專利名稱：生物液中腎上腺髓質(zhì)素原中間區(qū)域部分肽的診斷檢測,和實施這樣的檢測的免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及，為醫(yī)療診斷目的，尤其是在診斷膿毒癥中，以及例如，在癌癥診斷和心臟病診斷或通常在那些檢測肽腎上腺髓質(zhì)素(AM)可以給出與診斷相關(guān)的結(jié)果的病理狀態(tài)診斷中，檢測生物液中的腎上腺髓質(zhì)素原中間區(qū)域部分肽(mid-proAM)尤其是proAM(45-92)部分肽的方法。尤其通過其中使用了標記抗體的這一類型的免疫檢測方法(夾心檢測法；根據(jù)SPALT或SPART原則的競爭性檢測法)來實施本發(fā)明的檢測。
在本說明書中，術(shù)語“診斷”原則上用作一個簡化的上位概念，它還有意包括預后判定/早期預后判定和伴隨治療的療程監(jiān)測(Phnochromozytom)。
1993年Kitamura等人首次將已從人嗜鉻細胞瘤(Phnochromozytom)分離的腎上腺髓質(zhì)素(AM)肽(參見18；數(shù)字信息基于所附參考文獻列表)描述為一種具有52個氨基酸的新降壓肽。同年，還描述了編碼具有185個氨基酸的前體肽的cDNA和該前體肽的完整氨基酸序列(19；SEQ ID NO1)。該前體肽，尤其是在N-末端包含一段21個氨基酸的信號序列，被稱作“前腎上腺髓質(zhì)素原”(pre-proAM)。本說明書中，所指明的所有氨基酸位置通常都涉及包含185個氨基酸、且具有序列SEQ ID NO1的pre-proAM，除非在特定的上下文中有明顯不同之處。
腎上腺髓質(zhì)素(AM)肽是一段含有52個氨基酸的肽(SEQ ID NO2)，它含有由蛋白酶剪切pre-proAM形成的pre-proAM的第95至146位氨基酸。時至今日，實質(zhì)上在pre-proAM剪切形成的肽片段中只有幾個已經(jīng)得到了較為精確的描述，尤其是生理活性肽腎上腺髓質(zhì)素(AM)和“PAMP”，它是一段含有20個氨基酸(22-41)的肽，在pre-proAM中緊隨于21個氨基酸的信號肽之后。此外AM和PAMP的生理活性子片斷都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并得到了進一步的研究。
1993年AM的發(fā)現(xiàn)及描述引發(fā)了大量研究和眾多文獻，其結(jié)果在近期已經(jīng)被歸納成各種綜述性文章，在本說明書中，列出了尤其是在“Peptides”(Peptides 22(2001))這本出版物中找到的關(guān)于AM的文章作為參考文獻，尤其是(12)和(2)。還有一份綜述是(3)。在至今的科學研究報告中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，尤其是，AM可以被看作是一種多功能調(diào)控肽。它以延長有甘氨酸的失活形式被釋放到體循環(huán)中(5)。還有一種特異于AM、且可能同樣調(diào)制AM的作用的結(jié)合蛋白(11)。
在迄今為止的研究報告中AM和PAMP的那些最重要的生理效應(yīng)是其影響血壓的效應(yīng)。因此，AM是一種有效的血管擴張劑，低壓效應(yīng)有可能與尤其是AM的C-末端的肽部分有關(guān)。另一方面，AM的N-末端的肽序列表現(xiàn)高壓效應(yīng)(參見例如(6))。
此外，還發(fā)現(xiàn)由pre-proAM形成的上述另一個生理活性肽PAMP同樣表現(xiàn)低壓效應(yīng)，即使它看起來似乎具有不同于AM的作用機制(除上述綜述性文章(2)和(3)之外亦參見(8)、(9)或(14)和EP0 622 458 A2)。
還發(fā)現(xiàn)，可以在體循環(huán)和其它生物液中測得的AM濃度，在大部分病理狀態(tài)下，顯著高于在健康對照人中發(fā)現(xiàn)的濃度。因此，充血心臟衰竭、心肌梗塞、腎疾病、高血壓疾病、糖尿病患者中、在休克急性期中以及膿毒癥和膿毒癥性休克中的AM水平，顯著提高，盡管程度不同(參見例如(2)，第7部分7，和本文中所引用的文獻)。在一些所述的病理狀態(tài)中，PAMP濃度也增加，但是針對于AM其血漿水平相對降低((2)；第1702頁)。
還已知，通常在膿毒癥和膿毒癥性休克中觀察到高濃度AM(參見(2)和(4)、(1)、(13)、(15)和(16))。這些發(fā)現(xiàn)涉及典型的血液動力學變化，已知該變化是膿毒癥和其它比如SIRS這樣的嚴重綜合癥患者病程中的典型現(xiàn)象。
盡管AM和PAMP是從相同的前體肽pre-proAM(SEQ ID NO1)形成的，在前體肽pre-proAM中對應(yīng)于這兩個肽的氨基酸序列以等摩爾量的部分肽存在，但是可以在生物液中測定的AM或PAMP濃度卻顯示不同。這沒有什么不尋常的。一個或相同前體肽的不同降解產(chǎn)物的可測定濃度因為這樣而可能不同，即，因為它們是不同的競爭降解途徑的結(jié)果，這些降解途徑例如在不同的病理狀態(tài)下導致前體肽的不同片段化并由此導致不同的降解產(chǎn)物。前體肽中所包含的某些特定部分肽可能成為或不成為自由肽，和/或不同的肽以不同的方式和不同的量形成。即使加工前體肽只有一種降解途徑，且由此所有的降解產(chǎn)物都從一個或者相同的前體肽產(chǎn)生且必定形成基質(zhì)上相同的摩爾量，在生物液中可以測定的不同部分肽或片段的穩(wěn)定狀態(tài)濃度也可能非常不同，也即，例如，當其各單體肽以不同的速率形成時和/或在各自生物液中具有不同的個體穩(wěn)定性(壽命)時，或者假如它們以不同的清除機制和/或以不同的清除速率從體循環(huán)中除去。
