專利名稱：魚類分子生物學(xué)快速鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類分子生物學(xué)鑒別方法。
背景技術(shù)：
保護(hù)生物多樣性，就是保護(hù)人類自己。由于水體生態(tài)環(huán)境的特殊性和大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物一直是人們捕捉的對(duì)象，魚類生物多樣性比陸生動(dòng)物多樣性顯得更為脆弱，承受的壓力更大。保護(hù)好魚類種質(zhì)資源，就是保護(hù)人類生存所必須的水產(chǎn)動(dòng)物蛋白的生產(chǎn)源泉。魚類資源是一種可更新的資源，只要利用得當(dāng)，就可取之不盡，經(jīng)久不衰，但如果酷捕濫捕，也可發(fā)生資源枯竭或個(gè)體變小、質(zhì)量降低。捕撈并不是一個(gè)消極因素，只要捕撈合理，它可使魚類種群產(chǎn)生最大的生產(chǎn)量，人們可獲得最大持續(xù)量。據(jù)Nelson(1994)報(bào)道，全世界共有魚類24618種，占脊椎動(dòng)物種數(shù)的一半以上，在動(dòng)物界中僅次于昆蟲。在全世界，水面占地球表面的71％，其中，海洋占地面總水面的97％，而淡水僅占地面總水面的1％，但41％的硬骨魚類正是生活在面積極其有限的淡水水體里(Cohen，1970)。全世界約有10億人以魚類為主要的蛋白質(zhì)來(lái)源，但同農(nóng)作物及畜禽類不同的是，目前，人類所消費(fèi)的魚類數(shù)量的80％以上依然來(lái)自天然捕撈產(chǎn)品。在全世界水產(chǎn)動(dòng)物，如魚類中，只有少數(shù)種類已用于養(yǎng)殖，極大多數(shù)種類的養(yǎng)殖潛力尚待評(píng)估。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，僅中國(guó)，由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展以及生活水平提高后對(duì)水產(chǎn)品需求的劇增，水域生態(tài)系統(tǒng)處于持續(xù)增長(zhǎng)的壓力之下，處于瀕危狀態(tài)和受到嚴(yán)重威脅的魚類有97種(9目，24科，80屬)(陳靈芝，1993)。
由于魚類分布范圍廣泛，地理差異，生態(tài)環(huán)境的不同，使得各個(gè)地區(qū)的種類不同。由于人們的生活水平的提高，對(duì)魚產(chǎn)品的需求猛增，于是產(chǎn)生了對(duì)魚類的過(guò)渡捕撈，亂捕亂撈時(shí)有發(fā)生，再加上人們?yōu)榱藵M足各種需要而對(duì)魚類生態(tài)環(huán)境造成的破壞；使許多魚種瀕臨滅絕。雖然我們采取了一些措施，例如每年設(shè)立禁魚期，發(fā)布魚類保護(hù)白皮書，但由于沒有強(qiáng)有力的執(zhí)法隊(duì)伍，主要是缺乏快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、易于操作的魚類鑒別方法(FAO 2000；Hoelzel2001；Pank etal.2001；Smith and Benson 2001；Shivji etal.2002)，所以遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到預(yù)期目的。國(guó)內(nèi)外過(guò)去常采用核DNA和線粒體DNA限制性長(zhǎng)度多態(tài)性、同工酶電泳、RAPD技術(shù)進(jìn)行魚類鑒別(Martin 1993；Malik et al.1997；Baker et al.1998；Palumbi and Cipviano 1998；Heist and Gold1999；Diozon et al.2000)，上述現(xiàn)有方法具有繁瑣費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢，不利于操作，可重復(fù)性差，誤差大等弊端(Callejas et al.2001；Chapman etal.2003)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耗費(fèi)時(shí)間少、易于實(shí)驗(yàn)室操作、方便直觀的魚類分子生物學(xué)快速鑒別方法。
本發(fā)明方法的基本思路是設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)對(duì)魚類某一個(gè)目rDNA特異的引物作為這個(gè)目的通用引物，利用該通用引物擴(kuò)增出該目下的各種魚的DNA片段并測(cè)序，然后通過(guò)對(duì)比設(shè)計(jì)出各種魚的特異引物，通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)各種魚擴(kuò)增效果好的特異引物，同時(shí)把各種魚的特異引物擴(kuò)增出的DNA片段作為分型標(biāo)準(zhǔn)物，然后把該目下各種魚的特異引物和通用引物進(jìn)行混合，利用所得混合引物對(duì)需鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，即可根據(jù)電泳條帶對(duì)同一目中的魚進(jìn)行鑒別分類。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的魚類分子生物學(xué)快速鑒別方法是按以下步驟進(jìn)行(1)、設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異針對(duì)魚類某一個(gè)“目”的核糖體DNA的引物，作為這個(gè)“目”的所有魚類通用引物對(duì)；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對(duì)，對(duì)該“目”中的各種魚的DNA樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得出該“目”的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)、分別對(duì)上一步驟所得到的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出每一種魚的一個(gè)與其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為該“目”中的每一種魚分別設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