光。此外，所述過程可容易地實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，例如在常規(guī)診斷中，借助于自動(dòng)化能夠方便地省時(shí)省錢。此外，尤其優(yōu)選的是將特定量的過氧化氫(HA)添加到含有銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))與分析物的接合物以及分析物特異性抗體和焚光團(tuán)特異性抗體的樣品溶液中。已證實(shí)過氧化氫對(duì)熒光具有積極影響(即發(fā)光的影響)。特別地，過氧化氫似乎增加或相應(yīng)地加強(qiáng)發(fā)光，從而使測(cè)量靈敏性顯著增加或相應(yīng)地允許極少量的待測(cè)量分析物。然而，過氧化氫的作用模式尚不清楚。優(yōu)選添加相對(duì)于接合物至少一等摩爾(equimolar)量的過氧化氫。相對(duì)于接合物而言更高量的過氧化氫，諸如2倍摩爾過量(2mol當(dāng)量)、3倍摩爾過量(3mol當(dāng)量)、5倍摩爾過量(5mol當(dāng)量)或IO倍摩爾過量(lOmol當(dāng)量)同樣是可能的。因此，可以相對(duì)于接合物為0.1:1至50:1，優(yōu)選0.5:1至10:l，進(jìn)一步優(yōu)選0.8:1至4:l,且特別優(yōu)選1:1至2(H202):1(接合物)，的摩爾比率來使用過氧化氫。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例包括向由分析物特異性抗體和熒光團(tuán)特異性抗體以及銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))與分析物的接合物構(gòu)成的樣品溶液添加其他發(fā)光團(tuán)。所述其他發(fā)光團(tuán)借助于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)來轉(zhuǎn)移或相應(yīng)地接收萸光(發(fā)光)信號(hào)，使得在測(cè)量樣品中的不同分析物可得到分析。所述其他發(fā)光團(tuán)優(yōu)選為所謂具有不同波長(zhǎng)的量子點(diǎn)。由接合物、兩種抗體以及量子點(diǎn)組成的組合物允許對(duì)在一個(gè)測(cè)量樣品中的數(shù)種不同分析物進(jìn)行多重篩選。此外，本發(fā)明涉及一種組合物，其包括a)分析物與銪穴合物熒光團(tuán)或(鋱穴合物熒光團(tuán))的接合物，其中分析物與銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物熒光團(tuán))的接合物僅允許同時(shí)結(jié)合一種單一抗體，b)對(duì)分析物特異的抗體，以及c)對(duì)銪穴合物焚光團(tuán)(或鋱穴合物焚光團(tuán))特異的抗體。所述組合物可進(jìn)一步含有作為另一組分的過氧化氫及/或其他發(fā)光團(tuán)。此組合物為用于檢測(cè)各種分析物的試劑盒的基本組分。此試劑盒含有用于片全測(cè)一種或一種以上分析物的前述組合物的至少一者和一種或一種以上用于實(shí)施反應(yīng)的樣品容器以及關(guān)于如何實(shí)施反應(yīng)的說明書。此外，組合物也可含有不同分析物與相同或不同銪穴合物熒光團(tuán)(或鋱穴合物安光團(tuán))的不同接合物以及不同分析物特異性抗體，以同時(shí)檢測(cè)不同分析物的存在。本發(fā)明的方法涉及均相免疫分析的實(shí)現(xiàn)。在均相系統(tǒng)中，將測(cè)量樣品(含有多個(gè)其他組分(其類型、濃度以及對(duì)測(cè)量系統(tǒng)的影響在很大程度上未知)以及分析物)與測(cè)量系統(tǒng)(含有用于產(chǎn)生測(cè)量信號(hào)的組分)組合。此后，立即進(jìn)行測(cè)量，即測(cè)量樣品的所有組分(甚至是未明確地影響且乂人而摻雜進(jìn)測(cè)-i-系統(tǒng)并因此摻雜進(jìn)測(cè)量信號(hào)的那些組分)保留在系統(tǒng)中。只要測(cè)量發(fā)生在限定基質(zhì)(例如分析物的水溶液)中，那么所述干擾就會(huì)受到控制。