專利名稱：新的嚴重急性呼吸道綜合癥冠狀病毒蛋白及其抗體和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒蛋白及其抗體，具體的說，本發(fā)明涉及一種新的嚴重急性呼吸道綜合癥冠狀病毒蛋白或其片段，編碼該蛋白或其片段的核苷酸序列，以及該蛋白或其片段的特異性抗體和應用。
背景技術(shù)：
嚴重急性呼吸道綜合癥(severe acute respiratory syndrome，SARS)為嚴重呼吸道傳染疾病，它有急性發(fā)病，早期出現(xiàn)肺部病變，死亡率高等特點，臨床主要表現(xiàn)為肺炎，典型癥狀為發(fā)高燒(＞38℃)、干咳、呼吸急促或呼吸困難，死亡率約為5％-7％。SARS病患，中國人稱之為“非典”，已經(jīng)成為嚴重危害人類健康的世界性問題。世界衛(wèi)生組織確認一種新型的冠狀病毒為SARS的病原體，并將之命名為SARS病毒。SARS病毒為正鏈的單鏈RNA病毒，復制不經(jīng)過DNA中間體，使用標準密碼子。
目前，對于SARS病毒除了有已知蛋白如P、S、M、E、N等之外，至少還編碼預測的5個開放讀碼框架(ORF)，分別命名為X1-X5(Rota PA，ObersteMS，Monroe SS等，嚴重急性呼吸道綜合癥相關(guān)冠狀病毒的特性描述(Characterization of a novel coronavirus associated with severe acuterespiratory syndrome，Science 2003；300(5624)1394-1399)或ORF3，4，7，8，11(Marra MA，Jones SJ，Astell CR等SARS相關(guān)冠狀病毒的基因組序列(The Genome sequence of the-associated coronavirus)Science2003；300(5624)1399-1404)。但是對于這些蛋白是否存在、是否能進一步分離獲得和對于病毒感染的意義目前尚無任何報道。
目前，盡管有一些關(guān)于SARS的早期實驗室診斷技術(shù)，但其仍然存在問題，特異性高的免疫檢測技術(shù)只能檢測病人的抗病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體，由于其出現(xiàn)時間晚，發(fā)病10-14天以前的病人難以測出，使患者的及時隔離造成困難。敏感性較高的PCR技術(shù)雖然能在發(fā)病4天檢測出病毒RNA，但由于存在假陽性和假陰性的問題，其診斷的特異性仍有疑問。目前迫切需要開發(fā)和研制高特異性的早期診斷方法及試劑，特別是免疫檢測方法及試劑。
在SARS的發(fā)病機理研究方面，目前也尚存在許多疑問，特別是急性期病人出現(xiàn)的間質(zhì)性肺炎，推測自身免疫病理損傷可能發(fā)揮重要作用，但仍缺乏實驗證據(jù)和分子機理研究。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種分離的蛋白，該蛋白包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段。
如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列(genebank登記號NP-828857)為本發(fā)明所述嚴重急性呼吸道綜合癥冠狀病毒X4蛋白的全長氨基酸序列，含有122個氨基酸，計算機分析發(fā)現(xiàn)它1-17位氨基酸含有信號肽序列，101-117位氨基酸含有跨膜區(qū)序列，屬于I型膜蛋白?；驋呙?Motif Scan)分析發(fā)現(xiàn)118-121位氨基酸含有潛在的cAMP-依賴性和cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化位點；83-85和116-118位氨基酸含有潛在的PKC磷酸化位點；5-15位和57-67位氨基酸含有潛在的原核膜脂蛋白脂質(zhì)體結(jié)合位點(Prokaryoticmembrane lipoprotein lipid attachment site)；38-43和70-75位氨基酸含有潛在的N-豆蔻?；稽c。同源比較分析證明X4蛋白與粘附分子L-選擇素(L-Selectin，CD62L)在氨基酸序列上有26.2％的同源性。
針對目前尚無任何資料報道X4蛋白是否存在、能否獲得分離的X4蛋白和對于病毒感染的意義的現(xiàn)狀，本發(fā)明以實驗證明了SARS病人血清能測出抗X4蛋白的抗體(參見實施例3和4)，SASR病毒轉(zhuǎn)染的真核細胞膜上表達X4蛋白(參見實施例6)，證明了X4蛋白的表達和客觀存在。在此基礎(chǔ)上，并進一步分離和獲得了X4蛋白。進一步的功能研究證明重組X4蛋白能抑制Balb/C 3T3細胞的生長(參見實施例7)。
本發(fā)明中的X4蛋白片段是指具有部分或全部本發(fā)明X4蛋白的蛋白，它至少由20個氨基酸組成，優(yōu)選由40個以上氨基酸組成，所述片段可以與X4蛋白在功能上相同、相似或不同，優(yōu)選為與其生物學活性基本相同的蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種蛋白片段(重組X4蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列無全長X4蛋白的信號肽、跨膜區(qū)和外膜區(qū)。由于其保留了X4蛋白的主要編碼區(qū)(對應于SEQ ID NO2所示的18-100位氨基酸)，其具有與所述全長序列基本相同的生物學活性。重組X4蛋白可以代替全長X4蛋白用于檢測X4蛋白的抗體的存在，或用于功能檢測，參見實施例1和2。本發(fā)明以實驗證明了SARS病人血清能測出抗X4蛋白的抗體(參見實施例3和4)，SASR病毒轉(zhuǎn)染的真核細胞膜上表達X4蛋白(參見實施例6)，證明了X4蛋白的表達和客觀存在。功能研究證明重組X4蛋白能抑制Balb/C 3T3細胞的生長(參見實施例7)。本發(fā)明的重組蛋白與全長序列相比，不僅功能基本相同，而且可以快速、低成本制備。
本發(fā)明的SARS病毒X4蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重組產(chǎn)生。本發(fā)明的SARS病毒X4蛋白或其片段可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生。實施例1和2，是以一個重組X4蛋白作為例子，詳細描述了X4蛋白的制備過程，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，可以用X4蛋白全長序列代替該重組X4蛋白，其余條件按相同或相似條件進行，獲得X4蛋白；其它的蛋白片段也可以按相同或相似條件獲得。本發(fā)明的SARS病毒X4蛋白也可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，PierceChemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學技術(shù)合成，或者可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無細胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO1所示核苷酸序列編碼。如SEQ ID NO1所示的序列為分離自SARS病毒基因組的序列。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述的如SEQ IDNO4所示氨基酸序列的蛋白可由如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列編碼。如SEQ ID NO3所示的序列是發(fā)明人根據(jù)X4蛋白的主要編碼區(qū)設計的核苷酸序列，其適于在大腸桿菌中表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以根據(jù)不同的宿主和表達載體，設計編碼本發(fā)明的X4蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列可以用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)測定。這類核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的蛋白可以同其它的蛋白或蛋白形成融合蛋白。其它蛋白或蛋白的編碼序列一般是已知的，有些可以以載體形式購買得到，或者可以按常規(guī)方法合成或者從已知生物體中克隆得到。
