專利名稱：檢測葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌屬中的致病性革蘭氏陽性菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測致病性微生物的技術(shù)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及通過擴(kuò)增并檢測所述致病性革蘭氏陽性菌的特定核酸序列而檢測由臨床樣品中的致病性革蘭氏陽性菌引起的感染的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
致病菌，特別是引起敗血癥的感染，大多發(fā)生且在醫(yī)院的加強(qiáng)監(jiān)護(hù)單元(ICU)中且較為嚴(yán)重。感染患者的細(xì)菌在絕大多數(shù)情況下是未知的且不能根據(jù)癥狀確定。每種細(xì)菌要求使用不同療法，給予特定的抗生素。目前，在常規(guī)診斷中，致病菌，特別是革蘭氏陽性菌是使用下列方法檢測的該方法包括培養(yǎng)血液或其它體液樣品從而使細(xì)菌(如果存在)生長。這類培養(yǎng)在有利于細(xì)菌生長的條件下維持約3天。在該時(shí)間內(nèi)，細(xì)菌數(shù)增加，由此它們的核酸數(shù)也增加。之后，溶解培養(yǎng)基。將溶解混合物用作雜交反應(yīng)的樣品。整個(gè)方法最少花費(fèi)約4天時(shí)間，直到清除任何樣品的致病菌感染。致病菌感染對于受感染的人而言是非常嚴(yán)重的。在感染的第一天，必須開始治療，優(yōu)選給予適于影響特定感染細(xì)菌的抗生素。否則，人將受到嚴(yán)重感染且可能在感染清除前死亡。另一方面，若干抗生素的同時(shí)給藥將阻止所有可能細(xì)菌的生長，從而不可避免地使患者虛弱。因此，該方法對于常規(guī)ICU診斷而言是不能令人滿意的。
長時(shí)間以來，使用特異性雜交探針、通過基于核酸的雜交來鑒定致病性生物如致病性細(xì)菌或真菌為本領(lǐng)域所知。例如，EP 0 131 052公開了方法和探針，其中特定物種或特定生物組的核糖體核糖核酸(rRNA)是從培養(yǎng)基直接檢測的。核糖體靶序列的檢測特別有效，這是由于這些序列是體內(nèi)擴(kuò)增，導(dǎo)致各測定法的高度靈敏性的事實(shí)。
基于致病性生物檢測的核酸序列的改進(jìn)是根據(jù)PCR技術(shù)的有效性實(shí)現(xiàn)的。就致病性真菌，如假絲酵母和曲霉而言，例如，WO 97/07238公開了一種使用通用引物擴(kuò)增所有類型的真菌核糖體18S rRNA序列，隨后與真菌物種特異性探針雜交的方法。
作為分析核糖體基因序列的選擇性方法，非-編碼但轉(zhuǎn)錄的核糖體間隔DNA序列，像位于16S和23S rRNA基因之間的ITS-1區(qū)已經(jīng)用于檢測和鑒定若干致病性生物(見，例如，EP 0 452 596)。
在另一篇文章中，已通過可與等位基因特異性擴(kuò)增方法相比較的靶-依賴性擴(kuò)增區(qū)別了革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的組(Klausegger等人，Journal of Clinical Microbiology 33(1990)464-466)。根據(jù)它們的16S rDNA序列，Klausegger等人研究的物種的區(qū)別在于16S rRNA基因的規(guī)定位置不同，所有研究過的革蘭氏陰性菌都在特定核苷酸位置包含G-殘基，而所有研究過的革蘭氏陽性菌都在所述核苷酸位置包含C-殘基。隨后，使用分別具有區(qū)別性的互補(bǔ)3’-末端C-殘基或互補(bǔ)G-殘基的適宜引物可導(dǎo)致革蘭氏陽性或革蘭氏陰性序列來源的DNA擴(kuò)增。
其它進(jìn)展是在可進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)PCR的基礎(chǔ)上做出的。在該類型的測定法中，在PCR的每個(gè)循環(huán)中監(jiān)測PCR產(chǎn)物的形成。擴(kuò)增通常是在熱循環(huán)儀中測量的，該熱循環(huán)儀還具有用于在擴(kuò)增反應(yīng)過程中監(jiān)測熒光信號的其它檢測工具。典型的例子是Roche DiagnosticsLightCyclerTM(Cat.No.20110468)。在LightCyclerTM以及迄今為止商業(yè)使用的其它實(shí)時(shí)PCR設(shè)備中，擴(kuò)增產(chǎn)物是利用熒光標(biāo)記的雜交探針檢測的，它們僅在與靶核酸結(jié)合時(shí)發(fā)射熒光信號，或在某些情況下也利用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料。測定所分析的所有反應(yīng)的限定信號閾值并測定靶核酸以及參照核酸如標(biāo)準(zhǔn)或管家基因達(dá)到該閾值所需的循環(huán)次數(shù)(Cp)。靶分子的絕對或相對拷貝數(shù)可根據(jù)所獲得的靶核酸及對照核酸的Cp值確定(Roche Diagnostics LightCyclerTM操作人員手冊(Cat.No.2 0110468))。
有不同的檢測擴(kuò)增DNA的方式a)DNA結(jié)合染料方式因?yàn)殡p鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的量通常多于最初存在于所分析樣品中的核酸量，因此可使用雙鏈DNA特異性染料，只要它們與雙鏈DNA結(jié)合，用適宜波長激發(fā)后，即顯示熒光增強(qiáng)。這種方法在EP 0 512 334中描述。優(yōu)選地，僅使用那些染料，例如SYBRGreen I，其不會(huì)影響PCR反應(yīng)的效率。
本領(lǐng)域已知的所有其它方式要求適當(dāng)設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記的雜交探針，其僅在與其靶核酸結(jié)合后發(fā)射熒光。
b)TaqManTM探針用兩種組分標(biāo)記單鏈雜交探針。根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，當(dāng)用適宜波長的光激發(fā)第一組分，即所謂的熒光劑時(shí)，吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二組分，即所謂的猝滅劑。在PCR反應(yīng)的退火步驟過程中，雜交探針結(jié)合靶DNA并在延伸階段過程中，被聚合酶，例如Taq聚合酶的5’-3’-外切核酸酶活性降解。因此，將激發(fā)的熒光組分和猝滅劑彼此空間分開，由此即可測量第一組分的熒光發(fā)射(EP B 0 543 942和US 5,210,015)。
c)分子信標(biāo)還可用第一組分和猝滅劑標(biāo)記這些雜交探針，所述標(biāo)記優(yōu)選位于至少部分自互補(bǔ)的探針的不同末端。由于探針的次級結(jié)構(gòu)，兩組分在溶液中空間鄰近。與靶核酸雜交后，兩組分彼此分開，這樣在用適宜波長的光激發(fā)后，即可測量第一組分的熒光發(fā)射(US 5,118,801)。
d)FRET雜交探針熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)雜交探針試驗(yàn)方式特別用于所有種類的均質(zhì)雜交測定法(Matthews，J.A.和Kr i cka，L.J.，Anal Biochem 169(1988)1-25)。它的特征在于兩個(gè)單鏈雜交探針，它們同時(shí)使用且與(擴(kuò)增)靶核酸相同鏈的相鄰位點(diǎn)互補(bǔ)。用不同熒光組分標(biāo)記兩個(gè)探針。當(dāng)用適宜波長的光激發(fā)時(shí)，按照熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，第一組分將吸收的能量轉(zhuǎn)移至第二組分，這樣一來，只有當(dāng)兩個(gè)雜交探針結(jié)合所檢測靶分子的相鄰位置時(shí)，才可測量第二組分的熒光發(fā)射。
當(dāng)退火于靶序列時(shí)，雜交探針的位置必須彼此非常接近，以頭-尾方式排列。通常，第一探針的標(biāo)記的3’末端與第二探針的標(biāo)記的5’末端之間的間隔要盡可能的小，即1-5個(gè)堿基。這樣使得FRET供體化合物與FRET受體化合物緊密鄰近，通常為10-100埃。詳細(xì)內(nèi)容是熟知的且在，例如，EP0 070 687中公開。