因此，與AM的形成相關(guān)，雖然可以推測，除AM和PAMP外，其它肽片段也必定在pre-proAM的蛋白水解加工中形成。然而，科學文獻根本沒有包含關(guān)于這樣的其它可能片段的出現(xiàn)和穩(wěn)定性的資料，即使對應(yīng)于這樣的pre-proAM肽片段的肽、以及用于檢測它們的放射免疫檢測法(RIA)是可以從商業(yè)途徑獲得以用于研究的，例如從PhoenixPharmaceuticals，Inc.獲得。
基于已經(jīng)從膿毒癥中出現(xiàn)激素原和降鈣素原而獲得的知識(參見例如EP 0 656 121 B1)，并從對于膿毒癥這種情況可能也可以在膿毒癥患者的體循環(huán)中檢測到其它通常觀察不到的激素原這一假說出發(fā)，本申請人使用商業(yè)獲得的RIA用結(jié)合pre-proAM第45-92位氨基酸、但不結(jié)合成熟AM的抗體實施了一個針對在膿毒癥患者血清中檢測腎上腺髓質(zhì)素原的實驗。WO 00/22439公開文本中描述的結(jié)果給出了一種暫時定名為腎上腺髓質(zhì)素原的分析物的濃度，該濃度與健康對照人相比有所升高。然而，所測定的升高僅僅是在正常值的兩倍這一數(shù)量級，也就是說是相當小的。根據(jù)文獻資料報道了在膿毒癥的情形下12倍于正常值這一數(shù)量級的升高的AM值所觀察到的通過所使用的檢測方法測定的proAM免疫反應(yīng)性上升至約為正常值的兩倍，這一提高對于在膿毒癥診斷中檢測該“proAM免疫反應(yīng)性”來替代AM似乎并不很具有吸引力。在所述實驗中是否確實測定了腎上腺髓質(zhì)素原(22-185或22-146)或者按所述方式測定的腎上腺髓質(zhì)素原免疫反應(yīng)性是否歸因于患者樣品中存在的一個物種或者大量不同物種，不能根據(jù)所測結(jié)果來決定。
在對可臨床用于膿毒癥診斷的生物標記的廣泛研究和開發(fā)過程中，以及特別是基于能夠借助多參數(shù)檢測方法(同時檢測多種生物標記)改進膿毒癥精確診斷這一目的，申請人還考慮了對在膿毒癥中升高的AM的檢測或附加檢測。然而，正如我們發(fā)現(xiàn)的，對AM進行可以獲得不受各別研究工作的限制而能夠?qū)λ鶞y結(jié)果做簡單比較的檢測并非立即就可能的。大多數(shù)研究工作信息都是利用以AM與標記肽競爭抗體的共同AM結(jié)合位點為基礎(chǔ)的RIA得到的。不同的RIA常常各自發(fā)展，而且使用了各種不同的抗體和肽，這為在所測得的結(jié)果間做定量比較帶來了更多困難(參見例如10)。此外，近期的研究結(jié)果已經(jīng)顯示，存在各種不同形式的AM(帶有或不帶有C-末端甘氨酸殘基)，它們可能具有不同的活性(參見(2)和，例如，(5))。一種AM結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)使(參見11)得情況變得更加復雜——甘氨酸存在與否或AM與其結(jié)合蛋白形成的復合物存在與否都能夠以不可預計的方式影響對AM作為各檢測方法的運作機能的檢測。這些情況為適于常規(guī)調(diào)查的AM有效免疫檢測法提出了更高的要求對于這樣一種檢測方法，如果實際存在與那些沒有被結(jié)合蛋白占據(jù)的AM區(qū)域結(jié)合的適宜抗體的話，則必須找到這樣抗體。作為選擇，必須采取預先的步驟來使結(jié)合蛋白與AM解放或分離開，這使得這一步驟對AM穩(wěn)定性的影響和/或所得的測定值難于估計。除了完整的AM之外，發(fā)現(xiàn)不同部分肽也有生理作用并且它們似乎在整個生理過程中起重要作用，這一事實使得有效免疫檢測法的形成與文獻中出現(xiàn)的測定值的可比性更為復雜。
因此本申請人的目的是提供一種適于常規(guī)程序的有效方法，該方法本質(zhì)上對上述直接測定AM的干擾因素不敏感，并能夠在各種病理狀態(tài)下給出AM和/或其前體的可靠的生理產(chǎn)生值，尤其是在膿毒癥中或在其它發(fā)現(xiàn)AM值升高病理狀態(tài)下。
根據(jù)本發(fā)明如此實現(xiàn)了該目的，為診斷目的不檢測AM或到目前為止所調(diào)查的另一pre-proAM部分肽，而是檢測包含pre-proAM第42-95位氨基酸的中間區(qū)域部分肽(SEQ ID NO3)，則這一檢測特別優(yōu)選利用使用了標記抗體的免疫檢測法來完成。
權(quán)利要求1代表了本發(fā)明的核心。
本發(fā)明的有利之處及當前優(yōu)選的實施方式描述于從屬權(quán)利要求中。
為實現(xiàn)提供可靠測定各種病理狀態(tài)下AM及其前體產(chǎn)物或副產(chǎn)物的形成的檢測方法這一目的，尤其是在膿毒癥中，以及例如心臟病、高血壓疾病或癌癥或其它可以觀察到AM水平升高的疾病。盡管它不是很有保證的結(jié)果，一方面與描述于WO 00/22439的在膿毒癥中“腎上腺髓質(zhì)素原免疫反應(yīng)性”升高的結(jié)果相結(jié)合，另一方面，利用各種新的檢測方法對膿毒癥、癌癥和心臟病患者血清測量進行補充的廣泛臨床研究，這一措施令人驚奇地給出了準確性大大提高的測定值。
