專利名稱：氯霉素親和柱及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種采用蛋白A瓊脂糖凝膠(protein A-Sepharose 4 fastflow)作為固相載體，與氯霉素的多克隆抗體(兔)相偶聯(lián)制備可重復使用的氯霉素親和柱及其制備方法和用途，代替樣品前處理中傳統(tǒng)的固相萃取技術凈化樣品，提高富集和凈化的效率。
背景技術：
氯霉素由于其具有療效好、價格低廉等優(yōu)點，曾經(jīng)廣泛應用于各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜂制品疾病的控制和治療。但氯霉素同時存在嚴重的副作用，尤其是非劑量依賴的引起不可逆的再生障礙性貧血，引起了國際組織和各國的高度重視，紛紛制定嚴格的計劃進行控制。鑒于此，包括我國在內(nèi)的許多國家都對動物性食品中氯霉素的殘留作了嚴格的限制，規(guī)定不得檢出。氯霉素的殘留同時也成為國際貿(mào)易中的技術壁壘，檢測的限量標準一降再降，歐盟的現(xiàn)行標準為0.3μg/Kg。目前，氯霉素的篩選方法較多的是采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，確證主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)。在儀器測定中，往往需要復雜的樣品凈化技術。傳統(tǒng)的凈化技術包括液液萃取、基質(zhì)固相分散和固相萃取等。液液萃取的凈化方式，一般首先用乙酸乙酯提取濃縮后，用0.4％的氯化鈉溶液溶解，再采用正己烷液液萃取除掉油脂，之后用乙酸乙酯反萃取進行濃縮，之后進行分析，該種凈化方式測定的檢測限不低于10μg/Kg，不能滿足目前的檢出要求；為了追求高的靈敏度，還需要進一步的凈化，通常的方式是采取C18柱或類似其它的固相萃取柱凈化，有的報道采用兩根以上的固相萃取柱連續(xù)凈化，可以達到檢測要求，但是由于基質(zhì)的差異，針對不同的樣品往往需要采用不同的凈化方式以除去不同性質(zhì)的干擾物質(zhì)；有研究使用氯霉素抗體與凝膠固相載體相聯(lián)制備親和層析柱，該方法特意性高，凈化富集的效果好，目前已有產(chǎn)品上市，但是目前的偶聯(lián)方式是采用抗體通過CNBr與凝膠固相載體聯(lián)結(jié)，這種方式?jīng)Q定了其對抗體的純度要求較高，否則雜蛋白的存在會影響測定結(jié)果、同時影響了柱的氯霉素負載量，而且可重復使用的次數(shù)有限，有些開發(fā)為一次性的親和層析柱，這樣成本較一般的固相萃取柱成本高出很多，而可以重復使用的產(chǎn)品對于溶劑的使用要求嚴格，一般禁止使用純?nèi)軇?，這樣就存在洗脫殘留造成的假陽性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用蛋白A瓊脂糖凝膠(protein A-Sepharose 4fast flow)作為固相載體，與經(jīng)過硫酸銨鹽析純化的氯霉素多克隆抗體(兔抗)相偶聯(lián)制備可重復使用的親和層析柱，代替樣品前處理中傳統(tǒng)的固相萃取技術凈化樣品，提高富集和凈化的效率，提高方法的靈敏度，同時該親和層析柱理論上可以適用多種基質(zhì)。本發(fā)明的技術方案如下親和柱的制備
(1)將氯霉素多克隆免疫血清抗體經(jīng)過硫酸銨分級沉淀純化后和0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合；(2)將蛋白A瓊脂糖凝膠與0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合；(3)將(1)與(2)混合，室溫，振蕩1-3小時，蛋白A瓊脂糖凝膠氯霉素多克隆免疫血清抗體0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液按體積1∶1∶3配比；(4)待氯霉素多克隆免疫血清抗體與蛋白A瓊脂糖凝膠特意性結(jié)合后，分別用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液洗去未結(jié)合的抗體和其它的雜蛋白；(5)然后加入0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液和二甲基庚二酸酯(DMP)，室溫，振蕩1-2小時，三乙醇胺溶液∶氯霉素多克隆免疫血清抗體∶蛋白A瓊脂糖凝膠按體積1∶1∶1配比，三乙醇胺溶液∶二甲基庚二酸酯按1ml∶5mg配比；(6)用0.02mol/L，pH7.4的乙醇胺溶液終止聯(lián)接反應后，換含0.01％柳硫汞鈉的0.01mol/L，pH7.4，磷酸鹽緩沖液置換柱內(nèi)液體，裝柱，0.25ml/柱，4℃保存。