作為監(jiān)測FRET受體組分的熒光增強(qiáng)的可選方法，還可監(jiān)測FRET供體組分的熒光減弱，如雜交事件的定量測量。
具體而言，F(xiàn)RET雜交探針方式可用于實(shí)時(shí)PCR，以便檢測擴(kuò)增的靶DNA。在實(shí)時(shí)PCR領(lǐng)域已知的所有檢測方式中，F(xiàn)RET-雜交探針形式已被證實(shí)十分靈敏，準(zhǔn)確且可靠(WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。然而，適宜的FRET雜交探針序列的設(shè)計(jì)有時(shí)可能受到所檢測靶核酸序列的特殊特性的限制。
作為使用兩個(gè)FRET雜交探針的選擇性方法，還可使用熒光-標(biāo)記的引物和僅僅一個(gè)標(biāo)記的寡核苷酸探針(Bernard，P.S.等人，Anal.Biochem.255(1998)101-7)。在這點(diǎn)上，可任意選擇，無論是用FRET供體還是FRET受體化合物標(biāo)記引物。
FRET雜交探針(也稱作FRET-Hybprobes或FRET探針)還可用于解鏈曲線分析(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。在這類測定法中，首先使用適宜的擴(kuò)增引物在典型PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶核酸。雜交探針在擴(kuò)增反應(yīng)過程中已經(jīng)存在或隨后加入。PCR-反應(yīng)完成后，樣品溫度顯著增加。只要雜交探針與靶DNA結(jié)合即可檢測熒光。在解鏈溫度下，雜交探針自它們的靶釋放出來，且熒光信號立即降至背景水平。這種降低是用適宜熒光與溫度-時(shí)間的曲線監(jiān)測的，這樣即可計(jì)算第一衍生物函數(shù)的負(fù)數(shù)。然后，將與所獲得的這種函數(shù)的最大值相對應(yīng)的溫度值確定為所述FRET雜交探針對的解鏈溫度。
靶核酸內(nèi)的點(diǎn)突變或多態(tài)性導(dǎo)致靶核酸與FRET探針之間的互補(bǔ)性低于100％，由此導(dǎo)致解鏈溫度降低。這樣一來，可通過FRET-Hybprobe雜交共同檢測序列變體的集合，而隨后，所述集合的不同成員可通過進(jìn)行解鏈曲線分析而加以區(qū)別。代替FRET雜交探針，分子信標(biāo)可替代性用于解鏈曲線分析。
在能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和均質(zhì)的實(shí)時(shí)PCR解鏈曲線分析的基礎(chǔ)上，可使用雙鏈DNA結(jié)合染料如SybrGreenTMI，或，可選地，使用專門設(shè)計(jì)的、與不同但相似的靶序列雜交的雜交探針，區(qū)分特定類型的物種或菌株。
在第一種情況下，必須確定所產(chǎn)生的雙鏈PCR產(chǎn)物的解鏈溫度。然而，由于差異，這種方法的應(yīng)用有限，這是因?yàn)楸O(jiān)測序列變異僅導(dǎo)致細(xì)微的解鏈溫度差異，不能被有效監(jiān)測。成功的例子已經(jīng)由Woo等人公開，見Journal of Microbiology 35(1999)23-30，他進(jìn)行了雙曲鉤端螺旋體16S rDNA序列的擴(kuò)增，隨后使用SybrGreenTMI作為DNA結(jié)合染料進(jìn)行解鏈曲線分析，以便區(qū)別雙曲鉤端螺旋體株與來源于不同鉤端螺旋體物種的DNA的非-特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
可選地，雜交探針可以確定探針/靶核酸雜交物的解鏈溫度的方式使用。例如，Espy等人，Journal of Clinical Microbiology 33(2000)795-799公開了通過擴(kuò)增單純皰疹序列，隨后使用FRET雜交探針進(jìn)行分析，以區(qū)別I型HSV和II型HSV基因型，而診斷單純皰疹感染。
此外，WO 01/48237總體上提出擴(kuò)增與溫度依賴性雜交之間的聯(lián)系以檢測不同的致病性物種。然而，WO 01/48237沒有教導(dǎo)能夠?qū)ｉT檢測致病性生物，而不是檢測任意非致病性生物的任何方法或情況。
甚至是目前使用的方法，包括體外擴(kuò)增特異性菌種且隨后檢測所述細(xì)菌，也不能用于需要緊急診斷的情況，例如，ICU，因?yàn)楸仨氝M(jìn)行各細(xì)菌的擴(kuò)增反應(yīng)和檢測反應(yīng)。這要求從每名患者中抽取大體積的樣品，如血液。在ICU中，從嚴(yán)重感染的患者中抽取大體積的樣品是不可行的。
因此，本領(lǐng)域需要提供特別用于檢測相關(guān)目標(biāo)致病性生物的方法。具體而言，本領(lǐng)域需要能夠檢測所有相關(guān)致病性革蘭氏陽性菌，但同時(shí)不檢測類似非-致病性革蘭氏陽性菌的方法。特別是，需要確定樣品中存在的致病性屬和/或種。
發(fā)明簡述上述問題是通過本申請中公開和要求保護(hù)的方法和化合物加以解決的。
因此，本發(fā)明涉及一種鑒定臨床樣品中的革蘭氏陽性致病生物或?qū)儆谥虏⌒愿锾m氏陽性菌預(yù)定組的成員的生物亞群的方法，包括a)分離含有至少部分純化的核酸的臨床樣品，b)使所述臨床樣品經(jīng)過至少一次擴(kuò)增和檢測，包括ba)使用至少一組擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增來自所述革蘭氏陽性致病性生物所屬的致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定亞組的預(yù)選核酸序列區(qū)，bb)使用至少一種雜交試劑進(jìn)行的檢測步驟，所述雜交試劑能夠檢測來自致病性革蘭氏陽性菌的所述預(yù)定亞組的所述預(yù)選核酸序列區(qū)，其中所述檢測步驟bb)包括步驟bba)監(jiān)測預(yù)選溫度下的雜交，所述雜交指示樣品中存在包含于所述亞組中的至少一個(gè)物種，和bbb)監(jiān)測雜交的溫度依賴性，所述溫度依賴性指示至少存在所述致病性革蘭氏陽性菌或所述生物亞群中的物種，c)根據(jù)bb)中監(jiān)測步驟的結(jié)果鑒定所述生物或所述生物亞群。
本發(fā)明還涉及適于進(jìn)行上述方法的組合物。
此外，本發(fā)明涉及適于進(jìn)行上述方法的試劑盒。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供特別適于診斷革蘭氏陽性菌的致病性感染的方法和化合物。在這點(diǎn)上，如果患者被懷疑感染革蘭氏陽性菌，則本發(fā)明提供一種確定所述致病性革蘭氏陽性生物的物種的方法。此外，本發(fā)明的新方法，特別是與實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，如LightCyclerTM系統(tǒng)聯(lián)合使用時(shí)，能夠快速診斷引起敗血癥的感染劑，其對于很多臨床環(huán)境都是非常重要的。
因此，總的說來，本發(fā)明涉及鑒定臨床樣品中的革蘭氏陽性致病生物或?qū)儆谥虏⌒愿锾m氏陽性菌預(yù)定組的成員的生物亞群的方法，包括a)分離含有至少部分純化的核酸的臨床樣品，b)使所述臨床樣品經(jīng)過至少一次擴(kuò)增和檢測，包括ba)使用至少一組擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增來自所述革蘭氏陽性致病性生物所屬的致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定亞組的預(yù)選核酸序列區(qū)，bb)使用至少一種雜交試劑進(jìn)行的檢測步驟，所述雜交試劑能夠檢測來自致病性革蘭氏陽性菌的所述預(yù)定亞組的所述預(yù)選核酸序列區(qū)，其中所述檢測步驟bb)包括步驟bba)監(jiān)測預(yù)選溫度下的雜交，所述雜交指示樣品中存在包含于所述亞組中的至少一個(gè)物種，和bbb)監(jiān)測雜交的溫度依賴性，所述溫度依賴性指示至少存在所述致病性革蘭氏陽性菌或所述生物亞群中的物種，c)根據(jù)bb)中監(jiān)測步驟的結(jié)果鑒定所述生物或所述生物亞群。
