專利名稱：心梗快速診斷盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種用于診斷急性心肌梗塞(急性心梗)的試劑盒。
背景技術(shù)：
心血管類疾病歷來是人們健康的大敵。近年來，隨著生活水平的提高及工作社會壓力的不斷加大，心血管疾病的發(fā)病率歷年增加，心臟病已成為僅次于癌癥的第二大死亡原因。在心臟病中尤其是心絞痛和心肌梗塞等缺血性心臟病的增加特別顯著，大約占了因心臟病死亡的人數(shù)的4成。
對于急性心?；颊?，搶救生命必須分秒必爭。目前最主要的搶救措施是溶栓治療，而溶栓治療者的存活率取決于壞死面積的大小，患者越快得到治療，存活的機率就越高。如果能在發(fā)病的4-6小時治療，患者康復(fù)的機會很大，如果過了6小時，往往再搶救也來不及了。
早期治療的成功關(guān)鍵取決于對急性心梗的早期快速診斷。目前臨床上除根據(jù)臨床癥狀、心電圖分析外，還使用CK-MB、肌鈣蛋白I和T、肌紅蛋白這幾個指標(biāo)。這些手段各有優(yōu)勢，但也各有明顯的缺限。部分病人的臨床癥狀不典型，心電圖變化不明顯，單靠臨床癥狀和心電圖不能作出全面肯定的診斷。CK-MB陽性檢出率太低；肌紅蛋白雖可測出發(fā)病早期的病人，但不特異；肌鈣蛋白I和T是目前臨床上的金標(biāo)準(zhǔn)，以其高準(zhǔn)確率見勝，但他們最大的缺點是只能在發(fā)病六小時以后測出，六小時之內(nèi)基本無效，這就往往使病人失去了六小時之內(nèi)最佳的治療時間。
肌紅蛋白(Mb)是另一種小分子(18KDa)蛋白質(zhì)，其血漿動力學(xué)與FABP相似，可在心梗后2-3h出現(xiàn)于血中，也是急性心肌梗塞(AMI)早期檢測的有用指標(biāo)，但由于Mb在骨胳肌中含量較高，因而缺乏特異性，其含量升高不能區(qū)分是來源于骨骼肌還是心肌。心臟肌鈣蛋白I和T(cTnI和cTnT)和肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB)對心肌損傷有較好的特異性，但對AMI早期診斷不佳，因其在AMI發(fā)生后6-8h才使血中濃度升高。
心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)是一組至少由6種不同相對分子質(zhì)量組成的蛋白質(zhì)(14,000～15,000道爾頓)，存在不同臟器中，心臟中的FABP和肝、小腸中的有明顯區(qū)別。它被認(rèn)為是重要的脂肪酸載體蛋白，不僅在脂酸酸代謝中起作用，而且在心臟中的能量代謝中也起重要作用。心肌缺氧時，H-FABP釋放至細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)，使血中FABP含量升高。特別由于其分子量小和心肌中含量很高(0.46mg/g濕重)因而其特異性相對高，在急性心肌梗塞(AMI)早期在血中就可查到其升高。
美國專利申請20030100038公開了一種用抗心臟型和腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP，B-FABP)的單克隆抗體和多克隆抗體檢測中風(fēng)的方法。
CN02117447公開了一種檢測急性心肌梗塞的試劑盒，其中用特異性抗H-FABP的單克隆抗體和多克隆抗體通過ELISA檢測H-FABP，但其缺點是Elisa法涉及的步驟多，需幾步孵浴及洗脫后再顯色，所以一般需兩小時才能讀到結(jié)果，故在臨床上特別是對急性心梗這樣的急癥實用意義不大?？傊?，急性心梗的早期診斷目前尚缺乏良好的手段，新的心梗早期指標(biāo)確定和診斷試劑盒的開發(fā)很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種早期快速檢測急性心肌梗塞的方法和試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測心肌梗塞的測試片，該測試片含有以下結(jié)構(gòu)加入樣品的加樣區(qū)；與加樣區(qū)側(cè)鄰的測試區(qū)；吸收區(qū)，吸收區(qū)的位置與加樣區(qū)相對而且吸收區(qū)相對測試片的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品層析通過測試區(qū)；其中，在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，
在測試片上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位置是沿樣品擴(kuò)散方向的在包被抗體點樣區(qū)的上游，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗FABP的第一單克隆抗體，并且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結(jié)合于FABP。
在另一優(yōu)選例中，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位于加樣區(qū)。
在另一優(yōu)選例中，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位于加樣區(qū)和測試區(qū)之間，或者位于測試區(qū)中。
在另一優(yōu)選例中，在檢測區(qū)中還設(shè)有對照區(qū)。
在另一優(yōu)選例中，所述的包被抗體點樣區(qū)、金標(biāo)抗體點樣區(qū)或?qū)φ諈^(qū)為線狀、點狀、長方形或其他任何形狀。
在另一優(yōu)選例中，所述檢測片還具有一基片，加樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)位于基片上，加樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)的厚度分別為0.05-5毫米(更佳地0.1-2毫米)，基片厚度為0.05-10毫米(更佳地0.1-2毫米)。
