專利名稱：新型熒光微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，更具體地說，涉及在基本上為氧化硅粒子的內(nèi)部層中選擇性地包含稀土類熒光配合物的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，更具體地說，涉及在氧化硅粒子的內(nèi)部層中選擇性地包含稀土類熒光配合物、且表面基本上是由氧化硅形成的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子；包含該氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑；和使用該氧化硅粒子作為標(biāo)記試劑的熒光標(biāo)記方法；以及，使用該熒光標(biāo)記試劑的熒光測(cè)定法和熒光測(cè)定法用試劑。
背景技術(shù)：
一直以來，作為生物樣品的微量分析的分析方法，通常利用抗原—抗體反應(yīng)的免疫檢定法、DNA雜交法等。在這些分析方法中，必需使用標(biāo)記抗體、DNA等的標(biāo)記試劑，作為可以高靈敏度檢測(cè)的標(biāo)記試劑，通常使用熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等。
雖然放射性同位素標(biāo)記的靈敏度高，但是卻存在著儲(chǔ)存、使用、處理時(shí)伴隨有危險(xiǎn)的缺點(diǎn)。此外，酶標(biāo)記也存在著酶的分子量大、容易受到溫度等外界因素的影響而不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差等問題，以及通過使酶標(biāo)記試劑與被標(biāo)記物結(jié)合，導(dǎo)致酶和被標(biāo)記物的活性降低的缺點(diǎn)。
此外，利用有機(jī)熒光色素的標(biāo)記(例如熒光素、若丹明、丹酰氯等)作為熒光標(biāo)記方法是已知的，但是卻存在著如下缺點(diǎn)由于激發(fā)光的散射所產(chǎn)生的激發(fā)光的背景噪音和存在于樣品中的其他共存物質(zhì)的熒光所產(chǎn)生的背景噪音極大阻礙了來自標(biāo)記試劑的熒光檢測(cè)，高靈敏度的測(cè)定變得很困難。
除此之外，利用稀土類熒光配合物的標(biāo)記作為熒光標(biāo)記方法也是公知的。稀土類熒光配合物具有如下特性熒光壽命長(zhǎng)(和常規(guī)的有機(jī)熒光物質(zhì)所具有的數(shù)納秒的熒光壽命相比，稀土類熒光配合物具有數(shù)十到數(shù)百微秒以上的熒光壽命)、斯托克斯頻移大、熒光發(fā)光峰尖銳。將這些特征應(yīng)用于時(shí)間分辨熒光測(cè)定法，可除去由于激發(fā)光或共存物質(zhì)所產(chǎn)生的短壽命的背景噪音，并可高靈敏度地進(jìn)行測(cè)定。利用該特性，已經(jīng)開發(fā)了使用稀土熒光配合物作為標(biāo)記試劑的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法。
本發(fā)明者已經(jīng)開發(fā)了許多稀土類熒光配合物標(biāo)記試劑，并對(duì)使用它們的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法的應(yīng)用進(jìn)行了研究。但是，合成具有能與被標(biāo)記物結(jié)合的結(jié)合基團(tuán)的配合物的反應(yīng)步驟多，反應(yīng)有困難，并且所合成的配合物還存在由于結(jié)合基團(tuán)的性質(zhì)不同而有很大變化的情況。此外，當(dāng)配合物的螯合力不充分時(shí)，存在所能夠使用的緩沖劑的種類受到限制的缺點(diǎn)。進(jìn)而，在被標(biāo)記物的結(jié)合部位少的情形中，每個(gè)被標(biāo)記物分子的稀土類熒光配合物標(biāo)記試劑的分子數(shù)受到限制，靈敏度的提高受到限制。
另一方面，在DNA的分析中，通常使用DNA探針法。該方法使用2種或2種以上的標(biāo)記試劑標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)樣品和檢測(cè)樣品，并將它們施加到同一探針DNA上，通過競(jìng)爭(zhēng)雜交的結(jié)果對(duì)檢測(cè)樣品中的DNA量進(jìn)行定量。但是，在該方法中，必須相對(duì)于該檢測(cè)樣品導(dǎo)入標(biāo)記試劑，該操作的結(jié)果就是會(huì)產(chǎn)生檢測(cè)樣品中的靶序列的豐度發(fā)生變化的可能性。此外，由于標(biāo)記試劑的導(dǎo)入導(dǎo)致DNA雙鏈的形成能降低，在基因變異與多態(tài)性的診斷中存在產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果的可能。
此外，在熒光發(fā)光體中，作為等離子顯示面板(PDP)等三原色發(fā)光體，不僅使用稀土類金屬，而且還使用鈣、鋅、錳等金屬離子。由于這些發(fā)光體是用于面板的，因此不僅在熒光發(fā)光強(qiáng)度方面，而且在機(jī)械強(qiáng)度和持續(xù)性方面都有一定的要求，在這些方面，已經(jīng)做了很多努力。例如，已有以下報(bào)道使用粒徑為5～20μm且比表面積為100～800m2/g的氧化硅粒子的表面作為由這些熒光性的金屬離子形成的硅酸鹽的熒光發(fā)光體(參閱專利文獻(xiàn)1)，使氧化鋅微粒內(nèi)包在氧化硅粒子中的熒光發(fā)光體(參閱專利文獻(xiàn)2)，比表面積為100m2/g以下、且在通過水解烷氧基硅烷形成的氧化硅粒子中包含有機(jī)羧酸的熒光發(fā)光體(參閱專利文獻(xiàn)3)，在氧化硅等無機(jī)物質(zhì)的表面負(fù)載了熒光體的物質(zhì)(參閱專利文獻(xiàn)4)，用折射率為1.435以上的氧化硅膜覆蓋發(fā)光體粒子的表面的物質(zhì)(參閱專利文獻(xiàn)5和6)、通過溶劑—膠體法在氧化硅的三維結(jié)構(gòu)中至少一部分被有機(jī)物質(zhì)置換的有機(jī)—無機(jī)復(fù)合型基質(zhì)結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)入Eu或Tb等稀土類配合物形成的熒光體(參閱專利文獻(xiàn)7)等。
此外，氧化硅粒子本身也被廣泛用作DNA或蛋白質(zhì)等的載體，例如，用交聯(lián)的樹脂覆蓋氧化硅等無機(jī)粒子的表面，在其中固定DNA等的方法(參閱專利文獻(xiàn)8)等。進(jìn)而，還報(bào)道了將標(biāo)記用配合物的配體固定在氧化硅等個(gè)體支持體的表面，使其結(jié)合金屬的方法(參閱專利文獻(xiàn)9)等。
但是，專利文獻(xiàn)1～7所述的熒光體是在全部粒子上分布有熒光體，并且可以用作以改善熒光體的壽命和機(jī)械強(qiáng)度等為目的的PDP等熒光體。在這樣的熒光體中，熒光體物質(zhì)分布在粒子的表面，容易受緩沖液等外部環(huán)境的影響，并且，由于在粒子表面上負(fù)載有DNA或蛋白質(zhì)，因而存在的反應(yīng)性官能團(tuán)少，因而不適合用作標(biāo)記用熒光粒子。