的同一“目”魚類通用引物對(duì)中的一條引物分別與該“目”中的每一種魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成該“目”中的每一種魚的“引物對(duì)”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對(duì)”，分別對(duì)該“目”中的每一種魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將所得到的該“目”中的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相混合，作為分型標(biāo)準(zhǔn)物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對(duì)和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應(yīng)體系中對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；(9)、讓上一步驟所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和所述分型標(biāo)準(zhǔn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳條帶的對(duì)比，得到鑒別結(jié)果。
在本發(fā)明的步驟(3)中，要求在對(duì)由通用引物擴(kuò)增出的每種魚的DNA片段測(cè)序時(shí)，要特別準(zhǔn)確，否則根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)出來(lái)的特異引物與目標(biāo)DNA序列不吻合，無(wú)法進(jìn)行特異擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
在本發(fā)明的步驟(4)中，各種魚特異引物的設(shè)計(jì)需要考慮以下幾個(gè)方面的要素①、它必須是每種類魚類基因組的特異序列，即它的序列不會(huì)與非特異種魚類基因組序列相同或互補(bǔ)。②、選取適當(dāng)?shù)囊镩L(zhǎng)度。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物長(zhǎng)度是一個(gè)非常關(guān)鍵的參數(shù)，18～24個(gè)堿基構(gòu)成的寡核苷酸鏈?zhǔn)潜容^優(yōu)化的引物長(zhǎng)度；引物過(guò)短，將會(huì)導(dǎo)致特異性的降低；引物過(guò)長(zhǎng)，擴(kuò)增退火時(shí)被引發(fā)的模板太少，在指數(shù)擴(kuò)增期，甚至每一步退火步驟的小失誤都將擴(kuò)大，以致引起擴(kuò)增產(chǎn)物的明顯減少。③、選取引物中堿基GC的含量和引物的退火溫度Tm。較低的Tm值會(huì)導(dǎo)致特異性的喪失，若采用太高的退火溫度，擴(kuò)增的效率將會(huì)非常低同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生非特異擴(kuò)增；如果退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性退火，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴(kuò)增。本發(fā)明推薦在設(shè)計(jì)引物的Tm值時(shí)選擇61℃，因?yàn)樵谠摐囟认?，?fù)合擴(kuò)增中絕大多數(shù)的PCR反應(yīng)都能進(jìn)行。
本發(fā)明中，每種魚特異引物擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段的大小一定要能在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)能肉眼識(shí)別片段大小的差異，所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要考慮PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。
在本發(fā)明的步驟(5)中，采用了步驟(1)所得到的“目”的魚類通用引物對(duì)中的一條引物分別與該“目”中的各種魚的特異引物配對(duì)，進(jìn)而構(gòu)成該“目”中的各種魚的“引物對(duì)”。在實(shí)際操作時(shí)，可以在通用引物對(duì)中任選一條引物與該“目”中的各種魚的特異引物配對(duì)。
在本發(fā)明中，特別地采用步驟(6)得到分型標(biāo)準(zhǔn)物，這一點(diǎn)極其重要，這也是本發(fā)明有別于現(xiàn)有技術(shù)的重要區(qū)別特征。這是因?yàn)?，該分型?biāo)準(zhǔn)物來(lái)自于每種魚的特異引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，它具有唯一性，即與每一種魚的特定DNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)一一對(duì)應(yīng)，從而為魚種的最后鑒別提供了基礎(chǔ)。
在本發(fā)明的步驟(7)中，在將通用引物對(duì)和各種魚的一條特異引物相混合而構(gòu)成混合引物時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際需要而采用不同的混合比例。本發(fā)明推薦采用大致為1比1的混合比例，即采用通用引物對(duì)中的每條引物與各種魚的一條特異引物等量的混合比例。
在本發(fā)明的上述步驟中，所涉及的PCR擴(kuò)增、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序、特異引物的設(shè)計(jì)和篩選、瓊脂糖凝膠電泳等具體操作均可以沿用現(xiàn)有技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。例如，在步驟(8)中，當(dāng)在PCR反應(yīng)體系中對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，除了使用步驟(7)所得到的混合引物之外，PCR反應(yīng)體系中還應(yīng)當(dāng)使用其它試劑，如DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、緩沖液和雙蒸水DDH2O等，由于PCR反應(yīng)體系的構(gòu)成屬于現(xiàn)有技術(shù)，故不再贅述。
