專利名稱：：呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及含有該單克隆抗體的呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：呼吸道合胞病毒(RSV，簡稱合胞病毒，屬副粘病毒科)于1956年首次在伴有感冒癥狀的猩猩體內(nèi)分離到。是引起小兒病毒性肺炎最常見的病原，因其在細(xì)胞培養(yǎng)中能形成特殊的細(xì)胞融和病變，故名。該病毒的感染可引起間質(zhì)性肺炎，及毛細(xì)支氣管炎。在北京，48%的病毒性肺炎和58%的毛細(xì)支氣管炎系由合胞病毒引起U9801984);在廣州，小兒肺炎及毛細(xì)支氣管炎的31.4%由合胞病毒引起(19731986);在美國，20%25%的嬰幼兒肺炎和50%75%的毛細(xì)支氣管炎由合胞病毒引起。RSV在電鏡下所見與副流感病毒類似，病毒顆粒大小約為150nm，較副流感病毒稍小，為RNA病毒，對(duì)乙醚敏感，無血球凝集性，在人上皮組織培養(yǎng)形成特有的合胞(syncytium),病毒在胞漿內(nèi)增殖，可見胞漿內(nèi)包涵體。用分子生物學(xué)方法證明合胞病毒有二個(gè)亞型。合胞病毒感染的潛伏期為28天(多為46天)。合胞病毒肺炎的典型所見是單核細(xì)胞的間質(zhì)浸潤。主要表現(xiàn)為肺泡間隔增寬和以單核細(xì)胞為主的間質(zhì)滲出，其中包括淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此外肺泡腔充滿水腫液，并可見肺透明膜形成。在一些病例，亦可見細(xì)支氣管壁的淋巴細(xì)胞浸潤。在肺實(shí)質(zhì)出現(xiàn)伴有壞死區(qū)的水腫，導(dǎo)致肺泡填塞、實(shí)變和萎陷。由于母傳抗體不能完全地預(yù)防感染的發(fā)生，合胞病毒肺炎在出生后任何時(shí)候都可能發(fā)生。多見于3歲以下，16個(gè)月可見較重病例，男多于女。我國北方多見于冬春季，廣東則多見于春夏。由于抗體不能完全防止感染，合胞病毒的再感染極為常見，有人觀察10年，再感染發(fā)生率高達(dá)65%。合胞病毒的傳染性很強(qiáng)，有報(bào)道家庭成員相繼發(fā)生感染，在家庭內(nèi)發(fā)生時(shí)，年長兒及成人一般為上呼吸道感染。文獻(xiàn)報(bào)道院內(nèi)繼發(fā)合胞病毒感染率高達(dá)30%50%。合胞病毒感染多見于嬰幼兒，其中半數(shù)以上為1歲以內(nèi)嬰兒，男多于女，其比例約為1.52:1。潛伏期約45日。初期可見咳嗽、鼻堵塞。約2/3的病例有高熱，最高可至4rc，但發(fā)熱一般不是持續(xù)性的，較易由解熱藥退燒，高熱時(shí)間多數(shù)為14天，少數(shù)為58天。約l/3病兒中度發(fā)熱，多持續(xù)14天。多數(shù)病例的熱程為410天3輕癥病例呼吸困難及神經(jīng)癥狀不著，中、重癥有較明顯的呼吸困難、喘憋、口唇青紫、鼻扇及三凹征，少數(shù)重癥病例也可并發(fā)心力衰竭。胸部聽診多有細(xì)小或粗、中羅音，叩診一般無濁音，少數(shù)有過清音。臨床病人由于不同的呼吸道病毒(如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等)感染引起的疾病癥狀可以十分相似。這導(dǎo)致了流行診斷比較困難，確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖僭\斷的方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可以得到明確的診斷，便于阻止疾病的傳染及改變流行的爆發(fā)。目前呼吸道合胞病毒感染的檢測(cè)主要有以下幾種方法-一、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)-病毒分離法實(shí)驗(yàn)室診斷呼吸道合胞病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離的方法。采用標(biāo)本的時(shí)間以發(fā)病前5天為宜，取病人鼻咽棉拭子或咯痰進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。該病毒不能在雞胚內(nèi)增殖，只能在人和猴細(xì)胞如Hep-2，Hda等細(xì)胞株中培養(yǎng)增殖，約培養(yǎng)23周才出現(xiàn)細(xì)胞界線不清、融合成多核巨細(xì)胞等的細(xì)胞病變，病毒通過出芽釋放。但是病毒分離的方法具有嚴(yán)重的缺陷。因?yàn)樗鼈兗荣M(fèi)時(shí)又費(fèi)力，通常需要較長時(shí)間才能得到最終結(jié)果，這樣在臨床方面對(duì)病人的有效治療有一定的局限性。二、快速診斷直接檢査病毒蛋白抗原和病毒核酸可達(dá)到快速診斷的目的，常用的方法有免疫熒光法、免疫酶法、放射免疫法、免疫膠體金法、電鏡技術(shù)、核酸雜交和PCR法等。