本發(fā)明所涉及的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)如下所述，其通過引用的方式包括在本申請(qǐng)中。
1.JP 2003-213254A2.JP 2003-201473A3.JP 2003-155478A4.JP 2002-180041A5.JP 2002-69442A6.JP 2001-55567A7.JP 09-227861A8.JP 2001-183378A9.JP 09-505061A發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述現(xiàn)狀而作出的，其目的在于提供一種在內(nèi)部包含大量的稀土類熒光配合物，并且不受緩沖液、被標(biāo)記物等外部環(huán)境影響的新型氧化硅粒子，及包含該氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑和使用該氧化硅粒子作為標(biāo)記試劑的熒光標(biāo)記方法，以及使用該熒光標(biāo)記試劑的熒光測(cè)定法等。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1表示包含本發(fā)明的BPTA-Tb配合物的氧化硅粒子的熒光光譜。分散液中的氧化硅粒子的濃度＝0.1mg/ml，在水中。激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm。
圖2表示對(duì)包含本發(fā)明的BPTA-Tb配合物的氧化硅粒子(圖2的右側(cè))，和對(duì)BPTA-Tb配合物的溶液的熒光強(qiáng)度的影響的研究結(jié)果，所述的BPTA-Tb配合物溶液是各種pH值緩沖液的溶液。
圖3表示包含本發(fā)明的BTTA-Eu配合物的氧化硅粒子的熒光光譜。分散液中的氧化硅粒子的濃度＝0.1mg/ml，在水中。激發(fā)波長(zhǎng)＝340nm。
圖4表示通過經(jīng)本發(fā)明的氧化硅粒子標(biāo)記化的DNA的時(shí)間分辨熒光測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度。
圖5是包含本發(fā)明的BTTA-Eu配合物的氧化硅粒子的掃描電子顯微鏡照片，所述的粒子用鉑-鈀覆蓋。
圖6表示通過未經(jīng)本發(fā)明的表面修飾的氧化硅粒子標(biāo)記的DNA的時(shí)間分辨熒光測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度。
圖7表示通過經(jīng)本發(fā)明的在表面導(dǎo)入了二價(jià)插入劑的氧化硅粒子標(biāo)記的DNA的時(shí)間分辨熒光測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度。
圖8表示通過經(jīng)本發(fā)明的在表面導(dǎo)入了一價(jià)插入劑的氧化硅粒子標(biāo)記的DNA的時(shí)間分辨熒光測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明者為了全面解決上述問題進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以通過簡(jiǎn)便的方法得到一種內(nèi)含熒光物質(zhì)的氧化硅粒子，在該氧化硅粒子內(nèi)部選擇性地存在熒光物質(zhì)、并且在存在熒光物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的外側(cè)具有基本上由氧化硅構(gòu)成的表面層的結(jié)構(gòu)。
即，本發(fā)明涉及含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，更具體地說，涉及基本上在氧化硅粒子的內(nèi)部層中選擇性包含稀土類熒光配合物的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及基本上在氧化硅粒子的內(nèi)部層中選擇性包含稀土類熒光配合物、且表面基本上是由氧化硅構(gòu)成的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。此外，本發(fā)明涉及含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的制造方法，該方法是在存在稀土類熒光配合物的情況下，使四烷氧基原硅酸鹽進(jìn)行乳液聚合。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及含有上述氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑，所述的氧化硅粒子含有本發(fā)明的稀土類熒光配合物；本發(fā)明還涉及熒光標(biāo)記的核酸探針，其中核酸探針結(jié)合于所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面；本發(fā)明還涉及檢測(cè)雙鏈DNA的方法，該方法使用所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，和在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子上導(dǎo)入與雙鏈DNA特異結(jié)合的插入劑；以及本發(fā)明還涉及靶分子測(cè)定用試劑盒，該試劑盒含有本發(fā)明上述的熒光標(biāo)記試劑，含有該熒光標(biāo)記試劑的標(biāo)記物，以及靶分子測(cè)定用材料。
本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，與現(xiàn)有的通過溶劑—膠體法等方法制造的熒光發(fā)光體在氧化硅粒子的整體上大致均勻地混合熒光物質(zhì)的氧化硅粒子不同，是在氧化硅粒子內(nèi)部選擇性地混入大量的稀土類熒光配合物，并且在粒子表面附近基本上直接存在氧化硅。因此，本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，其內(nèi)部的熒光配合物不受外部環(huán)境的影響，并且可以簡(jiǎn)單地在粒子表面導(dǎo)入能夠與被標(biāo)記的物質(zhì)(被標(biāo)記物)結(jié)合的活性取代物，進(jìn)而可以通過在粒子的表面導(dǎo)入插入劑分子直接標(biāo)記雙鏈DNA。
本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的特征在于，具有基本上包含稀土類熒光配合物的內(nèi)部層、和基本上由氧化硅構(gòu)成且基本上不包含稀土類熒光配合物的氧化硅表面層的雙層結(jié)構(gòu)。稀土類熒光配合物可以存在于氧化硅粒子內(nèi)部或表面等粒子中的任何部位，但優(yōu)選作為稀土類熒光配合物發(fā)揮功能的部位存在于粒子的內(nèi)部。在本發(fā)明中，將稀土類熒光配合物能夠在氧化硅粒子的內(nèi)部層發(fā)揮作為熒光配合物的功能的情形稱為“稀土類熒光配合物基本上存在于氧化硅粒子的內(nèi)部層”。
