專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
氯霉素類(lèi)藥物(Chloramphenicol，CAP)是應(yīng)用廣泛的抗菌素，曾對(duì)畜禽疾病控制和治療起重要作用。但由于氯霉素類(lèi)藥物在食品中殘留對(duì)人體有嚴(yán)重的副作用，能引起人的再生性障礙性貧血，粒細(xì)胞缺乏癥等疾病，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已相繼禁止或嚴(yán)格禁止使用。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件中規(guī)定，動(dòng)物源性食品中氯霉素的殘留限量為不得檢出。用酶聯(lián)免疫測(cè)定方法和高效液相色譜分析法(HPLC)檢測(cè)時(shí)，要求其檢測(cè)限均為1ng/kg。由于高效液相色譜分析法和氣譜色譜等儀器分析方法樣本前處理及測(cè)定操作煩瑣和費(fèi)用高，推廣使用受到限制。酶聯(lián)免疫測(cè)定法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，儀器化程度低和樣本前處理相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶的用于動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測(cè)方法。
(二)技術(shù)方案為解決所述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒由下列成分組成(1)包被了氯霉素類(lèi)藥物抗原或抗抗體的酶標(biāo)板；(2)氯霉素類(lèi)藥物抗體；(3)氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)酶標(biāo)記物；
(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液；(8)終止液。
本發(fā)明中所指的氯霉素類(lèi)藥物為氯霉素和琥珀氯霉素，或者其它與氯霉素結(jié)構(gòu)相似、具有相同藥理活性的氯霉素類(lèi)藥物。
其中所述的包被了氯霉素類(lèi)藥物抗原的酶標(biāo)板在制備的過(guò)程中，所用的包被原是用混合酸酐法將氯霉素合成氯霉素類(lèi)藥物半抗原，再采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)將氯霉素類(lèi)藥物半抗原與兔血清白蛋白(RSA)偶聯(lián)得到的；所用的包被液是pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；所用的封閉液是含有3～10％小牛血清和3％惰性蛋白的溶液。
其中所述的氯霉素類(lèi)藥物抗體在制備的過(guò)程中的免疫原是采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)將氯霉素類(lèi)藥物半抗原和甲狀腺蛋白(BCG)進(jìn)行偶聯(lián)得到的，所用的抗體稀釋液是pH值7.4、0.02mol/L、含有1％卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明試劑盒中氯霉素類(lèi)藥物抗體的蛋白濃度為0.5～5.0μg/L。
其中所述的氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0～4.05μg/L，可以為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。
其中所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原，所用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶；本發(fā)明優(yōu)選辣根過(guò)氧化物酶。所述標(biāo)記酶可采用現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法將其與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)，如戊二醛法，過(guò)碘酸鈉法等，本發(fā)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的勞動(dòng)創(chuàng)造將過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行了改良，使反應(yīng)更加省時(shí)，并且降低了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料；酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原是采用混合酸酐法將標(biāo)記酶與氯霉素類(lèi)藥物半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，其中所述的底物顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)底物顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液。
其中所述的濃縮洗滌液為含有0.8～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉(NaN3)防腐劑的磷酸鹽緩沖液。
其中所述的濃縮復(fù)溶液為含有5‰N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液。
當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，其中所述的終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸，當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液。
可作為固定氯霉素抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或氯霉素類(lèi)特異性抗體的載體的物質(zhì)很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等。
本發(fā)明還提供了使用上述試劑盒定性、定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量的方法，它包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。
優(yōu)選地，樣品處理方法為a、動(dòng)物組織組織樣本(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚(yú))前處理方法均質(zhì)樣品，稱(chēng)取均質(zhì)后的樣品于離心管中，加入乙酸乙酯，振蕩，離心，取出上層液體，在氮?dú)饬飨赂稍?，加入正己烷溶解干燥的殘留物，再加稀釋了的?fù)溶液強(qiáng)烈振蕩，離心，去除上層相，取下層水相進(jìn)行分析。
b、尿液移取尿液到離心管中，加pH4.8、100mM醋酸鈉緩沖液混合，加葡萄糖苷酸酶(Merck，Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)，該溶液恢復(fù)至室溫后加入乙酸乙酯混合，離心，取出上層液體在氮?dú)庀?0～60℃干燥，用稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，即可進(jìn)行分析。
c、血清血漿取血清或血漿至試管中，加乙酸乙酯上下振蕩，靜置使水相與有機(jī)相分層，移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0℃水浴中吹干，殘留物用稀釋后的復(fù)溶液溶解，即可進(jìn)行分析。