然而，這些系統(tǒng)缺乏實(shí)用相關(guān)性。對(duì)于實(shí)用相關(guān)測(cè)量(例如在患者的血清物質(zhì)、生產(chǎn)廢渣或土壤樣品的分解物中).來說，測(cè)量信號(hào)與背景信號(hào)應(yīng)加以區(qū)別。僅在滿足這些先決條件時(shí)，均相系統(tǒng)關(guān)于測(cè)量過程簡(jiǎn)便性以及由此得到的時(shí)間和勞力減少的優(yōu)點(diǎn)才會(huì)變得顯而易見。本發(fā)明的方法是一種均相熒光猝滅免疫分析法。先前所述的上下文對(duì)于此系統(tǒng)也有效。迄今已知使用"簡(jiǎn)單"熒光團(tuán)(諸如熒光素)的系統(tǒng)有約20年，盡管所述系統(tǒng)具有不容置疑的功能以及明顯優(yōu)點(diǎn)，-f旦由于所述原因，其仍未獲得實(shí)用相關(guān)性。目前尚未解決的問題在于所述的基質(zhì)效應(yīng)。在測(cè)量樣品與測(cè)量系統(tǒng)的混合物中，不僅激發(fā)焚光團(tuán)而且激發(fā)測(cè)量樣品中的多個(gè)其他組分(例如血清蛋白)以使其發(fā)熒光。在此上下文中，所述熒光團(tuán)的發(fā)光在與殘留在測(cè)量樣品測(cè)量混合物中組分發(fā)射相同的時(shí)間窗內(nèi)發(fā)生。背景信號(hào)的類型以及強(qiáng)度取決于測(cè)量樣品的個(gè)體組成并且不能事先確定。因此，不能實(shí)施實(shí)用相關(guān)測(cè)量樣品(諸如患者血清)的測(cè)量。然而，這些問題可借助于時(shí)間分辨熒光測(cè)量(TRF)得以解決。為此，述絡(luò):物內(nèi)的輻射自由能;夭遷,；導(dǎo)致發(fā)光延遲。如前所述，激發(fā)測(cè)量樣品的組分以及熒光團(tuán)，以使其同時(shí)發(fā)熒光。然而，只有在背景熒光消退后才可^r測(cè)測(cè)量信號(hào)。因此，也可分析實(shí)用相關(guān)樣品。這可以通過將均相測(cè)試原則與時(shí)間分辨變光測(cè)量組合而成為可能。因此本發(fā)明的方法尤其適用于測(cè)量包含多個(gè)其他組分的樣品(諸如血液樣品或土壤樣品)，而無需預(yù)先對(duì)測(cè)量樣品進(jìn)行純化。實(shí)例實(shí)例1:1.)制備針對(duì)TBP銪穴合物的免疫血清用以下物質(zhì)使balb/c小鼠免疫50Pg鏈霉親和素(streptavidin)-TBP銪穴合物第1次免疫25鏈霉親和素-TBP銪穴合物第2次免疫(1個(gè)月后)抽取血液以及提取血清(專家已知)2.)檢測(cè)血清對(duì)TBP銪穴合物的結(jié)合(圖1)制備測(cè)試接合物根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，使用戊二醛，通過連接游離氨基，而將TBP銪穴合物與BSA偶聯(lián)。在ELISA中檢測(cè)與BSA接合物結(jié)合的抗體。3.)檢測(cè)由于抗體與TBP銪穴合物結(jié)合而引起的熒光猝滅(圖2)測(cè)量沖羊品(15GW),由以下各物組成TBP銪穴合物1:20Q000(最終濃度)75W針對(duì)TBP銪穴合物的免疫血清連續(xù)稀釋75W或相應(yīng)地三種免疫前血清(圓形)針對(duì)三種其他抗原的三種免疫血清(正方形)熒光測(cè)量激發(fā)337nm;發(fā)射620nm:4.)檢測(cè)分析物結(jié)合抗體對(duì)焚光團(tuán)結(jié)合抗體的置換(圖3)制備分析物(熒光素)與熒光團(tuán)(銪穴合物)的接合物使異石克氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)與TBP銪穴合物(0.03niM)以2:1的摩爾比率反應(yīng)。PBS用作培養(yǎng)基，并且反應(yīng)時(shí)間為室溫下4小時(shí)。測(cè)量樣品(150W),由以下各物組成接合物1:20G000(最終濃度)75W針對(duì)TBP銪穴合物的免疫血清1:20Q(最終濃度)37.5W抗體DE1(抗焚光素抗體)或相應(yīng)地37.5W抗體D35(抗葡萄糖氧化酶抗體)熒光測(cè)量激發(fā)337nm;發(fā)射620run圖3顯示第1至4號(hào)測(cè)量樣品的測(cè)量值。