可以通過能夠形成如上所述的雙層結(jié)構(gòu)的各種方法制造本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，例如可以在稀土類熒光配合物的存在下，通過使諸如四烷氧基原硅酸酯的氧化硅材料進(jìn)行乳液聚合的方法，簡(jiǎn)便、且有效地形成目標(biāo)雙層結(jié)構(gòu)，并可以作為本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的優(yōu)選制造方法被列舉出來。
例如，在與水不混溶的有機(jī)溶劑和水的混合系統(tǒng)中，加入表面活性劑，并加入四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料，通過超聲波處理等使其乳化。將通過這種方法得到的乳化液稱為液體I，接著，同樣地制備包含催化劑和稀土類熒光配合物的乳化液作為液體II，然后，可以通過將液體I和液體II混合，并使其發(fā)生乳液聚合進(jìn)行制造。
作為液體I的與水不混溶的有機(jī)溶劑，只要是能夠在表面活性劑的存在下與水形成乳化液的有機(jī)溶劑即可，更優(yōu)選為四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料的溶劑的有機(jī)溶劑。作為液體I的與水不混溶的有機(jī)溶劑的實(shí)例，可以舉出環(huán)己烷、己烷、辛烷、奴約耳(nujol)等烴類溶劑；己醇、庚醇等脂肪醇等的1種或2種以上的混合物。作為用于乳化的表面活性劑，可以是陽離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑的任一種，優(yōu)選Triton X、Brij等非離子性表面活性劑。表面活性劑的使用量只要是乳化所必需的量即可。
液體I是通過在與水不混溶的有機(jī)溶劑和表面活性劑的混合溶液中加入水、乳化，并向其中加入四烷氧基原硅酸酯等氧化硅材料制備的。作為所使用的氧化硅材料，只要是能夠在催化劑的存在下通過乳液聚合形成氧化硅粒子的氧化硅材料即可，并沒有特別的限制，并且四烷氧基原硅酸酯可以作為優(yōu)選的氧化硅材料被列舉出來。作為四烷氧基原硅酸酯的烷氧基，優(yōu)選碳原子數(shù)為大約1～8、優(yōu)選碳原子數(shù)為大約1～5的支鏈或直鏈的低級(jí)烷氧基。四烷氧基原硅酸酯的4個(gè)烷氧基優(yōu)選是相同的，但也不一定必須是相同的。作為優(yōu)選的烷氧基，可以舉出例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基等，具體來說，可以舉出四乙氧基原硅酸酯、四甲氧基原硅酸酯等。
液體II是包含稀土類配合物和催化劑的乳化液，并優(yōu)選為與液體I相同組成的乳化液?？梢酝ㄟ^與制備液體I相同方法制得該乳化液，例如優(yōu)選通過將稀土類熒光配合物與催化劑的水溶液與上述液體I所示的與水不混溶的有機(jī)溶劑和表面活性劑的混合液混合，通過攪拌和超聲波處理等將其乳化。這時(shí)的與水不混溶的有機(jī)溶劑和表面活性劑優(yōu)選使用與上述液體I相同的有機(jī)溶劑和表面活性劑。
液體I和液體II的混合方法優(yōu)選為向液體I中緩緩加入液體II的方法。根據(jù)該方法，在氧化硅材料的乳化液中少量均勻地加入稀土類熒光配合物和催化劑，在過量的烷氧基原硅酸酯中的界面上進(jìn)行稀土類熒光配合物的吸收以及原硅酸酯的聚合，因此可以方便地得到小粒徑(納米級(jí))的本發(fā)明的氧化硅粒子。
對(duì)其中所使用的催化劑沒有特別的限制，只要是能夠通過酸或堿使氧化硅材料發(fā)生聚合的催化劑即可，優(yōu)選為能夠與稀土類熒光配合物穩(wěn)定共存的催化劑。作為這樣的催化劑，具體來說，可以列舉出氨水、氫氧化鈉等無機(jī)堿，鹽酸、硫酸等無機(jī)酸。
對(duì)本發(fā)明的稀土類熒光配合物沒有特別的限制，只要是以稀土類金屬作為中心元素發(fā)射熒光的配合物即可，但優(yōu)選具有熒光壽命長(zhǎng)(和常規(guī)的有機(jī)熒光物質(zhì)所具有數(shù)納秒的熒光壽命相比，稀土類熒光配合物具有數(shù)十到數(shù)百微秒以上的熒光壽命)、斯托克斯頻移大、熒光發(fā)光峰尖銳等特性，且作為標(biāo)記試劑能夠進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)定法的稀土類熒光配合物。作為優(yōu)選稀土類熒光配合物，可以列舉出下述通式(1)～(6)所示的配位體

(在式(1)～式(6)中，n表示整數(shù)1～4，R表示可以具有取代基的芳基，R’表示氫原子、氨基、羥基、羧基、磺基或異硫氰酸酯基。)或者具有下述列舉結(jié)構(gòu)的配位體和稀土類元素構(gòu)成的稀土類熒光配合物

此外，還可以用至少一種選自下式所表示的化合物作為配位體 本發(fā)明的一個(gè)特征在于使用至少一種選自上述的化合物作為本發(fā)明的稀土類熒光配合物。
作為本發(fā)明的稀土類熒光配合物的稀土類金屬可以舉出鋱或銪，更具體地說，是鋱離子或銪離子。
作為式(2)、和式(4)～式(6)的芳基基團(tuán)，是1個(gè)或1個(gè)以上5或6元的單環(huán)、多環(huán)、或者稠合的芳環(huán)，并且該芳環(huán)也可以在環(huán)中具有1個(gè)或多個(gè)選自氮原子、氧原子、或硫原子的雜原子。作為優(yōu)選的芳基，可以舉出苯基、萘基、聯(lián)苯基、吡啶基、咪唑基等。作為這些芳基的取代基，可以舉出碳原子數(shù)為1～8、優(yōu)選碳原子數(shù)為大約1～5的支鏈或直鏈狀的低級(jí)烴基；碳原子數(shù)為1～8、優(yōu)選碳原子數(shù)為1～5左右的支鏈或直鏈狀的低級(jí)烷氧基；如氯、氟、溴等鹵素；羥基、氨基、羧基、磺基等。此外，式(3)的R’基為吡啶環(huán)的取代基，當(dāng)其具有取代基時(shí)，可以具有氨基、羥基、羧基、磺基、異硫氰酸酯基等取代基。
更具體地說，例如，作為稀土類熒光配合物，可以舉出鋱離子與有機(jī)配位體N，N，N1，N1-[2，6-雙(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶]四乙酸(N，N，N1，N1-[2，6-bis(3’-aminomethyl-1’-pyrazolyl)-4-phenylpyridine]tetrakis(acetic acid))(上述通式(2)的取代基R為苯基。以下簡(jiǎn)稱為BPTA)所構(gòu)成的鋱熒光配合物熒光(以下簡(jiǎn)稱為BPTA-Tb3+)，BPTA及其N-羥基琥珀酰亞胺單酯(簡(jiǎn)稱為NHS-BPTA)的合成，可以按照本發(fā)明者所報(bào)道的方法(J.Yuan，G.Wang，K.Majima，K.Matsumoto，Anal.Chem.，2001，73，1869)進(jìn)行。BPTA-Tb3+的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。
