專利名稱：將蛋白質(zhì)相對免疫原性進行分級的基于群體的評估方法和手段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了評估群體的免疫反應(yīng)特性的方法。特別地，本發(fā)明提供了定性地評估人類群體的免疫反應(yīng)的方法，其中對于針對任何目標蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)進行分析。本發(fā)明進一步提供了基于蛋白質(zhì)的相對免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，本發(fā)明提供了方法來創(chuàng)造在多種應(yīng)用中使用的具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)具有潛在地引起威脅生命的免疫反應(yīng)的能力。這一限制阻礙了蛋白質(zhì)在消費者終端應(yīng)用和產(chǎn)品中的廣泛使用。實際上，這一引起免疫反應(yīng)的潛在性已經(jīng)引起了美國食品和藥品管理局(FDA)的注意，結(jié)果導致在批準新的蛋白質(zhì)治療劑之前和之后都要求免疫原性測試?？墒?，雖然有大量的可用于評估免疫原性的動物模型，但是沒有有效的在人中辨識相對免疫原性的方法。
盡管有這些擔憂，蛋白質(zhì)的免疫原性在很長時間內(nèi)已經(jīng)是在酶生產(chǎn)工業(yè)中所關(guān)心的事情。已經(jīng)證明，職業(yè)性的蛋白質(zhì)接觸可導致工業(yè)和實驗室工作者的致敏。對于特定蛋白質(zhì)的致敏通常通過測試來進行評估，例如皮膚針刺測試(skin-prick test)，其可揭示出個體是否形成了對于該蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。
實際上，已經(jīng)證明職業(yè)性的蛋白質(zhì)接觸可導致工業(yè)和實驗室工作者的致敏。在大多數(shù)環(huán)境中，致敏可通過減少空氣傳播的蛋白質(zhì)的水平來加以控制(見Sarlo和Kirchner，Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.，297-101；和Schweigert等人，Clin.Exp.Allergy301511-1518)。已經(jīng)實施了職業(yè)暴露指南來控制空氣傳播的與蛋白質(zhì)的接觸。這些指南提供了與特定蛋白質(zhì)接觸的允許水平，其對于減少在指定的工業(yè)環(huán)境中發(fā)生的致敏事件的總數(shù)量是有用的。當要生產(chǎn)一種新的蛋白質(zhì)時，對于該新的蛋白質(zhì)建立職業(yè)暴露指南(OEG)是需要認真關(guān)注的問題。一般接受的用于確定這些指南的方法為豚鼠氣管內(nèi)測試法(GPIT)(見Sarlo，F(xiàn)undam.Appl.Toxicol.，3944-52)。在該測試中，通過氣管內(nèi)滴注大約10-12星期來將豚鼠與測試蛋白質(zhì)進行接觸。定時性地從這些動物取得血清樣品，并通過本領(lǐng)域中已知的合適方法來測試其抗原特異性抗體的水平(例如，對于IgG1的被動皮膚測試(PCA)，和對于沉淀IgG的微免疫擴散測試(MID))。將這些結(jié)果與從一組用對照蛋白質(zhì)(例如ALCALASE酶，從Novo商購可得)進行測試的豚鼠中獲得的結(jié)果進行比較，該對照蛋白質(zhì)具有已知和有效的暴露指南?？紤]血清滴度的測定、MID陽性和反應(yīng)的時間，從而確定相對效價值。這一方法已經(jīng)成功地用于設(shè)置對于許多工業(yè)酶的OEG。
可是，雖然GPIT測試是有用的，但是其消耗時間而且價格昂貴，還需要許多動物和多重測試周期。相對近來的一段時間，建立了基于小鼠的測試法，據(jù)報道這種方法可再現(xiàn)GPIT中獲得的結(jié)果，其使用更便宜的和麻煩更少的動物模型。一些公司使用小鼠鼻內(nèi)測試法(MINT；見Robinson等人，Toxicol.Sci.4339-46)來制定OEG指南?？墒?，還沒有獲得對于該模型的工業(yè)范圍的認可(關(guān)于蛋白質(zhì)過敏原性的預(yù)報性測試的綜述，見Robinson等人，如上，以及Kimber等人，F(xiàn)undam.Appl.Toxicol.，331-10；和Kimber等人，Toxicol.Sci.，48157-162)。
因此，盡管動物模型是有用的，但是它們是有限制的。在GPIT中使用部分遠交的豚鼠使得需要使用大量的動物，以便當比較小組之間的反應(yīng)時獲得統(tǒng)計上的顯著性。另外，對照動物反應(yīng)的實驗間變化是非常大的，這使得基于單組對照反應(yīng)的效價測定的可信性降低了。MINT檢測不會受到抗體反應(yīng)中這么多變化的影響，因為所使用的小鼠通常為BDF1小鼠，其是兩個高度近交小鼠品系之間的雜交品種。雖然這一附加的控制水平允許更有力的數(shù)據(jù)分析，但是不同品系的小鼠對于相似的酶通常會得出非常不同的效價分級(見Blaikie，F(xiàn)oodChem.Toxicol.，37897-904；和Blaikie和Basketter，F(xiàn)ood Chem.Toxicol.，37889-896)。這很可能是由于小鼠品系中的免疫反應(yīng)的特異性造成的，這種小鼠品系經(jīng)過近交而表達非常有限的MHC分子。另外，雖然來自使用MINT檢測的單個實驗室的數(shù)據(jù)可能是有力的，但是MINT檢測也受到實驗室間差異的困擾。
值得注意的是，所有的動物測試都沒有能力合適地代表在人中對于指定蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)。小鼠的近交系呈現(xiàn)出具有其鼠科動物MHC分子所賦予的特異性的肽分子。人HLA分子雖然與小鼠MHC分子高度相關(guān)，但是不具有相同的肽特異性。此外，已經(jīng)選擇出能夠表達單I-A和/或I-E分子的近交小鼠品系，但是這種情況在高度遠交的人類群體中是極少出現(xiàn)的。另外，小鼠免疫系統(tǒng)具有許多未在人中發(fā)現(xiàn)的特性(例如已經(jīng)在小鼠中進行了描述的Th1對Th2的范例(paradigm)在人中卻不清楚得多)。例如，在人中，Th1和Th2表型中具有可塑性，其可以用IFN-α基因中的基因不一致性來解釋。與之相反，在小鼠中Th1和Th2表型不是動態(tài)的，這是由于在這些動物的IFN-α基因中具有插入物(見Farrar，Nat.Immunol.，165-69)。另外，人在激活的T-細胞上表達II型HLA分子，而小鼠則不表達。此外，人供體通常帶有內(nèi)源性的病毒并常常具有亞臨床感染，而實驗室小鼠通常保持在無特異性病原體(SPF)的環(huán)境中。另一個有關(guān)的事是，C57BI/6小鼠品系(形成轉(zhuǎn)基因小鼠模型的常用背景材料)具有確定的抗原加工缺陷，這使得與人來源的數(shù)據(jù)進行比較的可信度存在疑問(Kim和Jang，Eur.J.Immunol.，22775-782)。人HLA轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)可用于人免疫反應(yīng)的機制研究(見Boyton和Altmann，Clin.Exp.Immunol.，1274-11；Black等人，J.Immunol.，1695595-5600；Raju等人，Hum.Immunol.，63237-247；和Das等人，Rev.Immunogenet.，2105-114)。可是，這些動物的使用是有限制的，因為HLA轉(zhuǎn)基因小鼠受到種特異性免疫系統(tǒng)復合物的影響。另外，由于HLA轉(zhuǎn)基因的表達沒有進行正確的調(diào)節(jié)，至少一些用于構(gòu)建這些小鼠的方法不能允許準確地分析肽特異性的反應(yīng)。當表達單HLA分子時，HLA轉(zhuǎn)基因小鼠常常用于作圖研究，這一情況沒有在人中發(fā)現(xiàn)。這一點對于HLA-DQ轉(zhuǎn)基因小鼠來說是特別要注意的地方，在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中顯示不同HLA-DQ等位基因之間的雜交配對以形成新的肽呈遞特異性(見Krco等人，J.Immunol.，1631661-1665)。因此，盡管在蛋白質(zhì)免疫原性的測定、評估和比較中取得了進展，但是在本領(lǐng)域中仍需要簡單的、可靠的和可重復的方法來進行這樣的測定。
同樣地，蛋白質(zhì)在治療、工業(yè)和營養(yǎng)應(yīng)用上的使用受到引起或加劇有害免疫反應(yīng)的潛在性的限制。這種潛在性對于重組人源蛋白質(zhì)的使用來說是特別要關(guān)注的問題。實際上，已經(jīng)證明重組人源蛋白質(zhì)可引起針對自身蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，結(jié)果導致自體免疫的形成(Li等人，Blood 983241-3248；和Casadell等人，N.Eng.J.Med.，346469-475)。在無意識地引起對于工業(yè)或食物蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)之后所發(fā)生的免疫系統(tǒng)的再次激活可以通過回避而最小化?？墒?，這不適合于使用人源治療蛋白質(zhì)的情況。因此，選擇和/或創(chuàng)造免疫原性減弱的蛋白質(zhì)變體對于改善所施用的蛋白質(zhì)的安全性和有效性來說是必需的。挑選天然存在的免疫原性減退的蛋白質(zhì)異構(gòu)體是一種選擇，其中存在幾種具有相似活性的相關(guān)分子。不幸的是，這不適合于許多治療蛋白質(zhì)。因此，在本領(lǐng)域中有長期存在的對于生產(chǎn)免疫原性減退的蛋白質(zhì)的方法的需要，這些蛋白質(zhì)適合于作為治療藥物使用和用于其他應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了評估群體的免疫反應(yīng)特性的方法。特別地，本發(fā)明提供了定性地評估人類群體的免疫反應(yīng)的方法，其中對于針對任何目標蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)進行分析。本發(fā)明進一步提供了基于蛋白質(zhì)的相對免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，本發(fā)明提供了方法來創(chuàng)造在多種應(yīng)用中使用的具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
形成本發(fā)明是為了避免在除了人之外的動物的免疫原性分析中出現(xiàn)的問題。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了通過使用人外周血單核細胞(PBMC)作為測試“對象”來將蛋白質(zhì)的免疫原性進行分級的方法。因為使用了大量人類樣品，所以獲得的信息可應(yīng)用于一般的人類群體。重要的是，該數(shù)據(jù)不受在使用近交小鼠中出現(xiàn)的特異性問題的影響。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了基于蛋白質(zhì)的總免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，通過將數(shù)據(jù)與先前存在的動物數(shù)據(jù)進行比較，本發(fā)明的方法提供了與蛋白質(zhì)的相對效價有關(guān)的信息。例如，在本發(fā)明的形成期間，將四個經(jīng)很好表征的工業(yè)過敏原以通過GPIT和MINT測試而確定的順序進行放置，然后與用本發(fā)明的方法獲得的結(jié)果進行比較，包括確定職業(yè)性暴露的工作者的致敏作用。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的方法包括使用作為抗原呈遞細胞的樹突細胞、偏移(offset)3個氨基酸從而包含完整的目標蛋白質(zhì)序列的15聚肽和從樹突細胞供體獲得的CD4+T-細胞。讓T-細胞在肽(每個肽分別進行測試)和分化的樹突細胞存在的情況下在樣品中進行增殖。至于肽組(pepset)的制備和樹突細胞的分化，不是想要將任何本發(fā)明的方法以任何特定的順序來進行。例如，在一些實施方案中于樹突細胞分化之前制備肽組，而在其他實施方案中于制備肽組之前進行樹突細胞的分化，和在另外其他實施方案中樹突細胞的分化和肽組的制備同時進行。因此，不是想要本發(fā)明限制于具有這些以任何特定順序排列的步驟的方法。
如果在對于肽的響應(yīng)中的增殖導致1.5-4.5的刺激系數(shù)(SI)，則認為和記錄該響應(yīng)為“陽性”。對于一個供體組將每個肽的結(jié)果列成表格，雖然具有一些變化，但是其優(yōu)選地反映出群體的一般HLA等位基因頻率。測定基于確定離開直線性的差異而得到的“結(jié)構(gòu)值”(structure value)，該值用于將蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級。因此，本發(fā)明提供了在蛋白質(zhì)的修飾中有用的信息，從而獲得預(yù)測在人中為有效的減少了的響應(yīng)率，而不需致敏志愿者。然后進行對于肽組的供體響應(yīng)的分析，所述分析基于這些經(jīng)設(shè)計而免疫原性減退的新蛋白質(zhì)，從而計算出新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值和確定它們的免疫原性與暴露潛在性。