氯霉素免疫親和柱的使用方法將制備好的氯霉素免疫親和柱從4℃冰箱中取出，室溫中放置2小時使用。
上樣放掉柱內(nèi)溶液，分別用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；將提取的樣品用0.3M，pH8.0的磷酸鉀緩沖液溶解、上樣；
淋洗溶液依次用水和甲醇-水，甲醇∶水＝20∶80淋洗柱床、棄去；洗脫溶液用100％甲醇洗脫用于測定；活化再生100％甲醇淋洗，用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)活化再生；保存條件用含0.01％柳硫汞鈉的0.01mol/L，pH7.4，磷酸鹽緩沖液置換柱內(nèi)液體，4℃保存，以待重復使用。
適用范圍可用于蜂蜜、水產(chǎn)、動物組織氯霉素殘留的測定以及飼料、血液和尿樣當中氯霉素的測定。
親和柱性能的評價包括柱容量、柱空白、柱回收、柱重復性和穩(wěn)定性。柱容量采用過量的氯霉素通過親和柱，測定柱內(nèi)的氯霉素決定其柱容量。柱空白選擇經(jīng)過柱容量測定的親和柱，采用上樣溶液通過親和柱，經(jīng)過淋洗、洗脫后測定洗脫液中的氯霉素。柱回收20ng氯霉素通過親和柱，經(jīng)過淋洗、洗脫后測定洗脫液中的氯霉素。柱重復性和穩(wěn)定性以測定食品實際樣品的結(jié)果來表示。氯霉素的含量通過N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氯硅烷(TMCS)(99∶1)衍生，然后采用GC-MS/MS進行測定。氯霉素的衍生原理、衍生物的全掃描質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖分別見圖1、圖2和圖3。
柱容量將制備好的氯霉素免疫親和柱從4℃冰箱中取出，室溫中放置2小時進行測試。放掉柱內(nèi)溶液，分別用10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；0.3M磷酸鉀緩沖液10ml，加入54ng氯霉素標準，混勻，上樣；自然流速收集上樣溶液；再分別用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗棄去，2ml甲醇洗脫并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，換液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的內(nèi)標(d5-氯霉素)；收集的上樣溶液用乙酸乙酯40ml萃取并濃縮，最終各收集管用氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同標準一起在75℃反應30分鐘進行衍生，氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，進行GC-MS分析。標準系列取不同濃度Cap系列標準溶液及50μL，100μg/L d5-Cap內(nèi)標溶液(100μg/L，50μg/L，20μg/L，10μg/L，5μg/L，2μg/L)，N2流下吹干，同上述衍生操作步驟。
GC-MS分析條件色譜條件載氣高純氦氣；恒壓10psi；進樣口溫度260℃；初始柱溫150℃，保持1min，20℃/min升至270℃，保持5min。傳輸線溫度250℃；進樣方式不分流進樣1μL。
質(zhì)譜參數(shù)燈絲電流50μA，離子化方式電子轟擊源，離子制備多反應監(jiān)測(MRM)；溶劑延遲8.5min；阱溫220℃；倍增器補償電壓250V；掃描時間0.4s；最大離子化時間65000μs；阱內(nèi)目標離子數(shù)5000counts；預掃描時間1500μs；碰撞誘導電位0.4V。Cap及d5-Cap監(jiān)測離子分別為m/z 225＞208、178、m/z 230＞213。