以下詳細描述了所完成的研究以及這些研究給出的最重要結(jié)果，參考文獻用數(shù)字表示。
附

圖1顯示，109位健康人血清中mid-proAM的測定結(jié)果，與110位膿毒癥患者以及20位多發(fā)性損傷患者的血清的測定結(jié)果比較。所用測定均采用在實施例部分詳細描述的SPALT檢測方法完成。顯著的是——與其它降鈣素原和其它炎癥標記相反——只有膿毒癥患者的值(相對于健康人值33pmol/l，約為550pmol/l和550fmol/ml的高濃度)是升高的，多發(fā)性損傷患者的值卻未升高。
附圖2顯示，利用實施例部分更詳細描述的夾心檢測法測定的274位健康人、267位膿毒癥患者、20位心臟病患者和49位癌癥患者血清中的mid-proAM測定值。
聯(lián)系得到本發(fā)明的研究方法，關(guān)于處于各種疾病狀態(tài)的物種的本質(zhì)或者關(guān)于尤其是檢測AM/proAM的適宜物種的問題是最重要的。因為RIA原則上不適于對這一問題給予有價值的信息，此外，由于各種原因，RIA對于為常規(guī)檢測提供有效的檢測方法這一發(fā)展目的似乎也不是很有希望，因此首先必須開發(fā)新的可以選擇標記抗體的這一類型的檢測方法、免疫檢測方法。
在研究根據(jù)WO 00/22439測定的膿毒癥中提高的腎上腺髓質(zhì)素原免疫反應(yīng)性值是否確實在所調(diào)查的樣品中表現(xiàn)出升高的腎上腺髓質(zhì)素原濃度這一問題時，首先開發(fā)了一種基于檢測方法設(shè)計的夾心檢測法，該方法本質(zhì)上特異于腎上腺髓質(zhì)素原(22-146或22-185)，因為它既不能識別AM也不能識別不包含AM的pre-proAM部分肽。
該夾心檢測法使用了兩種不同的特異性識別肽(69-86肽區(qū)段SPCD19；SEQ ID NO4)或肽(129-147；C-末端AM肽)氨基酸序列的抗體。所使用的標準材料是重組完整腎上腺髓質(zhì)素原(22-185)，其在商業(yè)競爭性AM檢測法中已經(jīng)得到校準。
在健康正常人血清和膿毒癥患者血清的測定中，用該夾心檢測法沒有得到高出檢測限度約40pg/ml的升高值(結(jié)果未顯示)。從這些發(fā)現(xiàn)，必須得出這一結(jié)論在膿毒癥中發(fā)現(xiàn)的升高的proAM免疫反應(yīng)性不是由于樣品中腎上腺髓質(zhì)素原肽的存在引起的。
為進一步核查關(guān)于早前測定的相對較輕微(約兩倍)升高的“proAM免疫反應(yīng)性測定值”是否真實以及由所使用的RIA引起的假象是否可能在這些測定起作用這一問題，又開發(fā)了一種基于所謂的SPALT原理的檢測方法。在這樣一種檢測方法中，利用了結(jié)合于固相(固相＝SP)的分析物(“抗原”＝A)競爭劑與分析物對反應(yīng)液中的標記抗體上的普通結(jié)合位點的競爭。在本發(fā)明的情況中，用發(fā)光示蹤劑標記抗體(LT)(參見實施例部分)。分析物的存在以及樣品中的競爭性結(jié)合部分對結(jié)合位點的占據(jù)是明顯的，因為標記抗體與固相的結(jié)合減少。
所述SPALT中所使用的固相結(jié)合競爭劑是固相結(jié)合肽(69-86肽區(qū)段SPCD19；SEQ ID NO4)，所使用的抗體是抗該肽并識別該肽的標記抗-SPCD19-綿羊抗體(親和純化；參見實施例部分)。所使用的標準物包含正常馬血清中的肽SPCD19稀釋物。檢測限度為約50pmol/l。在該檢測中，將各樣品100μl(標準)和100μl在包被有SPCD19肽的Polysorb試管中4℃中示蹤劑孵育過夜，之后用申請人的LUMItest公司的4×1ml標準洗滌液洗滌，之后在照度計中測定。
在一次用該SPALT檢測方法測定膿毒癥過程中，在膿毒癥患者和健康正常人間發(fā)現(xiàn)巨大差異。在檢測限度約1ng/ml時，膿毒癥患者血清給出平均約為19000pg/ml的值?？紤]到在使用商業(yè)RIA的預備實驗中相當?shù)偷纳?WO 00/22439)，膿毒癥患者和健康人之間的實質(zhì)差別是非常驚人的。
將所述SPALT檢測方法擴展到了臨床測定。擴展研究結(jié)果用圖表概括在附圖1中，作為上述對附圖1的說明的明確參考。
使用SPALT檢測方法的上述陽性結(jié)果顯示，(i)在膿毒癥血清中測定的“proAM-免疫反應(yīng)性”不能歸結(jié)于腎上腺髓質(zhì)素原的實際存在，但是(ii)對具有pre-proAM中間部分的氨基酸序列，更精確地說是根據(jù)SEQ ID NO3的mid-proAM，的對應(yīng)測定，適于清楚地將膿毒癥患者與正常人區(qū)分。
根據(jù)這些結(jié)果，將調(diào)查向兩個方面擴展1.鑒定體循環(huán)中實際出現(xiàn)的pre-proAM，以及可選地調(diào)查其作為常規(guī)測定中的生物標記的適宜性。
2.同時，進一步調(diào)查測定這些種類可以給出在診斷上有價值的結(jié)果的程度。
以下參照實施例部分更詳細地描述結(jié)果。它們可以歸納如下1.包含pre-proAM第45-92氨基酸(SEQ ID NO3)或由其組成的、且在本發(fā)明中稱作的mid-proAM肽在體循環(huán)(血清、血漿)中以顯著升高的濃度存在，而且可測定性可以良好重復。