在濃度為0.1mg/ml的氧化硅粒子的分散液中，用320nm的激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)包含BPTA-Tb3+的本發(fā)明的氧化硅粒子的熒光特性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。圖1的橫軸表示波長(zhǎng)(nm)、縱軸表示熒光強(qiáng)度。從其結(jié)果可知，本發(fā)明的氧化硅粒子顯示出與導(dǎo)入的BPTA-Tb3+幾乎相同的熒光光譜。
接著，對(duì)本發(fā)明的氧化硅粒子的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。將包含BPTA-Tb3+的本發(fā)明的氧化硅粒子分散于各種pH的緩沖液，例如15mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷鹽酸50mM和氯化鈉緩沖液(pH 7.4)、1×SSC、1×PBS、1×TE和100mM碳酸緩沖液(pH 9.0)等，分別制備成1.0mg/l的分散液，對(duì)這些分散液進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)定。作為對(duì)照，使用于相同緩沖液的BPTA-Tb3+溶液。結(jié)果如圖2所示。圖2的縱軸表示熒光強(qiáng)度、橫軸的左側(cè)表示BPTA-Tb3+溶液的情況、右側(cè)表示本發(fā)明的氧化硅粒子的情況。6個(gè)棒狀圖從左側(cè)起分別表示(i)15mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)(涂黑)、(ii)15mM三氨基甲烷鹽酸50mM氯化鈉緩沖液(pH 7.4)(用黑點(diǎn)表示的灰色部分)、(iii)1×SSC緩沖液(深灰色)、(iv)1×PBS緩沖液(右下斜線)、(v)l×TE緩沖液(pH 8.0)(稍淺的灰色)，和(vi)100mM碳酸緩沖液(pH9.0)(波浪型形式)。測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝545nm、延遲時(shí)間(Delay time)＝0.5ms、窗期(window time)＝1.4ms、循環(huán)時(shí)間(cycling time)＝2.0ms。
結(jié)果可以觀測(cè)到在BPTA-Tb3+溶液中(圖2的左側(cè))，特別是在1×PBS、1×TE和100mM碳酸緩沖液(pH 9.0)中的熒光強(qiáng)度急劇減少；而本發(fā)明的氧化硅粒子的熒光幾乎顯示為恒定值，顯示稀土類熒光配合物存在于粒子內(nèi)部，能夠完全保護(hù)其免受緩沖液等外部環(huán)境的影響。
此外，還可以舉出包括銪離子與以下式
所表示的上述式(2)的R基團(tuán)為聯(lián)苯基的2，2’，2”，2-[4’-聯(lián)苯基-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶-6，6”-二基]雙(亞甲基次氮基)四乙酸(以下簡(jiǎn)稱為BTTA)作為有機(jī)配位體的下式所表示的熒光配合物(以下簡(jiǎn)稱為BTTA-Eu3+) 在濃度為0.1mg/ml的氧化硅粒子的分散液中，和340nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，對(duì)包含BTTA-Eu3+的本發(fā)明的氧化硅粒子的熒光特性進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果如圖3所示。圖3的橫軸表示波長(zhǎng)(nm)、縱軸表示熒光強(qiáng)度。從其結(jié)果可知，本發(fā)明的氧化硅粒子顯示出與導(dǎo)入的BPTA-Eu3+幾乎相同的熒光光譜。
本發(fā)明的特征在于含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面基本上由氧化硅構(gòu)成，并且在保護(hù)內(nèi)部稀土類熒光配合物免受外部環(huán)境的影響的同時(shí)，在氧化硅粒子的表面上具有可與各種化合物結(jié)合的官能團(tuán)?？梢酝ㄟ^使用這樣的官能團(tuán)與被標(biāo)記的物質(zhì)(被標(biāo)記物)直接結(jié)合，還可以通過在氧化硅粒子的表面的官能團(tuán)中導(dǎo)入與被標(biāo)記的物質(zhì)的結(jié)合基團(tuán)使其結(jié)合。作為這樣的結(jié)合基團(tuán)，可以舉出氰基、烷氨基、烷硫基、烷基羧基、烷基醛基等各種官能團(tuán)。這些具有烷基的官能團(tuán)可以通過烷基與氧化硅粒子表面的硅原子，以Si-烷基胺或Si-烷硫醇等結(jié)構(gòu)結(jié)合到氧化硅粒子的表面上。
在本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面上，可以通過上述結(jié)合基團(tuán)、或者直接地結(jié)合各種分子。作為這樣的分子種類，可以舉出抗體、抗原、受體、核酸探針等可特異性結(jié)合的分子種類。例如，作為核酸探針，預(yù)先使10～50個(gè)堿基、10～30個(gè)堿基、或者10～25個(gè)堿基左右長(zhǎng)度的DNA或RNA分子結(jié)合到本發(fā)明的氧化硅粒子的表面，通過與被檢出的核酸雜交，可以通過熒光標(biāo)記檢測(cè)出雜交的核酸探針。因此，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面結(jié)合DNA或RNA等核酸探針的熒光標(biāo)記化核酸探針。
此外，可以直接或者使用上述結(jié)合基團(tuán)在氧化硅表面導(dǎo)入插入劑分子。這類插入劑分子可以特異性地與核酸類的雙鏈雜交體內(nèi)部螯合，能夠特異性地標(biāo)記成雙鏈的DNA/DNA、RNA/RNA、PNA/PNA、DNA/RNA、DNA/PNA、PNA/RNA。例如，通過使被檢出的DNA與探針DNA雜交，并加入本發(fā)明的氧化硅粒子或?qū)肓瞬迦雱┑难趸枇Ｗ?，可以容易地檢測(cè)出是否發(fā)生了雜交。因此，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子或?qū)肓瞬迦雱┑牡暮⊥令悷晒馀浜衔锏难趸枇Ｗ?，檢測(cè)核酸類的雙鏈雜交的方法。
作為這樣的插入劑分子，可以舉出下述分子。
上式中的R基團(tuán)表示用于與氧化硅粒子結(jié)合的連接基的一部分。作為這樣的連接基，可以舉出聚醚、聚亞乙基多胺類、亞烷基等。更具體地說，可以舉出具有下式所述的連接基的插入劑分子。