在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了用于將蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的檢測系統(tǒng)(即I-MUNE檢測)。在一個實施方案中，該方法包括在體外測量CD4+T-細胞在對于蛋白質(zhì)的肽片段的響應(yīng)中的增殖，匯集所測量的對于蛋白質(zhì)的響應(yīng)，確定所匯集的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值，和比較該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值與第二個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值，其中將具有最小結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)分級為比具有更高結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)對于人類有著更弱的免疫原性。在另一個可選擇的實施方案中，被測試的蛋白質(zhì)是酶。在更進一步的實施方案中，酶為蛋白酶。在一個另外的實施方案中，被測試的蛋白質(zhì)選自抗體、細胞因子和激素。在進一步的實施方案中，在并行的測試中測定每個肽片段和每個蛋白質(zhì)的T-細胞增殖。在其他實施方案中，基于2.7-3.2的SI值來確定“陽性”響應(yīng)。在特別優(yōu)選的實施方案中，增殖的水平導致2.95或者更高的刺激系數(shù)。
本發(fā)明也提供了方法來評估在人中變體蛋白質(zhì)的減弱的免疫原性能力。在一些實施方案中，該方法包括減少一個或多個親本蛋白質(zhì)的顯著區(qū)域(prominent region)至背景水平從而形成變體蛋白質(zhì)，測定變體的結(jié)構(gòu)值，和比較變體的結(jié)構(gòu)值和親本蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值，其中較低的結(jié)構(gòu)值表明蛋白質(zhì)具有減弱的免疫原性。在一些優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)為酶。在一些可選擇的實施方案中，蛋白質(zhì)選自蛋白酶、細胞因子、激素、抗體、淀粉酶和其他酶，其他酶包括枯草桿菌蛋白酶、ALCALASE酶、纖維素酶、脂肪酶、氧化酶、異構(gòu)酶、激酶、磷酸酶、內(nèi)酰胺酶和還原酶，但不局限于此。在進一步的實施方案中，減少至背景水平的顯著區(qū)域的數(shù)目為1-10，優(yōu)選為1-5。在另一個實施方案中，將在親本蛋白質(zhì)的顯著區(qū)域中的一個或多個氨基酸殘基加以改變以形成變體。
本發(fā)明也提供了從一組相關(guān)蛋白質(zhì)中選擇出具有最弱免疫原性的蛋白質(zhì)的方法。在一個實施方案中相關(guān)蛋白質(zhì)為抗體，而在一個可選擇的實施方案中它們?yōu)榧毎蜃?，和在另一個實施方案中它們?yōu)榧に亍Ｔ谶M一步的實施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)蛋白。在另一個實施方案中，蛋白質(zhì)為酶。在一些優(yōu)選的實施方案中，酶選自蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶、異構(gòu)酶、激酶、磷酸酶、內(nèi)酰胺酶和還原酶。
本發(fā)明進一步提供了通過使用相關(guān)蛋白質(zhì)的相對分級來確定適合于(特別是在人中)減弱蛋白質(zhì)免疫原性的T-細胞表位修飾的方法。本發(fā)明也提供了將蛋白質(zhì)進行分類的方法，其是基于它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和它們的結(jié)構(gòu)值來進行的。因此，在一些進一步的實施方案中，將經(jīng)分析的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和結(jié)構(gòu)值進行分類和/或分級。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于將第一個蛋白質(zhì)和至少一個附加蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從每個附加蛋白質(zhì)中制備至少一個附加的肽組，其中每個肽組；(b)從單個人血源中獲得含有樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)分化樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與第一個肽組結(jié)合在一起；(e)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與來自附加蛋白質(zhì)的每個肽組結(jié)合在一起；(f)測量步驟(d)和(e)中T-細胞的增殖，以測定對于第一個和附加肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中T-細胞對于第一個蛋白質(zhì)和附加蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于第一個蛋白質(zhì)和附加蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)將對于第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于附加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定第一個蛋白質(zhì)和附加蛋白質(zhì)的免疫原性分級。在一些優(yōu)選的實施方案中肽組包含有長度為大約15個氨基酸的肽，而在一些特別優(yōu)選的實施方案中每個肽與鄰近肽重疊大約3個氨基酸?？墒?，這不是想要將肽組中的肽限制為任何特定的長度或者重疊，因為其他的肽長度和重疊數(shù)量在本發(fā)明中是有用的。
在一些實施方案中，將有最小結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)分級為比有更高結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。在另外的實施方案中，至少兩種蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。在更進一步的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在另一些其他的實施方案中，抗附加蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在進一步的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值，抗附加蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在一些實施方案中，步驟(d)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)，而在另外的實施方案中，步驟(e)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)。在更進一步的實施方案中，步驟(d)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)，步驟(e)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。在一些附加的特別優(yōu)選的實施方案中，比較對于每一個人血源和蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值。本發(fā)明也提供了將蛋白質(zhì)進行分類的方法，其是基于它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和它們的結(jié)構(gòu)值來進行的。因此，在一些進一步的實施方案中，將經(jīng)分析的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和結(jié)構(gòu)值進行分類和/或分級。
本發(fā)明也提供了用于將兩個蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其中第二個蛋白質(zhì)是第一個蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)變體，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從第二個蛋白質(zhì)中制備第二個肽組；(b)從單個人血源中獲得含有樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)分化樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與第一個肽組合并在一起；(e)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與第二個肽組合并在一起；(f)測量步驟(d)和(e)中T-細胞的增殖，以測定對于第一個和第二個肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中T-細胞對于第一個蛋白質(zhì)和第二個蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于第一個蛋白質(zhì)和第二個蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；(i)將對于第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于第二個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定第一個蛋白質(zhì)和第二個蛋白質(zhì)的免疫原性分級。在一些實施方案中，將第二個蛋白質(zhì)分級為比第一個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性，而在可選擇的實施方案中，將第一個蛋白質(zhì)分級為比第二個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。在一些優(yōu)選的實施方案中肽組包含有長度為大約15個氨基酸的肽，而在一些特別優(yōu)選的實施方案中每個肽與鄰近肽重疊大約3個氨基酸?？墒?，這不是想要將肽組中的肽限制為任何特定的長度或者重疊，因為其他的肽長度和重疊數(shù)量在本發(fā)明中是有用的。在另外的實施方案中，第一個和第二個蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。在更進一步的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值，而在其他實施方案中，抗第二個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在另外的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值，抗第二個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在更進一步的實施方案中，步驟(d)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)，步驟(e)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。在一些附加的特別優(yōu)選的實施方案中，比較對于每一個人血源和蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值。在一些實施方案中，第二個蛋白質(zhì)減少了至少一個第一個蛋白質(zhì)中的顯著區(qū)域。在進一步的實施方案中，步驟(e)中T-細胞的增殖為背景水平。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，比較對于每一個人血源和蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值。本發(fā)明也提供了將蛋白質(zhì)進行分類的方法，其是基于它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和它們的結(jié)構(gòu)值來進行的。因此，在一些進一步的實施方案中，將經(jīng)分析的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和結(jié)構(gòu)值進行分類和/或分級。