2.利用特異性測定該mid-proAM的檢測方法測定患者血清給出的測定結(jié)果不僅可以明顯區(qū)分膿毒癥患者和正常人而且還——結(jié)合臨床研究——能夠探測其它與形成升高的AM有關(guān)的疾病，尤其是心臟病和癌癥。
因此該發(fā)明尤其涉及患者體循環(huán)，尤其是血漿樣品，中mid-proAM的檢測。
以下還詳細解釋了本發(fā)明優(yōu)選實施方式的一些大致方面，以及對進一步選擇出的實驗結(jié)果做了更詳細地說明。
對于本發(fā)明的實際實施，優(yōu)選其中使用了標記抗體的檢測方法，比如根據(jù)上述競爭性SPALT原理運作的檢測方法(但是其它標記，例如SPART檢測法中的放射性標記，也可以使用)。
然而，非競爭性夾心檢測法，例如如同以下詳細描述的所使用的用于進一步更廣泛調(diào)查的這一類型，是尤其優(yōu)選的。
與競爭性免疫檢測法相比，非競爭性夾心檢測法(雙向免疫檢測法)有諸多優(yōu)點，包括它們可以比固相檢測法(異源檢測法)更好地設(shè)計這一事實，在操作上更牢固，能夠得出具有更高敏感度的測定結(jié)果，以及還更適于自動化和系列測定。此外，與只用一種類型的抗體運作的競爭性免疫檢測相比它們還可以給出附加的信息，因為夾心免疫檢測僅識別那些在同一個分子中存在用于形成夾心的抗體的兩個結(jié)合位點的分子或肽。
原則上該抗體可以是任何適宜的單克隆和/或多克隆抗體，但是優(yōu)選親和純化的多克隆抗體。
尤其優(yōu)選的是，其中一種抗體是通過用包含具有pre-proAM的第69-86位氨基酸和N-末端附加甘氨酸殘基(SEQ ID NO4)的合成肽序列的抗原免疫接種動物，尤其是綿羊，獲得的。相應(yīng)地可以用，例如，包含具有pre-proAM的第83-94位氨基酸(肽區(qū)段PSR13；SEQ ID NO5)和N-末端的附加甘氨酸殘基的合成肽序列的抗原獲得另一個抗體。用共同包含proAM序列的連續(xù)中間區(qū)域的合成肽獲得的抗體，僅識別上述mid-proAM(第45-92位氨基酸)區(qū)域中的結(jié)合位點，更精確地說是pre-proAM的第60-92位氨基酸。
在一種優(yōu)選實施方式中，該方法作為一種異源夾心免疫檢測法來實施，其中，一種抗體被固定在任意一種固相上，例如包被了的試管壁上(例如聚苯乙烯；“Coated Tubes”；CT)或微量滴定板上，例如聚苯乙烯，或顆粒上，例如磁珠，而另一種抗體帶有表示可直接檢測的標記、或者可以與抗體選擇性連接、且用于檢測所形成的夾心結(jié)構(gòu)的殘基。還可能用適宜的固相進行時間性延遲的或隨后的固定。
原則上，可以使用在所述類型的檢測方法中使用的所有的標記技術(shù)，這些技術(shù)包括用放射性、酶、熒光、同位素標記，或化學發(fā)光或生物發(fā)光標記，以及比如金原子和染料顆粒這樣的直接可光學探測的顏色標記，尤其是如同在所謂的床旁(POC)或快速檢測中所使用的。對于異源夾心免疫檢測的情況，兩種抗體也可以具有同源檢測法中下述類型的部分檢測系統(tǒng)。
本發(fā)明因此還涉及根據(jù)本發(fā)明將該方法設(shè)計為快速檢測。
本發(fā)明的方法還可以被設(shè)計成同源方法，其中從兩種抗體與所要探測的mid-proAM形成的夾心復合物保持懸浮于液相中。這種情況下，優(yōu)選對作為檢測系統(tǒng)一部分的兩個抗體都進行標記，當兩個抗體被整合在一個夾心中時，這個檢測系統(tǒng)就能產(chǎn)生信號或者開啟信號。這樣的技術(shù)可以設(shè)計成尤其是熒光擴增或熒光淬滅檢測法。這一類型的一種尤其優(yōu)選方法是涉及，使用成對使用的檢測劑，例如，如US-A-4 822733、EP-B1-180 492或EP-B1-539 477以及本文所引用的現(xiàn)有技術(shù)中所述的。它們可以直接在反應(yīng)混合物中進行僅選擇性探測在單個免疫復合物中同時包含兩個標記成分的反應(yīng)產(chǎn)物的檢測。作為例子，提供了商標為TRACE(Time Resolved Amplified Cryptate Emission)和KRYPTOR的技術(shù)，這些技術(shù)可以執(zhí)行上述應(yīng)用的教導。
已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明對mid-proAM(SEQ ID NO3)的這一檢測給出極為顯著的測定結(jié)果。正如以下將顯示的，這一論斷不僅適用于膿毒癥的診斷也適用于心臟病和癌癥的診斷。
據(jù)推測，本發(fā)明的檢測方法尤其有利的還可以在所謂的多參數(shù)診斷中實施，尤其是在心臟病診斷領(lǐng)域以及膿毒癥和癌癥診斷領(lǐng)域。由此測定的其它參數(shù)是，例如，心臟參數(shù)ANP、BNP、proANP或proBNP或選自例如抗-神經(jīng)節(jié)苷脂抗體、降鈣素原蛋白、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白、LASP-1、可溶性細胞角蛋白片段、尤其是CYFRA 21、TPS和/或可溶性細胞角蛋白片段(sCY1F)、Inflammin肽和CHP、其它肽激素原、甘氨酸-N-酰基轉(zhuǎn)移酶(GNAT)、氨甲?；姿岷铣擅?(CPS 1)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)或其片段的膿毒癥參數(shù)。對于所述多參數(shù)檢測的情況，意欲同時或平行檢測多參數(shù)的測定結(jié)果并對其進行評估，例如，借助于也利用診斷顯著性參數(shù)相關(guān)性的計算機程序。