d、蜂蜜取蜂蜜，放入離心管中，用去離子水溶解。加入乙酸乙酯上下震蕩，離心，移取上層乙酸乙酯到另一離心管中，50～60℃氮?dú)饬飨抡舾?，殘留物用稀釋后的?fù)溶液溶解，即可進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，其中試劑盒檢測(cè)是向包被有氯霉素類(lèi)藥物抗原的酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液和氯霉素類(lèi)藥物抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值?；蛘?，是向包被有羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板微孔中加入氯霉素類(lèi)藥物抗體，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗原及標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。
優(yōu)選地，檢測(cè)結(jié)果分析過(guò)程為用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，即百分吸光度值。計(jì)算公式為百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％公式中B為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。以氯霉素類(lèi)藥物濃度的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中氯霉素的濃度則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍，再根據(jù)氯霉素的實(shí)際殘留量利用交叉反應(yīng)率計(jì)算出樣本中氯霉素類(lèi)藥物的實(shí)際殘留量。
優(yōu)選地，檢測(cè)結(jié)果的分析也可以采用回歸方程法，計(jì)算出樣品溶液中氯霉素類(lèi)藥物的濃度。
優(yōu)選地，檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)軟件，此法更便于大量樣品的快速分析，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需1.5小時(shí)可以完成，最低檢測(cè)限為0.5μg/L。
其中，抗原及抗體的制備方法為(1)抗原的合成將氯霉素類(lèi)藥物分子結(jié)構(gòu)中的醇羥基采用戊二酸酐酰化得到具有氯霉素類(lèi)藥物官能團(tuán)的半抗原，再與兔血清白蛋白(RSA)、甲狀腺蛋白(BCG)等載體蛋白采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)在不同的溶劑中進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
所述合成半抗原的優(yōu)點(diǎn)為a、突出了氯霉素類(lèi)藥物母核的分子結(jié)構(gòu)。
b、反應(yīng)產(chǎn)率大大提高，使合成的氯霉素類(lèi)藥物分子在較溫和的條件下不被分解。
c、保留了氯霉素類(lèi)藥物半抗原分子結(jié)構(gòu)中有較強(qiáng)免疫原性的抗原決定簇——苯環(huán)上的硝基，提高特異性抗體的親和力。
通常免疫原的純度要求較高，免疫原的純度越高，制備的抗體特異性越強(qiáng)，至少要達(dá)到90％以上，本發(fā)明合成的免疫原采用免疫電泳測(cè)定其純度為98.5％。
(2)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體的制備采用改良后的過(guò)碘酸鈉法將羊抗鼠抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過(guò)碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體或氯霉素類(lèi)藥物抗原的摩爾濃度比為4∶1；由于辣根過(guò)氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，活化的辣根過(guò)氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，從而降低酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。這樣為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們將傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了改良，即1)省去了氨基的封閉過(guò)程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。
2)降低了辣根過(guò)氧化物酶∶抗抗體或氯霉素類(lèi)藥物抗原的摩爾濃度比率至2∶1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡(jiǎn)便，對(duì)酶活性的損失減少。
(3)酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原的制備采用混合酸酐法將標(biāo)記酶與氯霉素類(lèi)藥物半抗原偶聯(lián)得到酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原。
(4)氯霉素類(lèi)藥物單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以氯霉素類(lèi)藥物半抗原與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，可以得到血液里含有氯霉素類(lèi)藥物特異性抗體的小鼠脾臟。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，7～14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7～10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
其中本發(fā)明的試劑盒所用試劑的配制方法為a.氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液氯霉素類(lèi)藥物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；b.包被緩沖液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；c.封閉液含有3％～10％小牛血清、3％惰性蛋白的溶液；d.濃縮洗滌液含0.8％～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉(Na3N)防腐劑的磷酸鹽緩沖液(0.01M pH7.4)，為正常使用濃度的15～25倍；e.氯霉素類(lèi)藥物抗體工作液將抗體用pH值7.4、0.02mol/L、含1％卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋成蛋白濃度為0.1～1μg/L使用；f.酶標(biāo)記物工作液酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體或酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原稀釋液；f.底物顯色液A液過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲；g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；h.底物顯色液對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液pH 8.1、含有MgCl20.01％100mmolTris-HCl；