本發(fā)明也提供了用于將第一個蛋白質(zhì)和至少一個變體蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從每一個變體蛋白質(zhì)中制備肽組；(b)從單個人血源中獲得含有樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)分化樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與第一個肽組合并在一起；(e)將經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞與從每個變體蛋白質(zhì)中制備得到的每個肽組合并在一起；(f)測量步驟(d)和(e)中T-細胞的增殖，以測定對于第一個和第二個肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中T-細胞對于第一個蛋白質(zhì)和變體蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于第一個蛋白質(zhì)和變體蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)將對于第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于變體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定第一個蛋白質(zhì)和變體蛋白質(zhì)的免疫原性分級。在一些優(yōu)選的實施方案中，肽組包含有長度為大約15個氨基酸的肽，而在一些特別優(yōu)選的實施方案中，每個肽與鄰近肽重疊大約3個氨基酸?？墒?，這不是想要將肽組中的肽限制為任何特定的長度或者重疊，因為其他的肽長度和重疊數(shù)量在本發(fā)明中是有用的。在一些優(yōu)選的實施方案中，將至少一種變體蛋白質(zhì)分級為比第一個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性，而在其他實施方案中，將第一個蛋白質(zhì)分級為比至少一種變體蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。在另外的實施方案中，第一個和變體蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。在進一步的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值，而在其他實施方案中，抗變體蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在另外的實施方案中，抗第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值，抗變體蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。在更進一步的實施方案中，步驟(d)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)，步驟(e)中T-細胞的增殖導致大約2.95或者更高的刺激系數(shù)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。在一些附加的特別優(yōu)選的實施方案中，比較對于每一個人血源和蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值。在一些實施方案中，變體蛋白質(zhì)減少了至少一個第一個蛋白質(zhì)中的顯著區(qū)域。在進一步的實施方案中，步驟(e)中T-細胞的增殖為背景水平。在一些優(yōu)選的實施方案中，步驟(e)中T-細胞對于至少一種變體蛋白質(zhì)的增殖為背景水平。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，比較對于每一個人血源和蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值。在進一步的實施方案中，在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。本發(fā)明也提供了將蛋白質(zhì)進行分類的方法，其是基于它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和它們的結(jié)構(gòu)值來進行的。因此，在一些進一步的實施方案中，將經(jīng)分析的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和結(jié)構(gòu)值進行分類和/或分級。
本發(fā)明進一步提供了用于測定測試群體抗測試蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的方法，其包括下列步驟(a)從測試蛋白質(zhì)中制備肽組；(b)獲得多個含有人樹突細胞的溶液和原初人CD4+和/或CD8+T-細胞的多個溶液，其中人樹突細胞的溶液和原初人CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液從測試群體中多個個體之中獲得；(c)分化樹突細胞以產(chǎn)生多個含有經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將多個經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液與肽組合并在一起，其中將來自測試群體中的單個個體的每一個經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液合并在一起；(e)測量步驟(d)中T-細胞的增殖，以測定對于肽組中每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(e)中T-細胞對于測試蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于測試蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)確定多個個體對于測試蛋白質(zhì)的暴露水平。在一些優(yōu)選的實施方案中肽組包含有長度為大約15個氨基酸的肽，而在一些特別優(yōu)選的實施方案中每個肽與鄰近肽重疊大約3個氨基酸?？墒牵@不是想要將肽組中的肽限制為任何特定的長度或者重疊，因為其他的肽長度和重疊數(shù)量在本發(fā)明中是有用的。在一些實施方案中，測試至少兩種測試蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實施方案中，比較多個個體對于測試蛋白質(zhì)的暴露水平。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將測試蛋白質(zhì)進行修飾以產(chǎn)生在測試群體中表現(xiàn)出減弱的免疫反應(yīng)的變體蛋白質(zhì)。本發(fā)明也提供了將蛋白質(zhì)進行分類的方法，其是基于它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和它們的結(jié)構(gòu)值來進行的。因此，在一些進一步的實施方案中，將經(jīng)分析的蛋白質(zhì)根據(jù)它們的背景響應(yīng)百分數(shù)和結(jié)構(gòu)值進行分類和/或分級。
附圖簡述

圖1顯示了，與發(fā)表的“高加索人”HLA-DRB1群體相比較，對于社區(qū)供體群體中184個隨機個體的HLA-DRB1等位基因的平均頻率。
圖2顯示了具有82個隨機個體的群體中的響應(yīng)者百分數(shù)，這82個隨機個體用來自地衣形芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的肽進行測試。偏移3個氨基酸的連續(xù)的15聚肽列于x軸，對于每一個肽有響應(yīng)的供體的百分數(shù)顯示于y軸。
圖3顯示了具有65個隨機個體的群體中的響應(yīng)者百分數(shù)，這65個隨機個體用來自遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)枯草桿菌蛋白酶的肽進行測試。偏移3個氨基酸的連續(xù)的15聚肽列于x軸，對于每一個肽有響應(yīng)的供體的百分數(shù)顯示于y軸。
圖4顯示了具有113個個體的群體中的響應(yīng)者百分數(shù)，這113個個體用來自芽孢桿菌(Bacillus)BPN’枯草桿菌蛋白酶Y217L的兩個肽組進行測試。偏移3個氨基酸的連續(xù)的15聚肽列于x軸，對于每一個肽有響應(yīng)的供體的百分數(shù)顯示于y軸。
圖5顯示了具有92個個體的群體中的響應(yīng)者百分數(shù)，這92個個體用來自ALCALASE酶的肽進行測試。偏移3個氨基酸的連續(xù)的15聚肽列于x軸，對于每一個肽有響應(yīng)的供體的百分數(shù)顯示于y軸。
圖6提供的圖顯示出計算所得的結(jié)構(gòu)值隨著增加每個肽的響應(yīng)數(shù)目而減少。所顯示的結(jié)構(gòu)值為那些當積聚響應(yīng)時對于α-淀粉酶(正方形)和BPN’Y217L(菱形)所測定的值。
圖7中，板塊A和B提供了對于四種工業(yè)酶的GPIT(板塊A)和MINT(板塊B)分級數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)系數(shù)值之間的比較。將在基于豚鼠(GPIT)和小鼠(MINT)的檢測中測定的α-淀粉酶、ALCALASE酶、BPN’Y217L和遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的相對過敏原性與結(jié)構(gòu)系數(shù)值(y軸)進行比較。
圖8提供了顯示出有限的數(shù)據(jù)組的圖，該數(shù)據(jù)組表明用于計算BPN’Y217L變體的結(jié)構(gòu)的變體肽響應(yīng)。48個社區(qū)供體用來自BPN’Y217L的序列的肽進行測試。偏移3個氨基酸的連續(xù)的15聚肽列于x軸，對于每一個肽有響應(yīng)的供體的百分數(shù)顯示于y軸。最后兩個肽代表了第24和37號肽的變體序列。
圖9提供的圖顯示出來自30個社區(qū)供體的PBMC對于BPN’Y217L(空心三角形，結(jié)構(gòu)值＝0.53)和未修飾的BPN’Y217L變體(實心正方形，結(jié)構(gòu)值＝0.40)的最大增殖響應(yīng)。每個供體的最大響應(yīng)顯示于y軸。2.0的SI是對于“陽性”反應(yīng)的閾值(cut-off)。BPN’Y217L和變體之間增殖響應(yīng)的差異為p＜0.01。
圖10提供的圖顯示出對于25種如實施例5中所述進行測試的蛋白質(zhì)的相對結(jié)構(gòu)值和響應(yīng)背景百分數(shù)。
圖11提供的圖顯示出測試供體對于11種測試蛋白質(zhì)中每種蛋白質(zhì)的每個肽的平均響應(yīng)百分數(shù)。
圖12提供的圖顯示出對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的響應(yīng)頻率(n＝65個社區(qū)供體)。板塊A顯示了對于描述枯草桿菌蛋白酶的線性肽的響應(yīng)百分數(shù)。連續(xù)的肽顯示于x軸。65個供體中的響應(yīng)百分數(shù)位于y軸。板塊B顯示了組內(nèi)的響應(yīng)頻率。顯示了對于在遲緩芽孢桿菌肽組中的肽的響應(yīng)頻率。
圖13提供的圖顯示出7個SPT+(皮膚針刺測試陽性)的供體對于遲緩芽孢桿菌肽的響應(yīng)。將來自7個通過皮膚針刺測試而證實對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶致敏的供體的PBMC用于本發(fā)明的I-MUNE檢測之中，以測試它們對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶肽的響應(yīng)。如果觀察到2.95或者更高的SI，則認為對于肽的響應(yīng)是陽性的。對每一個肽有響應(yīng)的供體的數(shù)目顯示于y軸。連續(xù)的遲緩芽孢桿菌肽顯示于x軸。
圖14提供了顯示對于鏈激酶的I-MUNE檢測數(shù)據(jù)結(jié)果的圖。板塊A提供了每個肽(n＝72)的響應(yīng)者百分數(shù)。連續(xù)的鏈激酶肽顯示于x軸。在數(shù)量為72的供體組中的響應(yīng)者百分數(shù)顯示于y軸。板塊B顯示了每個肽的響應(yīng)頻率。
圖15提供的表顯示了用本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)獲得的I-MUNE檢測結(jié)果與發(fā)表的鏈激酶表位之間的表位對比。
圖16提供了顯示出對于β-2微球蛋白的I-MUNE檢測結(jié)果的圖。板塊A顯示了每個肽(n＝87)的響應(yīng)者百分數(shù)。連續(xù)的人β-2微球蛋白肽顯示于x軸。數(shù)量為87的供體組中的響應(yīng)百分數(shù)顯示于y軸。板塊B顯示了每個肽的響應(yīng)頻率。
