專利名稱：熒光化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的光致發(fā)光化合物，涉及新的蛋白質(zhì)檢測(cè)物(detector)并涉及檢測(cè)蛋白質(zhì)在流體、特別是水或體液中的存在的新方法。
光致發(fā)光化合物是已知的，并且已知的光致發(fā)光化合物包括被稱為squaraine染料的染料類別，特別是假吲哚系列的squaraine染料，它們是如下通式的取代和未取代化合物 其中X＝S，Se或C(CH3)2和R1＝烷基和R2＝H，烷基或鹵素已知的假吲哚squaraine染料包括對(duì)稱和不對(duì)稱的化合物，并且描述于，例如E.Terpetschnig等在Anal.Chim.Acta 282(1993)第633-641頁的文章中。
這些染料在水中是不可溶的，并且特別用于在流體中的蛋白質(zhì)存在的定性檢測(cè)。為了使用這些染料來對(duì)蛋白質(zhì)的存在進(jìn)行檢測(cè)，必須將所述染料溶解在包含水和醇諸如甲醇的混合物的溶劑中，所述蛋白質(zhì)本身在流體，特別是水性流體中是水溶性的。當(dāng)將蛋白質(zhì)加入假吲哚squaraine染料的水/甲醇溶液中時(shí)，存在熒光的增加。在上述引用的文章中公開的分析方法是純定性的方法，僅僅記錄蛋白質(zhì)在測(cè)試的流體樣品中的存在或缺乏，并且因此不能用于測(cè)定存在的蛋白質(zhì)的量。
目前對(duì)于流體中蛋白質(zhì)的定量分析的方法和對(duì)于凝膠中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量和半定量分析如染色的方法包括針對(duì)流體的Bradford[M.M.Bradford，Anal.Biochem.72(1976)248]，Lowry[O.H.Lowry等J.Biol.Chem.193(1951)265]方法和二金雞納酸(bicinchoninic acid)(BCA)[P.K.Smith等Anal.Biochem.150(1985)76]方法以及針對(duì)凝膠的銀染[C.R.Merril，Meth.Enzymol.182(1990)477]和考馬斯藍(lán)[S.Fazekas de St.Groth等，Biochim.Biophys.Acta 71(1963)377]。Bradford，Lowry和BCA方法是比色技術(shù)(即，顏色變化)并適合于8-2000μg/mL的溶液蛋白質(zhì)范圍，需要多個(gè)試劑和溫育時(shí)間并受到來自許多常見試劑的干擾。用在Bradford方法中的考馬斯藍(lán)需要20-30分鐘并且不被tris緩沖液所阻礙。銀染是非常敏感的(10-100ng/mL)顯色技術(shù)并被用作凝膠染色技術(shù)但是在處理凝膠中必須小心，整個(gè)技術(shù)需要2-3小時(shí)?？捡R斯藍(lán)也是凝膠染色劑并且如果蛋白質(zhì)范圍在顯色μg范圍內(nèi)，可以代替銀染色劑使用。檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度的其它商業(yè)技術(shù)包括來自Molecular Probes的NanoOrangeTM蛋白質(zhì)定量試劑盒和CBQCATM蛋白質(zhì)定量試劑盒，它們是依賴于熒光變化的超靈敏溶液技術(shù)，但是在對(duì)于squaraine衍生物給定的范圍內(nèi)不是線性的。這兩種技術(shù)也需要30分鐘的制備時(shí)間。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的光致發(fā)光化合物，特別是可溶于水、或包含水的溶劑混合物的新的光致發(fā)光化合物，并且它保持其在這些介質(zhì)中的光致發(fā)光性質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供檢測(cè)蛋白質(zhì)在流體中的存在的方法，或作為凝膠染色的方法，其中上述時(shí)間限制被減少或基本被避免并具有更高的靈敏度。
本發(fā)明提供包括下式對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)的水溶性光致發(fā)光化合物
其中x可以代表任意整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
特別優(yōu)選的按照本發(fā)明的化合物包括其中x＝3的那些。
另外優(yōu)選的按照本發(fā)明的化合物包括未被取代的那些或其中一個(gè)或兩個(gè)苯環(huán)在5位上被烷基(包括i丙基和t丁基)或鹵素基團(tuán)取代的那些。
特別優(yōu)選的按照本發(fā)明的化合物包括2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環(huán)丁烯二鎓-1，3-二醇酸酯(diolate)或所述磺酸的任何金屬或季氮(即，銨，一-、二-或三烷基銨，吡啶鎓等)鹽。
本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)檢測(cè)物，所述檢測(cè)物以1×10-9-1mol/L的濃度，在水溶液或含水的溶劑混合物中，包含包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)的化合物 其中x可以表示任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
本發(fā)明還提供測(cè)量流體樣品的總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)含量的方法，所述方法包括如下步驟(a)以1×10-10-1mol/L的濃度，在水溶液或含水的溶劑混合物中溶解包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)的化合物
其中x可以表示任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
(b)將步驟(a)的溶液與測(cè)試流體樣品混合；(c)測(cè)量樣品的熒光；和(d)將所述熒光與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值(即，校正曲線)比較從而獲得所述總蛋白質(zhì)含量的值。
本發(fā)明還提供檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或?qū)⒌鞍踪|(zhì)定量的方法，所述蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在或缺乏的情況下，在已經(jīng)被固定在包含含水甲醇和含水乙酸的水性/有機(jī)/酸混合物中的支持基質(zhì)例如聚丙烯酰胺、瓊脂糖或淀粉中以電泳分離，在所述方法中接著以1×10-10到1mol/L的濃度，用在10％含水甲醇或含水乙酸的溶液中的光致發(fā)光化合物對(duì)所述基質(zhì)進(jìn)行染色，并進(jìn)行脫色以顯現(xiàn)條帶，所述光致發(fā)光化合物包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu) 其中x可以代表任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
為了在需要的檢測(cè)范圍內(nèi)建立蛋白質(zhì)水溶液的熒光的標(biāo)準(zhǔn)值，使用5×10-8M的化合物的水溶液來測(cè)量含有已知濃度的蛋白質(zhì)BSA的溶液的熒光，所述化合物包括下式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)