i.終止液1～2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液；j.濃縮復(fù)溶液為含有5‰二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液，為正常使用濃度的2～3倍。
其中酶標(biāo)板的制備方法為(1)用包被緩沖液將氯霉素類(lèi)藥物半抗原與兔血清白蛋白的偶聯(lián)物稀釋?zhuān)蛎嘎?lián)板微孔中加入抗原稀釋液，放入37℃環(huán)境進(jìn)行孵育，再放入4℃環(huán)境過(guò)夜(得到的酶聯(lián)板的穩(wěn)定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
(2)用包被緩沖液稀釋抗抗體，向酶聯(lián)板微孔中加入抗抗體稀釋液，放入37℃環(huán)境進(jìn)行孵育，放入4℃環(huán)境過(guò)夜(得到的酶聯(lián)板的穩(wěn)定性好)，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37℃孵育，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為(1)將氯霉素類(lèi)藥物抗原偶聯(lián)物(CAP-RSA)吸附在固相載體上，加入樣本或氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品并加入氯霉素類(lèi)藥物抗體工作液，待測(cè)樣本中殘留的氯霉素類(lèi)藥物與固相載體上包被的氯霉素類(lèi)藥物抗原競(jìng)爭(zhēng)氯霉素類(lèi)藥物單克隆抗體，再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止，測(cè)定的樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素的含量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較可判斷樣品中氯霉素的濃度范圍，再根據(jù)樣本中氯霉素實(shí)際殘留量利用交叉反應(yīng)率計(jì)算出樣本中其它氯霉素類(lèi)藥物在樣本中的殘留量。
(2)將抗抗體吸附與固相載體上，加入氯霉素類(lèi)藥物抗體工作液，再加入酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原，并加入樣本或氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)樣本中殘留的氯霉素類(lèi)藥物與酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在抗抗體上的氯霉素類(lèi)藥物單克隆抗體，顯色后終止，測(cè)定的樣品的吸光度值，該值與樣品中氯霉素殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出氯霉素的含量，再根據(jù)樣本中氯霉素實(shí)際殘留量利用交叉反應(yīng)率計(jì)算出樣本中其它氯霉素類(lèi)藥物在樣本中的殘留量。
(三)有益效果本發(fā)明的檢測(cè)氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定性或定量檢測(cè)動(dòng)物組織、血清、尿液、蜂蜜、蝦等樣品中氯霉素類(lèi)藥物的殘留量；對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。
本發(fā)明的試劑盒采用高特異性的氯霉素類(lèi)藥物單克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟的冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確度高、準(zhǔn)確度高、對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。


圖1氯霉素類(lèi)藥物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1試劑盒組分的制備1、半抗原的合成將氯霉素分子結(jié)構(gòu)中的醇羥基采用戊二酸酐酰化得到氯霉素半抗原。
2、抗原的合成a、取氯霉素類(lèi)藥物半抗原2g溶于20ml，0.5M的氫氧化鈉溶液中。
b、取1.5g碳化二亞胺溶于5ml純水并加到半抗原溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)。
c、取載體蛋白兔血清白蛋白(RSA)或甲狀腺蛋白(BCG)20g溶于75mlpH9.6碳酸鹽緩沖液。
d、將載體蛋白滴加到半抗原中4℃攪拌過(guò)夜。
e、將反應(yīng)完的人工抗原對(duì)0.1M的磷酸鹽緩沖液透析7天，每天換液3～4次。最后將抗原濃縮或凍干保存。
3、酶標(biāo)記抗抗體的制備將抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法是改良的過(guò)碘酸鈉法，方法如下a、8mg辣根過(guò)氧化物酶溶解于2mL蒸餾水中。
b、加入現(xiàn)配制的100mmol/L NaIO4溶液0.4mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20分鐘。
c、用1mmol/L醋酸鹽緩沖液于4℃透析過(guò)夜，除去多余的NaIO4，同時(shí)使自身偶聯(lián)的酶還原。
d、加入磷酸鹽緩沖液(pH8.6、0.5mol/L)40μl和含有IgG16mg的磷酸鹽緩沖液(pH 8.6、5mol/L)2.0mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4小時(shí)。
e、加入現(xiàn)配制的NaBH4水溶液(1mol/L)0.1mL4℃反應(yīng)4小時(shí)，以還原Schiff堿。
f、純化保存。
4、氯霉素類(lèi)藥物單克隆抗體制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以氯霉素類(lèi)藥物半抗原與甲狀腺蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只，首免時(shí)將抗原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。
單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×106個(gè)/只，7天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
5、酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將氯霉素類(lèi)藥物半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物稀釋成0.05μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，4℃過(guò)夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌5次，每次15～30秒，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育1～2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