1、免疫學(xué)方法1、l免疫酶法免疫酶法(EIA)的基本原理是利用酵與抗體與抗原結(jié)合后，形成酶結(jié)合物，它既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)活性，有保留酶本身的酶活性，然后加入酶的相應(yīng)低物，在酶的催化作用下使原來無色的低物發(fā)生水解、氧化或其他反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物。EIA法敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡便，肉眼可觀察，便于大規(guī)模檢測(cè)，在呼吸道合胞病毒研究中，它主要用于合胞病毒的快速診斷和單克隆抗體的篩選，較少用于病毒株的抗原性分析。1、2免疫熒光法將患者的鼻咽分泌物脫落細(xì)胞涂片，用免疫熒光法可直接?xùn)撕习《究乖Ｃ庖邿晒馐且环N高度敏感和特異的技術(shù)，但它需要在標(biāo)本中少量的細(xì)胞和專業(yè)的技術(shù)人員來解釋結(jié)果。1、3免疫膠體金膠體金標(biāo)記，實(shí)際上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。目前醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的免疫膠體金診斷技術(shù)主要有兩種，膠體金快速免疫層析法和快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法。這兩種方法的基本原理都是以微孔濾膜作為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)吸管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上的包被的抗體或抗原結(jié)合，在用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而達(dá)到檢測(cè)的目的。免疫膠體金快速診斷技術(shù)具有放射免疫法、酶免疫法等診斷方法不可取代的優(yōu)點(diǎn)首先，它不需要酶聯(lián)免疫法中所需要的低物，因此可省去一些操作步驟，使操作簡單化；其次，膠體金無污染，不會(huì)危害操作者和污染環(huán)境；再次，膠體金抗體復(fù)合物在凍干狀態(tài)下室溫儲(chǔ)存穩(wěn)定；此外膠體金還具有檢測(cè)迅速、靈敏、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備、產(chǎn)物顯色永久不褪等優(yōu)點(diǎn)。由于免疫膠體金快速診斷技術(shù)己經(jīng)日趨成熟，以及它的便捷、靈敏、安全、低成本等優(yōu)點(diǎn)，使其在診斷領(lǐng)域中迅速推廣。目前市場(chǎng)上出售和文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在婦女妊娠系列、病原體抗原或抗體檢測(cè)系列、藥物濫用檢測(cè)系列、疾病相關(guān)蛋白檢測(cè)系列等。2、基因診斷2、l核酸雜交法此法比電鏡、免疫酶標(biāo)等方法更為特異、敏感，而且可定量。目前常用于呼吸道合胞病毒的快速診斷。核酸分子雜交技術(shù)能廣泛的用于臨床標(biāo)本中病毒序列的檢測(cè)，只是因?yàn)槌Ｒ?guī)的方法(如免疫學(xué)方法)就可以成功的檢測(cè)臨床標(biāo)本中的病毒，臨床就不需要它來診斷疾病。另一方面，核酸分子雜交技術(shù)作為診斷疾病的工具仍有一定的困難，如需要一定的設(shè)備，費(fèi)時(shí)。故在許多實(shí)驗(yàn)室尚不能作為常規(guī)診斷方法來應(yīng)用，因此目前該方法僅用于研究。2、2RT-PCR對(duì)許多RNA病毒來說RT-PCR診斷方法比傳統(tǒng)的病毒分離和抗原診斷方法既快又靈敏。而且RT-PCR可以很容易的同時(shí)診斷多種病毒，另一些診斷方法如病毒分離和免疫熒光分析卻不能。盡管基因檢測(cè)技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處，如PCR技術(shù)，最大的優(yōu)點(diǎn)恰恰帶來了它在實(shí)際應(yīng)用中的最大障礙，DNA擴(kuò)增的高校性導(dǎo)致了極微量的污染既可出現(xiàn)假陽性，因而使結(jié)果失真。此外病毒作為外原基因的入侵者，必須在闡明其全部或部分核苷酸序列時(shí)，才可以設(shè)計(jì)引物或探針，進(jìn)行核酸分子雜交和PCR檢測(cè)。從現(xiàn)有的呼吸道合胞病毒的檢測(cè)方法可見，病毒分離、EIA、RT-PCR診斷方法盡管都有一定的特異性和敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但在操作上需要專業(yè)技術(shù)人員、專門的儀器設(shè)備和特定的條件及費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，而近年發(fā)展成熟的免疫膠體金診斷技術(shù)具有特異性高、敏感度高、操作簡單而且不需要專業(yè)人員和儀器設(shè)備，已經(jīng)成為合胞病毒診斷新的發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可以快速、準(zhǔn)確檢驗(yàn)人呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了抗呼吸道合胞病毒的單克隆抗體，及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。