專利名稱：毛細(xì)流定向自組裝成環(huán)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化、藥物及環(huán)境分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于微量分析的自組裝成環(huán)分析方法。
背景技術(shù)：
自組裝是自然界普遍存在的現(xiàn)象。DNA的合成、RNA的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控、蛋白質(zhì)的合成與折疊等生物化學(xué)過(guò)程都與自組裝相關(guān)。更完善、更復(fù)雜的生命有機(jī)體也都是自組裝所形成的產(chǎn)物。另外，自組裝在智能材料、自恢復(fù)體系、網(wǎng)狀傳感器等動(dòng)力學(xué)和多組分體系中普遍存在。近年來(lái)，科學(xué)家對(duì)自組裝研究產(chǎn)生濃厚興趣。環(huán)狀自組裝是一類非常特殊的自組裝，環(huán)的形成對(duì)印刷、印染、表面污染防治、清洗和涂敷等表面處理工業(yè)、納米陣列、流體力學(xué)的動(dòng)態(tài)過(guò)程及固載表面的圖紋化會(huì)產(chǎn)生影響。生命體中也有這樣的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)它的研究不僅具有仿生學(xué)價(jià)值，同時(shí)還可能獲得具有特殊結(jié)構(gòu)的功能材料。
在各種生化分析和其它分析領(lǐng)域中，迫切需要具有高靈敏度、高選擇性和取樣量少的分析方法。經(jīng)典的濾紙點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)是一種具有發(fā)展前景的分析方法。但由于部分樣品溶液能擴(kuò)散到濾紙內(nèi)部，使得該方法缺乏較高的靈敏度。環(huán)爐技術(shù)是在點(diǎn)滴分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的微量分析方。該方法的特點(diǎn)是借助于濾紙的毛細(xì)效應(yīng)，使試樣中的待測(cè)物質(zhì)選擇性地徑向擴(kuò)散，并在環(huán)爐的熱阻擋作用下不斷濃集，在濾紙上形成一個(gè)環(huán)帶。該方法和在疏水性濾紙上的成環(huán)分析法，由于濾紙和所形成環(huán)的不均勻性，常常使它們的重現(xiàn)性受到影響。為了克服這一不足，發(fā)展了固載表面的成環(huán)分析法。Ishida等首次將自組裝環(huán)技術(shù)應(yīng)用于分析測(cè)定。他們發(fā)現(xiàn)，在有PVA存在下，o，o’-二羥基偶氮苯和鋁離子形成的配合物可以在聚氯乙烯盤上形成一個(gè)圓環(huán)，但環(huán)的直徑較大，為10.6mm。借助一個(gè)紫外光源，可測(cè)定1~30ppb的鋁離子，檢測(cè)限為5.0×10-8M。Kaneko等用自組裝環(huán)技術(shù)，在十八烷基硅烷化硅盤片上用羅丹明B測(cè)定了全血中的微量血色素。然而，這兩種方法存在的主要問(wèn)題是薄膜基質(zhì)的背景干擾很強(qiáng)，影響測(cè)定的靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的自組裝成環(huán)技術(shù)在使用過(guò)程中存在的上述不足，發(fā)明了一種新的毛細(xì)流定向自組裝成環(huán)分析方法，用疏水性玻片代替薄膜作為基質(zhì)，借助輔助成環(huán)劑，獲得環(huán)徑很小的自組裝環(huán)，使溶液中幾乎全部溶質(zhì)都富集在環(huán)線上，降低背景干擾，提高測(cè)定的靈敏度，利于批量數(shù)據(jù)的處理。