圖17提供的表顯示了通過本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)鑒定的對于細菌蛋白酶中的表位肽的IC50結(jié)合值。低于500nM的值可認為是良好的結(jié)合物，其在表中以粗體加以強調(diào)。簡并性指明了18個進行測試的全部等位基因中以低于500nM的IC50進行結(jié)合的II型HLA蛋白質(zhì)的數(shù)目。
發(fā)明描述本發(fā)明提供了評估群體的免疫反應(yīng)特性的方法。特別地，本發(fā)明提供了定性地評估人類群體的免疫反應(yīng)的方法，其中對于針對任何目標蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)進行分析。本發(fā)明進一步提供了基于蛋白質(zhì)的相對免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，本發(fā)明提供了方法來創(chuàng)造在多種應(yīng)用中使用的具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了用于在人類群體基礎(chǔ)上鑒定CD4+T-細胞表位的離體技術(shù)。在對于目標蛋白質(zhì)預(yù)先致敏的供體群體內(nèi)，可以定義出所有記憶表位(recall epitope)。對于定義為對于目標蛋白質(zhì)不致敏的供體群體，鑒定基本的或者可交叉反應(yīng)的表位。雖然不能正式地排除后者，但是有許多事實支持這樣的結(jié)論，即所發(fā)現(xiàn)的表位為基本表位(primary epitope)。首先，在工業(yè)蛋白質(zhì)中找到的表位主要為混雜的結(jié)合物，其在體外結(jié)合檢測中具有低的IC50值。記憶響應(yīng)的特征在于一段時間內(nèi)的低的閾值，而不是限定于最高的結(jié)合值(見Hesse等人，J.Immunol.，1671353-1361)。第二，當使用可能未致敏的供體時，總是發(fā)現(xiàn)全部記憶表位的亞組。這是基本的、免疫顯性的表位的特征(見Muraro等人，J.Immonol.，1645474-5481；Vanderlugt等人，Nat.Rev.Immunol.，285-95；Vanderlugt等人，J.Immonol.，164670-678；和Yin等人，J.Immonol.，262063-2068)。第三，β-2微球蛋白以一組偏移3個氨基酸的15聚肽進行測試，其代表了一組52個肽，對于這些肽沒有發(fā)現(xiàn)顯著的表位響應(yīng)。似乎不可能的是，沒有發(fā)現(xiàn)這些序列中的一個為在任何其他蛋白質(zhì)中的交叉反應(yīng)序列。第四，當發(fā)現(xiàn)與在來自人病原體的蛋白質(zhì)中找到的序列可交叉反應(yīng)的表位時(正如對于檢查細菌酶蛋白質(zhì)的情況)，對于表位肽的響應(yīng)百分數(shù)是非常高的(30％)，這比在其他10種如實施例7中所述進行測試的工業(yè)酶中所比較的任何響應(yīng)要高得多。第五，本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)通過使用富含CD4+T-細胞的響應(yīng)者細胞和活化的源自單核細胞的樹突細胞作為APC來進行。所見的增殖響應(yīng)的程度是非常小的，這與抗原特異性CD4+T-細胞的低前體頻率相一致。所檢測到的記憶增殖響應(yīng)比在可能未致敏的群體中檢測到的響應(yīng)要強烈得多。最后，用表位序列進行BLAST搜索。對于源自芽孢桿菌的蛋白質(zhì)，芽孢桿菌菌種含有在所鑒定的表位序列內(nèi)有修飾的蛋白酶變體。可是，不可能的是，供體庫會對于這些或者任何其他的芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶變得敏感(用上面所引用的明顯的交叉反應(yīng)例子)。有趣的是，在BPN’Y217L中的70-84位氨基酸表位區(qū)域和推定的人源ATP依賴型RNA解旋酶中的區(qū)域之間具有一些同源性(66％同源性)(見Imamura等人，Nucl.Acids Res.，262063-2068)。可以期望與廣泛表達的管家基因如該基因的同源性會引起耐受性，而不是激起交叉反應(yīng)的響應(yīng)。
在分析群體數(shù)據(jù)時，背景率是重要的要考慮的事項。背景率是由于對于表位肽的聚積性陽性響應(yīng)以及達到2.95SI閾值的隨機事件而造成的。隨機聚積性陽性響應(yīng)的低水平反應(yīng)了在人供體中CD4+T-細胞增殖狀況的異質(zhì)性(見Asquith等人，Trends Immunol.，23595-601)。雖然背景可以通過增加響應(yīng)值閾值而人工地減少，但是具有可測量的背景率使得能夠確定響應(yīng)頻率是以非隨機的方式在何處積聚的。例如，對于HPV16 E6的背景響應(yīng)率比對于工業(yè)酶的背景響應(yīng)率明顯地要高，這可能反映了在社區(qū)供體群體中HPV16感染的高度流行(Lazcano-Ponce等人，Int’l J.Cancer 91412-420；和Stone等人，J.Infect.Dis.，1861396-1402)。對于鏈激酶可能出現(xiàn)同樣的情況。
盡管在I-MUNE檢測系統(tǒng)中包括有這么多可變情況，但是對于表位響應(yīng)頻率的變異系數(shù)(CV)是非常良好的(對于四種測試肽，平均值為20％)。有利的是，這種重現(xiàn)性水平與在實驗室內(nèi)和供體間的主要ELISPOT數(shù)據(jù)重復測試中所報道的變異系數(shù)值進行比較，這一重復測試是一種類似的離體檢測(Keilhoz等人，J.Immunother.，2597-138；和Asai等人，Clin.Diag.Lab Immunol.，7145-154)。一般地，當對于表位肽的反應(yīng)百分數(shù)增加時，CV值減小。另外，具有減少的頻率(通常低于供體群體的10％)的非表位肽響應(yīng)有著增加的CV值。例如，在實施例7中，總背景率為3.15％，其具有1.6％的標準偏差，和51％的CV。
如果群體經(jīng)證實對于目標蛋白質(zhì)預(yù)致敏，那么用于確定表位肽的統(tǒng)計學方法是不同的。增加的背景響應(yīng)可能是由于對于在記憶響應(yīng)中所見的功能性激活的閾值減少了(見Hesse等人，如上)。對于功能性激活的閾值的減少導致本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)可檢測出更多的表位。I-MUNE檢測系統(tǒng)的結(jié)果與來自致敏供體的數(shù)據(jù)之間的比較顯示出，I-MUNE檢測數(shù)據(jù)中的顯著表位響應(yīng)與無性繁殖CD4+T-細胞系所限定的表位響應(yīng)相一致。通過降低統(tǒng)計學方法的嚴格性水平，在I-MUNE檢測系統(tǒng)中表位肽的選擇與發(fā)表的表位序列一致。在具有非常低的背景率的數(shù)據(jù)組如工業(yè)酶數(shù)據(jù)中表位狀況的標明是更加嚴格的。當背景響應(yīng)非常低時，如果使用嚴格性減少的測定，則許多肽積聚達到閾值的響應(yīng)，但是總響應(yīng)頻率是非常低的，并且將會難以重現(xiàn)。通常地，當響應(yīng)低于總?cè)后w的10％時，由于測試超過100個供體的技術(shù)困難它們將會變得難以重現(xiàn)。顯著的表位響應(yīng)可容易地從頻率數(shù)據(jù)中推斷出來，在這些頻率數(shù)據(jù)中表位響應(yīng)是超偏值。在未致敏的供體中的表位肽序列可能反映了能夠引起再次增殖的緊密結(jié)合混雜表位(Viola和Lanzavecchi，Science 273104-106；和Rachmilewitz和Lanzavecchia，Trends Immunol.，23592-595)。這一點通過體外肽結(jié)合研究對于在兩個工業(yè)酶中標明的表位肽而得到確認(見實施例7)。
本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)沒有鑒定人β-2微球蛋白中的任何表位。這一結(jié)果突出了本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)與基于算法的II型HLA結(jié)合預(yù)測方法之間的差異。肽結(jié)合算法可通過互聯(lián)網(wǎng)自由地使用，而且對于本領(lǐng)域的人員來說是已知的，其預(yù)測在該序列中的II型結(jié)合表位。可是，正如此處給出的結(jié)果所例示的，與II型分子結(jié)合并不總是表明功能性表位的存在。對于確定T-細胞表位，與II型HLA結(jié)合是必需的，但是還不夠。這是眾所周知的預(yù)測方法的特性，因此這些方法常常用功能測試來加以補充?？墒?，本發(fā)明提供了來獲得這一信息的更直接的方法。
重要的是要注意到此處描述的表位確定是在群體基礎(chǔ)之上定義的。雖然顯著表位常常顯示出一定水平的HLA特異性，但是表位肽主要通過它們的混雜HLA結(jié)合能力來定義。因為這一點，如果要尋找免疫原性減退的蛋白質(zhì)，那么這些表位可能是超型(supertype)結(jié)合物，因此它們代表了用于修飾的良好候選物。可是，要注意到，由于是基于群體的分析，用這些結(jié)果作為指導而形成的免疫原性減退的蛋白質(zhì)并不總是在每個獨立情況下都沒有免疫原性。雖然如此，在群體基礎(chǔ)上確定T-細胞表位在表征對感染源的免疫反應(yīng)中是有用的(見Novitsky等人，J.Virol.，7610155-10168；和Pathan等人，J.Immunol.，1675217-5225)。這樣的研究的一個目的是設(shè)計有效的疫苗，其中也保證包含有混雜超型結(jié)合物。有趣的是，當將在一個這些研究(Pathan等人，如上)中給出的數(shù)據(jù)通過此處定義的暴露供體方法而進行的分析時，選擇出了同樣的一組優(yōu)勢表位響應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。
除了其在傳染病的確定以及蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用之外，本發(fā)明的方法還提供了用于在任何目標蛋白質(zhì)中定位功能性CD4+T-細胞表位的方法。當認為供體群體沒有接觸目標蛋白質(zhì)時，背景響應(yīng)是低的，嚴格的統(tǒng)計學可以用于選擇出CD4+表位序列。有趣的是，人蛋白質(zhì)具有非常低的背景響應(yīng)。高的背景水平是與供體接觸目標蛋白質(zhì)相應(yīng)的，此時表位的確定依賴于較不嚴格的標準。表位的標明已經(jīng)通過與經(jīng)證實致敏的供體的數(shù)據(jù)進行比較而得到確認。正如上面所指明的，在人β-2微球蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)表位，這種情況也適用于普遍表達并且使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐受性的蛋白質(zhì)。因此，本I-MUNE檢測系統(tǒng)提供了用于預(yù)測基于群體的CD4+T-細胞表位的有價值的工具。這一技術(shù)的應(yīng)用包括創(chuàng)造免疫原性減退的蛋白質(zhì)變體，選擇用于創(chuàng)造基于表位的疫苗的表位區(qū)域，和作為一種工具而包含于所有商用蛋白質(zhì)的風險評估的評價系統(tǒng)中。
實際上，本發(fā)明提供了減少CD4+T-細胞的致敏潛能的方法。這種方法特別可用于這樣的目標群體中，即該目標群體以前未接觸潛在的商用蛋白質(zhì)或者任何其他想要用于人和其他動物的蛋白質(zhì)。實際上，除了創(chuàng)造過敏原性/免疫原性減退的商用蛋白質(zhì)變體之外，T-細胞表位的鑒定是許多疫苗策略的基礎(chǔ)(Alexander等人，Immunol.Res.，1879-2；和Berzofsky，Ann.N.Y.Acad.Sci.，690256-264)。由清除病原體的個體相對于沒有清除病原體的個體所識別的T-細胞表位的鑒定有利于癌癥和病毒疫苗的設(shè)計(Manici等人，J.Exp.Med.，189871-87；Doolan等人，J.Immunol.，1651123-1137；和Novitsky等人，J.Virol.，7610155-10168)。過敏原性/免疫原性減退的蛋白質(zhì)在個人護理、健康護理和家庭護理情況中的使用以及在商業(yè)應(yīng)用中的使用也是清楚的。實際上，這樣的過敏原性/免疫原性減退的蛋白質(zhì)在無數(shù)的情況和應(yīng)用中是有用的。
對于創(chuàng)造CD4+T-細胞表位經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，第一個緊要的步驟是在蛋白質(zhì)中定位功能性表位。由許多基于計算機的方法來預(yù)測與II型HLA分子結(jié)合的肽序列的定位(Yu等人，Mol.Med.，8137-148；Rammensee等人，Immunogenet.，50213-219；Sturniolo等人，Nat.Biotechnol.，17555-561；和Altuvia等人，J.Mol.Biol.，249244-250)。對于CD4+T-細胞的激活來說，與HLA的結(jié)合是必需的，但還不夠。最佳的是必須進行體外和體內(nèi)測試以確認功能性。對于基于計算機的方法在它們的能力上進行了改進，以便正確地鑒定緊密的HLA結(jié)合物，但是仍然缺乏對于結(jié)合非II型HLA-DR分子的預(yù)測，并且具有明顯的錯誤陰性率。另外，功能的差異如耐受性的引起和通過激活的T-細胞而引起不同響應(yīng)的表位不能用計算機建模來進行評估。