在本發(fā)明中，所說(shuō)的魚的DNA樣本可以按以下常規(guī)方法進(jìn)行提取a、取魚類新鮮組織，如魚的肌肉、魚鱗、魚鰭、魚卵、魚血、魚類粘液等，置于1.5ml的離心管消化過(guò)夜，用酚----氯法提取DNA；b、魚類烘干或曬干制品，魚類罐頭制品，可以直接取樣，同新鮮組織一樣提取DNA；c、對(duì)于用95％酒精保存的魚類組織樣本，需用雙蒸水浸泡過(guò)夜，再用酚----氯法提取DNA。
與前述現(xiàn)有魚類鑒別方法相比較，本發(fā)明的魚類鑒別方法利用魚類編碼魚類RNA的核DNA序列的保守性和它的轉(zhuǎn)錄間隔子種間的變異，設(shè)計(jì)出通用引物和種屬特異性引物，從而建立了一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、直觀、易于操作的鑒別珍稀魚類的方法。對(duì)于魚類形態(tài)學(xué)等其它方法無(wú)法鑒別的魚類卵子，魚類粘液，魚類的分割樣本，特別是魚類的混合樣本來(lái)說(shuō)，本鑒別方法均能夠有效并快速地加以鑒別。同時(shí)，本方法的樣本需要量小，通過(guò)一片魚鱗、一個(gè)魚卵、一滴粘液或者是粘液斑痕就能確定魚類種屬。本方法的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)旌蠘颖具M(jìn)行檢測(cè)，這種檢測(cè)能夠幫助實(shí)現(xiàn)對(duì)珍稀魚類產(chǎn)卵場(chǎng)準(zhǔn)確定位，迅速統(tǒng)計(jì)珍稀魚類(特別是瀕危魚類)種群的大小，通過(guò)對(duì)各種珍稀魚類生物學(xué)特性分子水平的了解，了解它們繁殖所需的生態(tài)環(huán)境，準(zhǔn)確地掌握它們的繁殖行為和繁殖時(shí)的生理生化變化，為我國(guó)的珍稀魚類的人工繁殖提供可靠的科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，本方法還為打擊非法捕撈、非法經(jīng)營(yíng)、非法走私提供了有力的技術(shù)保障。另外，對(duì)那些魚類分類不是很擅長(zhǎng)的非魚類專業(yè)人員來(lái)說(shuō)，本方法也極具實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。


圖1和圖2是采用通用引物對(duì)對(duì)魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增結(jié)果圖。
圖3是采用混合引物同時(shí)對(duì)四川白甲DNA樣本、華鯪DNA樣本、胭脂魚DNA樣本、巖元鯉DNA樣本和重口裂腹魚DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖4是采用混合引物對(duì)四川白甲的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖5是采用混合引物對(duì)華鯪的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖6是采用混合引物對(duì)重口裂腹魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖7是采用混合引物對(duì)胭脂魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
圖8是采用混合引物對(duì)巖元鯉的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例以鯉形目的鑒定為例，先設(shè)計(jì)出鯉形目的通用引物，分別對(duì)要鑒定的魚的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)每種魚DNA樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，設(shè)計(jì)篩選出每種魚的特異引物，用特異引物對(duì)每種魚的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物作為分型標(biāo)準(zhǔn)物(即分子馬克)，再把通用引物和特異引物進(jìn)行混合，對(duì)要鑒定的魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和分型標(biāo)準(zhǔn)物(即分子馬克)進(jìn)行電泳，即可通過(guò)產(chǎn)物在凝膠中的位置與分型標(biāo)準(zhǔn)物中各種魚PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的位置的比較，清楚地區(qū)分出要鑒定魚的種類。具體步驟如下(1)、設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異針對(duì)魚類鯉形目的核糖體DNA的引物，作為鯉形目的所有魚類通用引物對(duì)；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對(duì)，對(duì)鯉形目中的各種魚的DNA樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得出鯉形目的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)、分別對(duì)上一步驟所得到的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出每一種魚的一個(gè)與鯉形目下的其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為鯉形目中的每一種魚分別設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的鯉形目魚類通用引物對(duì)中的一條引物分別與鯉形目中的每一種魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成鯉形目中的每一種魚的“引物對(duì)”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對(duì)”，分別對(duì)鯉形目中的每一種魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將所得到的鯉形目中的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相混合，作為鯉形目魚類的分型標(biāo)準(zhǔn)物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對(duì)和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應(yīng)體系中對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；(9)、讓上一步驟所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和所述分型標(biāo)準(zhǔn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳條帶的對(duì)比，得到鑒別結(jié)果。