為了上述目的，本發(fā)明釆取的技術(shù)方案如下本發(fā)明所產(chǎn)生的呼吸道合胞病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2A7己于2005年11月28日，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC1546。本發(fā)明抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體，可以用常規(guī)技術(shù)從保藏號(hào)為CGMCC1546的雜交瘤細(xì)胞株2A7產(chǎn)生。本發(fā)明呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，其包含從保藏號(hào)為CGMCC1546的雜交瘤細(xì)胞株2A7產(chǎn)生的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)具有以下有點(diǎn)①檢測(cè)快速IO分鐘出結(jié)果；②特異性僅對(duì)呼吸道合胞病毒呈陽性，而對(duì)其它呼吸道病毒和細(xì)菌等13種病原體呈陰性結(jié)果；③敏感性對(duì)呼吸道合胞病毒可以檢出3X104TCID5。/0.1mh④準(zhǔn)確率高經(jīng)八所三甲醫(yī)院臨床試驗(yàn)共3026例，與病毒培養(yǎng)法比較，總符合率為95.2%;⑤保存和運(yùn)輸方便在室溫下可以保存18個(gè)月；⑥臨床及家居使用極為便利，而且具有產(chǎn)業(yè)性。為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的制備(1)骨髓瘤細(xì)胞SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所。用時(shí)將儲(chǔ)存在液氮罐中的SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇，在含有10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48-72小時(shí)，待細(xì)胞生長良好，細(xì)胞渾圓、透亮、大小均一、排列整齊，呈對(duì)數(shù)分裂，準(zhǔn)備融合。將H印-2細(xì)胞培養(yǎng)好后，直接涂玻片上，-3(TC超低溫冰箱保存，供監(jiān)測(cè)抗細(xì)胞克隆用。(2)免疫親代細(xì)胞免疫用呼吸道合胞病毒購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所。將毒株接種在H印-2細(xì)胞中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)(+++)，立即放入-7(TC超低溫冰箱保存，以此作為免疫動(dòng)物的抗原。呼吸道合胞病毒抗原基質(zhì)片的制備將呼吸道合胞病毒接種在H印-2細(xì)胞中培養(yǎng)，待細(xì)胞病變達(dá)(+++)，將細(xì)胞從瓶壁上消化下來，離心沉淀，取潔凈活膠棉涂的10孔玻片，將病變細(xì)胞平鋪于玻片孔內(nèi)，立即用電風(fēng)扇吹干，丙酮國定，吹干，-3(TC超低溫冰箱保存，備抗體檢測(cè)用。制備的抗原液從-7(TC超低溫冰箱取出溶解后，用4號(hào)針頭分別給BALB/C小鼠(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)鼻孔滴入5-6滴，每只二次，間隔10天。融合前3日，在小鼠脾臟和腹腔以抗原0.15ml進(jìn)行攻擊。(3)細(xì)胞融合融合劑PEG(分子量1500，日本產(chǎn))；培養(yǎng)液10%小牛血清DMEM。SP2/0細(xì)胞和免疫的BALB/C小鼠的淋巴細(xì)胞分別按2X107和1X108比例融合。(4)陽性孔的監(jiān)測(cè)將融合孔上清液分別加在上述病毒基質(zhì)片上和H印-2細(xì)胞片上。放37。C恒溫箱內(nèi)30分鐘。以免疫熒光技術(shù)羊抗鼠熒光標(biāo)記物顯示。以熒光顯微鏡觀察結(jié)果，凡于病毒片反應(yīng)者又與H印-2細(xì)胞片反應(yīng)者，為抗細(xì)胞陽性，應(yīng)棄掉。同時(shí)用基因重組呼吸道合胞病毒N蛋白10ug/ml包被抗原板，加上融合孔上清，并以羊抗鼠酶標(biāo)記二抗，以酶聯(lián)儀測(cè)定，凡是大于空白對(duì)照2個(gè)0D值為陽性。(5)獲得陽性孔獲得陽性孔38孔。