本發(fā)明還提供一種單克隆抗體或多克隆抗體，該單克隆抗體或多克隆抗體與SARS病毒X4蛋白或其片段特異性結(jié)合。這里所述的“特異性”是指抗體能結(jié)合于本發(fā)明的X4蛋白基因產(chǎn)物或片段。優(yōu)選那些能與本發(fā)明的X4蛋白或其片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體也包括那些能夠結(jié)合并抑制本發(fā)明冠狀病毒X4蛋白或其片段的抗體。這種結(jié)合并抑制本發(fā)明冠狀病毒X4蛋白或其片段的抗體，可包含于用于抑制SARS病毒的藥物組合物中，用于結(jié)合并抑制本發(fā)明的冠狀病毒X4蛋白或其片段。
本發(fā)明的單克隆抗體或多克隆抗體可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法進行制備。例如，純化的本發(fā)明X4蛋白基因產(chǎn)物或其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導單克隆抗體和多克隆抗體的產(chǎn)生(參見實施例5和6)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選單克隆抗體，其可利用雜交瘤技術(shù)制備(見Kohler等人，Nature 256495；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and Tcell Hybridaomad，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的各類抗體可以利用X4蛋白基因產(chǎn)物或其片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得，這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用蛋白合成儀合成。與本發(fā)明X4蛋白的基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如，E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或蛋白)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明提供一段分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含選自(1)編碼如SEQ ID NO2所示蛋白或其片段的多核苷酸；
(2)如(1)所述的多核苷酸序列的互補序列。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，編碼本發(fā)明的X4蛋白(如SEQ ID NO2所示)的多核苷酸序列可以是DNA也可以是RNA。其中，DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。反義鏈或者其一部分(反義寡核苷酸)可用于抑制細胞內(nèi)X4蛋白的表達。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還已知，RNA序列與相對應的非模板DNA序列基本相同，只是以U(胞嘧啶)代替T(胸腺嘧啶)。本發(fā)明的多核苷酸序列還可以包括非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5′或3′端的非編碼序列等。
本發(fā)明還進一步涉及與編碼本發(fā)明X4蛋白的多核苷酸序列雜交的多核苷酸，優(yōu)選序列間存在至少有80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％同源性的多核苷酸序列?！巴葱浴笔峭ㄟ^多核苷酸序列之間核苷酸序列的比較以及保守序列核苷酸序列的數(shù)量而確定的。所述多核苷酸編碼的蛋白可以與本發(fā)明所述如SEQ ID No2所示蛋白具有相同或相似的生物學活性，也可以具有不同的生物學活性，優(yōu)選具有相同的生物學活性。特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明X4蛋白基因雜交的多核苷酸，所說的“嚴格條件”已知雜交發(fā)生在低于Tm(meliting temperature，融解溫度)5℃至低于Tm20-25℃的條件下。所述多核苷酸可以含有至少20個堿基，優(yōu)選至少30個堿基并且更優(yōu)選至少50個堿基與X4蛋白的多核苷酸雜交且與之具有如上所述同源性。
編碼本發(fā)明的X4蛋白的片段的多核苷酸也應包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。編碼所述X4蛋白片段的多核苷酸序列可以是例如，去掉信號肽、跨膜區(qū)、膜外區(qū)的序列后的主要編碼區(qū)序列，也可以是引物或者雜交探針，以用于檢測編碼本發(fā)明的X4蛋白的多核苷酸序列。所述片段編碼的蛋白可以與X4蛋白在功能上相同、相似或不同，優(yōu)選為與其生物學活性基本相同的蛋白。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還已知，當一條多核苷酸的序列確定后，按照堿基互補原則，同樣可以確定其互補序列。
在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種如SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列。經(jīng)GenBank檢索，對于如SEQ ID NO1所示核苷酸序列，在所有117株不同來源的SARS病毒毒株的序列中，只有4株(AY304493、AY351680、AY394978和AY394979)出現(xiàn)單核苷酸突變，其它未發(fā)現(xiàn)在X4蛋白編碼序列中出現(xiàn)變異，這表明X4蛋白高度保守。生物信息學的研究還發(fā)現(xiàn)，X4蛋白僅存在于SARS病毒的基因組中，其它種屬的冠狀病毒如雞、豬、牛、馬、人類及鳥類等基因組中均未發(fā)現(xiàn)X4基因，說明X4分子可能與SARS病毒的致病性密切相關(guān)。針對X4蛋白是否存在和對于病毒感染的意義尚無任何報道的現(xiàn)狀，本發(fā)明以實驗證明了SARS病人血清能測出抗X4蛋白抗體(參見實施例3和4)，SASR病毒轉(zhuǎn)染的真核細胞膜上表達X4蛋白(參見實施例6)，證明了X4蛋白的表達和客觀存在。在此基礎(chǔ)上，進一步分離并獲得了本發(fā)明的X4蛋白。
本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸序列，其核苷酸序列為如SEQ ID NO1所示或為其互補序列。
如SEQ ID NO1所示的多核苷酸為本發(fā)明全長X4蛋白(SEQ ID NO2)的編碼序列，全長369bp，編碼122個氨基酸的開放讀碼框架。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明的X4蛋白的核苷酸序列可以完全相同于如SEQ ID NO1所示的編碼序列，也可以由于遺傳密碼的簡并性，不完全等同于上述核苷酸的編碼序列。例如，根據(jù)每個具體的原核宿主或者真核宿主所使用的密碼子的頻率不同，可以選擇相應的密碼子，從而提高所述的多核苷酸在相應的宿主中表達效率。也可以為了獲得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸，如更長的半衰期，轉(zhuǎn)換密碼子。
在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種分離的多核苷酸序列，其核苷酸序列為如SEQ ID NO3所示或為其互補序列。
