專利名稱：用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及用于糖尿病性視網(wǎng)膜病的診斷物質(zhì)，更具體的說，涉及包含免疫球蛋白A蛋白及其抗體的診斷試劑盒和使用這種試劑盒的診斷方法。
背景技術(shù)：
一般而言，作為復(fù)雜的代謝紊亂引起微血管病的糖尿病是一種系統(tǒng)性疾病，廣泛損害全身組織。糖尿病可能影響視覺，而且最重要的是，損害眼睛中的血管(LEE Tae-hee、CHOI Young-gil，《DiabeticVascular Complications》即糖尿病性血管并發(fā)癥，漢城，KoryoMedicine)。隨著糖尿病患者的壽命和發(fā)病時程因生活水平的改進和治療的發(fā)展而延長，糖尿病性視網(wǎng)膜病，最嚴重的并發(fā)癥之一，成為最重要的問題(Klein R.等人，Arch Ophthalmol.，102520-532，1984)。糖尿病性視網(wǎng)膜病分為兩個階段，非增生階段和增生階段。非增生階段的特征是由血管紊亂導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷局限于視網(wǎng)膜。增生階段的特征是來自視網(wǎng)膜的新血管組織突入玻璃體腔(Green，《Ophtalmic Pathologyan atlas and textbook》即眼科病理學圖集和課本，第4版，Spencer WH編，費城，WB Saunder，1124-1129，1996)。糖尿病性視網(wǎng)膜病是通過觀察眼底結(jié)構(gòu)中的特征性變化來診斷的。由于糖尿病性視網(wǎng)膜病的視力受損源自增生階段中伴隨著黃斑牽引性視網(wǎng)膜脫落的出血性corporis vitrei和黃斑病。眾所周知手術(shù)治療的激光處理對視力受損的效力(《Diabetic Retinopathy StudyReport》即糖尿病性視網(wǎng)膜病研究報告，第14期；Int OphthalmolClin.，27239-253，1987)。遵循正確步驟的這種治療能夠預(yù)防視力受損，將副作用降至最小。應(yīng)當經(jīng)常檢查和診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病以確定是否對糖尿病性視網(wǎng)膜病進行手術(shù)。然而，由于目前只能通過眼底鏡檢查來診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病，因此難以在其早期階段檢測糖尿病性視網(wǎng)膜病。結(jié)果是，患者非常普遍的喪失了預(yù)防糖尿病性視網(wǎng)膜病和對其進行手術(shù)的機會。因此，本發(fā)明公開了用于早期在血液中診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法。尚無使用血液診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法。本發(fā)明人通過蛋白質(zhì)組學(proteomics)發(fā)現(xiàn)了在血液中發(fā)生變化的一種蛋白質(zhì)，并將這種蛋白質(zhì)應(yīng)用于診斷學。由于這種蛋白質(zhì)在沒有糖尿病性視網(wǎng)膜病并發(fā)癥的糖尿病患者與具有并發(fā)癥的糖尿病患者之間顯示顯著的數(shù)量變化，通過免疫學方法使用精確定量而完成了包含這種蛋白質(zhì)的本發(fā)明。
發(fā)明詳述為了克服上述問題，本發(fā)明的一個目標是為糖尿病性視網(wǎng)膜病提供有用的診斷劑。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的試劑盒，包括診斷劑。
本發(fā)明的還有一個目標是提供用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法。
為了實現(xiàn)上述目標，提供了有效診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的免疫球蛋白A蛋白及其蛋白質(zhì)片段。
通過蛋白質(zhì)分析得到的序列符合免疫球蛋白A重鏈的一個恒定位點。免疫球蛋白A蛋白以重鏈和輕鏈型存在。由于每條鏈都具有一個可變區(qū)，因此蛋白質(zhì)包含具有許多不同序列的位點。結(jié)果是，能夠獲得經(jīng)測定是免疫球蛋白A蛋白的具有某種序列的蛋白質(zhì)。
公開的免疫球蛋白A蛋白可以具有多種氨基酸序列，像重鏈的SEQID NO1。
IgA H鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO1所述。
公開的免疫球蛋白A蛋白質(zhì)片段可以具有多種類型的片段，包括SEQ ID NO2的肽。
提供了特異結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體?？贵w可以是多克隆的和單克隆的，但是更優(yōu)選單克隆的。
還提供了包含抗體且用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的試劑盒。
公開的試劑盒還包含通過綴合酶過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素得到的抗體蛋白。
公開的診斷試劑盒中所使用的其余試劑可以容易的由一般診斷試劑盒中所使用的成分獲得。
還提供了用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法，包括a)用血樣和綴合了過氧化物酶、堿性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A蛋白處理抗體；并b)測量化合物的光密度，其中當測量結(jié)果表示低于400mg/dL免疫球蛋白A時診斷是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
提供了用于編碼免疫球蛋白A蛋白的SEQ ID NO3免疫球蛋白A基因和用于編碼SEQ ID NO2肽的SEQ ID NO4核苷酸。
下面將詳細描述本發(fā)明。