在本發(fā)明中，上面所用的特定術(shù)語定義如下術(shù)語“鑒定致病性革蘭氏陽性生物”用于描述確定樣品中是否存在革蘭氏陽性菌預(yù)定組或亞組中所含物種內(nèi)的特定物種或菌株或分離物的方法。鑒定的輸出或結(jié)果是物種或菌株或分離物的名稱。這使得隨后能夠進(jìn)行選擇性抗生素療法的適當(dāng)選擇。
術(shù)語“致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組”用于描述由作為特定任務(wù)目標(biāo)的致病性革蘭氏陽性菌組成的致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組。優(yōu)選地，革蘭氏陽性菌的預(yù)定組可以是所有致病性革蘭氏陽性菌的組，在已知的臨床環(huán)境下，它們在臨床上相關(guān)聯(lián)，且其被擴(kuò)增的各基因組序列基本上是本領(lǐng)域已知的。
例如，這種預(yù)定組可包括兩個(gè)或多個(gè)屬的臨床相關(guān)成員。可選擇性地，特定屬的所有已知臨床相關(guān)成員可構(gòu)成這種預(yù)定組?？蛇x擇性的，特定物種的所有已知的臨床相關(guān)成員或菌株或分離物可構(gòu)成這種預(yù)定組。預(yù)定組還可包括不同屬的分類學(xué)亞組，與來源于其它屬或物種的菌株混合。
術(shù)語“特異性”用于描述受試者的特征(例如方法、步驟或試劑)，所述受試者僅涉及特定和限定的結(jié)果。例如，如果只檢測特定物種，但不檢測其它物種，則用于檢測該物種的方法被認(rèn)為是特異的。探針與靶的特異性雜交是僅在探針與靶之間發(fā)生，而不是與其它核酸分子發(fā)生的雜交。
在本文中，本發(fā)明的整個(gè)方法優(yōu)選在生物鑒定方面基本上是特異的。優(yōu)選不鑒定不屬于預(yù)定組或亞組成員的生物，這是因?yàn)槭褂迷噭┻M(jìn)行的步驟被調(diào)整為不檢測不屬于該組的生物。這并非必需指整個(gè)方法的每個(gè)步驟都是特異性的，而這是可能的。例如，如果選擇對所鑒定生物為非特異性的擴(kuò)增引物(那些引物可用于擴(kuò)增不鑒定的生物的核酸)，步驟ba)可以是非特異性的。整個(gè)方法的特異性可通過選擇特異性檢測步驟的一個(gè)或多個(gè)部分，例如步驟bbb)來實(shí)現(xiàn)。作為例子，本發(fā)明包括下列實(shí)施方案，其中步驟bba)產(chǎn)生陽性信號，這是由于雜交試劑與預(yù)定組成員的核酸和樣品或/和步驟ba)中擴(kuò)增的非-靶核酸雜交，但在步驟bbb)監(jiān)測溫度依賴性中，僅證實(shí)了預(yù)定組成員物種的身份，與非-靶核酸的身份無關(guān)。
作為與本領(lǐng)域已知方法相比的主要優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明首次選擇性鑒定了細(xì)菌屬或種的致病性成員，而沒有鑒定其它已知的、所述屬或種的非-致病性成員。
在本文中，值得注意的是，如果所分析的臨床樣品含有新的、具有新的稍稍不同于靶序列的先前未知的菌株，那么有時(shí)候本發(fā)明的新方法可導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。如果擴(kuò)增并檢測未知的非-致病性生物，步驟bba)的結(jié)果將是假陽性的。然而，在這種情況下，假陽性結(jié)果可在要求保護(hù)方法的步驟bbb)，即雜交的溫度依賴性的監(jiān)測過程中檢測。在這種情況下，比較步驟bbb)的溫度依賴性和已知致病性生物的溫度依賴性可表明該生物不屬于預(yù)定組的物種，即步驟c)的結(jié)果將是陰性的。在未知的致病性生物沒有被擴(kuò)增或檢測的情況下，則結(jié)果是假陰性的。然而，根據(jù)迄今為止本發(fā)明人進(jìn)行的有關(guān)臨床分離物的所有研究，這些情況是非常少見的且，此外，不能由本領(lǐng)域已知的任何其它類似方法避免。
術(shù)語“革蘭氏陽性菌的預(yù)定亞組”用于描述致病菌預(yù)定組的一部分或全部。優(yōu)選地，預(yù)定亞組僅是所有致病性革蘭氏陽性菌的一小部分，更優(yōu)選是主要存在于醫(yī)院中的細(xì)菌。所述組和亞組的成員可從一個(gè)屬選擇，但也可從不同屬選擇。如果預(yù)定組由屬的所有致病性和臨床相關(guān)成員代表，則各亞組可包含特定物種的所有各致病性成員。同樣，如果所述預(yù)定組由特定物種的所有臨床相關(guān)成員組成，那么所述亞組可由特定菌株的所有成員組成。其中一個(gè)非常優(yōu)選的亞組由物種金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌(稱作I組)和菌株組成。另一優(yōu)選亞組由金黃色葡萄球菌和所有凝固酶陰性葡萄球菌組成。另一優(yōu)選亞群由屎腸球菌和糞腸球菌組成。
術(shù)語“擴(kuò)增和檢測反應(yīng)”是指任何類型的體外方法，它包括一個(gè)或多個(gè)“擴(kuò)增步驟”，從而擴(kuò)增核酸序列集合中的一個(gè)或多個(gè)靶序列，它還包括一個(gè)或多個(gè)“檢測步驟”，從而揭示擴(kuò)增產(chǎn)物的身份。
術(shù)語“擴(kuò)增步驟”是指通過使用從含DNA樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的正向和反向引物而擴(kuò)增靶序列-如果存在于臨床樣品中-的反應(yīng)或一系列反應(yīng)。所述擴(kuò)增步驟的特異性取決于所選的組且由所用引物的特異性支配。優(yōu)選地，擴(kuò)增是使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增通常對細(xì)菌是特異性的，即，病毒并沒有被大量擴(kuò)增。
優(yōu)選地，擴(kuò)增步驟對亞組成員是特異性的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增對所鑒定物種所屬的屬是特異性的。
術(shù)語“檢測步驟”是指通過與適宜雜交試劑雜交而檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，包括監(jiān)測所述試劑與靶核酸雜交的溫度依賴性。擴(kuò)增和檢測不是必需分開且連續(xù)進(jìn)行，而是可同時(shí)進(jìn)行。
術(shù)語“預(yù)選核酸序列區(qū)”是指存在于所要擴(kuò)增和檢測的所有生物DNA中的獨(dú)特靶核酸區(qū)。根據(jù)實(shí)施方案不同，在不同生物的序列之間可存在某些序列變異。換句話說，它常常是各生物的相同基因或相同同源序列，其被擴(kuò)增。這種區(qū)的例子是16S/23S rDNA間隔區(qū)，即編碼16S和23S rRNA的序列或其一部分之間的區(qū)。更優(yōu)選地，預(yù)選核酸序列區(qū)包含來自所擴(kuò)增生物的16S/23S間隔區(qū)的至少20個(gè)、甚至更優(yōu)選超過40個(gè)連續(xù)的核酸堿基。該區(qū)包含進(jìn)化保守的以及高變的序列，其允許屬和種特異性引物和探針的靈活設(shè)計(jì)。所述區(qū)包含在由核酸上的引物結(jié)合位點(diǎn)限定的區(qū)內(nèi)。
術(shù)語“致病性”是指如果人類被細(xì)菌感染，則該細(xì)菌可影響人類的健康狀況。本發(fā)明的要點(diǎn)涉及引起敗血癥的細(xì)菌的鑒定。在這種情況下，是該預(yù)定組。
術(shù)語“擴(kuò)增引物組”是指至少兩個(gè)(可延伸的)寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，即，至少一個(gè)結(jié)合靶核酸的第一條鏈的(正向)引物，和至少第二個(gè)結(jié)合所擴(kuò)增的靶核酸序列的相反鏈的(反向)引物。此外，引物的定位是以這種方式設(shè)計(jì)的，即每個(gè)引物的模板依賴性延伸產(chǎn)生延伸產(chǎn)物，其本身包括可與其它引物雜交的引物結(jié)合位點(diǎn)。