實(shí)施例2檢測(cè)氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被氯霉素類(lèi)抗原的酶標(biāo)板；(2)蛋白濃度為0.5μg/L的氯霉素類(lèi)鼠單克隆抗體工作液；(3)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；(5)底物顯色液A液為過(guò)氧化氫，底物顯色液B液為鄰苯二胺；(6)濃縮洗滌液為含有0.8％吐溫20和1‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)濃縮復(fù)溶液為含有5‰N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液。
(8)終止液為1mol/L的硫酸溶液。
實(shí)施例3檢測(cè)氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板；(2)蛋白濃度為5.0μg/L的氯霉素類(lèi)鼠單克隆抗體工作液；(3)用堿性磷酸酯酶標(biāo)記的氯霉素類(lèi)藥物抗原；(4)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L；(5)底物液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液；(6)濃縮洗滌液為含有1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；(7)濃縮復(fù)溶液為含有5‰N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液。
(8)終止液為2mol/L的氫氧化鈉溶液。
實(shí)施例4樣品中氯霉素類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)1、樣品前處理(1)動(dòng)物組織組織樣本(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚(yú))前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱(chēng)3g±0.1g均質(zhì)后的樣品于離心管中，加入6ml乙酸乙酯，振蕩10min，室溫3000g以上離心10min，取出4ml上層液體，在氮?dú)饬飨?0～60℃干燥，加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩1min，室溫3000g，離心5min，去除上層相，取下層水相50μl進(jìn)行分析。
(2)尿液移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶(Merck，Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)，該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min，室溫3000g離心10min，取出4ml上層液體，在氮?dú)庀?0～60℃干燥，用1ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，取50μl進(jìn)行分析。
(3)血清血漿取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯上下振蕩1min，靜置使水相與有機(jī)相分層，移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0℃水浴中吹干，殘留物用1ml復(fù)溶液溶解，取50μl進(jìn)行分析。
(4)蜂蜜取2g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解。加入4ml乙酸乙酯上下震蕩10min，室溫3000g離心10min，移取1ml上層乙酸乙酯到另一離心管中，50～60℃氮?dú)饬飨抡舾?，殘留物用稀釋后?.5ml復(fù)溶液溶解，取50ul進(jìn)行分析。
2、用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)向包被氯霉素類(lèi)藥物半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)物的96孔酶標(biāo)板微孔中加分別加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液50μl，然后加入氯霉素類(lèi)藥物鼠單克隆抗體工作液50μl，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應(yīng)1h。倒出孔中液體，每孔加入250μl洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液100μl，用蓋板膜封板，25℃恒溫箱中反應(yīng)30min。取出酶標(biāo)板，如前述洗板5次。每孔加入底物顯色液A液50μl，再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃恒溫箱避光顯色30min。每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。
對(duì)50μl樣品溶液重復(fù)上述操作。
結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中氯霉素的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度再根據(jù)樣本中殘留的氯霉素的濃度利用交叉反應(yīng)率計(jì)算出其它氯霉素類(lèi)藥物在樣本的殘留量。利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。
根據(jù)酶標(biāo)板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度范圍。
實(shí)驗(yàn)例1試劑盒可重復(fù)性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)從每批按照實(shí)施例2(3)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.45μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1標(biāo)準(zhǔn)品可重復(fù)性試驗(yàn)


結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.9％～7.5％之間，符合了變異系數(shù)小于20％的規(guī)定，說(shuō)明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 17號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中第4點(diǎn)精密度和準(zhǔn)確度的精密度的標(biāo)準(zhǔn)。
樣本可重復(fù)性試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的氯霉素標(biāo)樣，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各三個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算板內(nèi)，批間變異系數(shù)。
表2雞肝樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表3雞肉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表4蝦樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