以下通過對優(yōu)選檢測組分的制備、夾心類型檢測方法的一種優(yōu)選實施方式、以及用這樣一種檢測方法檢測對照人以及膿毒癥、心臟病和癌癥患者的EDTA血漿中mid-proAM檢測結(jié)果進行說明，來更詳細的解釋本發(fā)明。
此外，還描述了對體循環(huán)中實際檢測和出現(xiàn)的proAM部分肽的鑒定。
實驗部分材料和方法1.肽合成從已知的人前腎上腺髓質(zhì)素原氨基酸序列(SEQ ID NO1)選擇第一區(qū)段(第69-86位肽區(qū)段SPCD19；SEQ ID NO4)和第二區(qū)段(第83-94位肽區(qū)段PSR13；SEQ ID NO5)。各區(qū)段N-末端都補加半胱氨酸殘基，兩個區(qū)段都經(jīng)標準方法合成、純化、利用質(zhì)譜法和反向HPLC進行質(zhì)量控制、并以等分量凍干(JERINIAG，Berlin，Germany)。這些肽的氨基酸序列是Peptid SPCD19RPQDMKGASRSPEDSSPD(SEQ ID NO4)Peptid PSR13CSSPDAARI RVKR (SEQ ID NO5)此外，合成了完整的mid-proAM(對應(yīng)于SEQ ID NO3的45-92位)作為標準ELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRV(SEQ ID NO3)2.綴合及免疫借助MBS(間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)將上述肽SPCD19和PSR13與載體蛋白KLH(匙孔血藍蛋白)綴合(參見PIERCE的工作指導“NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers”，Rockford，IL，USA)。根據(jù)以下方案用這些綴合物接種綿羊各綿羊最初接受100μg綴合物(基于綴合物肽部分的粗略數(shù)據(jù))，之后每四周接受50μg綴合物(基于綴合物肽部分的粗略數(shù)據(jù))。從初始接種后的第四個月開始，每四周從各綿羊抽取700ml血液，并將這些血液離心獲得抗血清。綴合物、接種和抗血清的獲得都由MicroPharm，Carmarthenshire，UK完成。
3.抗體的純化在一步法中，按照下述從自接種后第四個月開始獲得的抗血清中制得肽-特異性抗體。
為此，首先將上述肽SPCD19和PSR13與SulfoLinkGel偶聯(lián)(參見PIERCE公司的工作指導“SulfoLinkKit”，Rockford，IL，USA)。對各肽，每5ml凝膠都使用5mg肽進行偶聯(lián)。
根據(jù)下述從抗這些肽的綿羊抗血清的親和純化出肽-特異性抗體首先用洗脫緩沖液(50mM檸檬酸，pH 2.2)和結(jié)合緩沖液(100mM磷酸鈉，0.1％Tween，pH 6.8)各10ml交替洗滌肽柱三次。將100ml綿羊抗血清濾過0.2μm，并與現(xiàn)有的柱材料混合。為此，在柱外用10ml結(jié)合緩沖液定量洗滌凝膠。室溫下渦旋孵育過夜。將孵育物定量轉(zhuǎn)移到空柱上(NAP 25，Pharmacia，清空)。棄去流過液。之后用250ml結(jié)合緩沖液洗滌至不含蛋白(洗脫液的蛋白質(zhì)含量＜0.02 A280nm)。向洗過的柱中加入洗脫緩沖液，收集到了1ml級分。用BCA法確定各級分的蛋白質(zhì)含量(參見PIERCE公司的工作指導，Rockford，IL，USA)。收集蛋白質(zhì)濃度＞0.8mg/ml的級分。用BCA法對這些收集物做蛋白質(zhì)檢測后，獲得了49mg抗-SPCD19抗體(親和純化的；多克隆)和60mg抗-PSR13抗體(親和純化的；多克隆)。
4.標記根據(jù)工作指導，在NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)柱上將500μl純化的抗-SPCD19抗體(參見上述)重新緩沖于1ml 100mM的磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)中?？贵w溶液的蛋白質(zhì)濃度測定值為1.5mg/ml。
為了對抗體做化學發(fā)光標記，向67μl抗體溶液中加入10μl MA70吖啶酯NHS酯(1mg/ml；來自HOECHST Behring)，并在室溫下孵育15分鐘。之后，加入423μl 1M的甘氨酸，室溫下再孵育10分鐘。之后，根據(jù)工作指導在NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)將標記物重新重新緩沖于1ml流動相A(50mM磷酸鉀，100mM NaCl，pH 7.4)并低分子量成分中脫離出來。為了分離出未結(jié)合于抗體的最終標記殘余，進行凝膠過濾HPLC(柱Waters Protein Pak SW300)。加入樣品，用流動相A層析，流速1ml/分鐘。用流式光度計測定280nm和368nm波長。作為抗體標記程度量度的吸收比率368nm/280nm在峰處為0.10。收集含有抗體的單個級分(滯留時間8-10分鐘)，置于3ml 100mM磷酸鈉、150mM NaCl、5％胎牛血清白蛋白、0.1％疊氮化鈉中，pH 7.4。