在另一優(yōu)選例中，加樣區(qū)為玻璃纖維膜并且在玻璃纖維膜上覆蓋有濾血膜；檢測區(qū)為硝酸纖維素膜；吸收區(qū)為吸水材料；基片為塑料片、玻璃片、金屬片、陶瓷片、紙板(如涂有粘膠的紙板)。
在另一優(yōu)選例中，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結(jié)合于FABP的不同表位，并且與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M，較佳地，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。
在另一優(yōu)選例中，所述包被抗體點樣區(qū)中抗FABP的第二單克隆抗體的數(shù)量為0.01-50ug(更佳地為0.1-20ug，最佳地為0.2-10ug)；金標(biāo)抗體點樣區(qū)中抗FABP的第一單克隆抗體的數(shù)量為0.02-50ug(更佳地為0.1-20ug，最佳地為0.2-10ug)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了所述測試片的用途，它被用于制備檢測急性心肌梗塞的試劑盒。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有本發(fā)明所述的測試片和說明書。


圖1顯示了FABP表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定圖(1％瓊脂糖凝膠.)。其中各泳道如下泳道MDNA標(biāo)準(zhǔn)物，GeneRulerTM1kb ladder，MBI Fermentas公司；泳道1pET32a/Fabp，用Nco I/BamH I切割；泳道2pET32a/Fabp，無切割。
圖2顯示了純化后的FABP融合蛋白。其中各泳道如下泳道13ug純化后的FABP；泳道26ug/ml純化后的FABP；泳道39ug/ml純化后的FABP；泳道412ug純化后的FABP；泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。
圖3顯示了Protein A純化的抗FABP的單克隆抗體HF2和HF10。其中各泳道如下泳道1-3單克隆抗體HF2；泳道4-6單克隆抗體HF10；泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。
圖4顯示了夾心ELISA測試中H-FABP的濃度曲線。其中，HF2為包被抗體，HF10為標(biāo)記抗體。H-FABP標(biāo)準(zhǔn)液用陰性血清配制而成。
圖5顯示了本發(fā)明一種測試片的結(jié)構(gòu)，其中箭頭方向為樣品流動方向。
圖6顯示了FABP金標(biāo)快速診斷試劑盒對不同濃度FABP蛋白的檢測結(jié)果。圖片下方為檢測樣本中FABP的含量(ng/ml)。C處為質(zhì)控線，T處為檢測線。當(dāng)血清中FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結(jié)果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現(xiàn)微弱條帶；隨著FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年廣泛而深入的研究，針對臨床上對急性心梗早期診斷的需求，以脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)為靶點，利用兩個識別脂肪酸結(jié)合蛋白不同表位(抗原決定簇)的、高特異性FABP單克隆抗體，用雙抗體夾心法為原理制備了金標(biāo)快速診斷測試片和試劑盒。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)是一種已知蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本領(lǐng)域已知的(見公知的GenBank數(shù)據(jù)庫)。
生產(chǎn)FABP的方法也是已知的。例如，通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用FABP的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的FABP蛋白。一般來說有以下步驟(1).用編碼人FABP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
另一方面，制備抗FABP蛋白抗體的技術(shù)也是本領(lǐng)域中眾所周知。優(yōu)選用于本發(fā)明的抗體是對人FABP具有特異性的單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人FABP蛋白或其片段。較佳地，指那些能與人FABP蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人FABP蛋白的分子，也包括那些并不影響人FABP蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人FABP基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人FABP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人FABP蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。