因此，本發(fā)明提供了迄今無法獲得的鑒定和確認功能性的方法以評估CD4+T-細胞表位經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了在體外基于人細胞的方法，來定位來自任何目標蛋白質(zhì)的免疫顯性的、混雜的II型HLA表位。和其良好地應(yīng)用于描繪基于群體的對于病原體來源的蛋白質(zhì)的表位響應(yīng)一樣，該方法同樣良好地應(yīng)用于工業(yè)酶、食物過敏原和人治療蛋白質(zhì)以及任何其他目標蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，大的供體組沒有對于HLA類型進行預(yù)選擇而進行測試。表位確定是基于將整個供體組對于所有來自蛋白質(zhì)序列的肽的響應(yīng)率進行統(tǒng)計學分析來完成的，因此代表了基于群體的表位。正如此處所指明的，本發(fā)明的方法能夠區(qū)分供體群體已經(jīng)接觸的蛋白質(zhì)和供體群體以前未遇到的或者還未對其變得敏感的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的形成期間，將兩個類型的分析與來自經(jīng)證實抗原致敏的供體的增殖結(jié)果進行比較。另外，測試人β-2微球蛋白，并將其確定為陰性對照。
正如此處所提到的，表位肽通過與背景響應(yīng)率的差異來標明。當對于多個隨機供體組進行測試時，表位肽響應(yīng)是可重現(xiàn)的，其具有21％這一變異系數(shù)中值。另外，如在此更詳細地討論的，本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)鑒定了對于蛋白質(zhì)鏈激酶的記憶表位，和鑒定了工業(yè)酶中的免疫顯性的、混雜的表位(其代表了全部記憶表位的一個亞組)。此外，I-MUNE檢測系統(tǒng)在陰性對照(即人β-2微球蛋白)中沒有發(fā)現(xiàn)表位。重要的是，本發(fā)明提供了方法以在沒有對于II型HLA的類型進行預(yù)選擇的情況下在任何蛋白質(zhì)中鑒定功能性CD4+T-細胞表位，從而可表明供體群體是否預(yù)先接觸了目標蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明對于體外測試不需要致敏的供體。
在本發(fā)明的形成期間，在大的人供體庫中使用肽特異性響應(yīng)的統(tǒng)計分析提供了一種度量，這種度量以小鼠和豚鼠暴露模型所確定的順序?qū)⑺姆N工業(yè)酶進行分級。該分級方法也有利地與在職業(yè)性暴露的工作者中的人致敏率進行了比較。也進行本發(fā)明方法的附加的確認，這是基于已知在人中引起致敏的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值來進行的。這些結(jié)果的比較表明了，致敏水平比對于人β-2微球蛋白所測定的值高。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了比較方法來預(yù)測在人中多種相關(guān)和不相關(guān)蛋白質(zhì)的免疫原性。因此，本發(fā)明提供的信息可用于蛋白質(zhì)療法的早期開發(fā)和其他基于蛋白質(zhì)的應(yīng)用以選擇或創(chuàng)造出免疫原性減弱的變體。
定義在此處除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有和與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域中普通熟練技術(shù)人員的通常理解相同的含義。例如，微生物學和分子生物學詞典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology，第二版，John Wiley & Sons出版社，NY(1994))；和Harper Collins生物學詞典(The Harper Collins Dictionary ofBiology，第二版，Hale和Marham，Harper Perennial出版社，NY(1991))為本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員提供了許多此處使用的術(shù)語的一般性詞典。雖然任何相似于或者相當于此處所描述的那些的方法和材料可在本發(fā)明的實施中使用，但此處描述了優(yōu)選的方法和材料。因此，在下面定義的術(shù)語通過參照作為一個整體的說明書而進行更完整的描述。
在此處使用時，術(shù)語“群體”是指在給定的區(qū)域內(nèi)相互聯(lián)系的和/或居住的個體。在一些實施方案中，該術(shù)語用于大量的享有共同特征的個體(例如具有特殊的HLA類型的群體，等等)。雖然在優(yōu)選的實施方案中該術(shù)語用于人類群體，但是這不是想要將該術(shù)語限制于人，因為其也可用于其他動物和生物。在一些實施方案中，該術(shù)語用于全部的條目(item)、特征、從中可取出樣本的個體等等。
在此處使用時，術(shù)語“基于群體的免疫反應(yīng)”是指群體成員的免疫反應(yīng)特性(即特征)。
在此處使用時，術(shù)語“免疫反應(yīng)”是指由于生物體(例如人或者其他動物)抗免疫原而引起的免疫學反應(yīng)。意圖是，該術(shù)語包括所有類型的免疫反應(yīng)，包括體液的(即抗體介導的)、細胞的和非特異性的免疫反應(yīng)，但并不局限于此。在一些實施方案中，該術(shù)語反映了群體的免疫水平(即對于特定抗原“有免疫性”的人的數(shù)量，和/或?qū)τ谔囟乖皼]有免疫性”的人的數(shù)量)。
在此處使用時，術(shù)語“減弱的免疫原性”是指，與原始的野生型(例如親本或源)蛋白質(zhì)相比，用變體(例如衍生物)蛋白質(zhì)所觀察到的免疫反應(yīng)的減小。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了變體蛋白質(zhì)，其與源蛋白質(zhì)相比在體外和/或體內(nèi)激起強度更小的免疫反應(yīng)?？善谕氖?，這些具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)將會在多種應(yīng)用中使用，包括生物產(chǎn)品、蛋白質(zhì)治療劑、食品和飼料、個人護理、去污劑和其他消費者相關(guān)的產(chǎn)品，以及在其他治療方法、診斷等等中使用，但并不局限于此。
在此處使用時，術(shù)語“增強的免疫原性”是指，與原始的野生型(例如親本或源)蛋白質(zhì)相比，用變體(例如衍生物)蛋白質(zhì)所觀察到的免疫反應(yīng)的增加。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了變體蛋白質(zhì)，其與源蛋白質(zhì)相比在體外和/或體內(nèi)激起強度更大的免疫反應(yīng)?？善谕氖牵@些具有增強的免疫原性的蛋白質(zhì)將會在多種應(yīng)用中使用，包括生物產(chǎn)品、蛋白質(zhì)治療劑、食品和飼料添加劑，以及在其他治療方法、診斷等等中使用，但并不局限于此。
在此處使用時，術(shù)語“過敏原性食物蛋白質(zhì)”是指任何能夠在人和其他動物中引起過敏反應(yīng)的食物蛋白質(zhì)?！巴贫ǖ倪^敏原性食物蛋白質(zhì)”是可能為過敏原的食物蛋白質(zhì)?！熬哂袦p弱的過敏原性的食物蛋白質(zhì)”是經(jīng)過修飾從而具有比原始的、未修飾的蛋白質(zhì)更弱的過敏原性的(即“過敏原性減退的”)食物蛋白質(zhì)。意圖是，這些術(shù)語包括天然存在的食物蛋白質(zhì)以及通過合成和/或使用重組技術(shù)生產(chǎn)出的食物蛋白質(zhì)。
在此處使用時，術(shù)語“改變的免疫反應(yīng)”是指增強的或減弱的免疫反應(yīng)。當?shù)鞍踪|(zhì)和肽激起的T-細胞和/或B-細胞響應(yīng)比親本(例如前體)蛋白質(zhì)或肽(例如目標蛋白質(zhì))激起的T-細胞和/或B-細胞響應(yīng)更強烈時，這些蛋白質(zhì)和肽顯示出“增強的免疫反應(yīng)”。這一更強的響應(yīng)的最終結(jié)果是增強的針對變體蛋白質(zhì)或肽的抗體反應(yīng)。當?shù)鞍踪|(zhì)和肽激起的T-細胞和/或B-細胞響應(yīng)比親本(例如前體)蛋白質(zhì)或肽激起的T-細胞和/或B-細胞響應(yīng)更弱時，這些蛋白質(zhì)和肽顯示出“減弱的免疫反應(yīng)”。這一更弱的響應(yīng)的最終結(jié)果是減弱的針對變體蛋白質(zhì)或肽的抗體反應(yīng)。在一些優(yōu)選的實施方案中，親本蛋白質(zhì)是野生型蛋白質(zhì)或肽。
在此處使用時，術(shù)語“刺激系數(shù)”是指，與對照相比，肽的T-細胞增殖響應(yīng)的度量。SI是這樣計算出來的，即將在測試含有肽的CD4+T-細胞和樹突細胞培養(yǎng)物中獲得的平均CPM(每分鐘計數(shù))除以含有樹突細胞和CD4+T-細胞但沒有肽的對照培養(yǎng)物的平均CPM。該值對于每個供體和每個肽進行計算。雖然在一些實施方案中，大約1.5-4.5的SI值用于表明陽性響應(yīng)，但用于表明陽性響應(yīng)的優(yōu)選的SI值為2.5-3.5(包括端值)，優(yōu)選地為2.7-3.2(包括端值)，和更優(yōu)選地為2.9-3.1(包括端值)。此處描述的最優(yōu)選的實施方案使用2.95的SI值。
在此處使用時，術(shù)語“數(shù)據(jù)組”是指對于一組肽和一組對于它們抗每個測試蛋白質(zhì)(即目標蛋白質(zhì))的響應(yīng)進行測試的供體所匯集的數(shù)據(jù)。
在此處使用時，術(shù)語“肽組”是指對于每個測試蛋白質(zhì)(即目標蛋白質(zhì))所產(chǎn)生出的一組肽。肽組中的這些肽用來自每個供體的細胞進行測試。
在此處使用時，術(shù)語“結(jié)構(gòu)”和“結(jié)構(gòu)值”是指用于將蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的值。結(jié)構(gòu)值根據(jù)下面的“偏離均值的總變化距離”公式進行測定Σ|f(i)-1p|]]>其中∑(大寫字母西格馬)為對于每個肽的響應(yīng)頻率減去該肽在組中的頻率的絕對值之和；f(i)定義為對于單個肽的響應(yīng)頻率；和p為肽組中肽的數(shù)量。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，對于每個進行測試的蛋白質(zhì)測定結(jié)構(gòu)值?；谒@得的結(jié)構(gòu)值，從一系列進行測試的蛋白質(zhì)中按最低值到最高值將測試蛋白質(zhì)進行分級。在該進行分級的系列中，最低值表明免疫原性最弱的蛋白質(zhì)，而最高值表明免疫原性最強的蛋白質(zhì)。
結(jié)構(gòu)值依賴于進行測試的供體的數(shù)量(即從不同的個體獲得的血液樣品的數(shù)量)。一般地，整個數(shù)據(jù)組的零響應(yīng)提供了1.0的結(jié)構(gòu)值。對于每個肽的響應(yīng)數(shù)目相同就會得到結(jié)構(gòu)值為0。因此，在優(yōu)選的實施方案中，應(yīng)當對肽組進行測試直至數(shù)據(jù)組的大部分都有響應(yīng)，以便數(shù)據(jù)能夠準確地反映對于特定的肽和肽區(qū)域的響應(yīng)。在特別優(yōu)選的實施方案中，對于數(shù)據(jù)組中每個肽都有響應(yīng)。可是，由于多種因素(例如不溶問題)一些數(shù)據(jù)組沒有顯示出對于數(shù)據(jù)組中每個肽的響應(yīng)。
雖然上面的公式是用于測定結(jié)構(gòu)值的優(yōu)選的公式，但是其他同等的公式在本發(fā)明中也是可用的。例如，“分布熵”(entropy of thedistribution)公式在本發(fā)明中是可用的，以及多種本領(lǐng)域中的人員已知的其他公式。
在一些實施方案中，肽組用至少與下列情況一樣多的供體進行測試，即應(yīng)當對于每個給出的肽產(chǎn)生響應(yīng)，其具有3％非特異性響應(yīng)的總比率。例如，在優(yōu)選的實施方案中，88個肽的肽組用最少30個供體進行測試。因此，在肽組包括更多的肽的實施方案中，供體的數(shù)量相應(yīng)地進行調(diào)節(jié)。盡管如此，30個供體還是優(yōu)選的最小數(shù)量。當然，可以用本發(fā)明的方法測試更多的供體，甚至當在肽組中存在更少的肽時。在一些優(yōu)選的實施方案中，數(shù)據(jù)組包括至少50個供體，以便提供良好的HLA等位基因的代表。