如SEQ ID NO3所示多核苷酸序列為不含信號肽和跨膜區(qū)的可溶性X4編碼區(qū)基因，編碼如SEQ ID NO4所示氨基酸序列的X4蛋白片段(以下稱為重組X4蛋白，該重組X4蛋白對應于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列18-100)，同時針對大腸桿菌修改了一些密碼子，以利于提高所述的多核苷酸在大腸桿菌中表達效率。在本發(fā)明的一個實施方式中，利用化學合成方法，獲得SEQ ID NO3，通過在大腸桿菌中表達，并經(jīng)離子交換層析，獲得95％以上純度蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，本發(fā)明所述的蛋白也可通過GST原核系統(tǒng)表達融合蛋白，經(jīng)親和層析純化蛋白獲得。
本發(fā)明還提供一種含有編碼本發(fā)明X4蛋白的多核苷酸的載體。按照載體的功能或用途來劃分，載體可以分為普通型載體和表達載體。其中，普通載體主要用于各種基因組文庫和cDNA文庫構(gòu)建的。表達載體主要用于研究基因的表達或是用于大量生產(chǎn)一些有用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)，有的也可用于cDNA文庫的構(gòu)建。表達載體中應含有適當?shù)膯幼?、核糖體結(jié)合位點、終止子等。為了便于表達產(chǎn)物在細胞中定位，在蛋白編碼序列上游可加入適當?shù)那皩蛄?。合適載體和啟動子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知。在細菌中適用的有效表達載體可以這樣構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當?shù)姆g起始和終止信號插入到帶有一個功能啟動子的可操縱的閱讀框中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件之載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達載體或構(gòu)建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達目的蛋白。具體地說，適用于原核細胞的市售表達載體一般均帶有可選擇標志和細胞復制原點，帶有l(wèi)acI、T7、λPL和trp等細菌啟動子，以及已知克隆載體pBR322(ATCC37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)?？筛鶕?jù)所選用的適當啟動子和待表達的結(jié)構(gòu)基因序列來選擇衍生于pBR322的適當載體。GST原核表達系統(tǒng)也可用于本發(fā)明。適用于真核細胞的載體帶有真核細胞啟動子如CMV、SV40等，這樣的載體包括pMT-hIL-3(馬大龍，狄春輝，龐健等(1991)高技術(shù)通訊1126-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本發(fā)明的一個實施方式中(參見實施例1)，本發(fā)明的重組X4蛋白的多核苷酸序列是利用將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體中(Promega)，進行純化測序；在本發(fā)明的另一個實施方式中(參見實施例1)采用大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEX-4T-1(AmershamPharmacia Biotech)，構(gòu)建本發(fā)明攜帶重組X4蛋白的表達載體pGEX-X4。
本發(fā)明同時提供一種適于表達本發(fā)明蛋白的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動物細胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細胞系，Gluzman(Cell 23175，1981)及其它的能表達相容載體的細胞系。將構(gòu)建體導入上述宿主細胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，包括但不限于氯化鈣介導的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F(xiàn).M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，813655-3659)。在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當?shù)募毎芏戎螅眠m當?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞選擇以及所表達的目的蛋白的性質(zhì)相應的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方式中(參見實施例1)，采用大腸桿菌XL-1Blue菌和DH5α作為宿主細胞。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)蛋白的方法，其包括以下步驟(1)在適于表達的條件下，培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸的宿主細胞；(2)從細胞培養(yǎng)物中獲得多核苷酸編碼的蛋白。
具體地說，在轉(zhuǎn)化宿主細胞并在被轉(zhuǎn)化的宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用適當?shù)姆椒?如溫度變動或化學物質(zhì)誘導)誘導啟動子，然后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，可用離心法收集細胞，并用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細胞?？梢杂酶鞣N已知的方法從宿主細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的X4蛋白或其片段的蛋白或融合蛋白，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。在本發(fā)明的一個實施方式中，(參見實施例2)，采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱梯度洗脫。
本發(fā)明還提供一種檢測本發(fā)明的X4蛋白或其片段的方法，該方法為免疫熒光方法或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。免疫熒光方法是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光方法又分為直接法、間接法和補體法。在本發(fā)明中優(yōu)選直接免疫熒光試驗或間接免疫熒光試驗。在本發(fā)明的一個實施方式中，利用熒光素標記的抗X4蛋白全長或其片段的單克隆抗體或多克隆抗體，檢測本發(fā)明的X4蛋白或其片段。
本發(fā)明還提供一種檢測本發(fā)明X4蛋白的特異性抗體的方法，所述方法為免疫印跡法或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。免疫印跡法(immunoblotting test，IBT)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法，因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法Southern blot相類似，亦被稱為Western blot。主要方法分三階段第一階段為抗原等蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；第二階段為電轉(zhuǎn)移將在凝膠中已分離的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三階段為顯色檢測硝酸纖維素膜(相當于包被了抗原的固相載體)，依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成顯色物的酶反應底物，使條帶染色。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horserad-ish Peroxidase，HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosphatease，AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本發(fā)明的一個實施方式中，選用堿性磷酸酶(參見實施例3)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于臨苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS等。堿性磷酸酶的底物一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)，在本發(fā)明的一個實施方式中，采用NBT(氮藍四唑)。常用的酶標第二抗體已有市售。在本發(fā)明的一個實施方式中，可以使用全長X4蛋白，或其重組片段作為抗原，檢測本發(fā)明X4蛋白的特異性抗體的方法。具體方法參見實施例3和4。