單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的單克隆抗體抗體可以利用人FABP基因產(chǎn)物或片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人FABP基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
特別優(yōu)選的抗體是與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M的抗體(即當(dāng)抗體濃度為1×1-6-1×10-12M時，可以與1μg/ml FABP抗原有明顯結(jié)合(OD405nm大于0.5))。較佳地，與FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M，最佳地為1×10-9-1×10-11M。
參見圖5，本發(fā)明的測試片包括可加入樣品的加樣區(qū)30(較佳地，加樣區(qū)還包括覆蓋在上方的濾血膜40)；與加樣區(qū)側(cè)鄰的測試區(qū)20；吸收區(qū)50，吸收區(qū)50的位置與加樣區(qū)30相對而且吸收區(qū)50相對測試片的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)30的樣品擴(kuò)散通過測試區(qū)；其中，在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)60，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試片上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)62，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位置是沿樣品擴(kuò)散方向的在包被抗體點樣區(qū)的上游，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗FABP的第一單克隆抗體。在圖1所示的優(yōu)選例中，金標(biāo)抗體點樣區(qū)62可位于加樣區(qū)。當(dāng)然，金標(biāo)抗體點樣區(qū)還位于加樣區(qū)和測試區(qū)之間，或者位于測試區(qū)中。
圖5中，80為血樣，當(dāng)血樣滴在點樣區(qū)上后，會被吸收區(qū)吸引向箭頭方向擴(kuò)散，先與金標(biāo)抗體點樣區(qū)62中金標(biāo)記的抗FABP的第一單克隆抗體結(jié)合，形成“第一單克隆抗體-FABP”復(fù)合物。該復(fù)合物繼續(xù)向吸收區(qū)擴(kuò)散，進(jìn)入測試區(qū)，然后與測試區(qū)中包被抗體點樣區(qū)60中固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，形成“第一單克隆抗體-FABP-第二單克隆抗體”復(fù)合物，并停留在包被抗體點樣區(qū)，并顯出檢測結(jié)果(見圖6)。此外，血樣樣品會繼續(xù)向吸收區(qū)擴(kuò)散，與對照區(qū)72中固定化的抗金標(biāo)抗體的抗體(如羊抗鼠抗體)或FABP結(jié)合，作為測試條的質(zhì)控對照。
由于本發(fā)明首次采用對FABP有高親和力(相對親合力為1×10-6-1×10-12M)，且識別不同表位的單克隆抗體，因此不僅靈敏度非常高，而且可以極其快速地檢測出血液中FABP，將現(xiàn)有技術(shù)中需數(shù)小時才能獲得檢測結(jié)果縮短到數(shù)分鐘(通常5分鐘即能讀到結(jié)果)，這對于救治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言具有極其重大的意義。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1單克隆抗體的制備A.H-FABP基因的克隆和抗原的表達(dá)以用常規(guī)方法抽提的人心臟細(xì)胞總RNA為起始模板，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR以獲得H-FABP基因，方法如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中以隨機引物為引物，用SuperScript IIRNase H-反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再用H-FABP特異引物(引物1和引物2)及platinum Taq DNA polymerase High Fidelity試劑盒(購自Invitrogen公司)擴(kuò)增H-FABP基因。
引物15’-actgccatggatgtggacgctttcctgggcac-3’(SEQ ID NO1)引物25’-actgggatcctcatgcctctttctcgtaag-3’(SEQ ID NO2)用Ndel和BamHI酶切上述PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32A(購自Novagen公司)，然后連接，獲得質(zhì)粒pET25b-FABP，轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌DH5α，抽提質(zhì)粒、經(jīng)酶切鑒定得到正確構(gòu)建的含表達(dá)質(zhì)粒(見圖1)。對插入片段進(jìn)行DNA測序，證實了插入的H-FABP基因具有正確的核苷酸序列。
將上述制備的質(zhì)粒pET32A-FABP轉(zhuǎn)入常規(guī)的大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化子接種于10ml LB培養(yǎng)基中，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶100稀釋于預(yù)熱的LB培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2.5hr，加IPTG至終濃度0.1mM后22℃誘導(dǎo)過夜，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8μm濾膜過濾后，經(jīng)Ni柱親和層析和分子篩純化得到FABP融合蛋白(在N端含有額外的TrxA-S-His6 Tag)。