在此處使用時，“顯著響應(yīng)”是指一個肽在數(shù)據(jù)組中產(chǎn)生體外T-細胞響應(yīng)率，該響應(yīng)率比背景響應(yīng)率高大約2.0倍。在進一步的實施方案中，該響應(yīng)比背景響應(yīng)率高大約2.0倍-大約5.0倍。這樣的響應(yīng)也包括在該術(shù)語之內(nèi)，即該響應(yīng)代表了在背景響應(yīng)率之上有大約2.5-3.5倍的增加、大約2.8-3.2倍的增加和2.9-3.1倍的增加。例如，在本發(fā)明的形成期間，對于一些肽記錄到了顯著響應(yīng)。
在此處使用時，“顯著區(qū)域”是指用特定的肽組獲得的I-MUNE檢測響應(yīng)，其比背景響應(yīng)率高大約2.0倍。在本發(fā)明的一個實施方案中，減少蛋白質(zhì)的所有顯著區(qū)域，從而降低它們在本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)中的響應(yīng)。在進一步的實施方案中，顯著區(qū)域的數(shù)目減少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，并且優(yōu)選地在相關(guān)蛋白質(zhì)中減少1-5個顯著區(qū)域。在一些實施方案中，顯著區(qū)域也符合T-細胞表位的要求。
在此處使用時，術(shù)語“樣本”是以其最寬泛的含義進行使用的。可是，在優(yōu)選的實施方案中，該術(shù)語用于指這樣的樣品(例如等分試樣)，該樣品含有正進行分析、鑒定、修飾和/或與其他肽比較的肽(例如肽組中的肽，其含有目標蛋白質(zhì)的序列)。因此，在多數(shù)情況下，該術(shù)語用于含有目標蛋白質(zhì)或目標肽的材料。
在此處使用時，“背景水平”和“背景響應(yīng)”是指對于在任何測試蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)組中任何給出的肽的平均響應(yīng)者百分數(shù)。該值是通過將對于組中的所有肽的響應(yīng)者百分數(shù)求平均值來測定的，這是通過對所有的測試供體進行匯集得到的。作為一個例子，3％的背景響應(yīng)表明，平均起來，當對100個供體進行測試時，對于數(shù)據(jù)組中的任何肽會有三個陽性(SI大于2.95)反應(yīng)。
在此處使用時，“抗原呈遞細胞”(“APC”)是指在其表面呈遞抗原的免疫系統(tǒng)細胞，從而抗原能夠被T-細胞表面上的受體識別?？乖蔬f細胞包括樹突細胞、交錯突細胞、激活的B-細胞和巨噬細胞，但并不局限于此。
在此處使用時，術(shù)語“T淋巴細胞”和“T-細胞”包括在T淋巴細胞譜系中的任何細胞，從T-細胞前體(包括沒有重排T-細胞受體基因的Thy1陽性細胞)至成熟的T-細胞(即對于CD4或CD8單陽性的、表面TCR陽性的細胞)。
在此處使用時，術(shù)語“B淋巴細胞”和“B-細胞”包括在B-細胞譜系中的任何細胞，從B-細胞前體如前B-細胞(已經(jīng)開始重排Ig重鏈基因的B220+細胞)至成熟的B-細胞和漿細胞。
在此處使用時，“CD4+T-細胞”和“CD4T-細胞”是指輔助T-細胞，而“CD8+T-細胞”和“CD8T-細胞”是指細胞毒性T-細胞。
在此處使用時，“B-細胞增殖”是指在有或沒有抗原存在的情況下將B-細胞與抗原呈遞細胞一起培養(yǎng)期間所產(chǎn)生的B-細胞的數(shù)量。
在此處使用時，“基本B-細胞增殖”是指，在不存在肽或蛋白質(zhì)抗原的情況下，對于暴露于抗原呈遞細胞作出響應(yīng)而通常在個體中見到的B-細胞增殖的程度。對于此處的目的，基本B-細胞增殖水平是這樣測定的，即在每個樣品的基礎(chǔ)之上對于每個個體測定在不存在抗原的情況下的B-細胞的增殖。
在此處使用時，“B-細胞表位”是指肽或蛋白質(zhì)的特征，這些肽或蛋白質(zhì)在對于含有那個抗原(即免疫原)的肽的免疫反應(yīng)中被B-細胞受體所識別。
在此處使用時，“改變的B-細胞表位”是指與前體肽或目標肽不同的表位氨基酸序列，因此目標肽變體在人或另一種動物中產(chǎn)生不同的(即改變的)免疫反應(yīng)。期望的是，改變的免疫反應(yīng)包括改變的免疫原性和/或過敏原性(即增強的或減弱的總免疫反應(yīng))。在一些實施方案中，改變的B-細胞表位包括替換和/或刪除選自位于鑒定出的表位中的那些殘基的氨基酸。在另一些可選擇的實施方案中，改變的B-細胞表位包括在表位內(nèi)添加一個或多個殘基。
在此處使用時，“T-細胞增殖”是指在有或沒有抗原存在的情況下將T-細胞與抗原呈遞細胞一起培養(yǎng)期間所產(chǎn)生的T-細胞的數(shù)量。
在此處使用時，“基本T-細胞增殖”是指，在不存在肽或蛋白質(zhì)抗原的情況下，對于暴露于抗原呈遞細胞作出響應(yīng)而通常在個體中見到的T-細胞增殖的程度。對于此處的目的，基本T-細胞增殖水平是這樣測定的，即在每個樣品的基礎(chǔ)之上對于每個個體測定在不存在抗原的情況下T-細胞對于抗原呈遞細胞作出響應(yīng)而產(chǎn)生的增殖。
在此處使用時，“T-細胞表位”是指肽或蛋白質(zhì)的特征，這些肽或蛋白質(zhì)在對于含有那個抗原(即免疫原)的肽的免疫反應(yīng)的起始階段中被T-細胞受體所識別。盡管不想將本發(fā)明限制于任何特定的機制，但一般相信T-細胞表位被T-細胞的識別是通過這樣的機制來進行的，即在該機制中T-細胞識別與在抗原呈遞細胞上表達的I型或II型MHC(即HLA)分子結(jié)合的抗原的肽片段(見例如，Moeller，Immunol.Rev.，98187)。
在此處使用時，“改變的T-細胞表位”是指與前體肽或目標肽不同的表位氨基酸序列，因此目標肽變體在人或另一種動物中產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。期望的是，改變的免疫反應(yīng)包括改變的免疫原性和/或過敏原性(即增強的或減弱的總免疫反應(yīng))。在一些實施方案中，改變的T-細胞表位包括替換和/或刪除選自位于鑒定出的表位中的那些殘基的氨基酸。在另一些可選擇的實施方案中，改變的T-細胞表位包括在表位內(nèi)添加一個或多個殘基。
在此處使用時，“目標蛋白質(zhì)”是指待進行分析、鑒定和/或修飾的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)。天然存在的蛋白質(zhì)以及重組蛋白質(zhì)在本發(fā)明中是可用的。實際上，本發(fā)明可用于任何這樣的蛋白質(zhì)，即希望通過抗這些蛋白質(zhì)來表征和/或調(diào)節(jié)人(或者其他動物)的免疫反應(yīng)。在一些實施方案中，包括激素、細胞因子、抗體、酶、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)可在本發(fā)明中使用。在一些實施方案中，包括胰島素、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)和黃體生成素(LH)在內(nèi)的激素可在本發(fā)明中使用，但并不局限于此。在進一步的實施方案中，包括干擾素(例如IFN-α和IFN-β)、白細胞介素(例如IL-1至IL-15)、腫瘤壞死因子(例如TNF-α和TNF-β)和GM-CSF在內(nèi)的細胞因子可在本發(fā)明中使用，但并不局限于此。在另一些其他的實施方案中，包括人類抗體和人源化抗體、任何類型的源自抗體的片段(例如單鏈抗體)在內(nèi)的抗體(即免疫球蛋白)可在本發(fā)明中使用，但并不局限于此。在另一些其他實施方案中，包括食物過敏原(例如Bere1[巴西堅果過敏原]和Ara H1[花生過敏原])在內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白可在本發(fā)明中使用，但并不局限于此。在另外的一些實施方案中，蛋白質(zhì)為工業(yè)和/或醫(yī)用酶。在一些實施方案中，優(yōu)選類型的酶包括蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、酯酶、淀粉酶、酚氧化酶、氧化酶、通透酶、支鏈淀粉酶、異構(gòu)酶、激酶、磷酸酶、內(nèi)酰胺酶和還原酶，但并不局限于此。
在此處使用時，“蛋白質(zhì)”是指任何由氨基酸組成的和被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員認為是蛋白質(zhì)的化合物。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”在此處可互換使用。其中，肽是蛋白質(zhì)的一部分，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可根據(jù)上下文理解術(shù)語的使用。術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括成熟形式的蛋白質(zhì)，以及相關(guān)蛋白質(zhì)的前體形式(pro-form)和前前體形式(prepro-form)。蛋白質(zhì)的前前體形式包括這樣的蛋白質(zhì)的成熟形式，即該蛋白質(zhì)具有可操作地連接到蛋白質(zhì)氨基端的前序列，和可操作地連接到前序列氨基端的“前”或“信號”序列。
在此處使用時，“野生型”和“天然”蛋白質(zhì)是指那些在自然中找到的蛋白質(zhì)。術(shù)語“野生型序列”和“野生型基因”在此處可互換使用，其是指在宿主細胞中天然的或天然存在的序列。在一些實施方案中，野生型序列是指作為蛋白質(zhì)工程計劃的起始點的目標序列。
在此處使用時，“蛋白酶”是指天然存在的蛋白酶以及重組蛋白酶。蛋白酶為羰基水解酶，其通?？梢郧懈畹鞍踪|(zhì)或肽的肽鍵。天然存在的蛋白酶包括α-氨酰肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰氨基水解酶、絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶、巰基蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶這樣的例子，但并不局限于此。包括絲氨酸、金屬、巰基和酸蛋白酶，以及內(nèi)切和外切蛋白酶。實際上，在一些優(yōu)選的實施方案中，使用絲氨酸蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶。這兩種絲氨酸蛋白酶具有含有天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯(lián)體。在枯草桿菌蛋白酶中，這些氨基酸的相對順序從羧基端開始為天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸，而在胰凝乳蛋白酶中，這些氨基酸的相對順序從羧基端開始為組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸。雖然枯草桿菌蛋白酶通常是從細菌、真菌或酵母來源中獲得的，但是在此處使用時，“枯草桿菌蛋白酶”是指具有上面定義的枯草桿菌蛋白酶催化三聯(lián)體的絲氨酸蛋白酶。另外，人枯草桿菌蛋白酶為具有枯草桿菌蛋白酶催化活性的人源蛋白質(zhì)，例如人源蛋白酶的kexin家族?？莶輻U菌蛋白酶對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是熟知的，例如解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶(BPN’)、遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)枯草桿菌蛋白酶、地衣形芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(見例如，U.S.專利4,760,025(RE 34,606)、U.S.專利5,204,015、U.S.專利5,185,258、EP 0 328 299和WO 89/06279)。
在此處使用時，功能上相似的蛋白質(zhì)被認為是“相關(guān)蛋白質(zhì)”。在一些實施方案中，這些蛋白質(zhì)來自不同的屬和/或種(例如枯草芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶)，包括了生物類型之間的差異(例如細菌枯草桿菌蛋白酶和真菌枯草桿菌蛋白酶)。在另外的實施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)從同一物種中提供。實際上，不是想要將本發(fā)明限定于來自任何來源的相關(guān)蛋白質(zhì)。
在此處使用時，“衍生物”是指源自前體蛋白質(zhì)(例如天然蛋白酶)并通過下列修飾的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)，即在C-末端和N-末端中的一個或兩者上添加一個或多個氨基酸，在氨基酸序列中一個或許多不同的位點替換一個或多個氨基酸，和/或在蛋白質(zhì)末端中的一個或兩者上或者在氨基酸序列中的一個或多個位點上刪除一個或多個氨基酸，和/或在氨基酸序列中的一個或多個位點上插入一個或多個氨基酸。蛋白質(zhì)衍生物的制備優(yōu)選地通過下列步驟來完成，即修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將該DNA序列轉(zhuǎn)化入合適的宿主中，然后表達經(jīng)修飾的DNA序列以形成衍生蛋白酶。