在絕大多數(shù)情況下，使用由一個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物組成的一對兩個(gè)擴(kuò)增引物就已足夠。然而，在某些情況下，在所鑒定的不同致病性革蘭氏陽性菌不同序列的引物結(jié)合位點(diǎn)序列中可能存在某些微小的序列變異。因此，不可能僅通過使用一個(gè)正向和一個(gè)反向引物來擴(kuò)增所有成員的序列。就那些情況而言，一組擴(kuò)增引物可由1個(gè)、2個(gè)、或更多正向引物和/或1個(gè)、2個(gè)或更多反向引物組成，它們是相似的且結(jié)合同源序列，但由于一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或若干單核苷酸-、二核苷酸-或三核苷酸的置換、缺失或添加而彼此不同。
此外，如果使用兩組、三組或多組能夠擴(kuò)增不同預(yù)選核酸序列區(qū)的擴(kuò)增引物，則也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這種情況下，所述不同預(yù)選核酸序列并非必需在序列方面彼此相關(guān)。然而，如果不同的預(yù)選核酸序列區(qū)是至少部分或幾乎完全重疊的，則它也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通常，擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)是以有關(guān)所擴(kuò)增致病菌的預(yù)選靶核酸序列區(qū)以及有關(guān)不擴(kuò)增的那些革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的同源序列的可獲得的序列信息為基礎(chǔ)進(jìn)行的。更確切而言，一組或多組擴(kuò)增引物是以下列方式選擇的，即對于致病性革蘭氏陽性菌的所選預(yù)定組的所有靶核酸序列存在最大序列互補(bǔ)性，且，另一方面，對于所有其它未選革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，即不屬于預(yù)定組或不是致病性的那些以及真菌的核酸序列存在最小序列互補(bǔ)性。
術(shù)語“雜交試劑”用于描述能夠在預(yù)選核酸序列區(qū)內(nèi)，即在擴(kuò)增子至少一個(gè)鏈上與步驟bb)的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的試劑。所述試劑可包含一個(gè)或多個(gè)探針，其優(yōu)選單鏈的或在雜交前被制成單鏈的。優(yōu)選地，所述試劑是單鏈核酸雜交探針系統(tǒng)，它通常包括能夠與雙鏈擴(kuò)增靶核酸的其中一個(gè)鏈雜交的一個(gè)或兩個(gè)核酸。根據(jù)檢測方式類型的不同，如果用可檢測實(shí)體適當(dāng)標(biāo)記雜交試劑，它在絕大多數(shù)情況下是有利的，這樣就可通過所述標(biāo)記的檢測來檢測擴(kuò)增子/雜交-試劑雜交體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用熒光實(shí)體標(biāo)記雜交試劑，這樣就可在商業(yè)所用的實(shí)時(shí)PCR設(shè)備中檢測雜交。用于此目的的試劑在上述描述用于擴(kuò)增DNA檢測的不同方式的文獻(xiàn)中公開。
簡單情況中的雜交試劑可以是寡核苷酸探針。例如，可應(yīng)用Molecular Beacon Format(US 5,118,801)。可選擇性地，還可使用適宜的單一標(biāo)記的寡核苷酸(WO 02/14555)。在此引用這些文獻(xiàn)，以便引入其中涉及試劑和檢測方法的內(nèi)容。
更優(yōu)選地，雜交試劑由兩個(gè)相鄰雜交的寡核苷酸組成，將它們適當(dāng)標(biāo)記，這樣一來它們就可按照上面公開的FRET-Hybprobe檢測方式共同發(fā)揮作用(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。
此外，在本文中，術(shù)語“FRET對”被定義為一對熒光標(biāo)記，它們可共同發(fā)揮作用，產(chǎn)生FRET過程，即它由FRET供體部分和FRET受體部分組成。
與設(shè)計(jì)一組擴(kuò)增引物組相似，雜交試劑或多種雜交試劑的設(shè)計(jì)也是以有關(guān)所擴(kuò)增和檢測的預(yù)選靶核酸序列以及有關(guān)那些不檢測的致病性革蘭氏陽性菌的同源序列的所有可獲得的序列信息為基礎(chǔ)進(jìn)行的。更確切而言，雜交試劑的序列是以下列方式選擇的，即對于致病性革蘭氏陽性菌的所選預(yù)定組的所有靶核酸序列具有最大序列互補(bǔ)性，且，另一方面，對于所有其它未選擇的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的所有同源核酸序列具有最小序列互補(bǔ)性。
此外，雜交試劑的設(shè)計(jì)需要考慮到可基于監(jiān)測雜交的溫度依賴性來區(qū)別若干靶序列變異。本發(fā)明要求雜交試劑與來源于不同致病性革蘭氏陽性菌的不同靶序列變體的雜交具有不同的解鏈溫度。因此，本發(fā)明雜交試劑的序列是以這種方式設(shè)計(jì)的，即不同雜交試劑/靶序列雜交體的計(jì)算解鏈溫度(通過本領(lǐng)域已知方法計(jì)算的)彼此相差至少2℃、優(yōu)選至少4℃且最優(yōu)選至少6℃。
總之，本發(fā)明提供設(shè)計(jì)亞組，優(yōu)選屬特異性雜交試劑的可能性，其特征在于它們可檢測屬于特定預(yù)定組的特定亞組屬的所有致病性成員。可選擇性地，可設(shè)計(jì)物種或菌株特異性雜交試劑，其允許檢測屬于特定預(yù)定組的特定種類的所有致病性菌株。
術(shù)語“監(jiān)測雜交的溫度依賴性”是指根據(jù)測定法預(yù)期準(zhǔn)確度的要求，監(jiān)測反應(yīng)混合物的特征達(dá)一段時(shí)間或以一定間隔進(jìn)行監(jiān)測，其隨著雜交體的解離而改變且依賴于雜交體的解離。通常，且與使用標(biāo)記探針的雜交測定法聯(lián)合，特征是受探針上標(biāo)記的影響且隨著探針與擴(kuò)增子/靶雜交而改變的信號。
在本文中，雜交體的解鏈溫度(Tm)被定義為雜交的第一衍生物對溫度信號曲線達(dá)到最大值的溫度。Tm是雜交體的特征，取決于鏈的互補(bǔ)性。
在本發(fā)明中，優(yōu)選探針的退火溫度低于所用引物的解鏈溫度。
特征的改變將特定在每個(gè)雜交體的解鏈溫度下或解鏈溫度周圍發(fā)生。解鏈溫度是通過特定的雜交試劑和與試劑結(jié)合的每個(gè)靶的相應(yīng)區(qū)決定的。具體而言，在本發(fā)明的方法中，將探針從與靶核酸/擴(kuò)增子形成的雜交復(fù)合物上解離下來的溫度確定為解鏈溫度。在本文中，值得注意的是，解鏈溫度(Tm)取決于若干因素，這些因素與實(shí)際的靶核酸序列本身，如鹽濃度、探針長度和GC-含量無關(guān)。此外，解鏈溫度很大程度取決于錯(cuò)配的數(shù)目，即，探針與靶序列之間的互補(bǔ)程度。因此，在不同物種或不同屬的不同物種的不同菌株中發(fā)現(xiàn)的靶序列得到不同的解鏈溫度。因此，使用適宜的探針設(shè)計(jì)，一個(gè)類型的雜交試劑(例如一個(gè)探針)可用于生物預(yù)選組的所有成員的檢測并通過監(jiān)測雜交的溫度依賴性區(qū)別所述成員。在這種情況下，所用探針的核苷酸序列與第一種革蘭氏陽性致病生物(例如，屎腸球菌)的靶區(qū)上的序列互補(bǔ)，但與第二種革蘭氏陽性致病菌(例如，糞腸球菌)的靶區(qū)上的序列稍有不同(例如，1個(gè)或2個(gè)核苷酸不同)。
術(shù)語“指示所述亞組中包含的至少一個(gè)物種”或“…所述屬中”是指如果雜交信號在步驟bba)中出現(xiàn)，那么可從步驟c)推斷出所述亞組或所述特定屬的致病生物可分別存在于從患者采集的樣品中。根據(jù)一組或多組擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)(例如，序列)，且此外，根據(jù)雜交試劑的設(shè)計(jì)，從不同雜交試劑的信號獲得的雜交信號甚至可指示所檢測致病生物的物種。優(yōu)選地，根據(jù)步驟bba)測定的雜交信號明確指示預(yù)定組其中一個(gè)成員的存在，但并非必需直接知曉究竟存在哪個(gè)成員。