定量計算以各系列標準溶液的進樣量(ng)與對應的氯霉素(m/z 208)和內(nèi)標(m/z 213)的峰面積比進行線性回歸計算，得出線性方程為按下式用內(nèi)標法計算樣品中AA的含量。
X=A×m2m1×m3]]>X-試樣中AA含量，μg/kg；A-試樣色譜峰與內(nèi)標色譜峰的峰面積比值對應的氯霉素質(zhì)量，ng；m1-取樣量，g；m2-標準溶液中標的質(zhì)量，ng；m3-樣品中內(nèi)標的質(zhì)量，ng。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
柱容量的測定結(jié)果見表1，由表1可以看出該免疫親和柱的柱容量不小于45ng。對于氯霉素的檢測，各國的規(guī)定均＜1μg/Kg，所以該親和柱的柱容量完全滿足樣品分析的容量要求。親和柱的制備日期為2004-10-18，截止2005-3-14共5個月的保存時間，重復使用次數(shù)不小于40次的情況下，其柱容量不低于40ng，而對于氯霉素殘留的檢測，10ng的柱容量已經(jīng)足夠。
表1柱容量測定結(jié)果

柱空白測試過程同柱容量，不同處為1)不上標準；2)只收集洗脫液(2ml甲醇)柱空白的測定為ND，其色譜圖見圖4，該方法的檢出限為2pg，定容體積為100μl，則柱空白不大于200pg。
柱回收測試過程同柱容量，不同處為1)將標準量改為20ng，因為考慮到各國制定的標準均＜1μg/Kg，而目前測定方法的取樣量一般≤10g；2)只收集洗脫液(2ml甲醇)。
柱回收結(jié)果同一根親和柱測定四次結(jié)果為85-96％之間。結(jié)果顯示親和柱的回收率可以滿足分析方法的要求。
重復性和穩(wěn)定性親和柱的重復性和穩(wěn)定性以測定食品中基質(zhì)復雜的蜂蜜樣品的加標回收來表示，加標的水平分別為0.1、0.3和1.0μg/Kg。
提取稱取蜂蜜樣品5g，加入10ml超純水，振蕩溶解；加入25ml乙酸乙酯振蕩提取30分鐘，3500rpm離心5分鐘，滴管轉(zhuǎn)移上層有機相，重復乙酸乙酯提取過程合并有機相；加入5ml 0.3M磷酸鉀緩沖液，45℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶口出現(xiàn)水霧；蒸發(fā)殘留物溶解在10ml0.3M磷酸鉀緩沖液中過親和柱。
凈化及GC-MS測定見柱容量。
重復性和穩(wěn)定性實驗結(jié)果蜂蜜樣品的加標結(jié)果見表2，測定的三個水平的回收率在80-90％之間，RSD在0.1μg/Kg水平為14.4％，其余兩個水平均小于10％。結(jié)果表明該方法測定蜂蜜中的氯霉素可以滿足分析方法的要求。蜂蜜的空白樣品含量＜0.1μg/Kg，將取樣量擴大到10g平行測定6次，結(jié)果為0.05±0.01，RSD20％。親和柱蜂蜜樣品0.1μg/Kg加標的質(zhì)量色譜圖見圖5，其信噪比為8-14，達到定量檢出的要求，m/z 208和178豐度比分別為100％、13％，與標準的豐度相比比誤差＜20％，滿足分析要求。
表2蜂蜜樣品的加標結(jié)果

與C18柱凈化結(jié)果的比較以目前最常用Sep-pak C18柱凈化蜂蜜樣品進行二者凈化效果的比對，加標的水平分別為0.1μg/Kg和0.3μg/Kg提取過程類似親和柱，但將內(nèi)標在提取前加入，并將最終的定溶液改為4mL乙腈/水(5/95，V/V)凈化先按下述過程活化Sep-pak C18柱依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、10mL水淋洗。將樣品提取液上活化后的SPEC18柱，用5mL乙腈/水(5/95)淋洗后，用3mL乙腈/乙酸乙酯(98/2)洗脫，收集洗脫液，在N2流下吹干。
衍生和測定同親和柱。
Sep-pak C18柱的測定結(jié)果為加標水平為0.3μg/Kg(n＝6)時，回收率111％±1.06，RSD為6.98％。加標水平為0.1μg/Kg時，其信噪比只有3-5，不足以達到定量檢出的要求。比較二者0.3μg/Kg的加標結(jié)果，回收率和RSD沒有顯著性差別，二者的質(zhì)量色譜圖均沒有雜峰干擾，但背景的離子化時間有明顯的區(qū)別，而離子化時間與阱中的離子數(shù)成反比反應了背景的干凈程度它，離子化時間越長說明背景越干凈。親和柱凈化的樣品背景的離子化時間均不小于45000μs，Sep-pak C18柱凈化的樣品背景的離子化時間均不大于20000μs。說明親和層析柱凈化效果優(yōu)于C18柱，雖然在測定蜂蜜時0.3μg/KKg的加標水平下兩種處理方式均能滿足分析要求，但在0.1μg/Kg加標水平下測定結(jié)果明顯優(yōu)于C18，而且可以預測面對基質(zhì)更復雜的樣品相對于C18柱本方法會有更好的凈化效果。