一方面按照以下更為詳細描述的將所標記的抗體用于夾心免疫檢測中，另一方面，也用在已經(jīng)描述過的SPALT中。
5.偶聯(lián)為提供夾心免疫檢測的固相，按照下述用純化的抗-PSR13抗體包被經(jīng)過照射的5ml聚苯乙烯試管(來自Greiner)將抗體在50mMTris、100mM NaCl，pH 7.8中稀釋至濃度6.6μg/ml。將300μl該溶液滴入各管。22℃孵育管20小時。用泵抽濾該溶液。然后向各管中填充4.2ml 10mM磷酸鈉、2％Karion FP、0.3％胎牛血清白蛋白，pH 6.5。20小時后，用泵抽濾該溶液。最后，在真空干燥機中干燥這些管。
還用各個其它抗體以基本相同的方式進行了所述標記和固定化方法，得到“反向”夾心檢測。按照類似于以下描述的利用這樣的“反向”標記/固定化免疫檢測的測定來完成測定給出了基本相同的結(jié)果，因此不再描述。
6.進行夾心免疫檢測及其評估制備具有以下組分的檢測緩沖液100mM磷酸鈉，150mM NaCl，5％胎牛血清蛋白，0.1％非特異性綿羊IgG，0.1％疊氮化鈉，pH 7.4。
所使用的標準材料是化學合成的mid-proAM(SEQ ID NO3)。在正常馬血清(來自SIGMA)中連續(xù)稀釋該肽。根據(jù)肽的樣品重量決定如此制備的標準物的濃度。
所測定的樣品是外表健康的人、膿毒癥患者、心臟病患者、癌癥患者的EDTA血漿。
將10μl標準物或樣品和200μl檢測緩沖液、含有一百萬RLU(相對發(fā)光單位)的MA70-標記的抗-SPCD19抗體滴入測試試管。22℃振蕩孵育兩小時。之后每次用1ml洗滌溶液每管(0.1％Tween 20)洗滌四次，倒掉洗滌液，并在照度計(BERTHOLD，LB952T；BRAHMS AG的基礎(chǔ)試劑)中測定結(jié)合于試管的化學發(fā)光。
用MultiCalc軟件(Spline Fit)，從標準曲線讀取樣品的中間區(qū)域腎上腺髓質(zhì)素原濃度。結(jié)果用圖形歸納于附圖2。
7.進行SPALT免疫檢測及其評估所述SPALT檢測中所使用的固相結(jié)合競爭劑是固相結(jié)合肽SPCD19(肽區(qū)域69-86；SEQ ID NO4)，它已經(jīng)結(jié)合于Polysorb試管壁。所使用的抗體是在如1至4中所述獲得的標記的抗-SPCD19-綿羊抗體(親和純化)。用正常馬血清中的肽SPCD19稀釋物作為標準。
檢測時，將各100μl樣品(或標準)和100μl示蹤劑于4℃下在包被有SPCD19肽的Polysorb試管中孵育過夜，此后用申請人的LUMItest的4×1ml的標準洗滌溶液洗滌，之后在照度計中測度。
利用該檢測獲得的測量值系列示于附圖1。
8.鑒定在所述檢測中測定的分析物為了濃縮被在上述檢測中所使用的抗體識別的分析物，將三份單獨的膿毒癥血漿直接經(jīng)C18反向HPLC分餾分析，用線性乙腈梯度洗脫。收集1ml級分并干燥。將級分置于檢測緩沖液中，檢測各個級分的SPCD19免疫反應(yīng)性。為此，將抗-SPCD19抗體(參見上述3)固定在Polysorb試管壁上，并檢測樣品(級分)的競爭和該抗體的發(fā)光-標記的SPCD19。
在這樣的一個分析中發(fā)現(xiàn)，對于全部的膿毒癥血漿，在相同的級分(級分22)中發(fā)現(xiàn)了最大免疫反應(yīng)性。
為進一步鑒定所測定分析物，收集了7份約3ml的膿毒癥血清(終體積為22ml)。用帶有抗-SPCD19抗體的Carbolink柱親和純化所收集的血清，如上述經(jīng)C18反相HPLC分級分離酸性洗脫物。干燥級分22并做質(zhì)譜分析調(diào)查。
在直接質(zhì)譜分析中，檢測到所分離分析物的摩爾質(zhì)量值約為5146Dalton。該值對應(yīng)于包含第45-92位氨基酸序列的proAM片段，也即mid-proAM，的摩爾質(zhì)量(理論值為5146.72 Dalton，假設(shè)其中存在的兩個甲硫氨酸被氧化)。
在對所分離的級分22胰蛋白酶消化物所作的MALDI-TOF分析中，特別是對應(yīng)于pre-proAM第79-89、75-89、61-74和61-78位氨基酸的肽片段被鑒定為單一同位素質(zhì)量(M+H+)。胰蛋白酶降解物的摩爾質(zhì)量數(shù)據(jù)和質(zhì)譜分析共同證明了，包含在所分離級分中的肽是名稱為mid-proAM(45-92)(SEQ ID NO3)的肽。其形成可以用信號肽酶、激素原轉(zhuǎn)化酶(在堿性氨基酸間切割)和氨基-和羧基-肽酶(除去堿性氨基酸)對原始pre-proAM翻譯產(chǎn)物的蛋白酶水解加工來解釋(參見(20)中降鈣素原降解的類似流程)。
9.穩(wěn)定性調(diào)查為考察關(guān)于在mid-proAM的測定中是否可能會因為mid-proAM在樣品或測定溶液中沒有充足的穩(wěn)定性而出現(xiàn)問題這一問題，對20份各在新鮮狀態(tài)下以及在室溫下存放3天后的膿血癥血清進行了測定。結(jié)果歸納于下表。它們顯示，保存3天后免疫反應(yīng)性本質(zhì)上沒有改變。這證明，mid-proAM的穩(wěn)定性是其在處理診斷方面的一個主要優(yōu)勢。
表1