術(shù)語“至少指示物種”是指基于在步驟bbb)中監(jiān)測雜交溫度依賴性的結(jié)果，從步驟c)明確推斷出哪個(gè)致病物種存在于臨床樣品中。由于一組或多組擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和雜交試劑的設(shè)計(jì)，從監(jiān)測雜交溫度依賴性獲得的數(shù)據(jù)指示物種的身份，甚至指示各致病生物的特定菌株。即使樣品可包含與靶序列相似或相同的非-靶序列，它們也不能被擴(kuò)增，因?yàn)樗鲆锊贿m于擴(kuò)增非-靶區(qū)。
術(shù)語“生物亞群”用于描述物種的預(yù)定集合，它們?nèi)慷际侵虏⌒愿锾m氏陽性菌預(yù)定組和預(yù)定亞組的成員。大多數(shù)情況下，這些生物屬于一個(gè)屬。這類組的例子是凝固酶陰性葡萄球菌(CoNS)的組，其包含表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌，或綠色鏈球菌組，其包含緩癥鏈球菌、變異鏈球菌和牛鏈球菌。所述亞群優(yōu)選包含少于10個(gè)、更優(yōu)選少于7個(gè)物種。鑒定生物是否存在于所述亞群中的本發(fā)明方法并非必需提供臨床樣品中包含所述亞群物種的結(jié)果。
總之，本發(fā)明提供一種鑒定革蘭氏陽性致病菌的方法，其中在第一擴(kuò)增步驟中使用一組或幾組適宜的引物對，擴(kuò)增所有目標(biāo)致病性革蘭氏陽性菌的序列，隨后利用適宜的雜交試劑檢測。由于適宜的引物和探針設(shè)計(jì)，非-致病性革蘭氏陽性菌或其它微生物的序列沒有被擴(kuò)增或沒有被檢測，或被擴(kuò)增而未被檢測。如果發(fā)生與不同的雜交試劑雜交，則至少指示革蘭氏陽性感染劑的亞組或?qū)佟?br> 隨后，監(jiān)測溫度依賴性熒光，例如，以如下形式使樣品經(jīng)歷溫度的連續(xù)升高并測定發(fā)生靶核酸與雜交試劑之間的解鏈的溫度。然后，監(jiān)測到的解鏈溫度至少指示已經(jīng)存在于原始樣品中的各病原體的物種甚或亞種或菌株。
通常，特別應(yīng)用新方法且該新方法在下列情況下是有效的，其中事先已經(jīng)知曉患者具有革蘭氏陽性致病菌感染，但所述感染劑的準(zhǔn)確身份還未可知。
與所要求方法的不同步驟的定義無關(guān)，應(yīng)了解步驟a)、b)和c)優(yōu)選相繼順序進(jìn)行，第一步是步驟a)，第二步是步驟b)，第三步是步驟c)。還可在這些步驟之前、之間和之后進(jìn)行其它步驟。
本發(fā)明方法的起始材料是臨床樣品，其被懷疑含有革蘭氏陽性菌。這種臨床樣品的例子是全血、血清和腦脊液。優(yōu)選起始材料是人類來源的。
步驟a)常常是首先并按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。在本文中，“臨床樣品”可理解為樣品，優(yōu)選流體，其來源于含核酸，包括所鑒定生物核酸的臨床樣品。
為了獲得檢測感染的充足敏感度，本發(fā)明方法要求來源于原始樣品的核酸至少部分純化。所分離的核酸可以是RNA或DNA或其混合物。作為本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案，使用細(xì)菌DNA用于致病性生物的最終鑒定，它無需臨床樣品含RNA。因此，無需將RNA從臨床樣品中部分或者甚至完全分離出來。DNA從臨床樣品中的分離應(yīng)是充分且完全的，因?yàn)樾枰邮站哂嘘栃詫φ盏男盘枴?br> 特別是，將核酸從存在于原始樣品中的蛋白、糖和鹽中分離出來。本發(fā)明可使用本領(lǐng)域已知的任何純化方法。優(yōu)選地，所用方法可將所要分析的總DNA從臨床樣品其它組分基本完全純化。至少，純化應(yīng)進(jìn)行至沒有任何進(jìn)一步大量稀釋，樣品等分試樣中的核酸序列可在體外擴(kuò)增，如PCR中被成功擴(kuò)增的程度。在純化中，除去核酸中充分抑制聚合酶的任何化合物。特別有效的核酸分離方法在WO 96/41811中公開。
步驟a)的結(jié)果通常是包含來源于原始臨床樣品的核酸的流體以及另外在分離步驟過程中加入的試劑，如緩沖液。在步驟b)中，臨床樣品或其一部分經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增和檢測反應(yīng)可包括一個(gè)或多個(gè)步驟。擴(kuò)增和檢測反應(yīng)兩者都是本領(lǐng)域已知的。擴(kuò)增是使用體外方法，優(yōu)選PCR進(jìn)行的(EP 0 201 184)。下文中提到PCR，但應(yīng)了解其它體外方法也是適宜的。擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果是產(chǎn)生所述引物的大量延伸產(chǎn)物，主要具有從一個(gè)引物的5’-末端位置到另一引物的5’-末端位置的序列。所產(chǎn)生的那些核酸通常被稱作“擴(kuò)增子”。
為了避免由存在于臨床樣品中并用于量化目的的抑制性殘余組分所致的假陰性結(jié)果，已經(jīng)證實(shí)如果加入內(nèi)部對照模板是特別有利的。通常，所述對照模板包括已知序列，該序列具有與用于擴(kuò)增所檢測靶核酸序列的至少一組擴(kuò)增引物互補(bǔ)的引物結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果，所述擴(kuò)增引物組也能夠引發(fā)對照模板所選序列的擴(kuò)增。使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，特別是用于量化的詳細(xì)描述在EP 0 497 784中公開。
已經(jīng)證實(shí)使用具有10-100μl體積的臨床樣品等分試樣進(jìn)行本發(fā)明的方法是有利的。因此，本發(fā)明方法可以充足的靈敏度進(jìn)行，只要得到少量臨床樣品如全血或血清即可。
然而，最終，本發(fā)明方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方法的結(jié)果可受到存在于臨床樣品中的人基因組DNA的高水平背景的影響。如果是這種情況，可按照WO01/94634進(jìn)行預(yù)-擴(kuò)增步驟，其特征在于選擇性擴(kuò)增選擇性非-人DNA序列。
就步驟b)而言，可能存在異源和同源實(shí)施方案。在異源實(shí)施方案中，首先加入步驟ba)所需的試劑并首先進(jìn)行擴(kuò)增步驟ba)。隨后進(jìn)行步驟bb)，且任選包括補(bǔ)充其它檢測試劑。在較之非均質(zhì)實(shí)施方案十分優(yōu)選的均質(zhì)實(shí)施方案中，在開始擴(kuò)增步驟ba)之前，將擴(kuò)增和檢測步驟所用試劑加入到樣品中。在某些情況下，步驟ba)和步驟bba)可并列進(jìn)行，即在擴(kuò)增過程中進(jìn)行雜交監(jiān)測，以針對每次熱循環(huán)過程中或之后或至少在進(jìn)行若干次熱循環(huán)之后的PCR。在這種情況下，優(yōu)選所述步驟bba)的預(yù)選溫度通常與PCR熱循環(huán)方案的退火溫度相同或非常相似。退火溫度是雜交試劑(例如探針)與其靶(即，所擴(kuò)增的核酸或/和在早期延伸反應(yīng)中形成的擴(kuò)增子)雜交的溫度。為了獲得充分的雜交特異性(即，為了主要檢測靶序列)，選擇退火溫度，這樣探針就可主要退火/雜交于靶核酸，但不會(huì)退火/雜交于不鑒定的生物核酸。影響探針與核酸雜交的選擇性的方法是廣泛已知的(長度、GC-含量和互補(bǔ)程度)。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在均質(zhì)測定方式中，順序進(jìn)行擴(kuò)增步驟ba)和檢測步驟bb)，其特征在于在擴(kuò)增步驟過程中，反應(yīng)混合物內(nèi)已經(jīng)存在一種或多種雜交試劑。換句話說，擴(kuò)增步驟ba)和檢測步驟bb)在同一反應(yīng)容器中進(jìn)行且在步驟之間無需加入其它試劑。
然而可選擇性地，如果在擴(kuò)增步驟ba)之后，將反應(yīng)混合物分成至少2、3、4或若干小份，則至少在某些情況下它可能是有利的。然后使用至少相同數(shù)量的不同雜交試劑進(jìn)行步驟bb)，每一個(gè)在不同的反應(yīng)容器中進(jìn)行。
步驟bba)是測量雜交的雜交試劑信號的步驟，其是按照常規(guī)的均質(zhì)核酸雜交進(jìn)行的，特別是按照上述不同方法在LightCycler上進(jìn)行的。
步驟bba)和bbb)優(yōu)選共同進(jìn)行，即首先在預(yù)選的第一溫度下監(jiān)測雜交事件本身。然后，持續(xù)升高溫度到至少含雜交試劑的雜交體被分辨的溫度。換句話說，進(jìn)行雜交體的解鏈曲線的分析。