本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下(1)首先對(duì)玻片進(jìn)行疏水性處理，其過(guò)程如下
將醫(yī)用載玻片(1.0mm×25mm×75mm)依次浸入下列溶液中用超聲波清洗儀進(jìn)行洗滌家用洗滌劑溶液、鉻酸洗液和二次水，用以除去玻璃表面的有機(jī)物。每從一種試劑中取出時(shí)均以大量水進(jìn)行沖洗。然后將載玻片浸入硝酸溶液進(jìn)行活化，然后分別用氫氧化鈉溶液和二次水超聲洗滌。洗凈的載玻片浸入丙酮5min，用氮?dú)獯蹈伞４藭r(shí)再把載玻片浸入新配的4.5％(v/v)二氯二甲基硅烷(DMCS)的甲苯溶液中30min，將載玻片從該溶液中取出，依次浸入氯仿、丙酮中各5min，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> (2)將樣品溶液與選用的輔助成環(huán)劑混勻，其中輔助成環(huán)劑選用聚乙烯醇PVA、聚丙烯酰胺PAM、聚乙二醇PEG水溶性聚合物；然后移取體積體積為0.xμl的液滴到疏水性玻片表面，放入60-80℃烘箱2-3min烘干，形成自組裝環(huán)，再在顯微鏡下激發(fā)觀察測(cè)定。
采用上述方法，當(dāng)點(diǎn)樣體積為0.1-2.0μL時(shí)，利用溶劑蒸發(fā)和向外的毛細(xì)流作用，可以將分析物移到接觸線上，并富集形成直徑小于1.1mm，環(huán)線寬在30μm以下的自組裝環(huán)，與薄膜基質(zhì)相比，環(huán)直徑縮小了近10倍。
以下是本發(fā)明獲得的自組裝環(huán)的定量分析關(guān)系當(dāng)液滴與表面的接觸角θ一定時(shí)，其半徑r與液滴體積V的立方根成正比，即r＝KV1/3(1)其中K=[6πtgθ2(3+tg2θ2)]13,]]>是一個(gè)與θ有關(guān)的函數(shù)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，SOR環(huán)線上溶質(zhì)的分布較好地符合高斯誤差曲線，而最大熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的量成正比Imax=K24πσK1(KV1/3-δ)m=ξm--(2)]]>其中，ξ=K24πσK1(KV1/3-δ),]]>K1是一個(gè)與σ和δ有關(guān)的積分常數(shù)，K2是與熒光物質(zhì)激發(fā)性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)，K與自組裝成環(huán)條件有關(guān)。利用最大熒光強(qiáng)度Imax與溶液中熒光物質(zhì)的量m成正比關(guān)系。據(jù)此可以用于自組裝環(huán)中熒光物質(zhì)的定量測(cè)定。
本方法的優(yōu)點(diǎn)(1).實(shí)驗(yàn)和理論證明，采用本方法，溶劑揮發(fā)使溶質(zhì)向液滴邊緣傳輸，經(jīng)歷了由斑點(diǎn)到圓環(huán)的富集，溶液中幾乎全部溶質(zhì)都能富集在環(huán)線上，背景干擾低，與環(huán)爐分析法相比提高50倍，比斑點(diǎn)分析技術(shù)提高近500倍，大大提高了測(cè)定的靈敏度，且由于環(huán)較小，利于批量數(shù)據(jù)的處理。
(2).與其它薄膜基質(zhì)上成環(huán)技術(shù)相比，來(lái)源于溶液的基質(zhì)效應(yīng)(背景干擾)降低。該方法已可以成功地用于核酸、蛋白質(zhì)、環(huán)境和藥物分析，檢測(cè)限達(dá)到飛摩爾到阿摩爾量級(jí)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，它將成為一種靈敏度高的固相分析方法并在藥物、環(huán)境、分離科學(xué)和生命科學(xué)研究等領(lǐng)域顯示出更大的優(yōu)越性和更廣泛的實(shí)用性。
