專利名稱：氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對血液進(jìn)行檢測的方法。
背景技術(shù)：
腦利鈉肽(brain naTriureTic pepTide，BNP)又稱B型利鈉肽(B-Type naTriureTic pepTide)，是心房利鈉肽(ANP)系統(tǒng)的成員，因首先從豬腦分離而得名。實際上它主要來源于心室。
人類BNP基因片段位于1號染色體短臂，其上游與ANP基因片段相連，由1900個核苷酸組成。mRNA含900-1000個核苷酸。表達(dá)產(chǎn)物含信號肽。信號肽降解后的產(chǎn)物為前體BNP(pro-BNP)，含108個氨基酸(aa)。pro-BNP進(jìn)一步裂解，成為76aa的N端前體BNP(NTpro-BNP)和C端的BNP。BNP具有種屬特異性。豬、狗與人的BNP都由32個氨基酸組成。
pro-BNP主要從心室分泌。在其分泌過程中或進(jìn)入血液后分解為具有生物活性的BNP。心肌延展及室壁張力對BNP的釋放進(jìn)行基礎(chǔ)調(diào)節(jié)。病理狀態(tài)下，水鈉潴留、中心靜脈壓升高以及左心室擴(kuò)張或肥厚都誘導(dǎo)pro-BNP合成、裂解及BNP分泌，血漿水平常增加可近百倍之多。
目前BNP或其前體測定的常用方法主要有放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法以及熒光標(biāo)記法等，均為定量方法。檢查需時較長，不利于快速確診。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明采用高親和力特異性單克隆抗體，按照免疫化學(xué)方法和免疫層析技術(shù)的原理制備的氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒。
本發(fā)明的制備工藝是a、膠體金溶液的制備在磁力攪拌下加熱超純水，再加入氯金酸溶液，待溶液沸騰后，立即加入檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰，攪拌，冷卻至室溫，保存；b、膠體金標(biāo)記鼠抗人NT-pro-BNP的單克隆抗體制備以碳酸鉀溶液調(diào)整膠體金溶液，加入鼠抗人特異性抗體，反應(yīng)，加入聚乙二醇，離心，調(diào)整測OD值；c、硝酸纖維反應(yīng)膜制備———即檢測線和質(zhì)控線的制備①取特異性抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被檢測線；②用羊抗鼠IgG多克隆抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被對照線。
③在真空下干燥后備用；d、將粘貼組成板的反應(yīng)體切割，待包裝。
本發(fā)明的檢測盒，是應(yīng)用于對血液中氮末端腦利鈉肽前體的臨界值定性進(jìn)行快速檢測。
本發(fā)明采用高親和力特異性單克隆抗體，按照免疫化學(xué)方法和免疫層析技術(shù)的原理制備的快速檢測試紙條，特異地檢測病人全血或血清中的NT-proBNP抗原從而反映心臟功能。具有靈敏度高、特異性好、符號顯示結(jié)果、操作簡便、無需特殊儀器設(shè)備、反應(yīng)迅速、5～15分鐘判讀結(jié)果等特點。雖然NT pro-BNP和BNP檢測的意義相同，但NT pro-BNP測定有2個優(yōu)點，半衰期比BNP長而且測定水平的影響因素比BNP少。
具體實施例方式一、試劑盒的制備1.設(shè)備、儀器1.1紫外分光光度計。
1.2 SDS-PAGE電泳儀。
1.3凝膠成像分析系統(tǒng)。
1.4包被儀。
1.5真空抽干腔國。
1.6可調(diào)式電腦切條機(jī)。
1.7普通冰箱。
1.8低溫冰箱。
2.試劑和輔助材料2.1特異性抗體兩株單抗經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其目標(biāo)抗體純度不低于90％，BCA法測蛋白含量大于3.5mg/ml，用ELISA法測抗體效價不低于11000000。
2.2羊抗鼠IgG多克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其目標(biāo)抗體純度不低于95％，經(jīng)BCA法測定蛋白含量大于1mg/ml，用ELISA法測抗體效價不低于1∶100000，PEG濃縮蛋白大于3mg/ml，低溫保存。
2.3活化的硝酸纖維膜孔徑12μm。吸水速度應(yīng)不低于4cm/100s。