其中x＝3染料1，所述熒光測(cè)量是在624nm的激發(fā)波長(ε＝1.0×105mol-1cm-1)和638nm的檢測(cè)波長下進(jìn)行。
在0-100ng/mL BSA的范圍內(nèi)，對(duì)于兩條單獨(dú)的校正曲線的結(jié)果顯示于

圖1；在0-500ng/mL BSA的檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)于三條單獨(dú)的校正曲線的結(jié)果顯示于圖2；在0-10μg/mL BSA的檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)于三條單獨(dú)的校正曲線的結(jié)果顯示于圖3。
特別令人吃驚的是注意到在這些檢測(cè)范圍內(nèi)的線性反應(yīng)。
對(duì)于本發(fā)明的光致發(fā)光化合物而言還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)的是，一旦已經(jīng)使用BSA建立了校正曲線，那么可以即刻測(cè)量任何數(shù)量的蛋白質(zhì)濃度。熒光也在較高的波長，并且不被任何漫射的較低波長的有機(jī)熒光所掩蔽。
實(shí)施例 圖1
圖2圖3實(shí)驗(yàn)例原材料
使用E.Havinga等在Synthetic Metals 69(1995)第581-582頁中的文獻(xiàn)方法，通過使用迪安-斯達(dá)克裝置在過量1，3-丙磺酸內(nèi)酯和甲苯中加熱2，3，3-三甲基假吲哚來制備2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺?；?假吲哚。冷卻后，將過量溶劑傾析掉并用石油醚重復(fù)洗滌從而得到紅色的油。在靜置數(shù)周后，從所述油形成2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺?；?假吲哚的晶體，單晶x-射線結(jié)構(gòu)顯示于圖4。
圖4
2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺?；?假吲哚結(jié)構(gòu)的分子構(gòu)象和原子命名方案。
染料1的制備 使用Sprenger和Ziegenbein在Agnew.Chem.Int.Ed.6(1967)第533頁中的文獻(xiàn)方法，通過使用迪安-斯達(dá)克裝置，與在50/50甲苯/丁烷-1-醇中的催化量的quinaline一起回流2∶1摩爾量的2，3，3-三甲基-1-(丙-3-磺?；?假吲哚和方形酸來制備2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-二甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環(huán)丁烯二(鎓)-13-二醇酸酯。去除反應(yīng)溶劑后，在真空中收集產(chǎn)物并重復(fù)用石油醚熱洗。
權(quán)利要求
1.包括下式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)的水溶性光致發(fā)光化合物 其中，x可以代表任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
2.按照權(quán)利要求1的光致發(fā)光化合物，其中x＝3。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的光致發(fā)光化合物，其是未被取代的。
4.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的光致發(fā)光化合物，其中一個(gè)或兩個(gè)苯環(huán)在5位上被烷基或鹵素基團(tuán)所取代，所述烷基包括i丙基和t丁基。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的光致發(fā)光化合物，其是2，4-二(1-(丙-3-磺酸)-3，3-三甲基-2-二氫亞吲哚基甲基)環(huán)丁烯二鎓-1，3-二醇酸酯或所述磺酸的任何金屬或季氮(即，銨，一-、二-或三烷基銨，吡啶鎓等)鹽。
6.基本上如本文所述并參考實(shí)施例的光致發(fā)光化合物。
7.一種蛋白質(zhì)檢測(cè)物，其在水溶液中以1×10-10到1摩爾/L的濃度包含光致發(fā)光化合物，所述光致發(fā)光化合物包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu) 其中x可以表示任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
8.一種測(cè)量流體樣品的總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)含量的方法，該方法包括如下步驟(a)以1×10-10-1mol/L的濃度，在水溶液中溶解包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)的光致發(fā)光化合物 其中x可以表示任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代；(b)將步驟(a)的溶液與測(cè)試流體樣品混合；(c)測(cè)量所述樣品的熒光；和(d)將所述熒光與標(biāo)準(zhǔn)值比較從而獲得所述總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)含量的值。
9.一種檢測(cè)蛋白質(zhì)和/或?qū)⒌鞍踪|(zhì)定量的方法，所述蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在或缺乏的情況下、在已經(jīng)被固定在包含含水甲醇和乙酸的水性/有機(jī)/酸混合物中的支持基質(zhì)中電泳分離，其中接著以1×10-10到1mol/L的濃度、用在10％含水甲醇或含水乙酸的溶液中的光致發(fā)光化合物對(duì)所述基質(zhì)進(jìn)行染色，并進(jìn)行脫色以顯現(xiàn)條帶，所述光致發(fā)光化合物包括如下通式的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu) 其中x可以代表任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其中所述支持基質(zhì)是聚丙烯酰胺，瓊脂糖或淀粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水溶性光致發(fā)光化合物，其包括式(A)的對(duì)稱骨架結(jié)構(gòu)，其中x可以代表任何整數(shù)，并且其中苯環(huán)可以被取代。本發(fā)明還公開了包含這種化合物的蛋白質(zhì)檢測(cè)物和測(cè)量流體樣品中總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)含量的方法。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1863889SQ200480028870
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月3日
發(fā)明者D·E·林奇, J·黑普廷斯托爾 申請(qǐng)人:考文垂大學(xué)