(3).耗樣量小(納升到微升級(jí))，可以形成很小的環(huán)。如果伴以點(diǎn)樣機(jī)器人、激光誘導(dǎo)熒光和CCD陣列檢測(cè)新技術(shù)，可以平行處理大批量的數(shù)據(jù)。對(duì)開(kāi)發(fā)具有高通量、高效率的微陣列分析技術(shù)具有十分重要的意義。目前生物芯片制備方法中多采用接觸點(diǎn)加樣法和噴墨法，與液滴在固載表面上的蒸發(fā)過(guò)程有關(guān)。然而由于人們對(duì)液滴在固載表面上蒸發(fā)過(guò)程的認(rèn)識(shí)還不是十分成熟，目前對(duì)大部分生物芯片的處理是采用陣列斑點(diǎn)分析而不是自組裝成環(huán)分析，沒(méi)有考慮溶質(zhì)應(yīng)在環(huán)線上集聚且使環(huán)線上溶質(zhì)分布均勻。如果在芯片構(gòu)建過(guò)程中利用毛細(xì)流作用將溶質(zhì)完全沉積在環(huán)線上，用最大熒光強(qiáng)度替代現(xiàn)在總熒光強(qiáng)度，采用多環(huán)的線性掃描代替面積掃描積分，不僅可以大大提高方法的靈敏度，而且可以加快數(shù)據(jù)處理的速度，簡(jiǎn)化設(shè)備要求，提高信號(hào)的強(qiáng)度。
(4).在PVA-124等高分子輔助劑存在下，毛細(xì)流可將生物大分子特別是DNA分子拉伸，我們初步試驗(yàn)了拉伸的生物大分子酶解進(jìn)行光學(xué)定位，并擬對(duì)蛋白質(zhì)亞單元和分子微區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行光學(xué)表征，或者將拉伸后的生物大分子經(jīng)過(guò)接觸擴(kuò)散進(jìn)行轉(zhuǎn)移印跡，開(kāi)展蛋白質(zhì)的免疫分析和核酸的雜交研究?？梢灶A(yù)見(jiàn)，將在快速、精確的基因組物理圖譜的繪制、基因定位及有序測(cè)序方面發(fā)揮更大的作用。
(5).由于自組裝環(huán)具有孔徑分布均勻和尺寸可控制的特點(diǎn)，有可能作為一種新型的氣、液膜固定介質(zhì)，從而改善和提高現(xiàn)有分離膜的分離性能。同時(shí)也有可能作為一種新型的色譜填料在生化分離領(lǐng)域中獲得應(yīng)用；另外，自組裝環(huán)的研究已經(jīng)為表面處理工業(yè)、分子圖案組裝、納米粒子界面組裝和流體力學(xué)的動(dòng)態(tài)過(guò)程等提供了豐富的信息并在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用。
我們將本發(fā)明方法應(yīng)用到藥物、蛋白質(zhì)、核酸和環(huán)境樣品分析中，絕對(duì)檢測(cè)限達(dá)到飛摩爾到阿托摩爾級(jí)，見(jiàn)表1。
表1.SOR技術(shù)在生化、藥物和環(huán)境分析中的應(yīng)用


具體實(shí)施方式
第一組實(shí)施例.利用藥物自身熒光強(qiáng)度，采用熒光顯微自組裝成環(huán)技術(shù)(SOR)對(duì)鹽酸小檗堿、熒光素鈉、羥甲香豆素等藥物進(jìn)行定量分析。