2.4內(nèi)控陽性參比血清2.5內(nèi)控陰性參比血清2.6牛血清白蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其純度不低于95％，蛋白含量大于1mg/ml。
2.7氯金酸分子式為HAuCl4，分子量為399.78，分析純。
2.8無紡布規(guī)格為90×28cm，重量為5.0±0.2g。厚薄均勻，顏色均一。
2.9粗纖維吸水紙定做。
2.10塑料板外觀平整，質(zhì)地均勻，無裂縫PVC板。
2.11單、雙面膠帶質(zhì)地均勻，粘度適中，無皺折的透明膠帶。
2.12鋁箔袋定做。
2.13包裝盒、標(biāo)簽定做。
3.主要工藝3.1膠體金溶液的制備采用構(gòu)櫞酸三鈉還原法，即在磁力攪拌下加熱一定量超純水至90℃時加入10％氯金酸溶液，待溶液沸騰后，立即加入相應(yīng)量的12％檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰，攪拌10分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)-紫-紅，冷卻至室溫，4℃避光保存。同時取1ml測定膠體金溶液吸光值，讀取并記錄峰波長吸光度值。用于抗體標(biāo)記的膠體金溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為峰波長532nm，吸光度(OD)大于0.8，溶液清澈透明。
3.2膠體金標(biāo)記鼠抗人NT-pro-BNP的IgG抗體制備3.2.1金標(biāo)條件的選擇氯金酸在還原劑的作用下可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電疏水膠溶液，由于靜電作用成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，即為膠體金。膠體金顆粒粒徑不同、顏色也各不同的。顆粒由大變小，顏色也由黑變?yōu)槌赛S色。這種球形的粒子對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力，膠體金的標(biāo)記，實質(zhì)上就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。
金標(biāo)抗原制備的主要影響因素表現(xiàn)在①膠體金顆粒的大小由還原劑的濃度控制，大小的確定由分光光度計的光譜中最大吸收峰的位置判定。作為一步法免疫檢測試劑所用的膠體金顆粒直徑選擇在60nm左右為宜，溶液顯示紫紅色，在530～535nm處有明顯吸收峰。②蛋白質(zhì)最適量采用方陣滴定法，將待標(biāo)記的抗體溶液作系列稀釋后，分別交叉配比。不同濃度、同體積(100ul)抗體溶液中加入定量(1ml)的膠體金溶液，混勻，再加入0.1M的NaCl混勻，靜置2小時，抗體蛋白濃度過高或過低都能使膠體金變得不穩(wěn)定，易產(chǎn)生沉淀或聚集。能使膠體金穩(wěn)定(無沉淀產(chǎn)生，溶液清澈透明)的蛋白質(zhì)最適量再加入10％即為最佳標(biāo)記蛋白量，我們采用的標(biāo)記抗體濃度為1.5mg/ml。③PH值在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點的條件下標(biāo)記比較合適，在此條件下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大，我們所選PH＝7.4，采用碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)。
3.2.2金標(biāo)抗體的制備以碳酸鉀溶液調(diào)整膠體金溶液PH＝7.4，加入鼠抗人NT-pro-BNP的IgG，反應(yīng)15分鐘，加入聚乙二醇，離心，調(diào)整532nm測OD值不低于0.5。
3.2.3金標(biāo)抗體固相載體的制備取工作濃度膠體金標(biāo)記抗體溶液，將無紡布浸濕、平整、干燥、檢測。
3.3硝酸纖維反應(yīng)膜制備(即檢測線和質(zhì)控線的制備)3.3.1反應(yīng)膜制備條件的選擇濃度、溫度、時間、溶液的PH值。我們通過大量的實驗，得出結(jié)論①抗體的包被量要相對飽和我們采用方陣滴定法，選用不同濃度的抗體進(jìn)行包被，與相對應(yīng)的金標(biāo)抗體配對，包被檢測抗體的最適濃度為1.5mg/ml，包被質(zhì)控抗體的最適濃度為1.0mg/ml。
②包被好的膜一定要充分干燥溫度24℃，相對濕度40％以下，經(jīng)真空干燥10小時以上，否則靈敏度將大受影響。