該親和層析柱提高了富集和凈化的效率，從而提高了方法的靈敏度，理論上可以適用多種基質(zhì)，該技術由于使用了蛋白A所以只有IgG可以聯(lián)結(jié)，偶聯(lián)的特意性高，柱子的氯霉素負載量大，即使使用純?nèi)軇┮部梢远啻沃貜褪褂谩?br>

圖1氯霉素衍生原理圖2氯霉素衍生物的全掃描質(zhì)譜3氯霉素衍生物MS/MS質(zhì)譜4柱空白的質(zhì)量色譜5親和柱蜂蜜樣品0.1μg/Kg加標的質(zhì)量色譜圖
具體實施例方式
實施例1本實施例是氯霉素免疫親和柱的制備。
所用試劑氯霉素多克隆抗體BSA-琥珀氯霉素免疫家兔，免疫血清經(jīng)過硫酸銨沉淀純化(蛋白濃度5mg/ml)；蛋白A瓊脂糖凝膠(PharmaciaBiotech)；二甲基庚二酸酯(Pierce Bitochnology，DMP)；甲醇、乙醇胺、三乙醇胺、柳硫汞鈉、NaCL、KCL、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O。
緩沖液的配置0.3M磷酸鉀緩沖液，pH8.064.8g K2HPO4·3H2O，蒸餾水溶解定容至1000ml，磷酸調(diào)節(jié)pH8.2；0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)NaCL 8.00g，KCL 0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，蒸餾水溶解定容至1000ml；含0.01％柳硫汞鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS-0.01％)；0.2mol/L三乙醇胺溶液(pH8.2)三乙醇胺5.968g蒸餾水溶解定容至200ml，磷酸調(diào)節(jié)pH8.2；0.02mol/L乙醇胺溶液(pH7.4)用0.2mol/L三乙醇胺溶液新鮮配置。
親和柱的制備取1ml蛋白A瓊脂糖凝膠微珠，3000rpm離心2分鐘，倒掉上清，加入2ml PBS輕輕混勻后3000rpm離心2分鐘，倒掉上清夜，重復兩次；加入氯霉素抗體1ml和1ml PBS室溫振蕩2小時；PBS洗三遍，每次2ml，三乙醇胺溶液洗兩遍，每次2ml；3000rpm離心2分鐘，倒掉上清，加入1ml三乙醇胺溶液和5mgDMP，室溫振蕩1小時；3000rpm離心2分鐘，倒掉上清，乙醇胺溶液洗兩遍，換液PBS-0.01％；裝柱，0.25ml/柱，4℃保存。
氯霉素免疫親和柱用于蜂蜜、水產(chǎn)、動物組織氯霉素殘留的測定以及飼料、血液和尿樣當中氯霉素的測定。
將制備好的氯霉素免疫親和柱從4℃冰箱中取出，室溫中放置2小時使用。
上樣放掉柱內(nèi)溶液，分別用10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；將提取的樣品用10ml0.3M磷酸鉀緩沖液(pH8.0)溶解、上樣。
淋洗溶液依次1ml水和2ml甲醇-水(甲醇∶水＝20∶80)淋洗柱床、棄去；洗脫溶液2ml100％甲醇洗脫用于測定；活化再生4ml100％甲醇淋洗，用10ml的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)活化再生；保存條件0.01％柳硫汞鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)，4℃保存。
實施例2用實施例1所述的方法制備氯霉素免疫親和柱，重復使用親和柱，測定食品中基質(zhì)復雜的蜂蜜樣品的加標回收，加標的水平分別為0.1、0.3和1.0μg/Kg。
提取稱取蜂蜜樣品5g，加入10ml超純水，振蕩溶解；加入25ml乙酸乙酯振蕩提取30分鐘，3500rpm離心5分鐘，滴管轉(zhuǎn)移上層有機相，重復乙酸乙酯提取過程合并有機相；加入5ml 0.3M磷酸鉀緩沖液，45℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶口出現(xiàn)水霧；蒸發(fā)殘留物溶解在10ml0.3M磷酸鉀緩沖液中過親和柱。