實(shí)施例1利用SOR技術(shù)測(cè)定鹽酸小檗堿首先，對(duì)玻片進(jìn)行疏水處理將醫(yī)用載玻片依次浸入家用洗滌劑溶液、鉻酸洗液中用超聲波清洗儀進(jìn)行洗滌，用以除去玻璃表面的有機(jī)物，每從一種洗液中取出時(shí)均以大量水進(jìn)行沖洗，然后再用二次水溶液進(jìn)行超聲清洗；將載玻片浸入硝酸溶液進(jìn)行活化，然后分別用氫氧化鈉溶液和二次水超聲洗滌；洗凈的載玻片浸入丙酮3-8分鐘，取出后用氮?dú)獯蹈?；再把載玻片浸入新配的4.5％(v/v)二氯二甲基硅烷(DMCS)的甲苯溶液中20-40分鐘，然后將載玻片從該溶液中取出，依次浸入氯仿、丙酮中，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> 然后，在1.50mL微量試管中，依次加入適量的鹽酸小檗堿溶液(工作液是1.0×10-5M)或樣品溶液，100μL HAc-NaAc緩沖溶液，50μL 0.6％的PVA-124溶液。每加一種試劑均旋渦混勻，最后將溶液用水稀釋為0.5mL，完全混勻。用微量進(jìn)樣器移取0.10-1.00μL溶液于處理好的疏水性玻片表面，立即放入溫度為70℃的烘箱中烘干3-5min，再在OlympusIX 70倒置顯微鏡下U激發(fā)(激發(fā)濾光片通帶為330-385nm，發(fā)射濾光片通帶為420-800nm)觀察測(cè)定。
樣品溶液復(fù)方黃連素藥片和膠囊(太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司和四川康復(fù)來(lái)制藥有限公司)。按文獻(xiàn)進(jìn)行預(yù)處理，即首先去掉藥片糖衣，然后研細(xì)。稱取0.18克粉末狀藥片直接溶于沸水，制成250mL樣品溶液。
尿樣樣品來(lái)源于西南師范大學(xué)健康志愿者。服藥120mg后，將不同時(shí)間間隔的尿樣離心10min(500rpm)，將上清尿液用二次蒸餾水稀釋25倍作為尿樣。不需要進(jìn)行其他預(yù)處理。
實(shí)施例2利用SOR技術(shù)測(cè)定熒光素鈉玻片疏水處理同例1。向1.50mL微量試管中，依次加入熒光素鈉工作溶液(1.0×10-5M)或樣品溶液，50μL 0.1M六氫吡啶溶液，混勻后再加入55μL 0.6％PVA-124溶液。最后加入二次水，使總體積維持500μL。使用微量進(jìn)液器移取0.1~1.0μL體積的液滴于載玻片上，立即放入70℃烘箱中烘干3min，再放到顯微鏡上B激發(fā)(激發(fā)濾光片通帶為450-480nm，發(fā)射濾光片通帶為515-800nm)觀察成像。
樣品溶液熒光素鈉注射液1(廣州明興制藥廠，廣州)和2(廣西梧州制藥集團(tuán)股份有限公司，廣西)分別用二次蒸餾水直接稀釋6.25×104倍，作為待測(cè)樣品。
實(shí)施例3利用SOR技術(shù)測(cè)定羥甲香豆素玻片疏水處理同例1。在1.5mL微量試管中用微量移液器依次加入適量的羥甲香豆素工作溶液(1.0×10-5M)或樣品溶液、30μl六氫吡啶溶液和50μL0.6％(w/v)PVA-124溶液，混合均勻后用二次水定容到0.5mL。用微量進(jìn)液器移取0.1~1.0μL溶液到疏水性處理的玻片上，放入70℃烘箱中烘干3～5min，再放到顯微鏡上U激發(fā)觀察成像。
樣品溶液(1).藥樣分別將羥甲香豆素藥片1(廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東)和藥片2(哈爾濱泰華藥業(yè)股份有限公司，哈爾濱)，按文獻(xiàn)進(jìn)行預(yù)處理。也即將藥片研碎，準(zhǔn)確稱取0.1000g藥末，加10mL 0.1M NaOH，然后用水稀釋到100mL棕色容量瓶中，過(guò)濾。將續(xù)濾液進(jìn)一步用2.0×10-3M NaOH稀釋200倍，置于棕色瓶中作為分析藥樣。
(2).尿樣取尿液離心10min(500rpm)，取上清液用二次蒸餾水稀釋10倍，備用。
實(shí)施例4利用SOR技術(shù)測(cè)定四環(huán)素玻片疏水處理同例1。在1.50ml微量試管中，依次加入一定量四環(huán)素工作溶液(1.0×10-4M)或樣品溶液、50μl六氫吡啶溶液，混勻后加入60μl 0.6％的PVA溶液，用二次水稀釋至500μl，搖勻，用微量進(jìn)樣器移取一定體積的溶液于處理好的疏水性玻片表面，立即放入溫度為70℃的烘箱中烘干，再放到Olympus IX 70倒置顯微鏡下使用U激發(fā)，配備Cohu 4910型冷卻式CCD(Cohu，美國(guó))觀察成像。用Scion Image圖像分析軟件對(duì)熒光成像進(jìn)行觀察分析，Origin 5.0軟件包用于線性和高斯擬合。