使用氰基作為結(jié)合基團(tuán)，將該插入劑分子固定在包含BPTA-Tb3+的本發(fā)明的氧化硅粒子的表面上。將1mg氧化硅粒子分散在緩沖液中，將其加入到固定有雙鏈DNA的微量滴定板中，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光測(cè)定。作為對(duì)照，使用未固定有雙鏈DNA的微量滴定板作為空白。結(jié)果如圖4所示。在圖4的左側(cè)的2根柱表示固定有雙鏈DNA的微量滴定板的情況，右側(cè)的2根柱表示空白的情形。圖4的縱軸表示熒光強(qiáng)度(a.u.)。測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝545nm、延遲時(shí)間＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循環(huán)時(shí)間＝2.0ms。
由該結(jié)果可知，通過在本發(fā)明的氧化硅粒子中結(jié)合了插入劑的分子的熒光標(biāo)記，可以非常清楚地檢測(cè)出雜交體的雙鏈DNA。
通過這種方式，本發(fā)明含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，能夠通過用于結(jié)合被標(biāo)記物質(zhì)(被標(biāo)記物)的結(jié)合基團(tuán)、插入劑分子等結(jié)合在該含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面上，因此，本發(fā)明提供了在本發(fā)明含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的表面上導(dǎo)入了上述結(jié)合基團(tuán)和插入劑分子的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
進(jìn)而，和具有2個(gè)與粒子反應(yīng)的部位的二價(jià)插入劑相比，通過使用反應(yīng)部位僅為1個(gè)的一價(jià)插入劑分子，能夠減少由于非特異性吸附所導(dǎo)致的背景噪音。作為這樣的插入劑分子，可以舉出下式所示的插入劑分子。
本發(fā)明可以使本發(fā)明的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子直接、或者通過上述結(jié)合基團(tuán)與能夠進(jìn)行特異性結(jié)合的各種分子種類結(jié)合，并能夠用作這些種類分子的熒光標(biāo)記試劑。因此，本發(fā)明提供了包含上述本發(fā)明含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑。
本發(fā)明的熒光標(biāo)記試劑可以與常規(guī)的熒光標(biāo)記試劑同樣使用，由于表面為基本上為氧化硅的氧化硅粒子，因此具有作為固定載體的功能，并且還具有作為粒子的流動(dòng)性。
進(jìn)而，包含本發(fā)明含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑，通過與抗體、抗原、受體、核酸探針等可特異性結(jié)合的分子種類結(jié)合，可以用作標(biāo)記物，更具體地說，可以用作熒光標(biāo)記物。
并且，使用含有本發(fā)明熒光標(biāo)記試劑的分子種類或者含有該熒光標(biāo)記試劑的標(biāo)記物，可以測(cè)定靶分子。作為這樣的測(cè)定方法，可以舉出常規(guī)的熒光測(cè)定方法、有效利用稀土類熒光配合物的特性的時(shí)間分辨熒光測(cè)定法等。此外，可以制成使用含有本發(fā)明的熒光標(biāo)記試劑的分子種類或包含該熒光標(biāo)記的標(biāo)記物的靶分子的測(cè)定中所必需的、通過將緩沖液和容器等靶分子測(cè)定用材料組合而成的靶分子測(cè)定用試劑盒。因此，本發(fā)明提供了靶分子測(cè)定用試劑盒，該試劑盒包括含有熒光標(biāo)記試劑的分子種類，或含有該熒光標(biāo)記試劑的標(biāo)記物，以及靶分子測(cè)定用材料。
另外，日本專利申請(qǐng)(特愿)第2003-316006號(hào)說明書所記載的內(nèi)容全文包括在本申請(qǐng)中。
實(shí)施例下面，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限制。
實(shí)施例1包含N，N，N’，N’-{2，6-雙(3’-氨基甲基-1’-吡唑基)-4-苯基吡啶}四乙酸(簡(jiǎn)稱為BPTA)鋱配合物的氧化硅粒子的合成將7.5ml環(huán)己烷、1.8ml正己醇、3.54ml表面活性劑(Triton X-100)混合，向其中加入340μl離子交換水，并進(jìn)行超聲波照射，形成乳液。向其中加入50μl四乙基原硅酸酯，得到液體I。將2.0mg BPTA、1.5mg氯化鋱六水合物溶于280μl離子交換水、60μl氨水中。將其加入到7.5ml環(huán)己烷、1.8ml正己醇、3.54ml表面活性劑(Triton X-100)的混合溶液中，并進(jìn)行超聲波照射，形成乳液，得到液體II。一邊攪拌一邊將液體II滴加到液體I中，然后進(jìn)一步在室溫下攪拌20小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入丙酮，通過離心分離得到粒子。分別使用乙醇和水將該粒子平均洗滌3次。完全除去殘留的表面活性劑和吸附在表面上的配合物，通過減壓干燥得到10mg白色粒子。
實(shí)施例2包含2，2’，2”，2-[4’-聯(lián)苯基-2，2’6’，2”-三聯(lián)吡啶-6，6”-二基]雙(亞甲基次氮基)四乙酸(簡(jiǎn)稱為BTTA)銪配合物的氧化硅粒子的合成將7.5ml環(huán)己烷、1.8ml正己醇、1.34g表面活性劑(Brij-97)混合，向其中加入1.36ml離子交換水，并進(jìn)行超聲波照射，形成乳液。向其中加入100μl四乙基原硅酸酯，得到液體I。將12mg BTTA、8.0mg氯化鋱六水合物溶于1.24ml離子交換水中、120μl的2M氫氧化鈉水溶液中。將其加入到7.5ml環(huán)己烷、1.8ml正己醇、1.34g表面活性劑(Brij-97)的混合溶液中，并進(jìn)行超聲波照射，形成乳液，得到液體II。攪拌液體I，向其中滴入液體II，然后在室溫下攪拌20小時(shí)。在反應(yīng)混合物中加入丙酮，通過離心分離得到粒子。分別使用乙醇和水將該粒子平均洗滌3次，完全除去殘留的表面活性劑和吸附在表面上的配合物，通過減壓干燥得到10mg白色粒子。
實(shí)施例3將實(shí)施例1得到的氧化硅粒子分散于15mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷鹽酸和50mM氯化鈉的緩沖液(pH 7.4)、1×SSC緩沖液、1×PBS緩沖液、1×TE緩沖液(pH 8.0)和100mM碳酸緩沖液(pH 9.0)中，分別制備成1.0mg/1的分散液。將這些溶液各100μl加入到微量滴定板的各個(gè)孔中，進(jìn)行熒光測(cè)定。