更準(zhǔn)確地說，擴(kuò)增反應(yīng)后，在第一溫度，例如90-100℃下使PCR產(chǎn)物變性(在有雜交試劑存在的條件下)，隨后冷卻至第二溫度，所述第二溫度與PCR方案的退火溫度相似或相同。然后以0.01-10℃/s，優(yōu)選0.1-2℃/s，且最優(yōu)選0.5-1℃/s的速率升高溫度。
一旦進(jìn)行充足數(shù)量的循環(huán)Cp以利用溫度依賴性將所存在的任何靶序列擴(kuò)增至可檢測水平，則優(yōu)選進(jìn)行監(jiān)測步驟bbb)。它通常與通過探針雜交檢測的核酸量一致，即，只要在步驟bba)中測量到清晰的陽性信號，即可進(jìn)行步驟bbb)。優(yōu)選Cp在20-40之間。
如果在擴(kuò)增反應(yīng)過程中監(jiān)測雜交(其也被稱作“實(shí)時(shí)”)，則可忽略解鏈曲線分析的情況，只要不能在預(yù)選溫度下發(fā)現(xiàn)雜交信號。
步驟c)包括解釋在步驟bb)過程中獲得的結(jié)果。這可通過解釋所得結(jié)果人工進(jìn)行。優(yōu)選地，使用計(jì)算機(jī)程序分析結(jié)果，其產(chǎn)生的結(jié)果可清楚表明樣品中是否存在革蘭氏陽性菌和存在哪種革蘭氏陽性菌并因此引起感染。
解釋是基于步驟bba)和bbb)獲得的信號與已知的陽性對照值之間的關(guān)聯(lián)。陽性對照的使用通常也是現(xiàn)有技術(shù)已知的。陽性對照是已知存在于樣品中或存在于人工制備的對照樣品中的核酸。例如，預(yù)選溫度下探針雜交的特異性用于確定樣品中是否存在核酸，該核酸已經(jīng)通過步驟ba)中的引物被擴(kuò)增且屬于所述革蘭氏陽性致病生物的亞組。陽性信號(與陰性對照相比)指示存在屬于所述亞組的種的物種(步驟bba)，即使沒有從步驟bba)確定所述物種的身份。
雜交的溫度依賴性用于鑒定存在于樣品中的物種。通過該步驟，可確定是所述生物屬于所述亞組的哪一物種，其存在是從步驟bba確定的。例如，它的解鏈溫度指示特定物種的核酸。因此，實(shí)際樣品中預(yù)定物種的存在可通過達(dá)到靶與雜交試劑的雜交體解鏈溫度時(shí)信號的改變加以證實(shí)。
在第一個(gè)具體實(shí)施方案中，致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組包括2個(gè)或更多下列物種和菌株。
金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、綠色鏈球菌組(緩癥鏈球菌、變異鏈球菌和牛鏈球菌)、屎腸球菌、糞腸球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌(被稱作I組)。
優(yōu)選地，這種方法不能充分檢測任何其它致病性和非致病性生物，優(yōu)選它不能檢測下列物種和生物大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、綠膿假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、白色假絲酵母、熱帶假絲酵母、近平滑假絲酵母、克魯斯氏假絲酵母、團(tuán)假絲酵母、煙曲霉(被稱作II組)。
最優(yōu)選地，這類方法可檢測由I組所有物種組成的生物組，但不能檢測屬于II組的任何生物。
在第二個(gè)具體實(shí)施方案中，致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組包括屎腸球菌和糞腸球菌物種和菌株，但不檢測II組的任何生物。
在第三個(gè)具體實(shí)施方案中，致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組包括金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌物種和菌株，但不檢測II組的任何生物。所鑒定的生物是金黃色葡萄球菌(物種)和CoNS(亞型，中間沒有差異)。
該區(qū)含有進(jìn)化保守的以及高變的序列，其允許屬和物種特異性引物和探針的靈活設(shè)計(jì)。
因此本發(fā)明還涉及如上所述檢測致病性革蘭氏陽性菌的方法，其中使用至少一組SEQ ID NO1和2(腸球菌)和SEQ ID NO7和8(葡萄球菌)的擴(kuò)增引物。
此外，本發(fā)明提供按照本發(fā)明中公開的方法，通過擴(kuò)增并檢測ITS-1序列而用于鑒定致病性革蘭氏陽性菌的化合物和試劑盒。
一方面，本發(fā)明提供一種組合物，它含有上面定義的至少一組擴(kuò)增引物，優(yōu)選具有SEQ ID NO1和2(腸球菌)和SEQ ID NO7和8(葡萄球菌)的序列。
第二方面，本發(fā)明提供一種組合物，還含有至少兩對FRET雜交探針，其中所述兩對選自下組FRET對SEQ ID NO.3和4SEQ ID NO.5和6SEQ ID NO.9和10。
除了上面公開的成分外，本發(fā)明組合物可包含一種或幾種其它化合物和試劑，它們選自下列-緩沖液，用于聚合酶鏈反應(yīng)-脫氧核苷三磷酸鹽-模板依賴性DNA聚合酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性的，每一種均分開或組合。
此外，這種組合物還可包含至少部分純化的核酸，其可以，例如，來源于臨床樣品或經(jīng)過本發(fā)明任何方法處理。
一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，它含有至少一組擴(kuò)增引物，所述引物具有SEQ ID NO1和2(腸球菌)和SEQ ID NO7和8(葡萄球菌)的寡核苷酸序列。
第二方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，它還含至少兩個(gè)FRET雜交探針，其中所述雜交探針能夠與擴(kuò)增子雜交，所述擴(kuò)增子是通過擴(kuò)增任何腸球菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的任何致病生物的16S/23S rRNA間隔區(qū)的至少20個(gè)核苷酸而制備的。
除了上面公開的成分外，本發(fā)明試劑盒可包含一種或幾種其它化合物和試劑，它們選自下列-緩沖液，用于聚合酶鏈反應(yīng)-脫氧核苷三磷酸鹽-模板依賴性DNA聚合酶，優(yōu)選熱穩(wěn)定性的，上面公開的各組分可在單一貯存容器中貯存。然而，也可將組分的任何組合貯存于同一容器內(nèi)。
此外，這種試劑盒還可包含軟件工具，如攜帶定性或定量分析通過所要求保護(hù)方法獲得的數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)程序的光盤。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)菌測定法的不同之處在于已知測定法僅提供有關(guān)一個(gè)特定物種或菌株的信息(檢測樣品中是否存在特定生物的常規(guī)方法)，而本發(fā)明的試劑適用于有效鑒定兩個(gè)或更多物種，且同時(shí)表明它們中的任何一個(gè)是否存在(與哪種生物無關(guān))。
參考文獻(xiàn)列表EP 0 131 052EP 0 452 596WO 97/46707WO 97/46712WO 97/46714EP 0 512 334EP 0 543 942US 5,210,015EP 0 070 687EP 0 201 184EP 0 497 784WO 01/94634WO 97/07238WO 01/48237WO 02/14555US 5,118,801Klausegger等人，Journal of Clinical Microbiology 33(1990)464-466Woo等人，Journal of Microbiology 35(1999)23-30Espy等人，Journal of Clinical Microbiology 33(2000)795-799Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，Anal Biochem 169(1988)1-25Bernard，P.S.等人，Anal Biochem 255(1998)101-7實(shí)施例提供下列實(shí)施例、參考文獻(xiàn)、序列表和圖用于幫助理解發(fā)明，其真正的范圍在權(quán)利要求中提出。應(yīng)理解可在不背離本發(fā)明精神的前提下對該過程進(jìn)行改進(jìn)。