樣品溶液四環(huán)素藥片，研細(xì)，溶于0.01M HCl，用二次去離子水稀釋到250mL，搖勻，過(guò)濾，取濾液備用。
第二組實(shí)施例利用熒光探針對(duì)藥物熒光增強(qiáng)或猝滅的性質(zhì)，應(yīng)用熒光顯微SOR技術(shù)對(duì)探針或藥物進(jìn)行定量分析。
實(shí)施例5利用鋁敏化鹽酸四環(huán)素?zé)晒鈴?qiáng)度測(cè)定四環(huán)素玻片疏水處理同例1。在1.50ml微量試管中加入適量鹽酸四環(huán)素工作液(1.0×10-4M)或樣品溶液、60μL of 1.00×10-4M鋁溶液、100μL Tris-HCl溶液，每加一種試劑后均旋渦混合，反應(yīng)30min。再加入75μL濃度為0.60％PVA-124溶液，加二次蒸餾水至500μL?；靹蚝笫褂梦⒘恳埔浩饕迫?.1~1.0μL的混合液到經(jīng)過(guò)修飾的載玻片上，并放入烘箱中恒溫70℃烘干3～5min。最后在配有CCD的顯微鏡下BV激發(fā)(激發(fā)濾光片通帶為420-440nm，發(fā)射濾光片通帶為475-800nm)，用Scion Image軟件包進(jìn)行熒光圖像的測(cè)定分析。
樣品溶液(1).藥片按照文獻(xiàn)，精密稱定0.25g研細(xì)的藥片(西南藥業(yè)股份有限公司)和膠囊內(nèi)容物(重慶碚陵藥業(yè)有限公司)，分別溶于0.01M HCl，，用二次去離子水稀釋到250mL，搖勻，過(guò)濾。取續(xù)濾液用二次去離子水稀釋10倍，作為藥樣分析物。
(2).尿樣離心10min(500rpm)，將上清尿液用二次蒸餾水稀釋25倍作為尿樣。新鮮的牛奶用二次去離子水稀釋250倍作為分析樣。
實(shí)施例6利用苦味酸猝滅鹽酸小檗堿熒光強(qiáng)度測(cè)定苦味酸玻片疏水處理同例1。在0.5mL微量試管中依次加入90.0μL(0.5μL點(diǎn)樣時(shí))1.0×10-5M鹽酸小檗堿溶液或樣品溶液，50.0μL pH＝4.58的HAc-NaAc緩沖溶液，一定量的苦味酸操作溶液，每加入一種試劑后都旋渦混合，然后加入35.0μL 0.6％(w/v)的PVA溶液，加水至0.5mL，搖勻。移取0.1~1.0μL混合液于疏水性的載玻片表面，然后將其置于70℃烘箱中烘3～5min，于倒置熒光顯微鏡下U激發(fā)對(duì)SOR進(jìn)行圖像分析。測(cè)定其熒光強(qiáng)度Imax，同時(shí)測(cè)定試劑空白熒光強(qiáng)度Imax0，作熒光猝滅值(ΔImax＝Imax0-Imax)~苦味酸濃度(c)的線性擬合方程。
樣品溶液天然水樣(井水，嘉陵江，自來(lái)水)、無(wú)機(jī)和有機(jī)合成樣品。
實(shí)施例7利用苦味酸猝滅羥甲香豆素?zé)晒鈴?qiáng)度測(cè)定苦味酸。
玻片疏水處理同例1。向1.5ml微量試管中用微量移液器依次加入適量苦味酸工作溶液(1.0×10-4M)或樣品溶液、25μL羥甲香豆素溶液之后，再加入0.2M的六氫吡啶30μL和0.6％PVA-124溶液40μL，最后定容到0.5mL?；靹蚝笥梦⒘窟M(jìn)液器移取0.1~1.0μL溶液滴加在載玻片上，立即放入70℃烘箱中烘干，此過(guò)程大約需要3-5min。烘干后再放到奧林巴斯倒置顯微鏡上U激發(fā)，用4倍和10倍物鏡觀察。分別測(cè)定試劑空白(不加苦味酸)的熒光強(qiáng)度(Imax0)和溶液(加苦味酸)的熒光強(qiáng)度(Imax)，作熒光強(qiáng)度猝滅值(ΔImax＝Imax0-Imax)與苦味酸濃度的線性擬合樣品溶液配制含苦味酸的無(wú)機(jī)和有機(jī)合成樣品。