本發(fā)明提供一種體外檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的方法，其為體外檢測待測樣品中本發(fā)明的X4蛋白或其片段，和/或體外檢測待測樣品中本發(fā)明的X4蛋白或其片段的特異性抗體?？蓮牟∪说捏w液中，如血液、尿液、唾液、咽試子、活體或尸檢材料中得到用于診斷試驗的樣品，優(yōu)選血液。本發(fā)明通過大量的實驗，證明了SARS病人血清能測出抗X4蛋白抗體(參見實施例3和4)，SASR病毒轉(zhuǎn)染的真核細胞膜上表達X4蛋白(參見實施例6)，從而，提供了一種體外檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的方法。
所述體外檢測來自待測樣品的本發(fā)明的蛋白的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，放射免疫法、競爭性結(jié)合法、免疫印跡法、ELISA及免疫熒光法等。在本發(fā)明的一個實施方式中，利用免疫熒光法體外檢測待測樣品中本發(fā)明所述的X4蛋白或其片段，優(yōu)選間接免疫熒光試驗或直接免疫熒光試驗。在本發(fā)明實施例6中，利用熒光素標記的抗X4蛋白全長或其片段的單克隆抗體或多克隆抗體，檢測外周血細胞膜的X4蛋白表達，或檢測咽試子中X4蛋白的存在。體外檢測待測樣品中本發(fā)明所述的X4蛋白或其片段可能更具早期診斷價值，因抗原應該先于抗體產(chǎn)生。
由于X4抗原的出現(xiàn)先于病毒裂解宿主細胞，X4蛋白的特異性抗體可能早于病毒結(jié)構(gòu)蛋白的特異性抗體的出現(xiàn)。因而，X4蛋白抗體具有很重要早期診斷價值(初步預實驗已經(jīng)證明X4抗體可以先于抗病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體出現(xiàn)，參見實施例4)。所述體外檢測待檢樣品中本發(fā)明X4蛋白或其片段的特異性抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，放射免疫法、競爭性結(jié)合法、免疫印跡法、ELISA及免疫熒光法等。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，采用免疫印跡法，檢測不同發(fā)病時期病人血清中針對X4蛋白的IgG、IgM、IgA抗體，這些抗體的出現(xiàn)早于針對病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體。作為本發(fā)明的抗原的蛋白可以是X4全長的氨基酸序列，也可以是其活性片段，如SEQ ID NO4所述的重組X4序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，分別采用的全菌裂解物和含有如SEQ IDNO4所述的重組X4序列的純化蛋白樣品作為抗原，檢測抗X4蛋白的特異性抗體的存在。在本發(fā)明的另一個實施方式中，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA間接法)，早期檢測正常人和SARS患者血清中抗X4蛋白的抗體。
本發(fā)明還提供一種體外檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的試劑盒，其含有本發(fā)明X4蛋白或其片段，和/或X4蛋白或其片段的特異性抗體。
本發(fā)明對于SARS的診斷、治療、以及發(fā)病機理的研究提供了新的思路。本發(fā)明的實驗已經(jīng)證明，SARS病毒感染細胞后，X4蛋白確實能在SARS病毒感染的早期出現(xiàn)，且在宿主細胞膜上表達(參見實施例6)，從而成為機體免疫系統(tǒng)攻擊的早期目標，并且殃及宿主細胞，引發(fā)機體對病毒感染細胞的自身免疫損傷。X4蛋白的功能研究表明，重組的X4蛋白能夠抑制Balb/C 3T3細胞的生長(參見實施例7)，說明宿主細胞表面的X4蛋白以及從細胞脫落的可溶性X4蛋白本身對宿主細胞有直接的病理作用，這可能與SARS疾病的進展和疾病的恢復密切相關(guān)。本發(fā)明的研究對SARS免疫病理機制的研究具有重要的理論意義，同時也具有針對性治療意義。例如，采用X4蛋白的拮抗劑可以抑制X4蛋白的功能，從而阻斷其生物學活性，達到治療和/或輔助治療的目的。


圖1顯示pGEX-X4表達質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖2顯示X4蛋白的PCR產(chǎn)物結(jié)果圖。其中，1DL2000分子量標準；2X4蛋白的PCR產(chǎn)物。
圖3顯示pGEM-X4鑒定結(jié)果圖。其中，1和4DL2000分子量標準；2pGEM-X4-1 PCR鑒定；3pGEM-X4-2 PCR鑒定；5pGEM-X4-1酶切鑒定；6pGEM-X4-2酶切鑒定。
圖4為經(jīng)過BamHI-SalI酶切的pGEX-4T-1和pGEM-X4。其中，1λ-HindIII分子量標準；2BamHI-SalI切的pGEX-4T-1；3BamHI-SalI切的X4片段；4DL2 000分子量標準。
圖5為pGEX-X4的BamHI-SalI雙酶切結(jié)果。其中，1DL2000分子量標準；2-5pGEX-X4的4個不同克隆。
圖6為pGEX-X4(DH5α)誘導表達后的SDS-PAGE圖。其中11-4和5-9單獨誘導的個克??；5蛋白分子量標準；10誘導前樣品。
圖7為IPTG誘導后，收獲的包涵體進行的SDS-PAGE圖。其中，1分子量標準；2誘導1小時；3誘導2小時；4誘導3小時；5誘導4小時；6誘導前。
圖8為柱層析后，目的蛋白的SDS-PAGE圖。其中，1分子量標準；210％NaCl洗脫峰310％NaCl洗脫峰；4包涵體；5誘導后的菌；6誘導前的菌；7空載體誘導。
圖9A-圖9C分別為pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物電泳后與三個康復期病人血清進行Western-blot結(jié)果示意圖。
圖10A為全菌裂解物和純化的GST-X4蛋白與急性期病人血清做Western-blot結(jié)果示意圖；圖10B為全菌裂解物和純化的GST-X4蛋白與康復期病人做Western-blot結(jié)果示意圖。其中，1為pGEX-4T-1(DH5α)誘導后樣品(對照)；2為pGEX-X4(DH5α)誘導后樣品；3為純化的GST-X4蛋白樣品。
圖11為不同克隆的鼠抗X4蛋白的單克隆抗體與重組的X4蛋白反應的Western-blot結(jié)果示意圖。8A5、4A2、8H6分別代表分泌抗X4蛋白的單克隆抗體的不同克隆株，陽性對照為鼠抗X4蛋白多克隆抗體。
圖12為間接免疫熒光檢測X4蛋白在SARS病毒感染VERO-E6細胞后表達和定位的示意圖。其中A對照；B-E分別為SARS病毒感染Vero E6細胞系8小時、16小時、30小時、40小時和48小時后，間接免疫熒光試驗結(jié)果。
圖13為重組X4蛋白抑制Balb/C 3T3細胞生長的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。所用試劑如未標明，則為Sigma公司產(chǎn)品或為國產(chǎn)分析純生化試劑。
實施例1 X4蛋白在大腸桿菌中的表達一、方法1、DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化等均為常規(guī)分子生物學操作。構(gòu)建流程示意圖參見圖1。