在本發(fā)明中，糖尿病性視網(wǎng)膜病患者眼球玻璃體的免疫球蛋白A蛋白顯示相對于健康玻璃體而言增加。本發(fā)明人在這里發(fā)現(xiàn)血液中的蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，即糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血液中的免疫球蛋白A蛋白相對于糖尿病患者而言減少了。因此，公開了使用免疫學方法的糖尿病性視網(wǎng)膜病診斷。
為了實現(xiàn)上述目標，使用蛋白質(zhì)組學方法分析了在糖尿病性視網(wǎng)膜病中顯示特異變化的蛋白質(zhì)群。通過分析糖尿病性視網(wǎng)膜病患者玻璃體與正常玻璃體中的蛋白質(zhì)數(shù)量變化和蛋白質(zhì)類型發(fā)現(xiàn)了下列結(jié)果。在檢查了血液中的靶蛋白變化之后，使用適當?shù)拿庖邔W方法制備了用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的試劑盒。第一，選擇正常玻璃體作為對照組。通過二維凝膠分離和圖像分析，在由糖尿病患者和糖尿病性視網(wǎng)膜病患者獲得的玻璃體中分離顯示性質(zhì)和數(shù)量差異的蛋白質(zhì)群。使用MS和Q-TOF分析儀鑒定蛋白質(zhì)群。證明了其中觀察并鑒定變化的蛋白質(zhì)是免疫球蛋白A。觀察到在正常玻璃體中幾乎觀察不到的免疫球蛋白A在糖尿病性視網(wǎng)膜病患者的玻璃體中增加。然而，尚無關(guān)于免疫球蛋白A在糖尿病性視網(wǎng)膜病患者的玻璃體中增加的報告。第二，這種蛋白質(zhì)在血液中顯示數(shù)量變化。在以糖尿病患者的血液作為對照組時，糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血液中的免疫球蛋白A減少。然而，這一結(jié)果也尚無報道。第三，通過制備經(jīng)由免疫學方法的試劑盒，選擇了用于測量蛋白質(zhì)存在值的簡單、靈敏、且精確的方法。
下面將依照優(yōu)選實施方案詳細描述本發(fā)明。
附圖簡述

圖1的示意圖例示了將要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學分析的眼球玻璃體的預(yù)處理過程。
圖2顯示的凝膠照片例示了眼底玻璃體蛋白質(zhì)在二維電泳后的CBB染色。正常眼球玻璃體的標記區(qū)域中未顯示蛋白質(zhì)，而糖尿病性視網(wǎng)膜病眼球玻璃體的標記區(qū)域中顯示蛋白質(zhì)。
圖3顯示的CBB染色凝膠照片例示了糖尿病性視網(wǎng)膜病患者和只是糖尿病患者的血清蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在二維電泳后CBB染色。只是糖尿病患者的標記區(qū)域中存在過量的蛋白質(zhì)，而糖尿病性視網(wǎng)膜病患者的標記區(qū)域中顯示蛋白質(zhì)的數(shù)量減少。
圖4顯示的曲線圖例示了使用MALDI-TOF和Q-TOF分析儀得到的圖2標記區(qū)域中蛋白質(zhì)的經(jīng)胰蛋白酶處理的肽的質(zhì)譜(A)，以及肽片段中肽的氨基酸序列(B)。
圖5顯示的標準滴定曲線圖例示了0、15.6、31.25、62.5、125、250、500ng/ml免疫球蛋白A標準溶液和ELISA反應(yīng)后的光密度測量值。
優(yōu)選實施方案實施例1用于分析蛋白質(zhì)組學的玻璃體的樣品制備糖尿病性視網(wǎng)膜病是由長期糖尿病引起的并發(fā)癥之一。糖尿病性視網(wǎng)膜病的特征是生成許多異常新血管系統(tǒng)，它們具有不完整的血管結(jié)構(gòu)，在眼球的玻璃體中引起出血。出血在視網(wǎng)膜中導(dǎo)致異常，進而視力削弱和喪失。在本發(fā)明中，使用蛋白質(zhì)組學方法通過分析正常對照組與糖尿病性視網(wǎng)膜病患者玻璃體中的蛋白質(zhì)來搜索疾病指征，并且獲得了表現(xiàn)疾病狀態(tài)的蛋白質(zhì)信息。首先，為了將蛋白質(zhì)組學方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)，處理玻璃體以便于分析。玻璃體含有大量的高分子量粘多糖、透明質(zhì)酸。然而，已證實這種多糖妨礙蛋白質(zhì)分離。因此，設(shè)計一種方法來有效清除這種多糖(見圖1)。首先，用16ml蒸餾水稀釋4ml玻璃體，將稀釋液置于具有1,000,000截留膜的管中并于4℃以8,000rpm離心2小時。將這一程序重復(fù)三次，通過分子量差異過濾超過1,000,000的高分子量多糖。將未過濾的蛋白質(zhì)置于具有10,000截留膜的管中，并于4℃以4,000rpm離心，然后濃縮用于分析。用于在本發(fā)明中清除高分子量多糖的方法通過解決在低pH不易分離的問題而使之能夠有效分析。
實施例2在由正常人與糖尿病性視網(wǎng)膜病患者獲得的眼球玻璃體中發(fā)生變化的蛋白質(zhì)群的研究由每個玻璃體分離蛋白質(zhì)，并濃縮至1mg/ml用于分析。首先，通過逐步法使用蛋白質(zhì)的兩個不同特征將蛋白質(zhì)在二維上分開。在第一步中，通過對蛋白質(zhì)施加電刺激使蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的凈電荷移動(IEF，pH 3-10)。在第二步中，蛋白質(zhì)在丙烯酰胺凝膠(8-18％)上根據(jù)每種蛋白質(zhì)的分子量移動。對蛋白質(zhì)進行一維電泳(根據(jù)pH的蛋白質(zhì)移動)，每塊凝膠50mA 12小時。然后，在聚丙烯酰胺上對蛋白質(zhì)進行二維電泳(根據(jù)分子量的蛋白質(zhì)移動)，每塊凝膠50mA 6小時。用考馬斯亮藍G250染料和銀染法將這些移動蛋白質(zhì)染色用于顯影。在電腦中使用圖象分析軟件Phoretix(Nonlinear dynamics，英國)分析正常玻璃體與糖尿病性視網(wǎng)膜病患者玻璃體之間的蛋白質(zhì)差異。通過分析兩組的蛋白質(zhì)，本發(fā)明人確認了存在顯示差異的蛋白質(zhì)群(見圖2和3)。