概述此處提到的所有寡核苷酸都是通過化學(xué)合成制備的。用于攻擊標(biāo)記的試劑可從Roche Diagnostics GmbH(LightCycler Red 640NHS EsterCat.No.2015161；LightCycler Red 705Phosphoramidite Cat.No.2157594；LightCycler Fluorescein(下面縮寫為‘F’)CPG Cat.No.3113906)購買。這些試劑的使用在Biochemica No.1(2001)，p.8-13中描述。
需要檢查所有試劑是否被所要檢測的生物污染。只有不含那些生物和來源于它們的核酸的試劑才能產(chǎn)生最佳靈敏度。
實(shí)施例1腸球菌A.材料引物SEQ ID NO 15′-tac ttt gtt cag ttt tga gag gt-3′正向引物SEQ ID NO 25′-gca att gaa ctt att aaa aaa ctc-3′反向引物探針SEQ ID NO 3LCR640-5′acc gag aac acc gcg ttg aat-3′錨定探針SEQ ID NO 45′-ctg gat att gaa gta aaa aga atc aaa ac-3′-F傳感探針SEQ ID NO 55′-gat att tga agt aaa tgt aag taa t-3′-F傳感探針(用于靶和用于IC)SEQ ID NO 6LCR705-5′-cca gca gaa tgc caa cca cc-3′錨(用于IC)陽性對照(PC)pEfis_wt1基于含糞腸球菌16S/23S-rRNA-間隔區(qū)的pT3T7BM的質(zhì)粒pEfum_wt2基于含屎腸球菌16S/23S-rRNA-間隔區(qū)的pT3T7BM的質(zhì)粒內(nèi)部對照(IC)PEntero_IC2基于pEfis_wt1的質(zhì)粒，但SEQ ID NO 3的互補(bǔ)序列被SEQ ID NO 6的互補(bǔ)序列替換硬件/軟件具有3.5版本軟件(Roche Diagnostics GmbH，Germany)的LightCyclerTM1.2(20μl毛細(xì)管)試劑1.FastStart聚合酶2.FastStart主混合物，含有MgCl23.5mM引物0.5μM傳感探針0.2μM錨定探針0.3μM傳感探針(IC)0.2μM3.PCR-級H2O(純化至不含交叉污染的核酸和早期擴(kuò)增的擴(kuò)增子)FastStart聚合酶和FastStart Master通常被建議用在LightCycler-FastStart-DNA Master Hybridization Probes試劑盒(Roche Diagnostics GmbH Cat.No.2239272)中。
樣品樣品是a.含引物和探針的適宜結(jié)合序列的質(zhì)粒DNA或b.細(xì)菌DNA制品(例如，來源于細(xì)菌培養(yǎng))。
樣品(特別是臨床樣品)經(jīng)過樣品制備，其中從樣品的其它組分釋放并純化核酸。這是使用MagNAPureTMLC和MagNA Pure LC DNA分離試劑盒III(細(xì)菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH，Germany，CatNo.3 264 785)進(jìn)行的。樣品制備產(chǎn)生含有溶于洗脫緩沖液中的核酸的樣品。
IC是在樣品制備中加工的(例如，通過MagNA Pure)或加入到完全的主混合物(見下文)中，這取決于它是用于樣品制備過程還是用于每個(gè)毛細(xì)管中LightCycler測定性能的過程內(nèi)對照。IC的信號是在LightCycler設(shè)備的F3通道中檢測的。
B.方法首先，將整個(gè)轉(zhuǎn)子的32個(gè)毛細(xì)管中的FastStart主混合物的所有組分混合在一起。
然后將15μl主混合物的等分試樣吸移到各毛細(xì)管中。在將IC用作PCR對照的情況下，將IC加入到主混合物中。
可選地，將IC放在MagNA Pure LC溶解/結(jié)合緩沖液中并與樣品共同處理。
向含主混合物的第一毛細(xì)管中加入5μl含兩個(gè)質(zhì)粒組合的陽性對照溶液，所述兩個(gè)質(zhì)粒分別具有對SEQ ID NO 3和4或SEQ ID NO 5和3特異的序列。
向第二個(gè)毛細(xì)管中加入5μl水形式的“陰性對照”，代替樣品或陽性對照。陰性對照還包含過程內(nèi)對照的IC。
蓋上陽性和陰性對照后，向其它毛細(xì)管中加入樣品(每種5μl體積)。
蓋上剩余毛細(xì)管后，使用下列方案進(jìn)行LightCycler-運(yùn)行循環(huán)次數(shù)時(shí)間(秒)溫度(℃)坡度(℃)變性1 600 95℃20擴(kuò)增45 10 95 2015 50 2010 72 20解鏈曲線1 60 95 2060 40 200 80 0.1冷卻1 30 40 20C.結(jié)果如上所述在LightCycler中進(jìn)行分析。屎腸球菌和糞腸球菌樣品分別在54.5℃和58.5℃下，在通道F2中顯示量化曲線和解鏈峰。絕大多數(shù)其它腸球菌物種沒有檢測到。某些少見的物種(例如，耐久腸球菌、小腸腸球菌、蒙氏腸球菌)在較低溫度(＜46℃)下達(dá)到解鏈峰。
因此，可將所檢測物種(屎腸球菌和糞腸球菌)彼此區(qū)別開來且樣品中存在的所有其它腸球菌物種可通過解鏈溫度不同而確定。我們發(fā)現(xiàn)至少10-20基因組等同物/PCR的較低檢測限。
PC(pEfis_wt1和pEfum_wt2的混合物)顯示出量化曲線和雙峰，其由屎腸球菌和糞腸球菌特異性峰的組合所引起。
IC允許在沒有特異性樣品存在的情況下檢測。在過量糞腸球菌或屎腸球菌模板DNA的情況下不可檢測。
實(shí)施例2葡萄球菌A.材料引物SEQ ID NO 75′-tgt aca ttg aaa act aga taa gta ag-3′正向引物SEQ ID NO 85′-acg cgt tat taa tct tgt gag t-3′反向引物探針SEQ ID NO 9LCR640-5′-gct tga att cat aag aaa taa tc-3′錨定探針SEQ ID NO 105′-ccg agt gaa taa aga gtt tta aa-3′-F傳感探針(用于靶和用于IC)SEQ ID NO 6LCR705-5′-cca gca gaa tgc caa cca cc-3′錨(用于IC)陽性對照(PC)PStaph_wt基于含金黃色葡萄球菌16S/23S-rRNA-間隔區(qū)的pT3T7BM的質(zhì)粒內(nèi)部對照(IC)PStaph_IC 基于pStaph_wt的質(zhì)粒，但SEQ ID NO 9的互補(bǔ)序列被SEQ ID NO 6的互補(bǔ)序列替換硬件/軟件具有3.5版本軟件(Roche Diagnostics GmbH，Germany)的LightCyclerTM1.2(20μl毛細(xì)管)試劑1.FastStart聚合酶2.FastStart主混合物，含有MgCl23.5mM引物0.4μM探針0.2μM傳感探針(IC)0.1μM
3.PCR-級H2O(純化至沒有交叉污染的核酸和早期擴(kuò)增的擴(kuò)增子)FastStart聚合酶FastStart Master通常被建議用在LightCycler-FastStart-DNA Master Hybridization Probes 試劑盒(RocheDiagnostics GmbH Cat.No.2239272)中。
樣品樣品是a.含引物和探針的適宜結(jié)合序列的質(zhì)粒DNA或b.細(xì)菌DNA制品(例如，來源于細(xì)菌培養(yǎng))。
樣品(特別是臨床樣品)經(jīng)過樣品制備，其中從樣品的其它組分釋放并純化核酸。這是使用MagNAPureTMLC和MagNA Pure LC DNA分離試劑盒III(細(xì)菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH，Germany，CatNo.3 264 785)進(jìn)行的。樣品制備產(chǎn)生含有溶于洗脫緩沖液中的核酸的樣品。
IC是在樣品制備中加工的(例如，通過MagNA Pure)或加入到完全的主混合物(見下文)中，這取決于它是用于樣品制備過程還是用于每個(gè)毛細(xì)管中LightCycler測定性能的過程內(nèi)對照。IC的信號是在LightCycler設(shè)備的F3通道中檢測的。