2、X4蛋白基因的全合成根據(jù)生物信息學分析的結(jié)果，X4蛋白基因序列如SEQ NO.1所示。去掉信號肽、跨膜區(qū)、膜外區(qū)，并針對大腸桿菌修改了一些密碼子之后的序列如SEQ NO.3所示。根據(jù)此序列，合成互補的4個片段，并利用片段互補PCR技術(shù)擴增出了用于大腸桿菌表達的X4基因片段，具體方法如下PCR反應體系Pyrobest DNA聚合酶(購自TAKARA公司)0.4ul10×Pyrobest Buffer10ul dNTP(2.5mM)8ulX1(SEQ NO.5)0.5ulX2(SEQ NO.6)0.5ulX3(SEQ NO.7)0.5ulX4(SEQ NO.8)0.5ulX5-1(SEQ NO.9)3ulX3-1(SEQ NO.10)3ulH2O73.6ulX15′--ATgTATCACTATCAggAgTgCgTTCgCggTACgACCgTTCTACTCAAAgAACCgTgCCCgTCCggCACgTACgAAggCA--3′(SEQ ID NO5)X25′--gTgggTgCTggTgCAggTCAgTgCAAATTTgTTgTCAgCCAgCgggTgAAATggggAgTTgCCTTCgTACgTgCCggAC--3′(SEQ ID NO6)X35′--TgACCTgCACCAgCACCCACTTTgCTTTTgCTTgCgCTgACggTACCCGTCACACCTATCAgCTgCgTgCACgTTCCgT--3′(SEQ ID NO7)X45′--TTATggAgAgTACAgCTCCTgCTgAACCTCCTCCTgACggATgAACAgTTTCggggAAACggAACgTgCACgCAgCTg--3′(SEQ ID NO8)X5-15′--ggATCCTATCACTATCAggAg--3′(SEQ ID NO9)X3-15′--gTCgACTTATggAgAgTACAgCT--3′(SEQ ID NO10)所用核酸片段及PCR引物由北京賽百盛公司合成。
PCR擴增參數(shù)為94℃，1min；94℃，30s；60℃，45s；72℃，20s；25個循環(huán)；最后72℃延伸15min；在最后延伸前加入少許的普通Taq酶(購自鼎國生物)和dATP(PCR產(chǎn)物加A末端)。跑電泳，并純化出260bp左右的片段。PCR結(jié)果如圖2所示。
3、PCR產(chǎn)物克隆、測序?qū)⒓兓腜CR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，并提取質(zhì)粒，用BamHI-SalI雙酶切和PCR方法進行鑒定(鑒定結(jié)果見圖3)，并陽性克隆測序獲得序列正確的克隆。
4、pGEX-X4表達質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒載體pGEX-4T-1(購自AmershamPharmacia Biotechp)和序列正確的pGEM-X4分別用BamHI、SalI(均購自TAKARA公司)雙酶切，采用DNA片段快速回收試劑盒(購自鼎國生物)回收片段(參見圖4)，并進行連接；轉(zhuǎn)化XL1-Blue(購自鼎國生物)感受態(tài)細胞后采用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?購自博大泰克)提取質(zhì)粒，用酶切方法鑒定陽性克隆(參見圖5)，獲得pGEX-X4陽性質(zhì)粒。
5、GST-X4融合蛋白在大腸桿菌中誘導表達將構(gòu)建好的pGEX-X4轉(zhuǎn)化到DH5α(購自鼎國生物)感受態(tài)細胞中，挑取單克隆分別接種含有相應抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)后，以1∶100分別稀釋至含AMP(100mg/l)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.4-0.6，加入誘導劑IPTG(購自Merck公司)至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，4℃5000g10min離心收集菌體。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測GST-X4的表達情況。融合蛋白的表達量，占大腸桿菌總可溶性蛋白的10％左右。pGEX-X4(DH5α)誘導表達后的SDS-PAGE可以參見圖6。
6、表達產(chǎn)物的可溶性分析用Tris-HCl(pH8.5)20mmol/L的EDTA緩沖液懸浮經(jīng)IPTG誘導的pGEX-X4的菌體，超聲波破碎后，4℃10000g離心10min，分別收集上清液和沉淀。SDS-PAGE檢測表達蛋白是否以可溶的形式存在。
二、結(jié)果用搖瓶培養(yǎng)工程菌株，在對數(shù)生長后期加入IPTG誘導，誘導4小時后，表達量達到10％以上。在誘導表達過程中，菌體濃度一直呈增長趨勢。按上述優(yōu)化的表達條件，用多個搖瓶分批培養(yǎng)。
實施例2 表達蛋白的分離純化一、方法將表達的菌體收集后，用20mmol/LTris-HCl(pH8.5)5mmol/L的EDTA緩沖液懸?。唤?jīng)超聲波破碎，離心后的沉淀部分為待純化樣品。
1、包涵體的洗滌洗滌緩沖液50mmol/LTris-HCl(pH8.5)5mmol/L的EDTA 1％TritonX-1001mol/L尿素緩沖液
2、包涵體變性將粗提后的樣品溶解在盡量少的變性緩沖液(50mmol/L Tris-ClpH8.5，8mol/L尿素，1μl/mlβ-ME或10mmol/L DTT)中，37℃放置0.5-1小時，離心，去沉淀，上清即為包涵體變性液。
3、包涵體的復性將變性包涵體用復性液(20mmol/L Tris-HCl pH8.5)稀釋10倍，室溫復性4小時，加入凝血酶(2000U/ml)每1mg變性蛋白加20U凝血酶，室溫復性過夜。
4、柱層析純化采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(2.6cm*20cm)，20mmol/LTris-Cl pH8.5平衡5-10個柱床體積，將復性液上柱，用相同的緩沖液流洗至基線；然后改用含1M NaCl的20mmol/L Tris-Cl pH8.5緩沖液進行線性梯度洗脫，流速20ml/min，收集蛋白峰。
二、結(jié)果1、包涵體的分離和初步純化目的蛋白在菌體中主要以包涵體形式表達，用含去污劑的緩沖液洗滌菌體裂解液，離心獲得的沉淀，除去一部分雜蛋白。收獲的包涵體經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達到70％以上。
2、蛋白的變性和復性將10g(濕重)包涵體用100mL 8mol/L脲的緩沖液充分溶解，高速離心后，取上清用稀釋法復性。
3、酶切結(jié)果按每毫克變性蛋白加20U的凝血酶(2000U/ml)。SDS-PAGE表明融合蛋白部分被全部切開。
4、柱層析純化結(jié)果復性液采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱線性梯度洗脫，10％NaCl梯度時出現(xiàn)一個洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE分析，為目的蛋白峰，純度達到95％以上。結(jié)果參見圖7、圖8。
實施例3免疫印跡檢測血清中抗X4蛋白的特異性抗體一、試劑1)電轉(zhuǎn)液(15.6mmol/L Tris-HCl 120mmol/L甘氨酸pH8.4)2)封閉液(5％牛血清白蛋白)3)堿性磷酸酶顯色液(100mmol/L NaCl 50mmol/L MgCl2100mmol/LTris-HCl pH9.5)4)2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)5)氮藍四銼(NBT)6)一抗(患者血清)，二抗(堿性磷酸酶標記抗人IgG)7)TBST(10mmol/L Tris-HCl 150mmolNaCl 0.1％Tween 20)二、方法(一)pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物與三個康復期病人血清進行Western-blot1、pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳跑2/3下膠，量膠的長度寬度，浸入電轉(zhuǎn)液中10min。
2、按膠的大小剪硝酸纖維膜，濾紙(稍大)6層，也浸入電轉(zhuǎn)液中。
3、用半轉(zhuǎn)干儀器先放三層濾紙，放中不要有氣泡。