作為對(duì)照試驗(yàn)，將BPTA-Tb3+分別加入到15mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.4)、15mM三氨基甲烷鹽酸和50mM氯化鈉的緩沖液(pH 7.4)、1×SSC緩沖液、1×PBS緩沖液、1×TE緩沖液(pH 8.0)和100mM碳酸緩沖液(pH 9.0)使其達(dá)到10-8M，將這些溶液各100μl加入到微量滴定板的各個(gè)孔中，進(jìn)行熒光測(cè)定。
本測(cè)定中所使用的時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置為ARVO-SX 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置(Wallac公司制造)，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝545nm、延遲時(shí)間＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循環(huán)時(shí)間＝2.0ms。
以上測(cè)定所得到的熒光強(qiáng)度如圖2所示。圖2的左側(cè)表示對(duì)照試驗(yàn)的結(jié)果，右側(cè)表示本發(fā)明的氧化硅粒子的情況。在對(duì)照實(shí)施例中，特別是在1×PBS緩沖液、1×TE緩沖液和100mM碳酸緩沖液(pH 9.1)中，可以觀測(cè)到熒光強(qiáng)度的減少。另一方面，在氧化硅粒子的熒光顯示為幾乎恒定的值，這顯示稀土類熒光配合物存在于粒子內(nèi)部，并保護(hù)其免受緩沖液等外部環(huán)境的影響。
實(shí)施例4氧化硅粒子的熒光特性評(píng)價(jià)將實(shí)施例1和實(shí)施例2所得到的氧化硅粒子分散于離子交換水中，制備0.1mg/ml的分散液。這些溶液的熒光光譜分別表示在圖1和圖3中。所得到的光譜與導(dǎo)入的稀土類熒光配合物的光譜幾乎相同，可知其以保持溶液中的特征的狀態(tài)被直接吸收到粒子中。
實(shí)施例5向氧化硅粒子的表面導(dǎo)入氨基將實(shí)施例1和實(shí)施例2所得到的氧化硅粒子分散于9.0ml的2M的碳酸鈉水溶液中，向其中加入1.0g溴化氰的0.5ml乙腈溶液，在室溫下攪拌10分鐘。通過離心分離把粒子分離后，使用冷水和PBS緩沖液分別洗滌2次，得到白色粒子。
實(shí)施例6向氧化硅粒子表面導(dǎo)入插入劑在實(shí)施例5中得到的氰基化的氧化硅粒子分散于1ml PBS緩沖液中，向其中加入10M插入劑(N，N-雙(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-1，4，5，8-四羧基二酰亞胺萘三氟乙酸鹽)的10ml PBS溶液，在室溫下放置15小時(shí)。然后，通過離心分離除去反應(yīng)液，加入1.0ml的0.1M甘油PBS溶液，在室溫下攪拌1小時(shí)。通過離心分離分離粒子，然后使用PBS緩沖液洗滌2次，得到淡茶色粒子。
實(shí)施例7使用本發(fā)明氧化硅粒子的DNA標(biāo)記使用實(shí)施例6得到的氧化硅粒子進(jìn)行固定在96孔微量滴定板上的DNA的標(biāo)記試驗(yàn)。具體操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化將雙鏈DNA(salmon testes)溶解于固定用緩沖液(20mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液、150mM氯化鎂和150mM氯化鈉)中，制備1mg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各個(gè)孔中平均加入100μl DNA溶液，在室溫下靜置一晚。使用固定用緩沖液洗滌一次，然后為了確保固定進(jìn)行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。
(ii)微量滴定板的封固在微量滴定板的各個(gè)孔中平均加入100ml的封固液(100mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.8)、100mM氯化鈉、2％牛血清白蛋白(BSA)和1％疊氮化鈉)，避光在室溫下放置1小時(shí)，然后使用0.01×SSC緩沖液洗滌3次。
(iii)DNA的標(biāo)記將1mg實(shí)施例4所得到的包含鋱配合物的氧化硅粒子分散于600μl的1×SSC緩沖液中，將其加入到微量滴定板的各個(gè)孔中，平均每個(gè)孔中加入100μl，避光在室溫下放置2小時(shí)，然后使用1×SSC緩沖液洗滌7次，用于測(cè)定熒光。
本測(cè)定中所使用的時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置為ARVO-SX 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置(Wallac公司制造)，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝545nm、延遲時(shí)間＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循環(huán)時(shí)間＝2.0ms 。
上述測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度和作為空白不存在DNA的情形的熒光強(qiáng)度如圖4所示。
實(shí)施例8通過掃描電子顯微鏡觀察實(shí)施例2所得到的粒子的形狀。粒子的大小大致為80nm。所得到的照片如圖5所示。
實(shí)施例9向氧化硅粒子表面導(dǎo)入插入劑(2)將實(shí)施例5得到的氰基化氧化硅粒子分散于5ml的0.1M碳酸緩沖液中，向其中加入200mM插入劑(N-(3-{2-[2-(3-氨基丙氧基)乙氧基]乙氧基}丙基)-N’-(N，N-二甲基氨基丙基)-1，4，5，8-四羧基二酰亞胺萘三氟乙酸酯)的250ml的0.1M碳酸緩沖液，在室溫下放置15小時(shí)。然后，通過離心分離除去反應(yīng)液，加入1.0ml的1M甘油PBS溶液，在室溫下攪拌1小時(shí)。通過離心分離分離粒子，然后使用PBS緩沖液洗滌2次，得到淡黃色粒子。
實(shí)施例10使用本發(fā)明氧化硅粒子的DNA標(biāo)記(1)
使用實(shí)施例1得到的氧化硅粒子進(jìn)行固定在96孔微量滴定板上的DNA的標(biāo)記試驗(yàn)。具體操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化將雙鏈DNA(salmon testes)溶解于固定用緩沖液(20mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液、150mM氯化鎂和150mM氯化鈉)中，制備250μg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各個(gè)孔中平均加入100μl DNA溶液，在室溫下靜置一晚。使用固定用緩沖液洗滌一次，然后為了確保固定進(jìn)行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。對(duì)于單鏈DNA，使用通過將上述雙鏈DNA溶解于固定用緩沖液中的溶液在95℃下加熱10分鐘、并急速冷卻進(jìn)行熱變性的樣品，通過與雙鏈DNA相同的操作進(jìn)行固定。