相關(guān)(和衍生)蛋白質(zhì)的一種類型為“變體蛋白質(zhì)”。在優(yōu)選的實施方案中，變體蛋白質(zhì)不同于親本蛋白質(zhì)，它們彼此之間相差少量的氨基酸殘基。差異氨基酸殘基的數(shù)目可以是一個或多個，優(yōu)選為1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多的氨基酸殘基。在一個優(yōu)選的實施方案中，變體之間差異氨基酸的數(shù)目為1-10。在特別優(yōu)選的實施方案中，相關(guān)蛋白質(zhì)和特定變體蛋白質(zhì)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。另外，在此處使用時，相關(guān)蛋白質(zhì)或變體蛋白質(zhì)是指在顯著區(qū)域的數(shù)量上不同于另一個相關(guān)蛋白質(zhì)或親本蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。例如，在一些實施方案中，變體蛋白質(zhì)具有1、2、3、4、5或10個不同于親本蛋白質(zhì)的相應(yīng)的顯著區(qū)域。在一個實施方案中，變體的顯著相應(yīng)區(qū)域只產(chǎn)生背景水平的免疫反應(yīng)。
在此處使用時，“相應(yīng)于”是指在蛋白質(zhì)或肽中的計數(shù)位置上的殘基，或者與另一個蛋白質(zhì)或肽中的計數(shù)位置上的殘基相似、同源或相當?shù)臍埢?br> 在此處使用時，“相應(yīng)區(qū)域”一般是指在相關(guān)蛋白質(zhì)或親本蛋白質(zhì)內(nèi)相似的位置。
在此處使用時，術(shù)語“相似序列”是指與目標蛋白質(zhì)具有類似的功能、三級結(jié)構(gòu)和/或保守殘基的蛋白質(zhì)之內(nèi)的序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，相似序列包括位于或鄰近表位的序列。例如，在含有α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)的表位區(qū)域內(nèi)，在相似序列內(nèi)氨基酸的置換優(yōu)選地保持了同樣的特異性結(jié)構(gòu)。
在此處使用時，“同源蛋白質(zhì)”是指具有與目標蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)類似的催化活性、結(jié)構(gòu)、抗原性和/或免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)。不是想要讓同源物和目標蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)在進化上必需相關(guān)。因此，想要讓該術(shù)語包括從不同物種中獲得的具有同樣功能的蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實施方案中，希望鑒定出具有與目標蛋白質(zhì)類似的三級和/或一級結(jié)構(gòu)的同源物，因為在目標蛋白質(zhì)內(nèi)用來自同源物的相似片段對于表位進行置換將會減少改變所帶來的破壞。因此，在大多數(shù)情況下，同源性高的蛋白質(zhì)提供了最想要的表位替換的來源。另一個原因是，其有利于尋找對于指定蛋白質(zhì)的人相似物。
在此處使用時，“同源基因”是指至少一對來自不同的但通常相關(guān)的物種的基因，它們互相相關(guān)和它們互相是同一的或非常類似的。該術(shù)語包括通過物種形成(即新物種的形成)而分離的基因(例如正向進化同源基因)，以及通過基因復制而分離的基因(例如平行進化同源基因)。
在此處使用時，“正向進化同源物”和“正向進化同源基因”是指在不同物種中通過物種形成而從共同的祖先基因(即同源基因)進化來的基因。通常地，正向進化同源物在進化過程期間保持了同樣的功能。正向進化同源物的鑒定可用于在新近測序的基因組中基因功能的可靠預(yù)測。
在此處使用時，“平行進化同源物”和“平行進化同源基因”是指在基因組內(nèi)通過復制而相關(guān)的基因。雖然正向進化同源物在進化過程中保持了同樣的功能，但是平行進化同源物卻進化出了新功能，即使一些功能常常與原始的基因相關(guān)。平行進化同源基因的例子包括編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，但并不局限于此，它們都是絲氨酸蛋白酶，并在同一物種中一起出現(xiàn)。
序列之間的同源性程度可以用本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來測定(見例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444；Wisconsin遺傳學軟件包中的程序如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics ComputerGroup，Madison，WI)；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12387-395)。
例如，PILEUP是對于測定序列同源性水平有用的程序。PILEUP通過使用漸進的、成對的比對而從一組相關(guān)序列中進行多序列對比。其也可以繪制顯示出用于進行比對的聚類關(guān)系的樹圖。PILEUP使用了Feng和Doolittle的漸進式比對方法的簡化形式(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35351-360)。該方法類似于Higgins和Sharp所描述的方法(Higgins和Sharp，CABIOS，5151-153)。有用的PILEUP參數(shù)包括3.00的默認缺口權(quán)重、0.10的默認缺口長度權(quán)重和加權(quán)的末端缺口。有用的算法的另一個例子為Altschul等人所描述的BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215403-410；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。一個特別有用的BLAST程序為WU-BLAST-2程序(見Aitschul等人，Meth.Enzymol.，266460-480)。參數(shù)“W”、“T”和“X”決定了對比的靈敏度和速度。BLAST程序使用的默認值有11的詞長度(W)、50的BLOSUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)排列(B)、10的期望值(E)、M’5、N’-4和兩條鏈的比較。
在此處使用時，“核酸序列同一性百分數(shù)(％)”定義為在候選序列中與序列的核苷酸殘基一樣的核苷酸殘基的百分數(shù)。
在此處使用時，術(shù)語“雜交”是指一種過程，通過這一過程核酸的一條鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合在一起，這在本領(lǐng)域中是已知的。
在此處使用時，“最大嚴格性”是指通常于大約Tm-5℃(比探針的Tm低5℃)出現(xiàn)的雜交水平；“高嚴格性”是指于比Tm低大約5℃-10℃出現(xiàn)的雜交水平；“中等嚴格性”是指于比Tm低大約10℃-20℃出現(xiàn)的雜交水平；和“低嚴格性”是指于比Tm低大約20℃-25℃出現(xiàn)的雜交水平。正如本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員將會理解的，最大嚴格性的雜交可以用于鑒定或檢測相同的多核苷酸序列，而中等或低嚴格性的雜交可以用于鑒定或檢測多核苷酸序列同源物。
在一些實施方案中，“等效殘基”是通過在前體蛋白質(zhì)(即目標蛋白質(zhì))的三級結(jié)構(gòu)水平上進行測定同源性來定義的，其中前體蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過x射線晶體學進行了測定。等效殘基定義為這樣的殘基，即對于這些殘基，前體蛋白質(zhì)和另一個蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基的兩個或更多個主鏈原子的原子坐標在排列比對之后位于0.13nm之內(nèi)，優(yōu)選地于0.1nm之內(nèi)。在將最好的模型進行定向和定位以便給出蛋白質(zhì)的非氫蛋白質(zhì)原子的原子坐標的最大重疊之后來完成對比。在大多數(shù)實施方案中，最好的模型是這樣的晶體學模型，即其給出對于在最高可用解析度的實驗衍射數(shù)據(jù)的最低R因子。
在一些實施方案中，優(yōu)選地對于編碼前體酶的氨基酸序列的“前體DNA序列”進行修飾，但在可選擇的一些實施方案中，修飾通過操作前體蛋白質(zhì)來進行。在殘基不保守的情況下，將一個或多個氨基酸的置換限制于這樣的替換，即該替換產(chǎn)生一種具有與自然中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列不一致的氨基酸序列的變體。在保守殘基的情況下，這種置換不應(yīng)當產(chǎn)生天然存在的序列。本發(fā)明提供的衍生物進一步包括改變蛋白酶特性的化學修飾。
在一些優(yōu)選的實施方案中，將蛋白質(zhì)基因連接入合適的表達質(zhì)粒之中。然后使用克隆的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，以便表達蛋白質(zhì)基因。在其含有熟知的對于質(zhì)粒復制必需的元件的情況下該質(zhì)?？梢栽谒拗髦袕椭疲蛘呖梢詫①|(zhì)粒設(shè)計為插入宿主染色體之中。提供必需的元件以用于有效的基因表達(例如可操作地連接到目標基因上的啟動子)。在一些實施方案中，這些必需的元件以下列形式進行提供，即基因本身同源的啟動子，如果其可被識別(即由宿主進行轉(zhuǎn)錄)，和轉(zhuǎn)錄終止子(對于真核宿主細胞來說為聚腺苷酸化區(qū)域)，其是外源的或者由蛋白質(zhì)基因的內(nèi)源終止子區(qū)域所提供。在一些實施方案中，也包括選擇基因，例如抗生素抗性基因，其使得經(jīng)質(zhì)粒感染的宿主細胞能夠通過在含有抗微生物劑的培養(yǎng)基中生長而持續(xù)地進行培養(yǎng)。
在涉及蛋白酶的實施方案中，通過檢測蛋白酶與多種商用底物之間的相互作用而測定變體蛋白酶活性，并將其與目標蛋白酶進行比較，商用底物包括酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白和膠原，但并不局限于此。實際上，可以想到的是蛋白酶活性可用任何本領(lǐng)域中已知的合適方法來測定。典型的用于測定蛋白酶活性的檢測方法包括琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺(SAAPFpNA)(引用)檢測法和2，4，6-三硝基苯磺酸鈉鹽(TNBS)檢測法，但并不局限于此。在SAAPFpNA檢測法中，蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的鍵從而給出在405nm吸收的可見黃色。在TNBS顏色反應(yīng)方法中，該檢測法測量酶催化水解底物形成含有游離氨基的多肽。這些氨基與TNBS相互作用而形成黃色復合物。因此，反應(yīng)的顏色越深，所測得的活性越高。黃色可以用多種本領(lǐng)域中已知的分析器或分光光度計進行測定。
變體蛋白酶的其他特性可以用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法來測定。典型的特性包括熱穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性和在多種底物或緩沖溶液或產(chǎn)品配劑中特定蛋白酶的穩(wěn)定性，但并不局限于此。
當聯(lián)合此處公開的酶穩(wěn)定性檢測程序時，可以鑒定出通過隨機誘變獲得的突變體，其顯示出增加或減少的堿或熱穩(wěn)定性，而同時保持酶活性。
堿穩(wěn)定性可以用已知的程序或者用此處描述的方法來測量。當與前體蛋白質(zhì)相比較時，突變體的酶活性的半壽期至少有大約5％或更大的增加或減少(在大多數(shù)實施方案中，其優(yōu)選為增加)可證明堿穩(wěn)定性有實質(zhì)性的改變。
熱穩(wěn)定性可以用已知的程序或者用此處描述的方法來測量。當與前體蛋白質(zhì)相比較而暴露于相對高的溫度和中性pH時，突變體的催化活性的半壽期至少有大約5％或更大的增加或減少(在大多數(shù)實施方案中，其優(yōu)選為增加)可證明熱穩(wěn)定性有實質(zhì)性的改變。