4、電壓22V 160A 20min開始。
5、5％脫脂粉浸泡，4℃封閉，過夜。
6、分別加入三個康復期病人血清(K1、k2和K3)(即理論上一抗)+TBST+0.1％Tween20(1∶5000)2h。
7、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
8、加入二抗+TBST+0.1％Tween20(1∶7500)2h。
9、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
10、66μl氮藍四銼(NBT)溶液同10ml堿性磷酸酶顯色液充分混勻后加入33μl 2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)溶液，顯色。
(二)全菌裂解物和純化的GST-X4蛋白與急性期和康復期病人血清做Western-blot1、分別以全菌裂解物和純化的GST-X4蛋白作為抗原，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳跑2/3下膠，量膠的長度寬度，浸入電轉(zhuǎn)液中10min。
2、按膠的大小剪硝酸纖維膜，濾紙(稍大)6層，也浸入電轉(zhuǎn)液中。
3、用半轉(zhuǎn)干儀器先放三層濾紙，放中不要有氣泡。
4、電壓22V 160A 20min開始。
5、5％脫脂粉浸泡，4℃封閉，過夜。
6、分別加入急性期和康復期病人血清(即理論上一抗)+TBST+0.1％Tween20(1∶5000)2h。
7、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
8、加入二抗+TBST+0.1％Tween20(1∶7500)2h。
9、TBST+0.1％Tween 20洗3次/10min。
10、66μl氮藍四銼(NBT)溶液同10ml堿性磷酸酶顯色液充分混勻后加入33μl 2，5-二溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)溶液，顯色。
二、結(jié)果1、pGEX-X4(DH5α)全菌裂解物與三個康復期病人血清進行Western-blot實驗結(jié)果顯示(參見圖9A-圖9C)，在康復期病人血清中可以檢測到抗X4蛋白的特異性抗體存在。
2、全菌裂解物和純化的GST-X4蛋白與急性期和康復期病人血清做Western-blot結(jié)果參見圖10A和圖10B，實驗結(jié)果顯示，急性期病人血清和康復期病人血清中可以檢測到抗X4蛋白的抗體，而且與全菌裂解物中GST-X4和純化的GST-X4結(jié)合，兩例病人血清中均產(chǎn)生了抗X4蛋白的抗體。
實施例4 利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA間接法)，早期檢測正常人和SARS患者血清中抗X4蛋白的抗體一、試劑1)包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液pH9.6)2)封閉液(5％牛血清白蛋白/PBS溶液)3)洗滌液(PBS-T PH7.4)4)標本稀釋液(PBS，PH7.4)5)酶標第二抗體(辣根酶標記抗人IgG)6)底物液A(OPD-H2O2溶液)A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)B液(0.2mol/LNa2HPO4)臨用前取A液4.86ml+B液5.14ml混合，加入OPD(鄰苯二胺)4mg，待充分溶解后加入30％(V/V)的H2O250ml7)終止液(2mol/L H2SO4溶液)
二、方法1、包被pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋至5ug/ml 150ul/孔，置于4℃過夜。
2、次日洗滌3次/孔，洗液為PBS-T。
3、封閉每孔加封閉液BSA，200ul/孔置37℃2小時。
4、稀釋樣品陰性對照為正常人血清；樣品稀釋度為1∶200，取60ul血清置于12ml PBS。
5、加樣每孔150ul；空白對照加入樣品稀釋液(PBS)置于37℃1小時30分。
6、洗滌(1)5次/孔。洗滌液PBS-T。
(2)加入酶標抗體IgG 150ul/孔，空白加入稀釋液，其中IgG為1∶500稀釋，置于37℃1小時。
7、加入底物顯色液(1)先洗滌5次/孔。
(2)加底物液(鄰苯二胺)150ul/孔，底物液用前加入H2O2100ul/ml，避光顯色15分鐘，37℃。
8、終止加入150ul終止液(濃H2SO4)；在490nm處檢測OD值，分析試驗結(jié)果。
三、結(jié)果通過檢測正常人和SARS患者血清中抗X4抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1、正常人血清中抗X4抗體為陰性；2、患者A，4月5日發(fā)病，4月7日入院治療，分別在4月10日、4月14日、4月22日進行血清抗體檢測。用其他方法檢測血清中的IgG抗體，4月22日為陽性，4月10日和4月14日為陰性，用本方法同樣檢測，4月10日和4月14日檢測血清抗體為陽性，即入院治療3天后即可檢測出抗體陽性，比其他方法提前12天做出診斷；3、患者B，4月1日發(fā)病，4月3日入院治療，分別在4月7日、4月9日、4月21日、4月29日和5月6日進行血清抗體檢測。用其他方法檢測血清中的IgG抗體，4月21日、4月29日、5月6日為陽性，4月7日和4月9日為陰性，用本方法同樣檢測血清抗體，4月9日檢測抗體為陽性，即入院治療6天后即可檢測出抗體陽性，也比其他方法提前12天做出診斷；4、用其他方法檢測的SARS患者血清為陽性者，用本方法檢測同樣為陽性。
實施例5鼠抗X4蛋白單克隆抗體的制備一、方法1、動物免疫將重組X4蛋白與等體積的弗氏佐劑混合制成油包水乳劑，每只小鼠腹腔注射0.5ml上述混合液(含X4蛋白100μg)，共注射5只小鼠。兩周后同劑量抗原加弗氏不完全佐劑加強免疫，7天后以間接ELISA(波長為490nm)檢測小鼠血清X4蛋白多抗的效價，效價高者靜脈再追加免疫1次，每只20μg，3天后進行細胞融合。
2、細胞融合將X4蛋白加強免疫的小鼠在3天后無菌取脾，制備成單個細胞懸液，與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0以5∶1的比例在PEG1500作用下融合，融合按常規(guī)法，PEG用1ml，1分鐘內(nèi)緩慢加完，反應時間為90秒，無血清的RPMI 1640終止反應，1000rpm離心10min，HAT完全1640培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度至1×106/ml，加入已預先鋪有飼養(yǎng)細胞(Balb/c小鼠的腹腔M)的96孔平底板，100μl/孔，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天觀察并換液，10天后以HT1640培養(yǎng)基換液，1周后換完全1640培養(yǎng)基。
3、間接ELISA法篩選以重組X4蛋白(1μg/ml)包被酶標96孔板，37℃反應2小時或4℃過夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封閉，4℃過夜，加入待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時，SP2/0細胞培養(yǎng)上清為陰性對照；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 37℃孵育1小時；鄰苯二胺(OPD)底物液顯色10-15min，2M H2SO4終止反應。每步完成均用含0.05％Tween 20的PBS充分洗滌，ELISA Reader測OD490值。所測的OD490值比陰性對照高5倍的克隆，進行亞克隆化，并進行擴增凍存。
4、克隆化-采用有限稀釋法細胞以含IL-6(300U/ml)的HT1640培養(yǎng)基稀釋至每孔1個細胞，鋪于U型96孔板，4小時內(nèi)鏡下觀察每孔實際細胞數(shù)，記錄單個細胞孔，待其長成克隆且ELISA鑒定抗體分泌呈陽性，即獲得單抗分泌株，大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克隆化鑒定之。