B.方法首先將整個(gè)轉(zhuǎn)子的32個(gè)毛細(xì)管中的FastStart主混合物所有組分混合在一起。
然后將15μl主混合物的等分試樣吸移到各毛細(xì)管中。在將IC用作PCR對照的情況下，將IC加入到主混合物中。
可選地，將IC放在MagNA Pure LC溶解/結(jié)合緩沖液中并與樣品共同處理。
向含主混合物的第一毛細(xì)管中加入5μl含質(zhì)粒的陽性對照溶液，所述質(zhì)粒分別具有對SEQ ID NO 9和10特異的序列。
向第二個(gè)毛細(xì)管中加入5μl水形式的“陰性對照”，代替樣品或陽性對照。陰性對照還包含過程內(nèi)對照的IC。
在蓋上陽性和陰性對照后，向其它毛細(xì)管中加入樣品(每種5μl體積)。
蓋上剩余毛細(xì)管后，使用下列方案進(jìn)行LightCycler-運(yùn)行
循環(huán)次數(shù)時(shí)間(秒)溫度(℃)坡度(℃)變性1 600 95℃20擴(kuò)增45 10 95 2015 50 2010 72 20解鏈曲線1 60 95 2060 40 200 80 0.1冷卻1 30 40 20C.結(jié)果如上所述在LightCycler中進(jìn)行分析。金黃色葡萄球菌和凝固酶-陰性葡萄球菌(稱作CoNS)樣品顯示量化曲線。分別在約55℃(金黃色葡萄球菌)和48-48℃(CoNS)下，在通道F2中觀察到解鏈峰。我們發(fā)現(xiàn)至少10-20基因組等同物/PCR的較低檢測限。
PC顯示出類似金黃色葡萄球菌量化和解鏈峰的量化曲線。
IC允許在沒有特異性樣品存在的情況下檢測。在過量葡萄球菌模板DNA的情況下不可檢測。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<110>F.Hoffmann-La Roche AG<110>Innogenetics N.V.
<120>檢測葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌屬中的致病性革蘭氏陽性菌的方法<130>21518 EP<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>腸球菌<400>1tactttgttc agttttgaga ggt23<210>2<211>24<212>DNA<213>腸球菌<400>2gcaattgaac ttattaaaaa actc 24<210>3<211>21<212>DNA<213>腸球菌<400>3accgagaaca ccgcgttgaa t 21<210>4<211>29
<212>DNA<213>腸球菌<400>4ctggatattg aagtaaaaag aatcaaaac 29<210>5<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對照<400>5gatatttgaa gtaaatgtaa gtaat 25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對照<400>6ccagcagaat gccaaccacc20<210>7<211>26<212>DNA<213>葡萄球菌<400>7tgtacattga aaactagata agtaag26<210>8<211>22<212>DNA<213>葡萄球菌
<400>8acgcgttatt aatcttgtga gt 22<210>9<211>23<212>DNA<213>葡萄球菌<400>9gcttgaattc ataagaaata atc 23<210>10<211>23<212>DNA<213>葡萄球菌<400>10ccgagtgaat aaagagtttt aaa 23<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>對照<400>11ccagcagaat gccaaccacc 20
權(quán)利要求
1.鑒定臨床樣品中的革蘭氏陽性致病生物或?qū)儆谥虏⌒愿锾m氏陽性菌預(yù)定組的成員的生物亞群的方法，包括a)分離含有至少部分純化的核酸的臨床樣品，b)使所述臨床樣品經(jīng)過至少一次擴(kuò)增和檢測，包括ba)使用至少一組擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增來自所述革蘭氏陽性致病性生物所屬的致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定亞組的預(yù)選核酸序列區(qū)，bb)使用至少一種雜交試劑進(jìn)行的檢測步驟，所述雜交試劑能夠檢測來自致病性革蘭氏陽性菌的所述預(yù)定亞組的所述預(yù)選核酸序列區(qū)，其中所述檢測步驟bb)包括步驟bba)監(jiān)測預(yù)選溫度下的雜交，所述雜交指示樣品中存在包含于所述亞組中的至少一個(gè)物種，和bbb)監(jiān)測雜交的溫度依賴性，所述溫度依賴性指示至少存在所述致病性革蘭氏陽性菌或所述生物亞群中的物種，c)根據(jù)bb)中監(jiān)測步驟的結(jié)果鑒定所述生物或所述生物亞群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述亞組是屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述雜交試劑包含兩個(gè)與靶核酸序列區(qū)中的相鄰序列互補(bǔ)的探針，一個(gè)被FRET供體標(biāo)記，另一個(gè)被FRET受體標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述致病性革蘭氏陽性菌的預(yù)定組包括物種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述預(yù)定亞組包括物種金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌和糞腸球菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述預(yù)選核酸序列區(qū)包含rRNA間隔區(qū)的至少20個(gè)核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增和檢測均質(zhì)地進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述物種選自葡萄球菌屬、腸球菌屬和鏈球菌屬。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述物種選自葡萄球菌屬之一。
10.一種鑒定選自腸球菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬的革蘭氏陽性致病菌的試劑盒，它包含一組引物，所述引物能夠分別擴(kuò)增來自腸球菌、葡萄球菌和鏈球菌的16S-23S rRNA間隔區(qū)的至少20個(gè)核苷酸的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定革蘭氏陽性致病菌的方法，包括(a)使用至少第一組擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟，所述擴(kuò)增引物能夠擴(kuò)增致病性革蘭氏陽性菌的第一預(yù)定亞組中的預(yù)選核酸序列區(qū)；(ab)使用至少第一種雜交試劑進(jìn)行的檢測步驟，所述雜交試劑能夠特異性檢測所述致病性革蘭氏陽性菌第一預(yù)定亞組中的預(yù)選核酸序列區(qū)，所述檢測步驟包括下列步驟(aba)無論在預(yù)選溫度下是否發(fā)生雜交，監(jiān)測雜交的發(fā)生，所述雜交的發(fā)生指示存在于樣品中的致病性生物的至少一個(gè)屬，和(abb)監(jiān)測雜交的溫度依賴性，所述溫度依賴性指示致病性革蘭氏陽性菌的至少一個(gè)物種。
文檔編號G01N33/542GK1745177SQ200380109551
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者G·哈伯豪森, T·埃姆里希, R·羅紹, G·延內(nèi)斯, D·德沃斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司, 基因創(chuàng)新有限公司