結(jié)果如圖2所示，純化的H-FABP蛋白的分子量為29KD，與預(yù)測值相符。
B.抗體的制備用天然H-FABP蛋白(購自Life Diagnostics Inc.公司)或以上重組表達(dá)的H-FABP融合蛋白作為抗原，分別與弗氏完全和/或不完全佐劑混合后對小鼠進(jìn)行三次以上免疫，每次50ug/鼠，收取血清，用ELISA法檢測血清滴度。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)所得抗血清與天然抗原(天然H-FABP)和重組表達(dá)的抗原均有1∶100000以上的效價，經(jīng)最后一次尾靜脈注射后，再經(jīng)融合、篩選、亞克隆等傳統(tǒng)步驟，制備出15株特異性抗H-FABP穩(wěn)定單克隆抗體，亞型確定其中10株為IgG1，4株IgG2a，一株IgG3。選用其中配對最好的2株HF2和HF10，用于制備H-FABP心梗早期診斷試劑盒。
C.抗體的鑒定篩選得到的穩(wěn)定單抗株HF2和HF10的鑒定試驗如下(1)單抗的純化和定量小鼠腹水經(jīng)ProteinA親和層析后得到純的抗體，抗體的純度用SDS-PAGE確定(見圖3)，并用Biorad BCA法測定抗體濃度。
(2)相對親和力的測定用天然H-FABP(1ug/ml)包板，將純化的抗體作梯度稀釋，并用酶標(biāo)抗鼠二抗(Sigma)作檢測抗體，結(jié)果顯示HF2和HF10的相對親合力均達(dá)到10-9M以上，分別為3×10-10M和6×10-10M。
實施例2用ELISA法評估HF2和HF10在雙抗體夾心法檢測H-FABP中的作用用于雙抗體夾心法進(jìn)行免疫檢測的一對抗體必須識別抗原上不同的表位才能配對。在夾心ELISA法中，如包被抗體和標(biāo)記抗體識別抗原上同一位點，則呈陰性結(jié)果；如包被抗體和標(biāo)記抗體識別抗原上不同位點，則呈陽性結(jié)果。本實施例中，對HF10抗體用辣根過氧化酶進(jìn)行標(biāo)記，以HF2為包被抗體，以不同濃度的天然的H-FABP為夾心抗原，進(jìn)行雙抗體夾心法檢測。
結(jié)果顯示，HF2和HF10在夾心ELISA試驗中配對良好，對H-FABP濃度的檢測在2ng/ml-100ng/ml范圍內(nèi)呈線性(圖4)。
實施例3膠體金法檢測H-FABP的方法和試劑盒根據(jù)臨床資料，H-FABP在正常人血清中的濃度高限為6.5ng/ml，一旦急性心梗發(fā)作，H-FABP的濃度馬上升高，甚至可達(dá)幾百到上千ng/ml。故將6.5ng/ml設(shè)為本試劑盒的臨界值。
(a)膠體金顆粒的制備(1)將HauCl4先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
(2)攪動下準(zhǔn)確加入1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.0ml。
(3)繼續(xù)加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過程約2～3min。
(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
用分光光度計掃描λmax來測量金顆粒的粒徑及均勻度。結(jié)果表明，制備的膠體金的可見光區(qū)最高吸收峰在520nm，估測制備的膠體金顆粒的直徑在35nm。吸收峰的峰形表明膠體金的均勻度較好。
(b)金標(biāo)抗體的制備(1)在電磁攪拌下，將1ml抗體溶液(HF2或HF10，濃度為1mg/ml)加入50ml膠體金溶液中，加入抗體時應(yīng)逐滴加入，繼續(xù)攪拌10分鐘。
(2)在磁性攪拌下加入牛血清白蛋白(BSA)，冰箱過夜。以保持標(biāo)記膠體金的穩(wěn)定。
(3)標(biāo)記好的金標(biāo)抗體溶液在4℃，10000xg，離心10min。用PBS清洗三次，用相同溶液重懸標(biāo)記好的金標(biāo)抗體，在可見光區(qū)吸收峰在520nm處測得OD值。制備不同OD值的金標(biāo)抗體(OD＝30，35，40)供金標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化實驗用。
(c)抗體濃度的優(yōu)化實驗分別把OD值為20、30、40、50的金標(biāo)抗體溶液取1ul噴在玻璃纖維膜上，把濃度為0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml抗體溶液取1ul噴在硝酸纖維素膜上，用正交法決定出0.4mg/ml符合檢測靈敏度的抗體濃度為金標(biāo)抗體OD值為30，檢測線上的抗體濃度為0.4mg/ml。
(d)試劑盒的制備檢測試劑盒的主要結(jié)構(gòu)包括上樣區(qū)，測試區(qū)和吸收區(qū)。上樣區(qū)由全血濾膜和帶有金標(biāo)記抗體的玻璃纖維膜組成，測試區(qū)為硝酸纖維膜，上有檢測線和質(zhì)控線，吸收區(qū)由吸水濾紙組成(見圖5)。三區(qū)按順序裝配在塑料底板上并經(jīng)切割包裝即完成。
(e)實驗室檢測結(jié)果用不含H-FABP的血清為稀釋液配成含不同濃度的H-FABP蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本金標(biāo)試劑盒進(jìn)行檢測。