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)例2:關(guān)于銪螯合物的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)血清樣品中猝滅銪螯合物萸光的多克隆抗體。模型系統(tǒng)用銪螯合物/OVA接合物(OVA=卵白蛋白)使測(cè)試動(dòng)物(balb/c小鼠)免疫。測(cè)試所,備血清樣品猝滅銪螯合物/BSA接合物熒光的特性。所用銪螯合物為具有以下結(jié)構(gòu)的[EuL]，其中Ln表示銪<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>制備銪螯合物/蛋白接合物銪螯合物[EuL]是以NHS酯的形式存在。在室溫下在磷酸鹽緩沖液(pH7.4.)中過夜進(jìn)行與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)以及0VA的偶聯(lián)。偶聯(lián)后，將接合物對(duì)PBS透析并且不預(yù)先純化或表征而用于測(cè)試中。用[EuL]-OVA使測(cè)試動(dòng)物免疫以及提取血清2只balb/c小鼠在完全Freund佐劑中用100Pg接合物進(jìn)行第一次免疫。一個(gè)月后在不含佐劑下用50Pg接合物進(jìn)行第二次免疫。在第2次免疫一周后抽取血液。用于猝滅[EuL]-BSA接合物熒光的免疫血清測(cè)試測(cè)量樣品由75W經(jīng)稀釋血清樣品以及751^1[EuL]/BSA接合物(1:IOOOQ稀釋；最終濃度)組成。用PBS-NKS(含5%牛血清的PBS)稀釋測(cè)量樣品的所有組分。1小時(shí)后在cryptor(Cezanne)中測(cè)量熒光。利用氮分子激光器在337腿下產(chǎn)生激發(fā)；在620nm下實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨熒光測(cè)量?！MTW906-1血清(來自免疫906-1的血清)顯示所希望的熒光猝滅效應(yīng)，即在血清中存在猝滅(類似于穴合物)銪螯合物熒光的抗體(參見圖4)。實(shí)例3:關(guān)于半抗原銪穴合物的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)利用與接合物中半抗原結(jié)合的第二分子對(duì)與半抗原(小分子)與熒光團(tuán)(銪穴合物)的接合物形成鍵結(jié)的猝滅銪熒光的單克隆抗體的置換,以及使用所述效應(yīng)測(cè)定半抗原濃度。模型系統(tǒng)使用銪穴合物(熒光團(tuán))與生物素(維生素H)(半抗原，分析物)的接合物。與焚光團(tuán)形成鍵結(jié)的幹滅銪穴合物熒光的單克隆抗體G24-BA9被結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)鏈霉親和素置換。所述效應(yīng)可通過外部引入游離分析物(生物素)而逆轉(zhuǎn)。在此上下文中發(fā)生的熒光改變?cè)试S測(cè)定游離分析物(生物素)的濃度。制備銪穴合物/生物素(維生素H)接合物Eu(NH2)-生物素材料穴合物NH;(cisbio)(穴合物NH2=TBP銪穴合物，參見第18頁(yè))生物素NHS(Fluka)偶聯(lián)將生物素NHS以及穴合物冊(cè)2預(yù)先溶解于DMS0中。以7(穴合物)比1(生物素)的摩爾比率將兩種組分混合于偶聯(lián)反應(yīng)中。在室溫下在G.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.0)中過夜進(jìn)行偶聯(lián)。在接合物未經(jīng)進(jìn)一步純化的情況下使用Eu(NH2)生物素接合物。在熒光猝滅免疫分析中測(cè)定生物素(維生素H)濃度以下四種組分以指定最終濃度各自混合于150W的測(cè)量反應(yīng)中穴合物Eu-NH廠生物素1:300000稀釋猝滅劑G24-BA920Pg/ml(穴合物抗體)置換抗體鏈霉親和素3Pg/ml分析物生物素連續(xù)稀釋0至1Q0ng/ml用PBS-NKS(含5%牛血清的PBS)稀釋測(cè)量樣品的所有組分。