在本實(shí)施例的步驟(1)中，先設(shè)計(jì)并篩選出了一對(duì)對(duì)魚類的鯉形目的核糖體DNA特異的引物，作為鯉形目的魚類通用引物對(duì)，該鯉形目通用引物對(duì)為
左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′在本實(shí)施例的步驟(2)中，先提取了鯉形目中的四川白甲、華鯪、重口裂腹魚、三角鯉、鯽魚、草魚、巖原鯉、鰱魚、鳙魚、建鯉、豐鯉和胭脂魚的DNA樣本，同時(shí)，為了進(jìn)行驗(yàn)證，還提取了非鯉形目的雜交大口鯰、班點(diǎn)叉尾鮰、黃顙魚、大口黑鱸的DNA樣本。
在提取上述魚類的DNA時(shí)，取每種魚的尾柄肌肉20mg，消化過(guò)夜，用酚----氯法提取，酒精沉淀，自然風(fēng)干，雙蒸水溶解保存在-20℃?zhèn)溆谩?br> 在常規(guī)的PCR擴(kuò)增體系中，采用通用引物對(duì)對(duì)魚類DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系中的各成份的濃度如下表

擴(kuò)增過(guò)程如下(1)預(yù)變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長(zhǎng)引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應(yīng)的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長(zhǎng)引物的5′端延著模板的5′→3′方向加入dNTP。
整個(gè)復(fù)合擴(kuò)增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性 94℃ 6分鐘變性 94℃ 30秒復(fù)性 55℃ 60秒延伸 72℃ 60秒循環(huán)次數(shù)34延伸 72℃ 10分鐘在上述PCR擴(kuò)增時(shí)，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
所得擴(kuò)增結(jié)果如圖1、2所示。
從圖1、2可以看出，用通用引物可以擴(kuò)增出全部鯉形目的魚類，而其它非鯉形目的魚類不能擴(kuò)增。
在本實(shí)施例的步驟(3)中，分別對(duì)上一步驟所得到的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，對(duì)于鯉形目中的各種魚，根據(jù)測(cè)序結(jié)果而各選出一個(gè)與鯉形目下的其它魚種有差異的DNA片段中的區(qū)域。
在本實(shí)施例的步驟(4)中，根據(jù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)出特異引物，再用特異引物擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的魚類DNA樣本，篩選出好的特異引物。以鯉形目中的胭脂魚、巖元鯉、四川白甲、華鯪、重口裂腹魚為例，篩選結(jié)果為胭脂魚的特異引物 5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪的特異引物 5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉的特異引物 5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚的特異引物 5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲的特異引物 5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′在本實(shí)施例的步驟(5)中，用步驟(1)所得到的鯉形目的魚類通用引物對(duì)中的一條引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′分別與該鯉形目中的上述魚的特異引物配對(duì)，進(jìn)而構(gòu)成鯉形目中的各種魚的“引物對(duì)”胭脂魚 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲 左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′在本實(shí)施例的步驟(6)中，使用上述各種魚的“引物對(duì)”，分別對(duì)鯉形目中的各種魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將所得到的鯉形目中的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相混合，作為分型標(biāo)準(zhǔn)物。
PCR反應(yīng)體系中的各成份的濃度如下表

擴(kuò)增過(guò)程如下(1)預(yù)變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長(zhǎng)引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應(yīng)的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長(zhǎng)引物的5′端延著模板的5′-3′方向加入dNTP。
整個(gè)復(fù)合擴(kuò)增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性 94℃ 6分鐘變性94℃ 30秒復(fù)性55℃ 60秒延伸72℃ 60秒循環(huán)次數(shù)34延伸72℃ 10分鐘在上述PCR擴(kuò)增時(shí)，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