(ii)微量滴定板的封固在微量滴定板的各個(gè)孔中平均加入100μl的封固液(100mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH 7.8)、100mM氯化鈉、2％牛血清白蛋白(BSA)和1％疊氮化鈉)，避光在室溫下放置l小時(shí)，然后使用0.01×SSC緩沖液洗滌3次。
(iii)堿性變性對(duì)于單鏈DNA，在封固操作后，在各個(gè)孔中平均加入100ml的0.1N NaOH和0.1M NaCl溶液，在室溫下放置20分鐘，然后使用冷卻至4℃的1×SSC緩沖液洗滌3次。
(iv)DNA的標(biāo)記將1mg實(shí)施例6所得到的包含鋱配合物的氧化硅粒子分散于600ml的1×SSC緩沖液中，將其加入到微量滴定板的各個(gè)孔中，平均每個(gè)孔中加入100ml，避光在室溫下放置5分鐘，然后使用1×SSC緩沖液洗滌7次，用于測(cè)定熒光。
本測(cè)定中所使用的時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置為ARVO-SX 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置(Wallac公司制造)，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝320nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝545nm、延遲時(shí)間＝0.5ms、窗期＝1.4ms、循環(huán)時(shí)間＝2.0ms。
上述測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度如圖6所示。
實(shí)施例11使用本發(fā)明氧化硅粒子的DNA標(biāo)記(2)使用實(shí)施例6得到的氧化硅粒子進(jìn)行固定在96孔微量滴定板上的DNA的標(biāo)記試驗(yàn)。具體操作方法和實(shí)施例10相同。測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度和作為空白的不存在DNA的情形的熒光強(qiáng)度如圖7所示。
實(shí)施例12使用本發(fā)明氧化硅粒子的DNA標(biāo)記(3)使用實(shí)施例9得到的氧化硅粒子進(jìn)行固定在96孔微量滴定板上的DNA的標(biāo)記試驗(yàn)。具體操作方法如下所述。
(i)DNA的固定化將雙鏈DNA(M 13mp 18RF DNA，TakanaBio公司制造)或單鏈DNA(M 13mp 18 Single strand DNA，TakanaBio公司制造)溶解于固定用緩沖液(20mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液、150mM氯化鎂和150mM氯化鈉)中，制備10μg/ml的DNA溶液。在微量滴定板的各個(gè)孔中平均加入100μl DNA溶液，在37℃下靜置一晚。使用固定用緩沖液洗滌一次，然后為了確保固定進(jìn)行UV照射(254nm，1600mJ/cm2)。
(ii)DNA的標(biāo)記將1mg實(shí)施例9所得到的包含鋱配合物的氧化硅粒子加入2.5ml 1×SSC緩沖液中，進(jìn)行5分鐘的超聲波照射使其分散，將其加入到微量滴定板的各個(gè)孔中，平均每個(gè)孔中加入100μl，避光在室溫下放置10分鐘，然后使用1×SSC緩沖液洗滌9次，使用0.2％TritonX-100水溶液洗滌9次，用于測(cè)定熒光。
本測(cè)定中所使用的時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置為ARVO-SX 1420時(shí)間分辨熒光測(cè)定裝置(Wallac公司制造)，測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)＝340nm、測(cè)定波長(zhǎng)＝615nm、延遲時(shí)間＝0.1ms、窗期＝1.5ms、循環(huán)時(shí)間＝2.0ms。
以上測(cè)定得到的熒光強(qiáng)度和作為空白的不存在DNA的情形的熒光強(qiáng)度如圖8所示。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種由在表面具有與被標(biāo)記物(例如來源于生物體的物質(zhì)、生理活性物質(zhì)等)結(jié)合的基團(tuán)、在內(nèi)部包含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子所形成的標(biāo)記試劑。該粒子內(nèi)的配合物不受外部環(huán)境的影響，并且與被標(biāo)記物結(jié)合的基團(tuán)能夠?qū)氲窖趸璧谋砻?，因此，能夠?qū)⑵駷橹褂捎陔y以導(dǎo)入結(jié)合基團(tuán)、由于結(jié)合基團(tuán)的導(dǎo)入導(dǎo)致熒光強(qiáng)度極度降低、由于螯合力不足導(dǎo)致稀土類金屬的解離等因素而不能作為標(biāo)記試劑使用的稀土類熒光配合物用作標(biāo)記試劑。進(jìn)而，由于在粒子中包含大量的熒光配合物，因此可以得到比直接標(biāo)記配合物的情形更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。
此外，本發(fā)明導(dǎo)入了插入劑的熒光標(biāo)記試劑能夠特異性地標(biāo)記雙鏈DNA，并可直接用于DNA芯片。
本發(fā)明提供一種將熒光標(biāo)記封閉在氧化硅粒子內(nèi)部的熒光標(biāo)記用的含熒光物質(zhì)的氧化硅粒子。本發(fā)明的氧化硅粒子形成的熒光標(biāo)記試劑可以用作各種熒光測(cè)定的熒光標(biāo)記試劑，其不僅可以和現(xiàn)有的熒光標(biāo)記試劑同樣地使用，還具有作為氧化硅粒子載體的功能，且熒光物質(zhì)被封閉在氧化硅粒子的內(nèi)部，因此標(biāo)記用的熒光物質(zhì)能夠不受外部環(huán)境影響而穩(wěn)定地存在。
因此，本發(fā)明的氧化硅粒子、以及使用該氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑和測(cè)定方法，作為各種熒測(cè)定用標(biāo)記試劑是有用的，并具有工業(yè)實(shí)用性。
權(quán)利要求
1.一種含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，其中包含稀土類熒光配合物。
2.如權(quán)利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土類熒光配合物包含至少一種選自下式(1)～(6) 所表示的化合物作為配位體。