1小時(shí)后在cryptor(Cezanne)中測(cè)量熒光。利用氮分子激光器在337nm下產(chǎn)生激發(fā)；在620nm下進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)量。結(jié)果與Eu-麗2-生物素形成鍵結(jié)的鏈霉親和素可被游離生物素置換。因此，G24-BA9可與熒光團(tuán)結(jié)合，從而猝滅熒光。鑒于所用材料(特別是鑒于所用接合物的原始性)，分析驚人地靈敏(參見圖7)。實(shí)例4:關(guān)于蛋白質(zhì)銪穴合物的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)利用與接合物中蛋白特異性結(jié)合的抗體對(duì)與蛋白質(zhì)(大分子)與熒光團(tuán)(銪穴合物)的接合物形成鍵結(jié)的淬滅銪熒光的單克隆抗體的置換。模型系統(tǒng)使用銪穴合物(萸光團(tuán))與過氧化物酶(POD)(分析物)的接合物。與熒光團(tuán)形成鍵結(jié)的猝滅銪穴合物熒光的單克隆抗體G24-BA9被結(jié)合過氧化物酶(POD)的抗體置換。所述效應(yīng)可通過外部添加游離分析物(POD)而逆轉(zhuǎn)。制備銪穴合物/過氧化物酶(P0D)接合物Eu(NH2)-POD材料穴合物仰2(cisbio)(穴合物NH2=TBP銪穴合物，參見第17頁(yè))過氧化物酶(sigma)偶聯(lián):在過氧化物酶的糖殘基上產(chǎn)生反應(yīng)性醛基，隨后將因此活化的POD對(duì)0.1MNaHC03除鹽。將如此制備的POD與穴合物NH2以等摩爾比率混合。在室溫下過夜進(jìn)行偶聯(lián)。利用乙醇胺(pH8)阻斷未偶聯(lián)的醛基，并且將接合物對(duì)PBS透析。在接合物未經(jīng)進(jìn)一步純化的情況下使用Eu(NH2)-POD接合物。.利用抗POD血清置換與Eu(NH2)-P0D形成4建結(jié)的G24-BA9以下四種組分以指定最終濃度各自混合于150W的測(cè)量反應(yīng)中穴合物Eu-NH2-POD1:2Q00稀釋猝滅劑G24-BA95Pg/ml置換抗體抗POD血清1:IQQQ稀釋分析物POD20Pg/ml用PBS-NKS(含5%牛血清的PBS)稀釋測(cè)量樣品的所有組分。1小時(shí)后在cryptor(Cezanne)中測(cè)量熒光。利用氮分子激光器在337nm下產(chǎn)生激發(fā)；在620nm下進(jìn)行時(shí)間分辨焚光測(cè)量。結(jié)果:在總共四種抗POD血清中，TW738顯示所希望的效應(yīng)。血清中所含多克隆抗體部分能夠置換與Eu(NHJ-POD形成4定結(jié)的G24-BA9。所述效應(yīng)可通過引入游離分析物POD而逆轉(zhuǎn)(參見圖5)。圖5的描述:—在實(shí)-瞼中，<吏用經(jīng)POD(過氧化物酶)免疫的四個(gè)測(cè)試動(dòng)物的血清(a.POD)。使用針對(duì)BSA(牛血清白蛋白)或相應(yīng)地GFP(綠色焚光蛋白)的免疫前血清以及免疫血清作為對(duì)照物。將血清稀釋為1:1000。在猝滅發(fā)光的抗體G24-BA9存在下測(cè)定Eu(麗2)/POD接合物的發(fā)光。實(shí)施實(shí)驗(yàn)以測(cè)試免疫血清(a.POD)中所含結(jié)合P0D的抗體能夠置換與接合物形成鍵結(jié)的抗體G24-BA9的程度。作為所述置換的結(jié)果，可預(yù)期發(fā)光會(huì)增加。血清TW738a.P0D顯示此效應(yīng)。其他免疫血清以及免疫前血清呈陰性。-通過引入過量游離POD可逆轉(zhuǎn)在血清TW738a.POD中所^見測(cè)到的效應(yīng)。在此情況下，與接合物結(jié)合的POD結(jié)合抗體主要與游離POD結(jié)合而非與接合物結(jié)合。因此，觀測(cè)到被G24-BA9結(jié)合的接合物以及發(fā)光的同時(shí)猝滅。利用結(jié)合P0D的單克隆抗體置換與Eu(NH2)-P0D形成鍵結(jié)的G24-BA9以下四種組分以指定最終濃度各自混合于150W的測(cè)量反應(yīng)中穴合物Eu-NH2-POD1:2000稀釋猝滅劑G24-BA95Pg/ml置換抗體抗P0D撫體20Pg/ml分析物P0D20Pg/ml用PBS-NKS(含5%牛血清的PBS)稀釋測(cè)量樣品的所有組分。