(6)陽性孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、傳代與克隆將陽性孔立即進(jìn)行復(fù)蘇、凍存、進(jìn)行傳代及復(fù)蘇的凍存工作。(7)將獲得的4個(gè)細(xì)胞株以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，培養(yǎng)傳代5個(gè)月。約40代，每傳一代進(jìn)行一次檢測(cè)，并進(jìn)行反復(fù)液氮凍存和復(fù)蘇。(8)抗體分泌穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以上4株產(chǎn)生抗合胞病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)連續(xù)克隆化檢測(cè)單克隆抗體陽性率達(dá)100%，在體外傳代5個(gè)月，并經(jīng)反復(fù)凍存復(fù)蘇均能達(dá)到保持穩(wěn)定的分泌抗體，上清效價(jià)1:6400-1:12800(++)IFA，或間接酶聯(lián)免疫上清效價(jià)在1:25600—1:51200以上。(10)細(xì)胞核學(xué)特征對(duì)上述雜交瘤細(xì)胞中期染色體檢測(cè)為87條；證明它們是SP2/0骨髓瘤與小鼠細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞。(11)選取其中的一株產(chǎn)生抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞l^命名為2A7，并于2005年11月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC1546實(shí)施例2:鼠源病毒檢査為了鑒定制備的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的特異性，即與所使用的鼠源病毒無交叉反應(yīng)。檢查鼠源病毒包括出血熱病毒(EHFV);淋巴細(xì)胞脈絡(luò)從腦膜炎病毒(LCMV);3型呼腸弧病毒(Reovirus);仙臺(tái)病毒；脫腳病毒；小鼠腺病毒(MAV);小鼠肺炎病毒(PVM)。細(xì)胞接種法將2A7雜交瘤細(xì)胞株分泌上清分別接種于Vero(非洲綠猴腎傳代細(xì)胞)；2BS(人胚肺)二倍體細(xì)胞，接種量為107。接種細(xì)胞后傳兩代，觀察細(xì)胞是否有病變，同時(shí)制片，用IFA法檢測(cè)病毒抗原，為陰性。動(dòng)物接種法2A7雜交瘤細(xì)胞株接種出生24小時(shí)以內(nèi)乳鼠各10只；體重15-20克成年小鼠各10只；體重300-350克的豚鼠各5只。每只動(dòng)物腹腔內(nèi)接種107活細(xì)胞，存活率為85%實(shí)施例3:支原體檢査培養(yǎng)法2A7雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞制片加支原體單克隆抗體(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)作用30分鐘，熒光染色，同時(shí)作陰、陽對(duì)照。結(jié)果:陰性對(duì)照結(jié)果(-)；陽性對(duì)照結(jié)果(+);檢測(cè)標(biāo)本結(jié)果陰性。培養(yǎng)上清進(jìn)行包被后加單克隆抗體，用ELISA方法檢測(cè)，同時(shí)做陰性對(duì)照，標(biāo)本結(jié)果陰性。實(shí)施例4:單克隆抗體的檢定免疫球蛋白類及亞類用免疫雙擴(kuò)散法，結(jié)果2A7雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體為IgG2b。呼吸道合胞病毒單克隆抗體用IFA法測(cè)定親和力常數(shù)為1.2X10—6M/L。實(shí)施例5:2A7單克隆抗體是針對(duì)呼吸道合胞病毒N蛋白單抗的鑒定采用間接ELISA測(cè)定呼吸道合胞病毒細(xì)胞株2A7單克隆抗體是針對(duì)呼吸道合胞病毒N蛋白的單抗，試驗(yàn)如下1.材料和方法1.1抗體呼吸道合胞病毒細(xì)胞株2A7制備純化的單克隆抗體(批號(hào)，200501、200502)，由本公司制備。1.2抗原呼吸道合胞病毒N重組蛋白抗原，由本公司制備。1.3試劑服P-羊抗鼠IgG抗體，購自中山科技有限公司；NBT貯存液，0.5gNBT于10mlDMT中，4。C保存；NBT/BCIP溶液，臨用前配。1.4ELISA測(cè)定rN用包被液稀釋成0.5mg/ml，每孔加入100u1包被于酶標(biāo)反應(yīng)板內(nèi)，并做雙復(fù)孔44"冰箱過夜0.01MPBS洗三次，每次5min，加入3%BSA100U1封閉I室溫60min0.01MPBS洗三次，每次5min,加入1:1000稀釋的鼠抗人呼吸道合胞病毒2A7i37。C60minO.OIMPBS洗三次，每次5min，加入3.0ug/ml服P-兔抗鼠IgG二抗100y1437。