3.如權(quán)利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土類熒光配合物包含至少一種選自下式 所表示的化合物作為配位體。
4.如權(quán)利要求1所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土類熒光配合物包含至少一種選自下式 所表示的化合物作為配位體。
5.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土類熒光配合物為鋱或銪的配合物。
6.如權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中所述的稀土類熒光配合物的氧化硅粒子是通過乳液聚合物制造的。
7.如權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中稀土類熒光配合物選擇性地包含在主要為氧化硅粒子的內(nèi)部層中。
8.如權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與被標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的氧化硅粒子，其中結(jié)合基團(tuán)為氰基。
10.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與雙鏈DNA特異性結(jié)合的插入劑。
11.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與雙鏈RNA特異性結(jié)合的插入劑。
12.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與雙鏈PNA特異性結(jié)合的插入劑。
13.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與DNA/RNA的雙鏈雜交體特異性結(jié)合的插入劑。
14.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在所述含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與DNA/PNA的雙鏈雜交體特異性結(jié)合的插入劑。
15.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中在含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子中導(dǎo)入與RNA/PNA的雙鏈雜交體異性結(jié)合的插入劑。
16.如權(quán)利要求10～15任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子，其中插入劑為一價(jià)的插入劑。
17.一種熒光標(biāo)記試劑，其中含有如權(quán)利要求1～16任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子。
18.一種熒光標(biāo)記核酸探針，其中在如權(quán)利要求1～16任一項(xiàng)所述的氧化硅粒子的表面結(jié)合有核酸探針。
19.如權(quán)利要求18所述的核酸探針，其中核酸為DNA。
20.如權(quán)利要求18所述的核酸探針，其中核酸為RNA。
21.如權(quán)利要求18所述的核酸探針，其中核酸為PNA。
22.一種檢測(cè)雙鏈DNA的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求10所述的導(dǎo)入了與雙鏈DNA特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
23.一種檢測(cè)雙鏈RNA的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求11所述的導(dǎo)入了與雙鏈RNA特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
24.一種檢測(cè)雙鏈PNA的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求12所述的導(dǎo)入了與雙鏈PNA特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
25.一種檢測(cè)DNA/RNA的雙鏈雜交體的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求13所述的導(dǎo)入了與DNA/RNA的雙鏈雜交體特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
26.一種檢測(cè)DNA/PNA的雙鏈雜交體的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求14所述的導(dǎo)入了與DNA/PNA的雙鏈雜交體特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
27.一種檢測(cè)RNA/PNA的雙鏈雜交體的方法，該方法使用了含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，所述的氧化硅粒子是如權(quán)利要求15所述的導(dǎo)入了與RNA/PNA的雙鏈雜交體特異性結(jié)合的插入劑的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子。
28.一種靶分子測(cè)定用試劑盒，其中包括含有如權(quán)利要求17所述的熒光標(biāo)記試劑的分子種類，或者含有該熒光標(biāo)記試劑的標(biāo)記物，以及靶分子測(cè)定用材料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含稀土類熒光配合物的新型氧化硅粒子，其特征在于在粒子表面具有可結(jié)合的官能團(tuán)，且不受緩沖液、被標(biāo)記物等外部環(huán)境的影響。本發(fā)明涉及包含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，更具體地說，涉及在氧化硅粒子的內(nèi)部層中選擇性地包含稀土類熒光配合物、且表面基本上是由氧化硅形成的含稀土類熒光配合物的氧化硅粒子，包含該氧化硅粒子的熒光標(biāo)記試劑，和使用該氧化硅粒子作為標(biāo)記試劑的熒光標(biāo)記方法，以及，使用該熒光標(biāo)記試劑的熒光測(cè)定法和熒光測(cè)定法用試劑。
文檔編號(hào)G01N33/566GK1875080SQ20048002578
公開日2006年12月6日 申請(qǐng)日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月8日
發(fā)明者松本和子, 西岡琢哉 申請(qǐng)人:學(xué)校法人 早稻田大學(xué)