1小時(shí)后在cryptor(Cezanne)中測(cè)量熒光。利用氮分子激光器在337nm下產(chǎn)生激發(fā)；在620nm下進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)量。結(jié)果所測(cè)試的總共33種P0D結(jié)合單克隆抗體中有兩種抗體可觀測(cè)到所希望的效應(yīng)。單克I^抗體B92-FG9以及E17-DA3能夠部分地置換與Eu(NH2)-P0D形成4走結(jié)的G24-BA9。通過引入游離分析物POD可逆轉(zhuǎn)所述效應(yīng)。證明將兩種抗體組合于一個(gè)反應(yīng)中尤其成功(參見圖6)。圖6的描述在實(shí)驗(yàn)中使用針對(duì)P0D的兩種單克隆抗體B92-FG9以及E17-DA3。在猝滅發(fā)光的抗體G24-BA9存在下測(cè)定Eu(冊(cè)2)-P0D接合物的發(fā)光。實(shí)施實(shí)驗(yàn)以測(cè)試兩種結(jié)合P0D抗體的混合物能夠置換與接合物形成鍵結(jié)的抗體G24-BA9的程度。作為所述置換的結(jié)果，可預(yù)期發(fā)光會(huì)增加。第一個(gè)條形說明在不含結(jié)合P0D的抗體情況下的發(fā)光。第二個(gè)條形說明在POD結(jié)合抗體存在下的比率。觀測(cè)到發(fā)光增加。第三個(gè)條形說明添加游離P0D逆轉(zhuǎn)所述效應(yīng)并顯著降低發(fā)光。實(shí)例5:由過氧化氫引起發(fā)光增加由于過氧化氬而引起銪穴合物發(fā)光增加。在實(shí)驗(yàn)中使用TBP銪穴合物(Eu(TBP)-鏈霉親和素，10M-8M)以及過氧化氫(過氧化氫脲，10%-5%)。測(cè)量體積為4001^1。在ICCD(Andor)柵格分光計(jì)中測(cè)量發(fā)光。結(jié)果，由于添加過氧化氫，TBP銪穴合物的發(fā)光增加30%(參見圖8)。實(shí)例6:關(guān)于鋱螯合物的實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)血清樣品中摔滅鋱螯合物熒光的多克隆抗體。模型系統(tǒng):如實(shí)例2中所述用鋱螯合物/0VA接合物使測(cè)試動(dòng)物(balb/c小鼠)免疫.類似地，使用與實(shí)例2中相同的穴合物，而差別在于在本實(shí)例中Ln表示鋱[TbL]。制備鋱螯合物/蛋白質(zhì)接合物鋱螯合物[TbL]以NHS酯形式存在。在室溫下在磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中過夜進(jìn)行與載體蛋白BSA(牛血清向蛋白)以及0VA的偶聯(lián)。偶聯(lián)后，將接合物對(duì)PBS透析，并且不預(yù)先純化或表征而用于測(cè)試中。用[TbL]-OVA使測(cè)試動(dòng)物免疫以及提取血清如實(shí)例2中所述使2只balb/C小鼠免疫。測(cè)試免疫血清猝滅[EuL]-BSA接合物熒光的特性測(cè)量樣品由75W經(jīng)稀釋血清樣品以及75W[TbL]-BSA接合物(1:10000稀釋；最終濃度)組成。用PBS-NKS(含5%牛血清的PBS)稀釋測(cè)量樣品的所有組分?！猯小時(shí)后在cryptor(Cezanne)中測(cè)量焚光。在545nm下測(cè)定鋱螯合物的熒光。結(jié)果兩種血清TW907-1(來自免疫907-.1的血清)與TW907-2(來自免疫907-2的血清)顯示^"希望的熒光猝滅效應(yīng)，即血清中存在幹滅(類似于穴合物)鋱螯合物熒光的抗體(參見圖9)。