C60min0.01MPBS洗三次，每次5min，加入(^041202底物液100u1I37°C10-20min加2NftS04終止液50y1，在酶標(biāo)儀上測(cè)0D490值2.結(jié)果用間接ELISA檢測(cè)呼吸道合胞病毒rN抗原與呼吸道合胞病毒的雜交瘤2A7制備的純化單克隆抗體(批號(hào)，200501、200502)呈現(xiàn)高特異結(jié)合免疫活性，結(jié)果見表l。3.結(jié)論以上研究結(jié)果證實(shí)，呼吸道合胞病毒膠體金快速檢測(cè)盒選用的雜交瘤2A7制備的單克隆抗體是針對(duì)呼吸道合胞病毒N蛋白的抗體。表1.ELISA測(cè)定2A7單抗與呼吸道合胞病毒rN抗原結(jié)合的免疫活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例6:特異性封閉試驗(yàn)以兔抗2A7血清封閉，證實(shí)2A7分別被不同濃度的異種動(dòng)物血清封閉。采用IFA方法2A7與呼吸道合胞病毒結(jié)合，呈陽性反應(yīng)。與H印-2細(xì)胞結(jié)合，呈陰性反應(yīng)。以上證明單克隆抗體與靶抗原的特異性。實(shí)施例7:交叉試驗(yàn)2A7產(chǎn)生的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體與流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒;，2、3型、腺病毒3、7型、呼腸病毒及SARS病毒均呈陰性反應(yīng)。間接熒光法IFA測(cè)定效價(jià)1:6400—1:12800。間接酶聯(lián)測(cè)定效價(jià)1:25600—1:51200。實(shí)施例8:細(xì)胞庫的建立和抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的產(chǎn)生單克隆抗體生產(chǎn)場(chǎng)所應(yīng)符合GLP要求，潔凈無污染，工作人員無傳染病，不得從事其他可以導(dǎo)致傳染源污染單克隆抗體制劑工作；無關(guān)人員不得進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)內(nèi)，在同一年內(nèi)，不得同時(shí)生產(chǎn)其他無關(guān)單抗。1、細(xì)胞庫建立原始細(xì)胞庫和生產(chǎn)細(xì)胞庫及種子批1、l原始細(xì)胞庫2A7雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的2A7雜交瘤細(xì)胞。1、2種子細(xì)胞庫2A7雜交瘤細(xì)胞，為擴(kuò)大培養(yǎng)凍存的細(xì)胞種子，每批細(xì)胞管數(shù)20支，貼上標(biāo)簽放入液氮罐中保存。每批留取保存時(shí)進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體及病毒污染1、3生產(chǎn)細(xì)胞庫經(jīng)檢定合格的2A7雜交瘤細(xì)胞按生產(chǎn)條件大量培養(yǎng)，凍存的細(xì)胞管數(shù)為生產(chǎn)細(xì)胞庫。每一生產(chǎn)細(xì)胞批細(xì)胞管數(shù)10支，每次生產(chǎn)腹水時(shí)取生產(chǎn)管1支復(fù)蘇、擴(kuò)增及生產(chǎn)、不再回凍。2、抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的制備2、l小鼠腹水法(1)小鼠SPF級(jí)小鼠，經(jīng)檢査無鼠源病毒污染，在腹水生產(chǎn)過程中如發(fā)現(xiàn)動(dòng)物不健康、咬傷、感染者應(yīng)棄掉。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施有北京醫(yī)學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)頒發(fā)的醫(yī)學(xué)動(dòng)物二級(jí)以上合格證。(3)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)取生產(chǎn)批細(xì)胞管l支復(fù)蘇，加營養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，l支生產(chǎn)細(xì)胞只用一次，不再凍存。(4)細(xì)胞接種制備腹水均需在無菌條件下進(jìn)行，注射雜交瘤細(xì)胞之前，每只小鼠腹腔注射降植烷0.5ml。一周后每只小鼠注射2A7雜交瘤細(xì)胞1-3X105。(5)腹水的采集注射細(xì)胞后7-10天，或小鼠瀕死前一次采集腹水，亦可以多次采集。離心分離出上清既為粗提抗體。注明批號(hào)、采集日期，置-20°C保存。2、2細(xì)胞培養(yǎng)法可用細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)收集上清液制備單克隆抗體。(1)種子細(xì)胞來源于生產(chǎn)細(xì)胞庫。(2)培養(yǎng)基牛血清培養(yǎng)基。