凈化將制備好的氯霉素免疫親和柱從4℃冰箱中取出，室溫中放置2小時后進行測定。放掉柱內(nèi)溶液，分別用10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；樣品提取物上樣；自然流速，棄取上樣溶液；再分別用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗棄去，2ml甲醇洗脫并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，換液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的內(nèi)標(d5-氯霉素)；最終用氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同標準一起在75℃反應30分鐘進行衍生，氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，進行GC-MS分析。
GC-MS分析條件色譜條件載氣高純氦氣；恒壓10psi；進樣口溫度260℃；初始柱溫150℃，保持1min，20℃/min升至270℃，保持5min。傳輸線溫度250℃；進樣方式不分流進樣1μL。
質(zhì)譜參數(shù)燈絲電流50μA，離子化方式電子轟擊源，離子制備多反應監(jiān)測(MRM)；溶劑延遲8.5min；阱溫220℃；倍增器補償電壓250V；掃描時間0.4s；最大離子化時間65000μs；阱內(nèi)目標離子數(shù)5000counts；預掃描時間1500μs；碰撞誘導電位0.4V。Cap及d5-Cap監(jiān)測離子分別為m/z 225＞208、178、m/z 230＞213。
蜂蜜樣品的加標結(jié)果見表2，測定的三個水平的回收率在80-90％之間，RSD在0.1μg/Kg水平為14.4％，其余兩個水平均小于10％。結(jié)果表明該方法測定蜂蜜中的氯霉素可以滿足分析方法的要求。蜂蜜的空白樣品含量＜0.1μg/Kg，將取樣量擴大到10g平行測定6次，結(jié)果為0.05±0.01，RSD20％。親和柱蜂蜜樣品0.1μg/Kg加標的質(zhì)量色譜圖見圖5，其信噪比為8-14，達到定量檢出的要求，m/z 208和178豐度比分別為100％、13％，與標準的豐度相比比誤差＜20％，滿足分析要求。另外，使用上述方法參加了2005年3月英國中心實驗室組織的FAPAS蜂蜜樣品的分析質(zhì)量考核，測定結(jié)果為0.56μg/Kg，全世界共有30多家實驗室參加考核，英國中心實驗室統(tǒng)計的均值為0.54μg/Kg，我們的測定結(jié)果相當準確，z評分為0.2。(z評分≤1，成績優(yōu)秀；1＜z評分≤2，成績良好；2＜z評分≤3，測定結(jié)果可疑；z評分＞3，測定結(jié)果無效)。
實施例3用實施例1所述的方法制備氯霉素免疫親和柱，測定蝦仁樣品的加標回收來，加標的水平分別為0.1、0.3和1.0μg/Kg。
提取稱取空白蝦仁樣品5g，加入氯霉素標準，加入10ml超純水，振蕩溶解；加入25ml乙酸乙酯振蕩提取30分鐘，3500rpm離心5分鐘，滴管轉(zhuǎn)移上層有機相，重復乙酸乙酯提取過程合并有機相；加入5ml 0.3M磷酸鉀緩沖液，45℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至瓶口出現(xiàn)水霧；蒸發(fā)殘留物溶解在10ml 0.3M磷酸鉀緩沖液中，再用分別用2ml正己烷液液萃取2次去除脂肪后備用。
凈化將制備好的氯霉素免疫親和柱從4℃冰箱中取出，室溫中放置2小時后進行測定。放掉柱內(nèi)溶液，分別用10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)和10ml 0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；樣品提取物上樣；自然流速，棄取上樣溶液；再分別用1ml水和2ml甲醇-水(20∶80)淋洗棄去，2ml甲醇洗脫并收集；4ml甲醇淋洗，10ml磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01mol/L，pH7.4)活化，換液PBS-0.01％，4℃保存。各收集管中加入5ng的內(nèi)標(d5-氯霉素)；最終用氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯和100μl BSTFA+TMCS(99∶1)，同標準一起在75℃反應30分鐘進行衍生，氮氣吹干，加入100μl乙酸乙酯定容，進行GC-MS分析。其余過程見實施例2測定的三個水平的回收率在80-90％之間，RSD在0.1μg/Kg水平小于20％，其余兩個水平均小于10％。結(jié)果表明該方法測定蝦仁中的氯霉素可以滿足分析方法的要求。