在本實(shí)施例的步驟(7)中，將步驟(1)中所得的該鯉形目通用引物對(duì)左引物5′-cggtggatcactcggctcgt-3′右引物5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′和步驟(4)中得到的各種魚的一條特異引物胭脂魚的特異引物5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′華鯪的特異引物 5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′巖元鯉的特異引物5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′重口裂腹魚的特異引物5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′四川白甲的特異引物 5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′相混合而構(gòu)成混合引物。在本實(shí)施例中，通用引物對(duì)中的每條引物與各種魚的特異引物以1比1的比例等量混合。
在本實(shí)施例的步驟(8)中，采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應(yīng)體系中對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)施例在進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，按照PCR擴(kuò)增的方法加入各種試劑、引物和需鑒別魚類的樣本。PCR反應(yīng)體系中的成份主要有模板DNA(待鑒別的魚類DNA樣本)、所述混合引物、高GC耐熱DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷三磷酸dNTP、1×Buffer(緩沖液)和雙蒸水DDH2O。其中，DNA耐熱聚合酶、MgCL2和10×Buffer(緩沖液)直接由市售的PCR試劑盒(生產(chǎn)廠家為TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名為TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。
PCR反應(yīng)體系中的各成份的濃度如下表

擴(kuò)增過(guò)程如下(1)預(yù)變性加熱至94℃。
(2)變性加熱至94℃秒，使雙鏈DNA解開；(3)退火降溫至60℃，在此溫度下，長(zhǎng)引物與模板DNA相結(jié)合；(4)延伸升溫至72℃，此溫度是DNA聚合酶反應(yīng)的最適合溫度，聚合酶在Mgcl2等作用下，在長(zhǎng)引物的5′端延著模板的5′→3′方向加入dNTP。
整個(gè)復(fù)合擴(kuò)增共循環(huán)34輪，循環(huán)參數(shù)如下預(yù)變性 94℃6分鐘變性94℃30秒復(fù)性55℃60秒延伸72℃60秒循環(huán)次數(shù)34延伸72℃10分鐘在本實(shí)施例的步驟(9)中，鑒于擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小、片段長(zhǎng)短不同，特別地利用電泳檢測(cè)法對(duì)其進(jìn)行分離檢測(cè)，以便檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。進(jìn)行分離檢測(cè)時(shí)，先將上一步驟所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液以一定的比例混勻，加入電泳槽中的瓊脂糖凝膠(凝膠中已加入溴乙淀)孔中，在其兩端加以電壓進(jìn)行電泳。由于各擴(kuò)增產(chǎn)物的分子大小不同，在相同電場(chǎng)力的作用下，其在單位時(shí)間內(nèi)在相同的介質(zhì)中所運(yùn)行的距離也不等。因此，在電泳儀中處理一段時(shí)間之后，各擴(kuò)增產(chǎn)物的差距逐漸拉開，此后取出凝膠，在紫外線燈下觀察，根據(jù)電泳條帶的位置，與分型標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較，最后即能直觀地看到鑒別結(jié)果。
所采用的電泳檢測(cè)原料、設(shè)備及條件如下瓊脂糖凝膠成份1、1.5％瓊脂糖凝膠溶液10ml2、每100ml瓊脂糖凝膠溶液中加入10ul1‰的溴乙淀電泳儀pharmacia1000型多功能電泳儀電泳條件1、上樣量樣本3μl 凝膠載樣緩沖液2μl電極緩沖液0.5×TBE溶液2、采用恒流方式電泳電流40mA時(shí)間30～40分鐘另外，由步驟(6)得到的分型標(biāo)準(zhǔn)物也上樣2.0ul，電泳30～40分鐘。
就步驟(8)和步驟(9)來(lái)說(shuō)，在采用混合引物同時(shí)對(duì)四川白甲DNA樣本、華鯪DNA樣本、胭脂魚DNA樣本、巖元鯉DNA樣本和重口裂腹魚DNA樣本進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。
在采用混合引物對(duì)四川白甲的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。
在采用混合引物對(duì)華鯪的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。
在采用混合引物對(duì)重口裂腹魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。
在采用混合引物對(duì)胭脂魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示。
在采用混合引物對(duì)巖元鯉的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后，在紫外線燈下所觀察到的擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示。
在圖1～8中，所標(biāo)注的第一原始分型標(biāo)準(zhǔn)物M1、第二原始分型標(biāo)準(zhǔn)物M2是指市售的用于測(cè)量DNA片段大小的基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。