③包被液的最適PH值為7.4。
3.3.2反應(yīng)膜制備①取工作濃度為1.5mg/ml的特異性抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被檢測線。
②用工作濃度為1.0mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被對照線。
③置真空24℃，相對濕度40％以下，干燥10小時后備用。
3.4反應(yīng)體組裝3.4.1反應(yīng)體組裝材料及規(guī)格(單位mm)塑料基板295×87S1260×25大雙面膠270×60S38小雙面膠270×28S2硬，30×27箭頭膠帶270×50S4270×34即時貼大270×45；中270×20；小270×2。
3.4.2組裝順序3.4.2.1貼S1按上下標(biāo)識，S1下緣距板下邊29mm平行貼于板上。
3.4.2.2貼硬S2細(xì)紋面朝下，圓邊壓S10.5mm。
3.4.2.3貼S4.S4平行壓S1下緣1mm。
3.4.2.4貼S3S3在S4基礎(chǔ)上距S1下緣4mm。
3.4.2.5貼中即時貼壓S4 2mm。
3.4.2.6貼小即時貼距中即時貼2mm。
3.4.2.7貼大即時貼壓過S1標(biāo)志線1～1.5mm處，用手沿S2邊緣壓實，上面用鋼板尺刮平，剩余部分向后反折。
3.5裁測將粘貼組成板的反應(yīng)體切割為適宜寬度(3.0mm)，待包裝。
3.6產(chǎn)品檢定及質(zhì)量研究3.6.1外觀及性能外觀平整，材料附著牢固，內(nèi)容齊全。無邊緣效應(yīng)，無水色分離，無空心杠，兩線間距合理，線體飽滿度好。
3.6.2物理檢查膜條寬度為3.0±0.1mm，液體移行速度不低于20mm/min。本底消退在5分鐘內(nèi)完成。
3.6.3敏感性用10份內(nèi)控陽性參比血清進(jìn)行檢定，每份取1支檢測試條檢測，結(jié)果應(yīng)全部為陽性。
3.6.4特異性用10份內(nèi)控陰性參比血清進(jìn)行檢定，每份取1支檢測試條檢測，結(jié)果應(yīng)全部為陰性。
3.6.5最低檢出限用定值陽性參考血清進(jìn)行人NT-pro BNP檢測，20分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，最低檢出量對應(yīng)于大于0.9ng/ml。
3.6.6精密度測試取內(nèi)控陽性參比血清3份，每份平行檢測10條，要求反應(yīng)結(jié)果一致，顯色度均一。取內(nèi)控陰性參比血清1份，每份平行檢測10條，要求反應(yīng)結(jié)果一致，顯色均一。
3.6.7穩(wěn)定性試驗37℃放置20天后，其靈敏度、特異性、最低檢出限和均一性應(yīng)符合要求。
二、設(shè)計原理
NT-pro BNP抗原檢測試劑利用膠體金標(biāo)記技術(shù)與反應(yīng)膜體系結(jié)合，形成直接免疫法反應(yīng)模式，用以特異性地檢測人血清中的NT-proBNP特異性抗原。
1、金標(biāo)抗體反應(yīng)體系根據(jù)膠體金標(biāo)技術(shù)特性，使膠體溶液中細(xì)微的金顆粒與鼠抗人NT-proBNP抗體穩(wěn)定結(jié)合，形成紫紅色的膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物。
2、膜反應(yīng)體系NT-proBNP抗原檢測試劑整體反應(yīng)體系是以硝酸纖維膜為固相包被材料，借助吸水材料的虹吸作用，將抗原抗體免疫反應(yīng)結(jié)果以金標(biāo)記紅色沉積線的符號特征表現(xiàn)出來，作為檢測試劑的主體，其膜反應(yīng)體系分別由以下部分構(gòu)成。
S1親和性硝酸纖維膜，經(jīng)預(yù)先處理后制備成反應(yīng)膜用來顯示整體系統(tǒng)的反應(yīng)結(jié)果。
S2吸附力較強(qiáng)的粗纖維吸水紙，主要起虹吸作用。
S3吸附力較強(qiáng)的無紡布，作為金標(biāo)記抗原的固相載體吸附材料。
S4無紡布，其作用加速吸水。
S5、S6分別為不同規(guī)格的雙面膠和單面膠帶，用于固定各種反應(yīng)膜和吸附材料。
S7塑料基板，作為反應(yīng)體的支撐物。
S8箭頭膠帶，起指示作用。
3、操作程序用取樣吸管取80μl全血或血清于樣本檢測端，加入PH值為7.0的PBS樣本緩沖液100ul。5～15分鐘觀察測試區(qū)顯示的結(jié)果。
4、預(yù)期反應(yīng)狀況及結(jié)果肉眼觀察結(jié)果。滴加血清樣本后，吸水材料使待檢樣品緩慢上移，反應(yīng)體系開始啟動。