(3)抗體收集可一次性收集，也可以連續(xù)收集，每一管種子細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后收集的上清為一個(gè)批號(hào)。2、3粗制抗體的檢測(cè)無論是小鼠腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)法制備的單克隆抗體，都需要進(jìn)行如下檢定(1)無菌試驗(yàn)。(2)支原體檢査。(3)鼠源病毒檢査。(4)效價(jià)測(cè)定；以上檢測(cè)合格后用于抗體的純化。2、4抗體純化(1)將2A7單克隆抗體分別用50%、33%、33%三種濃度的SAS鹽析三次。SAS—般不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，可以去除不需要的白蛋白分子。(2)DEAE-52纖維素對(duì)鹽析過的單克隆抗體進(jìn)行洗脫，可見抗體活性峰與蛋白峰的重疊。(3)結(jié)果2A7單克隆抗體腹水純化回收率為100%，免疫電泳結(jié)果顯示一條清晰的沉淀線。(4)應(yīng)用將純化的單克隆抗體按效價(jià)的4-8單位應(yīng)用于檢測(cè)。連續(xù)生產(chǎn)三批，各批產(chǎn)品必須符合質(zhì)檢要求，批間具有良好的重復(fù)性。1)腹水效價(jià)的檢定2A7單克隆抗體腹水自小鼠腹腔取出后，立即分別用FluA抗原基片進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，要求IFA效價(jià)達(dá)到1:6400—1:12800，或間接酶聯(lián)免疫上清效價(jià)達(dá)到1:25600-1:51200。2)腹水純化隨時(shí)測(cè)定純化后的效價(jià)，要求每次測(cè)定(IFA)效價(jià)應(yīng)達(dá)1:6400—1:12800。2、5純化后處理(1)滅活必要時(shí)56。C水浴滅活30分鐘，離心取上清。(2)合并不同亞批的合格制品合格后在2-8r放置一個(gè)月以上，除去部分不穩(wěn)定蛋白。(3)除菌分裝將滅活抗體用0.22um濾膜過濾，過濾后，每4_8單位加入青霉素10單位，鏈霉素lug/ml，再加入適量的20%甘露醇進(jìn)行分裝，每支2ml，-30。C過夜，次日在進(jìn)行冷凍千燥。實(shí)施例9:單克隆抗體的大量生產(chǎn)采用體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。(1)實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長期的2A7雜交瘤細(xì)胞按1-3X107ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml，共2-4點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10-20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體的含量可達(dá)到1-10mg/ml。但采血量有限。(2)腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植垸)或液體石蠟于BALB/C小鼠，1-2周后腹腔注射1Xl(f個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-IO天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠瀕于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5-10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5-10mg/ml腹水，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、最多。實(shí)施例10:大量單克隆抗體的純化單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄糖球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(最常用S印harose)交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá)90%以上。蛋白可與IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3結(jié)合，同時(shí)還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測(cè)，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時(shí)，1.44(吸光單位)相當(dāng)于lmg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對(duì)保持抗體的活性至關(guān)重要。