實施例3在糖尿病患者與糖尿病性視網(wǎng)膜病患者之間顯示差異的血清蛋白質(zhì)的鑒定通過MALDI-TOF和Q-TOF分析儀搜索并鑒定具有數(shù)量和性質(zhì)差異的蛋白質(zhì)以獲知蛋白質(zhì)的種類(見圖4)。顯示糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血液中的免疫球蛋白A數(shù)量低于糖尿病患者的血液。
實施例4通過酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病進行本研究是為了查明能否通過三明治酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)使用抗免疫球蛋白A抗體在糖尿病患者中鑒別糖尿病性視網(wǎng)膜病的血清。在醫(yī)院中，由10名正常健康人、45名沒有糖尿病性視網(wǎng)膜病的糖尿病患者和86名糖尿病性視網(wǎng)膜病患者獲得血清。首先，向EIA 96孔板的每個孔中加入100ul溶于包被緩沖液(50mM NaHCO3，pH 9.0)的抗免疫球蛋白A(Koma，韓國)(1ug抗體蛋白/孔；終濃度10ug/ml)，并于室溫反應(yīng)并包被1小時。將每個孔用400ul PBST清洗兩次10分鐘，然后用含1％BSA的PBS封閉(post-coated)。向每個孔中加入100ul用PBST緩沖液稀釋的患者血清，反應(yīng)1小時，然后用PBS清洗五次。向每個孔中加入100ul稀釋的綴合了過氧化物酶的抗免疫球蛋白A抗體(KOMA生物技術(shù)公司，韓國)，然后反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，將每個孔用PBS清洗三次。然后，向其中加入100ul含1mg/ml OPD(鄰苯二胺二氫氯化物)和0.03％H2O2的0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽(pH 4.9)，并于室溫反應(yīng)20-30分鐘。加入100ul 3M硫酸終止反應(yīng)，并使用ELISA讀數(shù)儀測量450nm光密度。通過將標準滴定曲線和稀釋度轉(zhuǎn)換成光密度來確定每個單位體積(ml)血液中的免疫球蛋白A數(shù)量(見圖5)。ELISA測量的結(jié)果是，免疫球蛋白A的數(shù)量在正常人血清中的范圍是131.2-298.7mg/dL，糖尿病患者血清中的范圍是226.5-771.9mg/dL，而糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血清中的范圍是105.3-557.2mg/dL。這些結(jié)果在表1中以平均值顯示。作為免疫球蛋白A的測量平均值，正常人是217.6±82.1mg/dL，糖尿病患者是457.6±151.6mg/dL，非增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病患者是244.4±117.1mg/dL，而增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病患者是278.6±123.6mg/dL。在這里顯著顯示了糖尿病患者群的血清中存在大量的免疫球蛋白A。然而，顯示了非增生性與增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病患者血清中的免疫球蛋白A數(shù)量存在略微差異。若當免疫球蛋白A數(shù)量低于ELISA值的400mg/dL時判定糖尿病性視網(wǎng)膜病是陽性的，則86人中有72人證明是患者。在這里顯示了83.7％的診斷靈敏性。在無視網(wǎng)膜病的糖尿病患者的情況中，45人中有22人證明是患者。在這里顯示了48.9％的診斷特異性(見表2)。
表1通過ELISA測量健康人和患者血清中免疫球蛋白A的平均值

表2根據(jù)ELISA標準400mg/dL(取舍點)判斷糖尿病性視網(wǎng)膜病患者

工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明涉及用于容易診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的技術(shù)，那是糖尿病的一種并發(fā)癥。尚無用于糖尿病性視網(wǎng)膜病的有效商品化診斷方法。糖尿病性視網(wǎng)膜病完全依靠醫(yī)院的眼科醫(yī)生來診斷。對于糖尿病患者而言，不可能在不進行定期眼科檢查且沒有視力缺陷的主觀癥狀的情況下在其早期診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病。本發(fā)明診斷方法的特征是簡單的血液測試，而且能夠非常有效的在眼科檢查之前鑒定并發(fā)癥的發(fā)展。具體而言，本發(fā)明的優(yōu)勢是花費低廉且處理簡單，尤其是對于接受醫(yī)學測試或咨詢醫(yī)生的一群糖尿病患者而言，只需調(diào)整使用96孔板的ELISA法就能夠大量測試。同樣，通過使用免疫化學方法，本發(fā)明的準確性和精確性也是卓越的。總之，本發(fā)明有效的在其早期診斷和篩選中診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病，而且有助于潛伏和早期糖尿病性視網(wǎng)膜病患者確定藥物治療時間，從而延緩疾病發(fā)展成嚴重的糖尿病性視網(wǎng)膜病。
序列表<110>EYEGENE INC.
<120>用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的蛋白質(zhì)<150>KR102002041771<151>2002-07-16<160>4<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>353<212>PRT<213>人類<400>1Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr1 5 10 15Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe20 25 30Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val35 40 45Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr50 55 60Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly65 70 75 80Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp85 90 95Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser115 120 125Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn130 135 140Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe145 150 155 160Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu165 170 175Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys180 185 190Ala Glu Pro Trp Ash His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr195 200 205Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn210 215 220Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu225 230 235 240Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser245 250 255Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro260 265 270Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly275 280 285Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu305 310 315 320Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro325 330 335Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys340 345 350Tyr<210>2<211>10<212>PRT<213>人類<400>2Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg1 5 10<210>3<211>1059<212>DNA<213>人類<400>3gcaagcttga ccagccccaa ggtcttcccg ctgagcctct gcagcaccca gccagatggg60aacgtggtca tcgcctgcct ggtccagggc ttcttccccc aggagccact cagtgtgacc120tggagcgaaa gcggacaggg cgtgaccgcc agaaacttcc cacccagcca ggatgcctcc180
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<400>4tggctgcagg ggtcacagga gctgccccgc 30
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO1中描述的免疫球蛋白A蛋白及其類似蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，其中蛋白質(zhì)有效診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病。
2.依照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)片段，其中蛋白質(zhì)片段包含SEQ IDNO2中描述的肽序列。
3.特異結(jié)合權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)的抗體。
4.包含權(quán)利要求3的抗體的用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的試劑盒。
5.依照權(quán)利要求4的試劑盒，還包含綴合了酶過氧化物酶、堿性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A抗體。
6.用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法，包括a)血樣和綴合了過氧化物酶、堿性磷酸酶、或生物素的抗免疫球蛋白A蛋白處理權(quán)利要求2的抗體；并b)測量化合物的光密度，其中當光密度的測量值(ELISA值)低于正常值時診斷是糖尿病性視網(wǎng)膜病。
7.編碼權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)的SEQ ID NO3的蛋白質(zhì)免疫球蛋白A基因和類似基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的材料。更具體的說，本發(fā)明涉及用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的免疫球蛋白A蛋白、包含針對該蛋白質(zhì)的抗體的用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的試劑盒、以及用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法。本發(fā)明可用于診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病。
文檔編號G01N33/68GK1675246SQ03819533
公開日2005年9月28日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月16日
發(fā)明者俞元一, 李誠鎬, 樸建宇, 趙良濟, 安寶暎, 權(quán)五雄 申請人:艾金株式會社, 健一藥品株式會社