表5蜂蜜樣品可重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果表明動(dòng)物組織(雞肉/肝、豬肉/肝、魚(yú)和)蝦樣品的變異系數(shù)均小于18％，蜂蜜樣品的變異系數(shù)均小于20％。符合了變異系數(shù)小于20％的規(guī)定，說(shuō)明本試劑盒測(cè)定樣本的精密度達(dá)到了《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā) 17號(hào)附件2試劑盒備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中第4點(diǎn)精密度和準(zhǔn)確度的精密度的標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)驗(yàn)例2試劑盒的準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的氯霉素標(biāo)樣，對(duì)樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。
表6準(zhǔn)確度測(cè)定試驗(yàn)

結(jié)果表明豬肉和豬肝的回收率在62.4％～89.8％之間，雞肉和雞肝樣本的回收率為65.5％～94.5％，蝦樣本的回收率64.5％～90.5％，蜂蜜樣本回收率61.5％～91.5％。
實(shí)驗(yàn)例3試劑盒特異性試驗(yàn)選擇與氯霉素類(lèi)似結(jié)構(gòu)和類(lèi)似功能的2種氯霉素類(lèi)藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過(guò)各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率愈小，表明試劑盒的特異性愈高。

表7試劑盒的特異性

實(shí)驗(yàn)例4試劑盒保存期試驗(yàn)試劑盒保存條件為2～8℃，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50％抑制濃度、氯霉素添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2～8℃保存6個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)動(dòng)物組織中氯霉素類(lèi)藥物的試劑盒，其特征在于它包含下列成分(1)包被了氯霉素類(lèi)藥物抗原或抗抗體的酶標(biāo)板；(2)氯霉素類(lèi)藥物抗體；(3)氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(4)酶標(biāo)記物；(5)底物顯色液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復(fù)溶液；(8)終止液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于氯霉素類(lèi)藥物抗原是將氯霉素分子結(jié)構(gòu)中的醇羥基采用戊二酸酐?；玫降模俨捎盟苄蕴蓟啺贩▽⒙让顾仡?lèi)藥物半抗原與兔血清白蛋白偶聯(lián)得到的；抗抗體是以羊?yàn)槊庖邉?dòng)物，以鼠源性抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫得到的。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)記物是酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或酶標(biāo)記的氯霉素類(lèi)藥物抗原，酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醛法或過(guò)碘酸鈉法將辣根過(guò)氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶與抗抗體偶聯(lián)得到，酶標(biāo)記氯霉素類(lèi)藥物抗原是采用活化酯法將標(biāo)記酶與氯霉素類(lèi)藥物半抗原偶聯(lián)得到。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液為含有0.8～1.2％吐溫20和1‰疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為含有5‰ N，N’-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，底物顯色液A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲、底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺、終止液為1～2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時(shí)，底物顯色液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于氯霉素類(lèi)藥物抗體的蛋白濃度為0.5～5.0μg/L。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于鏈霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。
7.一種檢測(cè)樣品中氯霉素類(lèi)藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1～6之任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中試劑盒檢測(cè)為向包被有氯霉素類(lèi)藥物抗原的酶標(biāo)板微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液，再加入氯霉素類(lèi)藥物抗體，溫育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記羊抗鼠抗抗體，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中試劑盒檢測(cè)為向包被有羊抗鼠抗抗體的酶標(biāo)板微孔中加入氯霉素類(lèi)藥物抗體，再加入酶標(biāo)抗原及標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫試劑盒，該酶聯(lián)免疫試劑盒包括包被了氯霉素類(lèi)藥物抗原或抗抗體的酶標(biāo)板、氯霉素類(lèi)藥物鼠單克隆抗體濃縮液、氯霉素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)記物、底物顯色液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、終止液。本發(fā)明還公開(kāi)了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)氯霉素類(lèi)藥物的方法，它包括以下步驟首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的檢測(cè)動(dòng)物組織中氯霉素類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1766629SQ20051008677
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者沈建忠, 何方洋, 萬(wàn)宇平, 馮才偉, 吳小平, 馮才茂, 汪善良, 李軍, 趙正苗, 張照亮, 史為民, 張素霞, 丁雙陽(yáng), 羅曉琴, 孫倩 申請(qǐng)人:北京望爾生物技術(shù)有限公司