平均值＝98.8％概言之，可以說檢測mid-proAM，使用例如SPCD19抗體，相比檢測，例如，AM具有許多優(yōu)點mid-proAM的檢測不受到任何已知的由于存在結(jié)合蛋白、片段和弱濃度動力學而導致的限制的約束。
分析物mid-proAM還具有良好的穩(wěn)定性，也即，在室溫存放過程中極少喪失免疫反應(yīng)性，這對于診斷性常規(guī)檢測是一個主要的實踐優(yōu)點。
觀察到了非常好的動力學，而且這不被認為僅特異于膿毒癥。
因此認為，檢測mid-proAM能夠?qū)λ斜幻枋鲇蠥M濃度上升的疾病表征都具有優(yōu)勢，其中在目前看來尤其有利于膿毒癥、心臟病和癌癥的診斷。
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序列表<110>B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft<120>生物液中腎上腺髓質(zhì)素原中間區(qū)域部分肽的診斷檢測，和實施這樣的檢測的免疫檢測方法<130>3723PCTCN<140>
<141>
<150>DE 10316583.5<151>2003-04-10<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>185<212>PRT<213>智人<400>1Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe1 5 10 15Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys20 25 30Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met35 40 45Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala50 55 60Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg85 90 95Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
100 105 110Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr115 120 125Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln130 135 140Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly145 150155 160Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro165 170 175Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu180 185<210>2<211>52<212>PRT<213>智人<400>2Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys1 5 10 15Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln20 25 30Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser35 40 45Pro Gln Gly Tyr50<210>3<211>48<212>PRT<213>智人<400>3Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys1 5 10 15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala20 25 30Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val35 40 45<210>4<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成肽<400>4Cys Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser1 5 10 15Ser Pro Asp<210>5<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列合成肽<400>5Cys Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg1 5 10
權(quán)利要求