5、制備單抗腹水12周齡以上的Balb/c小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml不完全弗氏佐劑，7天后每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml含4×106的雜交瘤細胞，7-10天后視小鼠腹部膨脹程度收集腹水，4℃離心，2500rpm離心20min，上清放置-20℃分裝保存?zhèn)溆谩?br> 二、結(jié)果利用重組的X4蛋白免疫小鼠，經(jīng)2次細胞融合、克隆篩選和亞克隆化，建立了3株穩(wěn)定分泌抗X4蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為8A5、4A2、8H6。免疫印跡實驗證明這些雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體能夠與X4蛋白特異性結(jié)合(圖11)，腹腔接種給Balb/c小鼠后可以形成腫瘤，并穩(wěn)定地產(chǎn)生特異性抗體，腹水抗體的效價為1∶105(良1)。
表1間接ELISA檢測小鼠腹水中X4單克隆抗體的滴度8A5 4A2 8H6 Sp2/01∶1031.5751.2251.3250.0451∶1040.4640.6120.4940.0561∶1050.1790.2200.1540.0731∶1060.1170.1120.0910.059實施例6雞抗X4蛋白多克隆抗體的制備和間接免疫熒光實驗一、方法1、雞抗X4蛋白多克隆抗體的制備將純化的重組X4蛋白100ug/只與等量的完全弗氏佐劑混合，多點注射在雞的兩側(cè)胸大肌上，2～3周后，同劑量的X4蛋白加弗氏不完全佐劑加強注射，一周后雞翅放血，利用間接EIISA檢測雞血清中X4多抗的效價。
2、間接免疫熒光試驗檢測X4蛋白在感染宿主細胞中的表達和定位將SARS病毒株F69感染Vero E6細胞系，取不同時間(8小時、16小時、30小時、40小時和48小時)感染的Vero E6細胞鋪在潔凈的載玻片上，-20℃丙酮固定30分鐘，加入雞抗X4蛋白的抗血清(1∶50)，37℃反應1小時，PBS洗3次，然后加入FITC標記的羊抗雞IgY，37℃反應30分鐘，PBS洗3次，共聚焦顯微鏡下觀察X4蛋白的表達和定位。
二、結(jié)果間接ELISA結(jié)果和免疫印跡的結(jié)果證明，雞抗X4蛋白的多克隆抗體能夠特異識別重組的X4蛋白，該抗體可以用于ELISA、Western Blot以及免疫熒光試驗。間接免疫熒光的結(jié)果證明，X4蛋白主要表達在SARS病毒感染的宿主細胞膜的表面，且在感染的早期(感染8小時)即有表達，部分細胞的胞漿中也有表達(見圖12)。說明SARS病毒感染宿主細胞后，X4蛋白能夠轉(zhuǎn)錄并在細胞膜的表面表達，利用X4抗體能夠檢測到細胞膜表面的X4蛋白。
實施例7利用MTT實驗檢測X4蛋白的抑制細胞生長活性一、方法將正常培養(yǎng)的Balb/C 3T3細胞鋪在96孔板中(2000細胞/孔)，分別加入不同濃度的重組X4蛋白(0.156μg/ml，0.312μg/ml，0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml)，每個蛋白濃度設3個重復孔。培養(yǎng)4天后，每孔加入終濃度為0.5mg/ml的MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)5小時后，用ELISA自動分析儀570nm波長下測定光吸收值(OD570nm)。
二、結(jié)果MTT分析的結(jié)果證明(見圖13)，重組X4蛋白能夠明顯抑制Balb/C 3T3細胞的生長，并呈濃度依賴性關(guān)系。
宿主細胞表面的X4蛋白以及從細胞脫落的可溶性X4蛋白本身對宿主細胞有直接的病理作用，這可能與SARS疾病的進展和疾病的恢復密切相關(guān)。本發(fā)明的研究對SARS免疫病理機制的研究具有重要的理論意義，同時也具有針對性治療意義。例如，采用X4蛋白的拮抗劑可以抑制X4蛋白的功能，從而阻斷其生物學活性，達到治療和/或輔助治療的目的。
應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述描述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本申請權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
序列表<110>北京大學北京北醫(yī)聯(lián)合生物工程有限公司北京地壇醫(yī)院<120>新的嚴重急性呼吸道綜合癥冠狀病毒蛋白及其抗體和應用<130>D0403056F<150>CN 03142562.3<151>2003-06-16<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>369<212>DNA<213>SARS病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(366)<223>
<400>1atg aaa att att ctc ttc ctg aca ttg att gta ttt aca tct tgc gag48Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15cta tat cac tat cag gag tgt gtt aga ggt acg act gta cta cta aaa96Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30gaa cct tgc cca tca gga aca tac gag ggc aat tca cca ttt cac cct144Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45ctt gct gac aat aaa ttt gca cta act tgc act agc aca cac ttt gct192Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60ttt gct tgt gct gac ggt act cga cat acc tat cag ctg cgt gca aga240Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80tca gtt tca cca aaa ctt ttc atc aga caa gag gag gtt caa caa gag288
Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu85 90 95ctc tac tcg cca ctt ttt ctc att gtt gct gct cta gta ttt tta ata336Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110ctt tgc ttc acc att aag aga aag aca gaa tga369Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120<210>2<211>122<212>PRT<213>SARS病毒<400>2Met Lys Ile Ile Leu Phe Leu Thr Leu Ile Val Phe Thr Ser Cys Glu1 5 10 15Leu Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys20 25 30Glu Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro35 40 45Leu Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala50 55 60Phe Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg65 70 75 80Ser Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu85 90 95Leu Tyr Ser Pro Leu Phe Leu Ile Val Ala Ala Leu Val Phe Leu Ile100 105 110Leu Cys Phe Thr Ile Lys Arg Lys Thr Glu115 120<210>3<211>252<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>重組X4蛋白<220>