權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其中所述用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法包括以下步驟a)提供以下三種組分所述分析物與銪穴合物熒光團(tuán)或鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，對(duì)所述分析物特異的抗體，以及對(duì)所述銪穴合物熒光團(tuán)特異或?qū)λ鲣堁ê衔餆晒鈭F(tuán)特異的抗體，其中所述分析物與所述銪穴合物熒光團(tuán)的接合物或所述分析物與所述鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物僅允許結(jié)合一種單一抗體，b)添加所述分析物，以及c)光譜法測(cè)量所述銪穴合物熒光團(tuán)的熒光或光譜法測(cè)量所述鋱穴合物熒光團(tuán)的熒光。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其進(jìn)一步包括過氧化氫。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其進(jìn)一步包括至少一種其他發(fā)光團(tuán)。4、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其中所述分析物的分子與所述銪穴合物熒光團(tuán)的分子之間析物與所述鋱穴合物熒^團(tuán)的接合物中。、H、；5、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用于檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，其中所述分析物是選自由病原體、病毒、朊病毒、細(xì)菌、寄生蟲、藥物、抗生素、細(xì)胞抑制劑、精神活性物質(zhì)、麻醉劑、止痛劑、心臟藥物、代謝物、凝結(jié)抑制劑、激素、白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、興奮劑、毒品、毒素、有害物質(zhì)、農(nóng)藥、殺蟲劑、木材防腐劑、除草劑、殺真菌劑、爆炸物、維生素以及香料組成的群組。6、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用于檢測(cè)一種或一種以上團(tuán)特異的抗體的:匕率，且其中限定對(duì)所述分析物特^的抗體與對(duì)所述鋱穴合物焚光團(tuán)特異的抗體的比率。7、根據(jù)前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的用于檢測(cè)一種或一種以上吡口定穴合物。8、一種抗體，能夠與銪穴合物焚光團(tuán)及/或分析物與所述銪穴合物熒光團(tuán)的接合物結(jié)合，且能夠借助于所述結(jié)合猝滅或可測(cè)量地降低所述銪穴合物熒光團(tuán)的熒光。9、一種抗體，能夠與銪穴合物熒光團(tuán)及/或分析物與所述銪穴合物熒光團(tuán)的接合物結(jié)合，且能夠借助于所述結(jié)合增強(qiáng)或可測(cè)量地增加所述銪穴合物熒光團(tuán)的熒光。10、一種抗體，能夠與鋱穴合物熒光團(tuán)及/或分析物與所述鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物結(jié)合，且能夠借助于所述結(jié)合猝滅或可測(cè)量地降低所述鋱穴合物焚光團(tuán)的熒光。11、一種抗體，能夠與鋱穴合物熒光團(tuán)及/或分析物與所述鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物結(jié)合，且能夠借助于所述結(jié)合增強(qiáng)或可測(cè)量地增加所述鋱穴合物熒光團(tuán)的熒光。12、一種組合物，包括a)分析物與銪穴合物焚光團(tuán)的接合物，合一種單一抗體，b)對(duì)所述分析物特異的抗體，以及c)對(duì)所述銪穴合物熒光團(tuán)特異的抗體。13、一種組合物，包括a)分析物與鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，抗體,b)對(duì)所述分析物特異的抗體，以及c)對(duì)所述鋱穴合物熒光團(tuán)特異的抗體。14、根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的組合物，其進(jìn)一步包括過氧化氫。15、根據(jù)權(quán)利要求12、13或14所述的組合物，其進(jìn)一步包括至少一種其他發(fā)光團(tuán)。