實(shí)施例ll:呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)的制備(1)膠體金的制備采用化學(xué)還原法，向氯化金水溶液中加入檸檬酸三鈉還原劑，使金離子聚合成40nm膠體金顆粒。先將0.01%的氯化金溶液500ml加熱至沸騰，邊攪拌邊迅速加入6.5ml1%擰檬酸三鈉水溶液，加熱至出現(xiàn)紅色后繼續(xù)煮沸7IO分鐘?；謴?fù)至室溫，恢復(fù)體積至500ml。(2)膠體金-抗體結(jié)合物制備及純化①、取膠體金顆粒溶液500ml，在磁力攪拌器下用0.2MK2C03調(diào)節(jié)PH至8.2。②、將本發(fā)明實(shí)施例8或9制備的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體用0.01MPB稀釋成lmg/ml。取5支試管各加入1ml膠體金溶液，在前4管分別加入30ul、40ul、45ul、50ul待標(biāo)記抗體，最后一管作為對(duì)照?；靹蚝笫覝胤胖?分鐘，前4管中各加入100ul濃度為10%的NaCl?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，和對(duì)照管對(duì)比，以沒有變藍(lán)色的一管所加入的抗體量作為最佳蛋白標(biāo)記量。在此基礎(chǔ)上加10%，作為標(biāo)記使用量。③、根據(jù)體積和標(biāo)記實(shí)用量計(jì)算標(biāo)記所需蛋白量，將lmg/ml的單克隆抗體緩慢加入膠體金溶液中，加入10mg蛋白的時(shí)間不超過5分鐘。室溫下攪拌30分鐘。然后進(jìn)行膠體金-抗體結(jié)合物穩(wěn)定性檢定取出2支試管，每管中加入lml己經(jīng)加入抗體的膠體金溶液，其中一管中加入IOOul濃度為1(E的NaCl，混勻后室溫放置10分鐘。對(duì)比兩管的顏色，應(yīng)無變化。④、加廳SA，至終濃度為1%。⑤、力卩10y。PEG，至終濃度為0.2%，室溫?cái)嚢?0分鐘。⑥、8500RPM離心30分鐘，小心吸去上清，用200ml膠體金保存液懸浮沉淀，再次以8300RPM離心30分鐘，小心吸去上清。用50ml膠體金保存液懸浮沉淀，置4"C保存?zhèn)溆谩?3)膠體金-抗體結(jié)合物玻璃纖維素膜的制備取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻噴在玻璃纖維上，放在平坦的塑料板上，然后冷凍1小時(shí)，放入冷凍干燥機(jī)上凍干過夜，至完全干燥。切成0.6-0.8cm寬，30cm長的條，室溫避光千燥環(huán)境中保存。(4)抗體固相硝酸纖維素膜的制備①、將本發(fā)明實(shí)施例8或9制備的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體用0.01MPBS稀釋成3.5±0.lmg/ml。用噴膜機(jī)將以上抗體以lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上(檢測(cè)線)。②、將羊抗鼠IgG多克隆抗體用0.01MPBS稀釋成2土0.lmg/ml。用噴膜機(jī)將以上抗體以lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上(對(duì)照線)。和檢測(cè)線的間隔為0.5cm。③、把固定有抗體的硝酸纖維素膜置37t:烤箱中干燥充分干燥。④、置干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?5)組裝試紙條①、在塑料板中間位置粘貼抗體固相硝酸纖維素膜。②、在塑料板上固定硝酸纖維素膜位置的頂端，粘附吸水墊，低端粘附金標(biāo)記抗體結(jié)合物-玻璃纖維素膜條帶。吸水墊和膠體金墊應(yīng)覆蓋硝酸纖維素膜邊沿約1毫米左右。③、膠體金墊下方粘附樣品墊，樣品墊覆蓋膠體金墊約1毫米。④、壓平整后，在切條機(jī)上切成0.4cm寬的條帶。(6)包裝(7)成品入庫根據(jù)檢定結(jié)果進(jìn)行分類，然后將制備的呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)按要求入庫。(8)檢定合格成品置常溫下保存。呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)質(zhì)量保證1雜交瘤細(xì)胞株的質(zhì)量保證(1)親本骨髓瘤細(xì)胞購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，該細(xì)胞具有穩(wěn)定遺傳性和無限增值能力。(2)免疫親代呼吸道合胞病毒購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所，是經(jīng)過技術(shù)檢定符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞株。