權(quán)利要求
1.一種氯霉素親和柱的制備方法，其特征在于(1)將氯霉素多克隆免疫血清抗體經(jīng)過硫酸銨分級沉淀純化后和0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合；(2)將蛋白A瓊脂糖凝膠與0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液混合；(3)將(1)與(2)混合，室溫，振蕩1-3小時，蛋白A瓊脂糖凝膠∶氯霉素多克隆免疫血清抗體∶0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液按體積1∶1∶3配比；(4)待氯霉素多克隆免疫血清抗體與蛋白A瓊脂糖凝膠特意性結(jié)合后，分別用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液洗去未結(jié)合的抗體和其它的雜蛋白；(5)然后加入0.2mol/L，pH8.2的三乙醇胺溶液和二甲基庚二酸酯(DMP)，室溫，振蕩1-2小時，三乙醇胺溶液∶氯霉素多克隆免疫血清抗體∶蛋白A瓊脂糖凝膠按體積1∶1∶1配比，三乙醇胺溶液∶二甲基庚二酸酯按1ml∶5mg配比；(6)用0.02mol/L，pH7.4的乙醇胺溶液終止聯(lián)接反應后，換含0.01％柳硫汞鈉的0.01mol/L，pH7.4，磷酸鹽緩沖液置換柱內(nèi)液體，裝柱，0.25ml/柱，4℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氯霉素親和柱的制備方法制備的氯霉素親和柱，其特征在于由蛋白A瓊脂糖凝膠(protein A-Sepharose 4 fastflow)作為固相載體，載體上的蛋白A與氯霉素抗體相偶聯(lián)，偶聯(lián)后的氯霉素抗體又與固定相化學鍵合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氯霉素親和柱的用途，其特征在于用于蜂蜜、水產(chǎn)或動物組織氯霉素殘留的測定及飼料、血液或尿樣當中氯霉素的測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的氯霉素親和柱的使用方法，其特征在于(1)放掉柱內(nèi)溶液，分別用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.3M磷酸鉀緩沖液淋洗柱床；(2)將提取的樣品用0.3M，pH8.0的磷酸鉀緩沖液溶解、上樣；(3)淋洗溶液依次用水和甲醇-水，甲醇∶水＝20∶80淋洗柱床、棄去；(4)洗脫溶液用100％甲醇作為洗脫溶劑洗脫并測定洗脫液；(5)活化再生100％甲醇淋洗，用0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)活化再生；(6)保存條件用含0.01％柳硫汞鈉的0.01mol/L，pH7.4，磷酸鹽緩沖液置換柱內(nèi)液體，4℃保存，以待重復使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氯霉素親和柱及其制備方法和用途，其采用蛋白A瓊脂糖凝膠(protein A－Sepharose 4 fast flow)作為固相載體，載體上的蛋白A與氯霉素抗體相偶聯(lián)，偶聯(lián)后的氯霉素抗體又與固定相化學鍵合，該親和柱制備方法簡單，可重復使用的，提高了富集和凈化的效率，從而提高了方法的靈敏度，理論上可以適用多種基質(zhì)，由于使用了蛋白A，所以只有IgG可以聯(lián)結(jié)，偶聯(lián)的特意性高，柱子的氯霉素負載量大，即使使用純?nèi)軇┮部梢远啻沃貜褪褂谩?br> 文檔編號G01N33/559GK1731182SQ20051008634
公開日2006年2月8日 申請日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者張珙, 王家紅 申請人:王家紅