16、一種用于檢測(cè)至少一種分析物的試劑盒，包括:)所述^析物與銪穴合物熒光團(tuán)的接合物—、—、抗體，b)對(duì)所述分析物特異的抗體，以及c)對(duì)所述銪穴合物熒光團(tuán)特異的抗體。17、一種用于檢測(cè)至少一種分析物的試劑盒，包括a)所述分析物與鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，合一種單一抗體，b)對(duì)所述分析物特異的抗體，以及c)對(duì)所述鋱穴合物焚光團(tuán)特異的抗體。18、根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的用于檢測(cè)至少一種分析物的試劑盒，其進(jìn)一步包括過氧化氫。19、根據(jù)權(quán)利要求16、17或18所述的用于檢測(cè)至少一種分析物的試劑盒，其進(jìn)一步包括至少一種其他發(fā)光團(tuán)。團(tuán)的接合物，其中所i分析物是選自由、^一、20.<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>病原體、病毒、朊病毒、細(xì)菌、寄生蟲、藥物、抗生素、細(xì)胞抑制劑、精神活性物質(zhì)、麻醉劑、止痛劑、心臟藥物、代謝物、凝結(jié)抑制劑、激素、白細(xì)胞介素與細(xì)胞因子、興奮劑、毒品、毒素、有害物質(zhì)、農(nóng)藥、殺蟲劑、木材防腐劑、除草劑、殺真菌劑、爆炸物、維生素以及香料組成的群組，且所述銪穴合物熒光團(tuán)或所述鋱穴合物熒光團(tuán)包括三聯(lián)吡咬穴合物。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的分析物與銪穴合物熒光團(tuán)的接合物或分析物與鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，其中所述分析物與所述銪穴合物熒光團(tuán)或所述鋱穴合物熒光團(tuán)是共價(jià)結(jié)合。22、一種根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的分析物與銪穴合物熒光團(tuán)的接合物或分析物與鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物的用途，用于檢測(cè)所述分析物，其中所述分析物是選自由病原體、病毒、朊病毒、細(xì)菌、寄生蟲、藥物、抗生素、細(xì)胞抑制劑、精神活性物質(zhì)、麻醉劑、止痛劑、心臟藥物、代謝物、凝結(jié)抑制劑、激素、白細(xì)胞介素與細(xì)胞因子、興奮劑、毒品、毒素、有害物質(zhì)、農(nóng)藥、殺蟲劑、木材防腐劑、除草劑、殺真菌劑、爆炸物、維生素以及香料組成的群組。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)一種或一種以上分析物的方法，所述方法包括提供分析物與銪穴合物熒光團(tuán)或鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，以及對(duì)分析物特異的抗體，和對(duì)銪穴合物熒光團(tuán)或鋱穴合物熒光團(tuán)特異的抗體；以及利用光譜法測(cè)定在添加分析物時(shí)所發(fā)生的熒光猝滅，其中分析物特別是病原體、病毒、朊病毒、細(xì)菌、寄生蟲、藥物、抗生素、細(xì)胞抑制劑、精神活性物質(zhì)、麻醉劑、止痛劑、心臟藥物、代謝物、凝結(jié)抑制劑、激素、白細(xì)胞介素與細(xì)胞因子、興奮劑、毒品、毒素、有害物質(zhì)、農(nóng)藥、殺蟲劑、木材防腐劑、除草劑、殺真菌劑、爆炸物、維生素以及香料。此外，本發(fā)明涉及分析物與銪穴合物熒光團(tuán)或鋱穴合物熒光團(tuán)的接合物，也涉及一種用于檢測(cè)分析物的試劑盒。文檔編號(hào)G01N33/58GK101228441SQ200680021739公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2006年5月2日優(yōu)先權(quán)日2005年5月2日發(fā)明者法蘭克·塞爾里申請(qǐng)人:勒瑞音菲炫股份有限公司