(3)免疫小鼠Balb/C購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，該中心具備SPF級(jí)飼養(yǎng)場(chǎng)所，并經(jīng)過國家認(rèn)證，小鼠經(jīng)過檢定，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。(4)建立單克隆細(xì)胞檢定方法檢測(cè)結(jié)果抗體分泌穩(wěn)定性陽性率為100%，細(xì)胞核學(xué)特征符合雜交瘤的核學(xué)特征，鼠源病毒檢査為陰性，無菌試驗(yàn)為陰性。2單克隆抗體的質(zhì)量保證(1)免疫球蛋白類及亞類用免疫雙擴(kuò)散法，結(jié)果符合要求。(2)親和力用IFA法測(cè)定親和力常數(shù)為1.1X10—6M/L，符合要求。(3)特異性采用IFA法，特異性為100%。(4)交叉試驗(yàn)2A7單克隆抗體與流感病毒A、B型、副流感病毒l、2、3型、腺病毒3、7型、SARS病毒均呈陰性反應(yīng)。(5)效價(jià)測(cè)定用間接熒光法(IFA)，不低于1:6400-1:12800，符合要求。3粗制抗體的檢測(cè)無論是小鼠腹水還是細(xì)胞培養(yǎng)法制備的單克隆抗體，都需要進(jìn)行如下檢定。(1)無菌試驗(yàn)為無菌生長.陰性。(2)支原體檢査為陰性。(3)鼠源病毒檢査為陰性。(4)效價(jià)測(cè)定用IFA法測(cè)定或間接酶聯(lián)免疫法測(cè)定，符合純化要球。4成品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立(1)外觀檢査試紙條寬度4mm土0.2mm。試紙表面平整，邊沿整齊。試紙條各組分粘貼牢固，銜接緊密，以保證加樣后液體的移動(dòng)連續(xù)。(2)液體移動(dòng)速度抽提液在硝酸纖維素膜上移動(dòng)2cm時(shí)間不低于15秒。實(shí)驗(yàn)本發(fā)明呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)的檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)l:和呼吸道合胞病毒的反應(yīng)和呼吸道合胞病毒的兩個(gè)株(A和B)呈陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)2:交叉反應(yīng)和流感病毒A、B型無交叉反應(yīng)；副流感病毒l、2、3型無交叉反應(yīng)；和腺病毒3、7型無交叉反應(yīng)；和4株SARS病毒無交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)3:呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)的檢測(cè)真實(shí)性評(píng)價(jià)。于三個(gè)不同醫(yī)院共檢測(cè)病人標(biāo)本1108份，其中512份陽性樣品中檢測(cè)出陽性504份，596份陰性樣品中檢測(cè)出陰性592份。靈敏度512份陽性樣品中檢測(cè)出陽性504份，靈敏度為98.4%。特異度596份陰性樣品中檢測(cè)出陰性592份，特異度為99.3%。權(quán)利要求1、具有保藏號(hào)為CGMCC1546的雜交瘤細(xì)胞株。2、抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體，可以從具有保藏號(hào)為CGMCC1546的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。3、呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，其特征在于其包含權(quán)利要求2所述的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體。4、如權(quán)利要求3所述的呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)，其特征在于權(quán)利要求2所述的抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體包附膠體金。全文摘要本發(fā)明公開了保藏號(hào)CGMCC1546的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗呼吸道合胞病毒N蛋白單克隆抗體，及含有該單克隆抗體的呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒(膠體金法)。該檢測(cè)試劑盒可以快速檢測(cè)呼吸道合胞病毒，特異性、敏感性及準(zhǔn)確率高，保存和運(yùn)輸方便，臨床及家居使用上極為便利，而且具有產(chǎn)業(yè)性。文檔編號(hào)G01N33/569GK101130765SQ200610111650公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2006年8月21日優(yōu)先權(quán)日2006年8月21日發(fā)明者王炳彥申請(qǐng)人:北京阿斯可來生物工程有限公司