從圖3、4、5、6、7、8我們可以看出，每種魚的特異引物只對(duì)該種魚的特異位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，該種魚的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有兩條帶；其它魚的樣本，不是同一目的樣本不能進(jìn)行擴(kuò)增，因此無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳時(shí)無(wú)條帶；同一目的只有通用引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，電泳只產(chǎn)生一條帶，通過(guò)與分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳條帶相對(duì)比，就可以鑒別各種魚。
需要說(shuō)明的是在本實(shí)施例的上述步驟(8)和步驟(9)中，是在已知的魚類DNA樣本下進(jìn)行擴(kuò)增和觀測(cè)、驗(yàn)證的(即已經(jīng)事先知道所擴(kuò)增和觀測(cè)的魚類DNA樣本屬于哪一種魚)，這主要是為了測(cè)定本發(fā)明方法用于鑒別魚類時(shí)的可行性及可靠性。而在實(shí)際操作中使用本方法時(shí)，事先并不知道需要鑒別的魚的種類，因此步驟(9)的實(shí)際做法是依據(jù)觀察到的擴(kuò)增結(jié)果并與分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳條帶相對(duì)比，推知步驟(8)所擴(kuò)增的魚類DNA樣本屬于哪一種魚，進(jìn)而判別待鑒別魚的種類。
當(dāng)然，就本發(fā)明的方法來(lái)說(shuō)，除能夠?qū)︴幮文恐械纳鲜鲭僦~、巖元鯉、四川白甲、華鯪、重口裂腹魚進(jìn)行鑒別外，還可以對(duì)鯉形目中的其它魚類進(jìn)行鑒別。同時(shí)，本發(fā)明的方法還可以對(duì)除鯉形目之外的其它目的魚類進(jìn)行鑒別。在對(duì)其它目的魚類進(jìn)行鑒別時(shí)，除設(shè)計(jì)并篩選出的通用引物及各種魚的特異引物有所不同之外，其鑒別步驟及原理均與本實(shí)施例相同，故不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種魚類分子生物學(xué)快速鑒別方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)、設(shè)計(jì)并篩選出一對(duì)特異針對(duì)魚類某一個(gè)“目”的核糖體DNA的引物，作為這個(gè)“目”的所有魚類通用引物對(duì)；(2)、采用步驟(1)中的通用引物對(duì)，對(duì)該“目”中的各種魚的DNA樣本分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得出該“目”的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)、分別對(duì)上一步驟所得到的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出每一種魚的一個(gè)與其它魚種有差異的DNA片段；(4)、在上一步驟所選出的DNA片段的區(qū)域內(nèi)，為該“目”中的每一種魚分別設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物；(5)、用步驟(1)所得到的同一“目”魚類通用引物對(duì)中的一條引物分別與該“目”中的每一種魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成該“目”中的每一種魚的“引物對(duì)”；(6)、使用上一步驟所得到的每一種魚的“引物對(duì)”，分別對(duì)該“目”中的每一種魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將所得到的該“目”中的各種魚的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相混合，作為分型標(biāo)準(zhǔn)物；(7)、將步驟(1)中所得的通用引物對(duì)和步驟(4)中得到的每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)、采用上一步驟所得到的混合引物，在PCR反應(yīng)體系中對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；(9)、讓上一步驟所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和所述分型標(biāo)準(zhǔn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)需要鑒別的魚類DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與分型標(biāo)準(zhǔn)物的電泳條帶的對(duì)比，得到鑒別結(jié)果。
全文摘要
一種魚類分子生物學(xué)快速鑒別方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行(1)設(shè)計(jì)“目”的所有魚類通用引物對(duì)；(2)采用通用引物對(duì)，對(duì)該“目”中的各種魚的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；(3)選出每一種魚的與其它魚種有差異的DNA片段；(4)為每一種魚分別設(shè)計(jì)并篩選出一條特異引物；(5)用通用引物對(duì)中的一條引物分別與每一種魚的特異引物配對(duì)，構(gòu)成每一種魚的“引物對(duì)”；(6)分別對(duì)每一種魚的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物相混合，作為分型標(biāo)準(zhǔn)物；(7)將通用引物對(duì)和每一種魚的一條特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；(8)采用混合引物，對(duì)需要鑒別的魚類DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增；(9)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶的對(duì)比，得到鑒別結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1789974SQ20051002232
公開日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者侯一平, 袁萬(wàn)安, 李英碧, 吳謹(jǐn), 顏靜, 張 申請(qǐng)人:四川大學(xué)