1.為診斷目的檢測生物液中的腎上腺髓質(zhì)素免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于測定含有完整前腎上腺髓質(zhì)素原(pre-proAM；SEQ ID NO1)的氨基酸(45-92)的腎上腺髓質(zhì)素原中間區(qū)域部分肽(mid-proAM；SEQID NO3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于借助免疫檢測法來測定生物液中的mid-proAM，其中的免疫檢測法用至少一種特異性識別mid-proAM的標記抗體來完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于該免疫檢測法是一種使用結(jié)合于固相的分析物競爭劑和標記抗體的檢測法(SPALT檢測法)或使用了至少兩種特異性結(jié)合于不同的mid-proAM(SEQ ID NO3)部分序列的抗體的夾心檢測法(雙向免疫檢測法)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一的方法，其特征在于檢測循環(huán)中的mid-proAM(SEQ ID NO3)，且生物液是血漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于兩種抗體都結(jié)合于mid-proAM中的一段從pre-proAM第60至第94位氨基酸的區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一的方法，其特征在于抗體是單克隆和/或多克隆的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一的方法，其特征在于兩種抗體都是親和純化的多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一的方法，其特征在于抗體中的一種是通過用包含含有pre-proAM第69-86位氨基酸(SEQ ID NO4)的合成肽序列的抗原免疫接種動物獲得的，抗體中的另一種是通過用包含含有pre-proAM第83-94位氨基酸(SEQ ID NO5)的合成肽序列的抗原免疫接種獲得的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一的方法，其特征在于其中一種抗體被標記，另一種抗體與固相結(jié)合或可以選擇性與固相結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一的方法，其特征在于第一種和第二種抗體都分散在液體反應(yīng)混合物中，且作為基于熒光和化學發(fā)光淬滅或放大的標記系統(tǒng)一部分的第一種標記組分與第一種抗體結(jié)合，該標記系統(tǒng)的第二種標記組分與第二種抗體結(jié)合，由此在待檢測的mid-proAM與兩種抗體都結(jié)合后，即產(chǎn)生一個使得可以在測定溶液中探測所得夾心復合物的可測定信號。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于該標記系統(tǒng)含有稀土穴狀化合物或稀土螯合物以及熒光或化學發(fā)光染料，尤其是花青型的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的方法，其特征在于用于診斷、嚴重性和預后的確定以及膿毒癥的過程伴隨性療法控制。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于它作為多參數(shù)檢測來實施，其中同時還至少檢測一個其它與膿毒癥診斷相關(guān)的參數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于另外一個或多個與膿毒癥診斷相關(guān)的參數(shù)選自抗-神經(jīng)節(jié)苷脂抗體、蛋白質(zhì)降鈣素原、CA 125、CA 19-9、S100B、S100A蛋白、LASP-1、可溶性細胞角蛋白片段，尤其是CYFRA 21、TPS和/或可溶性細胞角蛋白-1片段(sCY1F)、肽Inflammin和CHP、其它肽激素原、甘氨酸-N-?；D(zhuǎn)移酶(GNAT)、氨甲?；姿岷铣擅?(CPS 1)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)或其片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的方法，其特征在于它用在心臟病診斷領(lǐng)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其特征在于它以同時還檢測其它與心臟病診斷相關(guān)的參數(shù)的多參數(shù)檢測來實施。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一的方法，其特征在于它用在癌癥診斷領(lǐng)域。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于它以同時還檢測其它與癌癥診斷相關(guān)的參數(shù)的多參數(shù)檢測來實施。
全文摘要
為診斷目的檢測生物液中腎上腺髓質(zhì)素免疫反應(yīng)性的方法，尤其是在膿毒癥、心臟病和癌癥診斷中，該方法中尤其借助利用至少一種特異性識別mid－proAM序列的標記抗體運作的免疫檢測法來測定包含完整前腎上腺髓質(zhì)素原(pre－proAM；SEQ ID NO1)第(45－92)氨基酸的腎上腺髓質(zhì)素原的中間區(qū)域部分肽(mid－proAM；SEQ ID NO3)。
文檔編號G01N33/68GK1759319SQ200480006345
公開日2006年4月12日 申請日期2004年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月10日
發(fā)明者A·貝格曼, J·施特魯克 申請人:B.R.A.H.M.S 股份公司