<221>CDS<222>(1)..(249)<223>
<400>3tat cac tat cag gag tgc gtt cgc ggt acg acc gtt cta ctc aaa gaa48Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys Glu1 5 10 15ccg tgc ccg tcc ggc acg tac gaa ggc aac tcc cca ttt cac ccg ctg96Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu20 25 30gct gac aac aaa ttt gca ctg acc tgc acc agc acc cac ttt gct ttt144Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala Phe35 40 45gct tgc gct gac ggt acc cgt cac acc tat cag ctg cgt gca cgt tcc192Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg Ser50 55 60gtt tcc ccg aaa ctg ttc atc cgt cag gag gag gtt cag cag gag ctg240Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu Leu65 70 75 80tac tct cca taa252Tyr Ser Pro<210>4<211>83<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重組X4蛋白<400>4Tyr His Tyr Gln Glu Cys Val Arg Gly Thr Thr Val Leu Leu Lys Glu1 5 10 15Pro Cys Pro Ser Gly Thr Tyr Glu Gly Asn Ser Pro Phe His Pro Leu20 25 30
Ala Asp Asn Lys Phe Ala Leu Thr Cys Thr Ser Thr His Phe Ala Phe35 40 45Ala Cys Ala Asp Gly Thr Arg His Thr Tyr Gln Leu Arg Ala Arg Ser50 55 60Val Ser Pro Lys Leu Phe Ile Arg Gln Glu Glu Val Gln Gln Glu Leu65 70 75 80Tyr Ser Pro<210>5<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重組X4蛋白的片段X1<400>5atgtatcact atcaggagtg cgttcgcggt acgaccgttc tactcaaaga accgtgcccg60tccggcacgt acgaaggca 79<210>6<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重組X4蛋白的片段X2<400>6gtgggtgctg gtgcaggtca gtgcaaattt gttgtcagcc agcgggtgaa atggggagtt60gcct tcgtac gtgccggac79<210>7<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重組X4蛋白的片段X3
<400>7tgacctgcac cagcacccac tttgcttttg cttgcgctga cggtacccgt cacacctatc60agctgcgtgc acgttccgt 79<210>8<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于合成重組X4蛋白的片段X4<400>8ttatggagag tacagctcct gctgaacctc ctcctgacgg atgaacagt ttcggggaaac 60ggaacgtgca cgcagctg 78<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物X5-1<400>9ggatcctatc actatcagga g 21<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物X3-1<400>10gtcgacttat ggagagtaca gct2權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白，該蛋白包含如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其片段。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白，該蛋白由如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，該蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白，該蛋白片段由如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列編碼。
6.一種單克隆抗體或多克隆抗體，該單克隆抗體或多克隆抗體與權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白特異性結(jié)合。
7.一段分離的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含選自(1)編碼如SEQ ID NO2所示蛋白或其片段的多核苷酸；(2)如(1)所述的多核苷酸序列的互補序列。
8.如權(quán)利要求7所述的多核苷酸，其核苷酸序列為如SEQ ID NO1所示或為其互補序列。
9.如權(quán)利要求7所述的多核苷酸，其核苷酸序列為如SEQ ID NO3所示或為其互補序列。
10.一種檢測如權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白的方法，該方法為免疫熒光方法或ELISA方法。
11.一種檢測如權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白的特異性抗體的方法，該方法為利用如權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白采用免疫印跡法或ELISA方法檢測。
12.一種體外檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的方法，其為體外檢測待測樣品中權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白，和/或體外檢測待測樣品中權(quán)利要求1-5任一項所述的蛋白的特異性抗體。
13.一種檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的試劑盒，其含有如權(quán)利要求1-5任一項所述蛋白，和/或如權(quán)利要求1-5任一項所述蛋白的特異性抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的嚴重急性呼吸道綜合癥冠狀病毒X4蛋白及其片段，編碼該蛋白及其片段的核苷酸序列，以及該蛋白及其片段的特異性單克隆抗體和多克隆抗體。本發(fā)明還涉及一種體外檢測嚴重急性呼吸道綜合癥的方法，其為體外檢測待測樣品中本發(fā)明的X4蛋白或其片段，和/或體外檢測本發(fā)明X4蛋白或其片段的特異性抗體。本發(fā)明進一步提供一種試劑盒，其含有本發(fā)明X4蛋白或其片段，和/或本發(fā)明X4蛋白或其片段的特異性抗體。本發(fā)明對于SARS的診斷、治療以及發(fā)病機理的研究提供了新的思路。
文檔編號G01N33/68GK1572799SQ20041004604
公開日2005年2月2日 申請日期2004年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者馬大龍, 陳英玉, 雙寶, 劉順愛, 韓普, 朱仁英, 宋泉聲, 張劍平 申請人:北京大學, 北京北醫(yī)聯(lián)合生物工程有限公司, 北京地壇醫(yī)院