第三組實(shí)施例熒光顯微毛細(xì)流SOR技術(shù)在生化分析中的應(yīng)用實(shí)施例8利用固相中四-(對(duì)三甲基銨基苯基)卟啉(TAPP)與核酸的熒光增強(qiáng)測(cè)定核酸玻片疏水處理同例1。在0.50ml微量試管中，依次加入適量的核酸溶液，10μL TAPP溶液(2.5×10-5M)，10μL Tris-HCl緩沖溶液和50μL 0.12％的PVA-124溶液。每加入一種試劑均混勻，最后將溶液稀釋至100μL，混勻后置于暗處10min。用微量進(jìn)樣器移取適量溶液與處理好的載玻片上，立即放入60℃烘箱中烘干，然后在倒置熒光顯微鏡下G激發(fā)(激發(fā)濾光片通帶為510-550nm，發(fā)射濾光片通帶為570-800nm)對(duì)SOR進(jìn)行圖像分析。
樣品溶液包含無(wú)機(jī)離子、蛋白質(zhì)和表明活性劑的核酸合成樣。
實(shí)施例9利用核固紅與蛋白質(zhì)的熒光增強(qiáng)效應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)玻片疏水處理同例1。在1.50ml微量試管中，依次加入20μL 5.0×10-5mol/L的核固紅溶液、50μL pH＝6.62 HAc-NaAc緩沖溶液和適量的蛋白質(zhì)溶液，混勻后加入50μL 0.6％的PVA溶液。用二次水稀釋至500μL，搖勻后置于暗處20min。用微量進(jìn)樣器移取一定體積的溶液于處理好的疏水性玻片表面，立即放入溫度為70℃的烘箱中烘干，再放到Olympus IX 70倒置顯微鏡下，使用G二色鏡配備Cohu 4910型冷卻式CCD(Cohu，美國(guó))觀測(cè)成像。
樣品溶液
人血清樣品，稀釋2000倍后進(jìn)行測(cè)定。
第四組實(shí)施例熒光顯微毛細(xì)流SOR技術(shù)在環(huán)境分析中的應(yīng)用實(shí)施例10利用鎘猝滅四-(對(duì)磺基苯基)卟啉(TPPS4)的熒光效應(yīng)測(cè)定鎘離子玻片疏水處理同例1。在0.50ml微量試管中，依次加入20μL鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，8μL TPPS4溶液(2×10-5M)，20μL Tris-HCl緩沖溶液，50μL 0.12％PVA-124溶液。2μL水被加入到試管中使總體積維持100μL。每加一種試劑都進(jìn)行漩渦混勻。然后將試管加蓋置于暗處35min后，使用微量進(jìn)樣器移取適量溶液于處理好的載玻片上，立即放入70℃烘箱中烘干，然后在倒置熒光顯微鏡下G激發(fā)對(duì)SOR進(jìn)行圖像分析。
樣品溶液自來(lái)水樣，飲用純凈水樣。
實(shí)施例11利用兩種偶氮類染料-鈣紅和酸性鉻深藍(lán)與鋁的熒光增強(qiáng)效應(yīng)測(cè)定鋁離子玻片疏水處理同例1。
鈣紅(CR)體系向1.50ml微量試管中，依次加入100μL HAc-NaAc緩沖溶液，適量鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液或含鋁樣品溶液，20μL CR溶液，將溶液混勻后加蓋沸水浴15min，冷卻到室溫后加入40μL 0.6％PVA-124溶液。用二次水稀釋至500μL，搖勻。用微量進(jìn)樣器移取適量溶液于處理好的載玻片上，立即放入70℃烘箱中烘干，然后在倒置熒光顯微鏡下IY激發(fā)(激發(fā)濾光片通帶為545-580nm，發(fā)射濾光片通帶為600-800nm)，同時(shí)使用ND25中性濾光片對(duì)SOR進(jìn)行圖像分析。