(1)陰性若被檢樣品中NT-pro BNP特異性抗原濃度小于檢測臨界值，反應(yīng)體系中的金標(biāo)鼠抗人NT-pro-BNP抗體和包被在醋酸纖維膜的抗體無法形成可見的夾心抗原抗體反應(yīng)，即在檢測區(qū)無紅色反應(yīng)線(T線)出現(xiàn)。這時，反應(yīng)體系中的金標(biāo)抗體繼續(xù)向試紙上端爬升，爬至對照線位置時，金標(biāo)記的抗體即于包被的羊抗鼠IgG多抗反應(yīng)結(jié)合，在反應(yīng)區(qū)形成一條紅色沉積對照線(C線)。這表明被測樣品中NT-pro BNP濃度低于最低陽性判別水平，為陰性結(jié)果；同時說明試紙整體反應(yīng)系統(tǒng)工作正常。
(2)陽性若被檢樣品中NT-pro BNP特異性抗原濃度大于檢測臨界值，該抗原先與反應(yīng)體系的金標(biāo)鼠抗人NT-pro-BNP抗體發(fā)生反應(yīng)，形成金標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物。此復(fù)合物繼續(xù)爬行，再與反應(yīng)體中包被在醋酸纖維膜的抗體相遇，形成金標(biāo)鼠抗人NT-pro BNP抗原-鼠抗人IgG抗體(包被在醋酸纖維膜上)的免疫復(fù)合物，在檢測區(qū)有一條紅色沉積反應(yīng)線(T線)出現(xiàn)。同時，過量的金標(biāo)物繼續(xù)爬升與反應(yīng)膜包被的羊抗鼠IgG多抗結(jié)合，在反應(yīng)區(qū)形成第二條紅色沉積反應(yīng)線(C線)。這表明被檢樣品中有NT-pro BNP特異性抗原，為陽性結(jié)果。
(3)無效若反應(yīng)后，在檢測區(qū)無紅色沉積對照線(C線)出現(xiàn)，說明試紙條整體反應(yīng)系統(tǒng)工作不正常。
本發(fā)明采用單盲方法，通過臨床考核對N-末端BNP前蛋白(NT-pro BNP)診斷試劑(膠體金法)(以下簡稱BNP膠體金法診斷試劑)的靈敏度、特異性、精密性等做出評價。
試驗對象2002年12月至2004年6月心衰病例151例，其中男71例，女80例；年齡29-73歲。另選294例非心衰病例(包括正常人群及其它疾病的患者；其中男145例，女149例；年齡21-79歲)做陰性對照組。采集標(biāo)本為血清、血漿或EDTA抗凝全血。標(biāo)本未經(jīng)熱滅活處理，-20℃低溫保存。
表1NT-proBNP試驗的特異性評價

靈敏性(真陽性率)＝98.7％特異度(真陰性率)＝99.2％假陽性率＝22.3％假陰性率＝1.3％陽性試驗的預(yù)示值＝77.6％陰性試驗的預(yù)示值＝99.2％考核試劑盒NT-pro BNP診斷試劑盒，吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室提供。以美國Biosite公司心梗/心衰酶標(biāo)記測試儀檢測作為參比結(jié)果。
表2臨床樣本的兩種BNP試劑盒平行對照測試

陽性符合率95.60％陰性符合率93.16％結(jié)果評價結(jié)果顯示N-末端BNP前蛋白(NT-pro BNP)膠體金診斷試劑可用于快速檢測人全血或血漿中反映心臟功能的NT-pro BNP特異性抗原。假陽性率和假陰性率都較低，具有較高的敏感性、特異性。該檢測試劑陽性實驗的預(yù)示值77.6％，提示陽性結(jié)果可能稍有誤差；陰性實驗預(yù)示值99.2％，表明陰性結(jié)果可用于心衰的排除診斷。
NT-pro BNP(膠體金法)檢測試劑盒對充血性心力衰竭診斷的特異性達(dá)到85.4％，而靈敏度高98.7％。有較高的臨床參考意義。
此外，NT-pro BNP(膠體金法)檢測試劑盒具有下述優(yōu)勢標(biāo)本用量小且能檢查全血標(biāo)本，操作簡便而無需任何儀器，能快速定性，單人份使用。特別適合基層醫(yī)院和急診使用；甚至可作為患者對心功能的自我監(jiān)測。在日趨社區(qū)化的醫(yī)療保健體系中，該試劑盒可望獲得很高的應(yīng)用價值。
采用單盲方法，對145例心衰病例和240例非心衰病例(包括正常人群及其它疾病的患者)進(jìn)行N-末端BNP前體蛋白(NT-pro BNP)膠體金檢測試劑盒(以下簡稱BNP膠體金法診斷試劑)的測定。分析試劑盒的靈敏度、特異性。
檢測標(biāo)本為2002年12月至2004年4月收集的144名心衰病人血清、血漿或EDTA抗凝全血，采集后-20℃低溫保存。另選240非心衰病例(包括正常人群及其它疾病的患者；其中男109，女131；年齡24-79歲)做陰性對照組。參比試劑為美國Biosite公司心梗/心衰測試板及測試儀。規(guī)格25人份/盒；試劑注冊號20023210353；有效期15個月。