結(jié)果如圖6所示，C處為質(zhì)控線，T處為檢測線。當(dāng)血清中FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結(jié)果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現(xiàn)微弱條帶；隨著FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。H-FABP含量越高，信號越強。
實施例4臨床初試結(jié)果用實施例3制備的心肌梗塞試劑盒，對26例病人的126個血清(含發(fā)病后的不同時間點)和12個正常人的血樣進(jìn)行檢測。
26個心梗病人的120個血樣進(jìn)行測試后，陽性符合率超過99％，僅一個病人的發(fā)病后1.5小時樣品未見明顯陽性，其它陽性標(biāo)本全部符合。而其他現(xiàn)有試劑盒如CK-MB和肌鈣蛋白I和T等在發(fā)病3小時前幾乎不能測出。12個正常人的血樣11個顯示陰性，一個顯示為極弱陽性。這些數(shù)據(jù)初步提示了FABP診斷盒在臨床上的靈敏度和準(zhǔn)確性。
此外，本發(fā)明試劑盒只需5分鐘即能讀到結(jié)果，這對于診治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言優(yōu)勢是顯而易見的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測心肌梗塞的測試片，其特征在于，該測試片含有以下結(jié)構(gòu)加入樣品的加樣區(qū)；與加樣區(qū)側(cè)鄰的測試區(qū)；吸收區(qū)，吸收區(qū)的位置與加樣區(qū)相對而且吸收區(qū)相對測試片的其他區(qū)域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品層析通過測試區(qū)；其中，在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)，所述包被抗體點樣區(qū)包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試片上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位置是沿樣品擴(kuò)散方向的在包被抗體點樣區(qū)的上游，并且所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)包含金標(biāo)記的抗FABP的第一單克隆抗體，并且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結(jié)合于FABP。
2.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位于加樣區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述的金標(biāo)抗體點樣區(qū)位于加樣區(qū)和測試區(qū)之間，或者位于測試區(qū)中。
4.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，在檢測區(qū)中還設(shè)有對照區(qū)。
5.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述檢測片還具有一基片，加樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)位于基片上，加樣區(qū)、測試區(qū)和吸收區(qū)的厚度分別為0.05-5毫米，基片厚度為0.05-10毫米。
6.如權(quán)利要求5所述的測試片，其特征在于，加樣區(qū)為玻璃纖維膜并且在玻璃纖維膜上覆蓋有濾血膜；檢測區(qū)為硝酸纖維素膜；吸收區(qū)為吸水材料；基片為塑料片、玻璃片、金屬片、陶瓷片、或紙板。
7.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結(jié)合于FABP的不同表位，并且與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M。
8.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。
9.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述包被抗體點樣區(qū)中抗FABP的第二單克隆抗體的數(shù)量為0.01-50μg；金標(biāo)抗體點樣區(qū)中抗FABP的第一單克隆抗體的數(shù)量為0.02-50μg。
10.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的測試片和說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于早期快速診斷心肌梗塞的測試片和試劑盒。該測試片包括a)加樣區(qū)，b)與加樣區(qū)側(cè)鄰的測試區(qū)；和c)吸收區(qū)。吸收區(qū)使得加至加樣區(qū)的樣品層析通過測試區(qū)。在所述測試區(qū)有包被抗體點樣區(qū)(固定有包被的第二單克隆抗體)，且在測試片上設(shè)有金標(biāo)抗體點樣區(qū)(包含金標(biāo)記的抗FABP的第一單克隆抗體)，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結(jié)合于FABP。本發(fā)明的測試片和試劑盒可極其快速和很準(zhǔn)確地診斷急性心肌梗塞。
文檔編號G01N33/558GK1704757SQ20041002478
公開日2005年12月7日 申請日期2004年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月31日
發(fā)明者陳克勤, 包維麗, 朱亞, 鄭建紅 申請人:上海單抗制藥技術(shù)有限公司