酸性鉻深藍(lán)(AB)體系向1.50ml微量試管中，依次加入適量鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液或含鋁樣品溶液，20μL AB溶液，100μL HAc-NaAc緩沖溶液，40μL 0.6％PVA-124溶液，將溶液混勻后加蓋沸水浴5min，冷卻到室溫后用二次水稀釋至500μL。用微量進(jìn)樣器移取適量溶液于處理好的載玻片上，立即放入70℃烘箱中烘干，然后在倒置熒光顯微鏡下IY激發(fā)，同時(shí)使用ND25中性濾光片對(duì)SOR進(jìn)行圖像分析。
樣品溶液1.血樣取血樣200μL于5ml刻度試管中，加入200μL 1.0×10-5M鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后滴加2-3滴濃硫酸，再分批加入1.5ml左右的濃硝酸，小心加熱直到溶液幾乎為無(wú)色，再緩緩加熱直至將濃硫酸趕凈為止。然后加入約200μL 0.1M HCl溶液溶解固體，再用pH5.2HAc-NaAc緩沖溶液定容。
2.水樣嘉陵江水樣，長(zhǎng)江水樣和飲用純凈水樣。
權(quán)利要求
1.毛細(xì)流定向自組裝成環(huán)分析方法，包括以下步驟(1).對(duì)玻片進(jìn)行疏水性處理；(2).將樣品溶液與選用的輔助成環(huán)劑混勻，用微量進(jìn)樣器移取到疏水性玻片表面，放入烘箱烘干，形成自組裝環(huán)，再在顯微鏡下激發(fā)觀察測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝成環(huán)分析方法，其特征在于對(duì)玻片的疏水性處理過(guò)程為將醫(yī)用載玻片依次浸入家用洗滌劑溶液、鉻酸洗液中用超聲波清洗儀進(jìn)行洗滌，用以除去玻璃表面的有機(jī)物，每從一種洗液中取出時(shí)均以大量水進(jìn)行沖洗，然后再用二次水溶液進(jìn)行超聲清洗；將載玻片浸入硝酸溶液進(jìn)行活化，然后分別用氫氧化鈉溶液和二次水超聲洗滌；洗凈的載玻片浸入丙酮3-8分鐘，取出后用氮?dú)獯蹈?；再把載玻片浸入新配的4.5％(v/v)二氯二甲基硅烷DMCS的甲苯溶液中20-40分鐘，然后將載玻片從該溶液中取出，依次浸入氯仿、丙酮中，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝成環(huán)分析方法，其特征在于輔助成環(huán)劑選用聚乙烯醇PVA、聚丙烯酰胺PAM、聚乙二醇PEG水溶性聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝成環(huán)分析方法，其特征在于獲得的自組裝環(huán)的直徑小于1.1mm，環(huán)線寬在30μm以下。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛細(xì)流定向自組裝成環(huán)分析方法，屬于生化、藥物及環(huán)境分析技術(shù)領(lǐng)域該方法是首先對(duì)玻片進(jìn)行疏水性處理；然后，將樣品溶液與選用的輔助成環(huán)劑混勻，用微量進(jìn)樣器移取到疏水性玻片表面，放入烘箱烘干，形成自組裝環(huán)，最后再在顯微鏡下激發(fā)觀察測(cè)定。該方法用疏水性玻片代替薄膜作為基質(zhì)，借助輔助成環(huán)劑，獲得環(huán)徑很小的自組裝環(huán)，使溶液中幾乎全部溶質(zhì)都富集在環(huán)線上，降低背景干擾，提高測(cè)定的靈敏度，利于批量數(shù)據(jù)的處理。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1563952SQ20041002209
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者黃承志, 李原芳, 范美坤, 劉穎 申請(qǐng)人:西南師范大學(xué)