考核結(jié)果試驗結(jié)果歸納后填寫表1，試驗數(shù)據(jù)按表2填寫。
表1評價試驗可信性歸納表

靈敏度(真陽性率)＝99.31％特異度(真陰性率)＝85.01％假陽性率＝14.99％假陰性率＝0.69％陽性試驗的預(yù)示值＝80.00％
陰性試驗的預(yù)示值＝99.51％表2臨床樣本的兩種BNP試劑盒平行對照測試

陽性符合率97.63％陰性和符合率93.06％結(jié)果評價根據(jù)對該試劑盒臨床考核結(jié)果認(rèn)為該試劑盒能快速特異地檢測人全血或血清中反映心臟功能的NT-pro BNP特異性抗原。具有高敏感性、特異性、假陽性率低、假陰性率低。陽性實驗的預(yù)示值和陰性實驗預(yù)測值均較高。尤其是其有很高的陰性預(yù)測值可用于心衰的排除診斷，有較高的臨床意義。
NT-pro BNP(膠體金法)檢測試劑盒對充血性心力衰竭診斷的特異性高(85.01％)，靈敏度高99.31％。與美國Biosite公司相關(guān)產(chǎn)品陽性符合率為97.63％，陰性符合率為93.06％，具有較高的相關(guān)性。
典型病例報告(1)甘XX男39歲2004-5-30入院，住院號406105。入院當(dāng)時表現(xiàn)頭面部和下肢水腫，輕度呼吸困難、心前區(qū)雙期雜音、心率97次/分；尿常規(guī)檢查蛋白(+)。取200微升指血，經(jīng)離心后分離血漿；加入試劑盒樣品槽中。20分鐘后檢測區(qū)呈現(xiàn)2條陽性反應(yīng)的紅色沉淀線。這一結(jié)果認(rèn)定水腫并非腎臟病變所致。臨床診斷風(fēng)濕性心臟病、二尖瓣狹窄及關(guān)閉不全、慢性充血性心力衰竭。經(jīng)強(qiáng)心治療后病情好轉(zhuǎn)。
(2)韓XX 女 79歲 2004-4-21入院，住院號403828。既往冠心病史17年，休克入院。本試劑盒檢查為陽性結(jié)果；心電圖左室前壁大面積心肌梗死。入院后雖經(jīng)保護(hù)心肌和升血壓治療，但血壓持續(xù)下降，2004-4-22死亡。心肌梗塞患者的本試劑盒和陽性參照檢查大多為陰性，但陽性時病人常為重患，預(yù)后不良。
權(quán)利要求
1.一種氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒，其制備工藝是a、膠體金溶液的制備在磁力攪拌下加熱超純水，再加入氯金酸溶液，待溶液沸騰后，立即加入檸檬酸三鈉溶液，保持此溶液沸騰，攪拌，冷卻至室溫，保存；b、膠體金標(biāo)記鼠抗人NT-pro-BNP的單克隆抗體制備以碳酸鉀溶液調(diào)整膠體金溶液，加入特異性抗體，反應(yīng)，加入聚乙二醇，離心，調(diào)整測OD值；c、硝酸纖維反應(yīng)膜制備---即檢測線和質(zhì)控線的制備①取特異性抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被檢測線；②用羊抗鼠IgG多克隆抗體在已活化硝酸纖維素膜上包被對照線。③在真空下干燥后備用；d、將粘貼組成板的反應(yīng)體切割，待包裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒，其是應(yīng)用于對血液中氮末端腦利鈉肽前體的臨界值定性進(jìn)行快速檢測。
全文摘要
一種氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒，涉及一種對血液進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明采用高親和力特異性單克隆抗體，按照免疫化學(xué)方法和免疫層析技術(shù)的原理制備的氮末端腦利鈉肽前體的免疫膠體金的快速定性檢測盒。本發(fā)明具有靈敏度高、特異性好、符號顯示結(jié)果、操作簡便、無需特殊儀器設(shè)備、反應(yīng)迅速、5～15分鐘判讀結(jié)果等特點。雖然NT pro－BNP和BNP檢測的意義相同，但NT pro－BNP測定有2個優(yōu)點，半衰期比BNP長而且測定水平的影響因素比BNP少。
文檔編號G01N33/532GK1763531SQ20041001116
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月20日
發(fā)明者方艷秋, 譚巖, 劉力華, 段秀梅, 許淑芬, 姜艷芳, 宋艷, 劉玲麗, 時陽 申請人:吉林大學(xué)第一醫(yī)院