許多本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體在配制多種用于許多應(yīng)用的組合物中使用，從個人護理至工業(yè)生產(chǎn)。例如，許多已知的化合物是在去污劑組合物中有用的合適表面活性劑，這些去污劑組合物含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體。這些去污劑包括非離子、陰離子、陽離子、陰離子或兩性離子去污劑(見例如，US專利No.4,404,128、US專利No.4,261,868和US專利No.5,204,015)。因此，可以預(yù)期到，如此處的描述而進行表征和修飾的蛋白質(zhì)將會在多種去污劑應(yīng)用中使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉不同的可用作清潔組合物的配劑。除了通常的清潔組合物之外，可以容易地理解，本發(fā)明的蛋白質(zhì)變體可在天然或野生型蛋白質(zhì)所用于的任何目的中使用。因此，這些變體例如可以用于塊狀肥皂或液體肥皂應(yīng)用、盤碟護理配劑、表面清潔應(yīng)用、接觸式鏡片清潔溶液和/或產(chǎn)品、肽水解、廢水處理、紡織品應(yīng)用，和在蛋白質(zhì)生產(chǎn)中作為融合-切割酶等等。例如，除了減弱的過敏原性之外，本發(fā)明的變體可以在去污劑組合物中具有增強的性能(與前體比較)。實際上，不是想要將本發(fā)明的變體限制于任何特定的使用。在此處使用時，“去污劑中的增強性能”定義為，當在標準的洗滌循環(huán)之后用通常的評估方法進行測定時，測定到對于某些酶敏感的污點(例如草汁或血液)的清潔性能增加了。
在一些實施方案中，本發(fā)明的方法所提供的蛋白質(zhì)(特別是酶)可以大約0.01％-大約5％(優(yōu)選為0.1％-0.5％)的重量比的水平配制進已知的pH為6.5-12.0的粉末和液體去污劑之中。在一些實施方案中，這些去污清潔組合物進一步含有其他的酶，例如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶或內(nèi)切糖苷酶，以及助洗劑和穩(wěn)定劑。
向常規(guī)的清潔組合物中添加蛋白質(zhì)不會造成任何特定的使用限制。也就是說，任何對于去污劑合適的溫度和pH也適合于本組合物，只要pH位于上述范圍和溫度低于所述蛋白質(zhì)的變性溫度。另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可用于無去污劑的清潔組合物，其單獨或者與助洗劑和穩(wěn)定劑聯(lián)合使用。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于紡織品處理的組合物，其含有本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)。該組合物可以用于處理例如絲綢或羊毛(見例如，RE 216,034、EP 134,267、US 4,533,359和EP 344,259)。在一些實施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域中所熟知的方法，根據(jù)蛋白水解活性來篩選這些變體。
正如上面所表明的，在優(yōu)選的實施方案中，當與它們的前體DNA所編碼的天然蛋白質(zhì)進行比較時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)顯示出經(jīng)修飾的免疫反應(yīng)(例如抗原性和/或免疫原性)。在一些優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)(例如蛋白酶)顯示出減弱的過敏原性。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員容易認識到，本發(fā)明的蛋白酶的使用將會在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的免疫學特性。例如，顯示出減弱的免疫反應(yīng)的蛋白酶可以用于清潔組合物。有效量的一種或多種此處描述的蛋白酶變體可在用于清潔多種需要去除蛋白質(zhì)污點的表面的組合物中使用。這樣的清潔組合物包括用于清潔堅硬表面的去污劑組合物、用于清潔織物的去污劑組合物、洗盤碟組合物、口腔清潔組合物和假牙清潔組合物。
有效量的一種或多種具有減弱的過敏原性/免疫原性(根據(jù)本發(fā)明的方法進行分級)的相關(guān)和/或變體蛋白質(zhì)可用于多種組合物，這些組合物為應(yīng)用于角蛋白材料如甲和頭發(fā)的組合物，包括那些用作頭發(fā)噴霧組合物、頭發(fā)香波和/或調(diào)理組合物的組合物，但并不局限于此，還有應(yīng)用于頭發(fā)生長調(diào)理目的的組合物，和對于治療皮脂溢出、皮炎和/或落頭皮屑的目的而應(yīng)用于頭發(fā)和頭皮的組合物。
在另一些實施方案中，有效量的一種或多種此處描述的蛋白酶變體可用于適合于對皮膚或毛發(fā)進行局部施用的組合物。這些組合物可以霜劑、洗液、凝膠等等形式進行配制，也可以配制為含水的組合物，或者可以配制為在含水連續(xù)相中具有一種或多種油相的乳濁液。
另外，具有減弱的過敏原性/免疫原性的相關(guān)和/或變體蛋白質(zhì)可用于其他應(yīng)用，包括藥物應(yīng)用、藥物遞送應(yīng)用和其他健康護理應(yīng)用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了評估群體的免疫反應(yīng)特性的方法。特別地，本發(fā)明提供了定性地評估人類群體的免疫反應(yīng)的方法，其中對于針對任何目標蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)進行分析。本發(fā)明進一步提供了基于蛋白質(zhì)的相對免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，本發(fā)明提供了方法來創(chuàng)造在多種應(yīng)用中使用的具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了通過分析個體供體對于一組描述了目標蛋白質(zhì)的肽的響應(yīng)率來評估任何蛋白質(zhì)的總免疫原性潛能的方法。這些方法可用于選擇免疫原性最弱的相關(guān)蛋白質(zhì)的異構(gòu)體。另外，這些方法可用于指導具有減弱的免疫原性的變體蛋白質(zhì)的開發(fā)。
在一些優(yōu)選的實施方案中，基于群體的免疫反應(yīng)特性可用于這些開發(fā)具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)的方法中。另外，本發(fā)明提供了確定一個特定的群體是否已經(jīng)接觸了目標蛋白質(zhì)的方法，以及確定在該群體的個體中免疫反應(yīng)的水平。該測定提供了信息以用于開發(fā)具有改變的免疫原性特征的蛋白質(zhì)，這些特征在一些應(yīng)用中是希望的，例如在生物產(chǎn)品、食品和飼料、蛋白質(zhì)治療劑、個人護理、健康護理產(chǎn)品、去污劑和其他消費者相關(guān)的產(chǎn)品中。
本發(fā)明提供了用于研究群體的免疫反應(yīng)的新方法。正如此處所表明的，對于涉及施用于人的蛋白質(zhì)的應(yīng)用的潛能測定目前使用非人的動物模型。另外，基于算法的T-細胞表位的測定沒有提供本發(fā)明的應(yīng)用所提供的所需的信息。實際上，本發(fā)明提供了用于評估個體以及群體的免疫反應(yīng)特性的方法，這提供了用于含蛋白質(zhì)產(chǎn)品的合理設(shè)計和開發(fā)的重要信息。
通過分析蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)和結(jié)構(gòu)值，可以在群體基礎(chǔ)上確定任何目標蛋白質(zhì)的免疫“歷史”。高的背景響應(yīng)表明群體的預(yù)暴露(即超過大約4％的群體顯示出對于測試蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng))。高的結(jié)構(gòu)值對于具有低背景值的蛋白質(zhì)表明潛在的免疫原，和當?shù)鞍踪|(zhì)具有高的背景值時表明新近的、頻繁的和“高質(zhì)量的”免疫反應(yīng)。在一些實施方案中，觀察到“高質(zhì)量的”免疫反應(yīng)，這是由于高水平的免疫原、抗免疫原的強免疫反應(yīng)和/或強佐劑加強的反應(yīng)。
在一些實施方案中，具有高背景的低結(jié)構(gòu)值表示減弱的免疫記憶響應(yīng)、群體中不常見的響應(yīng)、外源抗原引起的耐受性和/或?qū)τ诟叨炔煌牡鞍踪|(zhì)的響應(yīng)(即它們也可以是“減弱”記憶響應(yīng)的產(chǎn)品)。可以想到，在這一類型的響應(yīng)特性中代表了普通的、非過敏原的食物蛋白質(zhì)。另外，具有低結(jié)構(gòu)值和低背景的蛋白質(zhì)表示在群體中無記憶響應(yīng)的非免疫原性蛋白質(zhì)，和/或人類群體對其耐受的蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實施方案中，修飾具有低的暴露背景水平的蛋白質(zhì)，從而將其制成“過敏原性減退的”蛋白質(zhì)(即當將它們暴露于人或其他動物時，它們不引起免疫反應(yīng)或者引起較弱的反應(yīng))。
為了建立一般供體群體未遇到的蛋白質(zhì)的背景值，對于包括蛋白酶、淀粉酶、漆酶和幾丁質(zhì)酶在內(nèi)的11種工業(yè)酶進行I-MUNE檢測(見Mathies，Tenside Surf.Det.，34450-454)。一種蛋白酶用以兩種不同方式產(chǎn)生的肽(PepSet對從Mimotope純化出的肽)進行兩次測試。每個肽組的測試供體的數(shù)目從19-113變化。每個肽組中肽的數(shù)目從80-188變化。當單個肽的刺激系數(shù)(S.I.或SI)為2.95或更高時，將響應(yīng)制成表格。計算出測試供體組中對于每個肽作出響應(yīng)的供體百分數(shù)。計算出對于每個測試蛋白質(zhì)的每個肽的平均響應(yīng)百分數(shù)，將其相對于測試供體的數(shù)量進行作圖表示(圖11)。相關(guān)系數(shù)為R2＝0.86。相關(guān)性的斜率揭示了為3.01％的平均響應(yīng)累積率。因此，對于任何給定的用來自工業(yè)蛋白質(zhì)的肽進行測試的供體，平均100個肽中會有3個肽得出陽性(SI≥2.95)響應(yīng)。這一平均響應(yīng)率包括表位肽(見下)和非表位肽。
背景響應(yīng)也可通過將完整的數(shù)據(jù)組中每個肽的響應(yīng)百分數(shù)求平均值來計算。將12個測試的背景響應(yīng)求平均值，該值為3.15+/-0.45(平均值+/-標準誤差)，其與通過相關(guān)趨勢線的斜率確定的值是一致的。
在本發(fā)明的形成期間，一組蛋白質(zhì)基于它們推測的在一般人類群體中的暴露而選擇出來。這些蛋白質(zhì)包括人乳頭狀瘤病毒(HPV)株系16和株系18E6蛋白、巴西堅果過敏原Bere1和鏈激酶。HPV 16和18是最普遍形式的致瘤性HPV病毒。通過年輕女性的抽樣分析，已經(jīng)估計對于這些病毒的暴露水平為5％或更高(Lazcano-Ponce等人，Intl.J.Cancer 91412-420；Stone等人，J.Infect.Dis.，1861396-1402；Goldsborough等人，Mol.Cell Probes，6451-457；和Lorincz等人，Obstet.Gynecol.，79328-337)。該比率隨著地區(qū)和年齡而變化。巴西堅果過敏反應(yīng)在＜1％的群體中發(fā)生，但是接觸食物中的巴西堅果卻是普遍的(Sicherer和Sampson，Curr.Opin.Pediatr.，12567-573)。另外，人外周血細胞培養(yǎng)物中鏈激酶特異性T-細胞響應(yīng)率隨著年齡而增加，30％的年輕供體有響應(yīng)，多于70％的超過40歲的供體有響應(yīng)(Warmerdam等人，J.Immunol.，168155-161)。將對于這四種蛋白質(zhì)的肽組用來自地方社區(qū)血庫的樣品進行測試。對于所有這四種蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)比在11種工業(yè)酶中發(fā)現(xiàn)的平均響應(yīng)高。當與基于來自圖11中11種工業(yè)酶的數(shù)據(jù)的期望值進行比較時，這顯示為更高的總背景響應(yīng)百分數(shù)和更高的每個肽的響應(yīng)頻率。對于HPV 16 E6和鏈激酶的背景響應(yīng)明顯地更高。這一結(jié)果與在供體庫中推測的對于這些蛋白質(zhì)更高的暴露率是一致的。對于HPV 18 E6和Bere1的背景響應(yīng)比工業(yè)蛋白質(zhì)的平均值更高，但并不是明顯地不同。與工業(yè)蛋白質(zhì)值相比背景值的增加是由于供體群體中CD4+記憶響應(yīng)的作用，其增加了對于給定蛋白質(zhì)的總響應(yīng)的幅度、數(shù)量和復雜性(Kuhns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9712711-12716；Muraro等人，J.Immunol.，1645474-5481；和Vanderlugt和Miller，Nat.Rev.Immunol.，285-95)。因此，更高的背景率代表更高水平的對于測試蛋白質(zhì)的致敏。可是，不是想要將本發(fā)明限制于任何特定的抗這些蛋白質(zhì)的總響應(yīng)的機制。對于此處描述的蛋白質(zhì)，可以推斷出，我們的供體群體具有對于HPV16 E6和鏈激酶的顯著接觸，和具有對于HPV 18 E6和Bere1的較少接觸。對于Bere1和HPV 18 E6的背景響應(yīng)暗示了與這些蛋白質(zhì)有接觸，但還沒有達到HPV 16 E6或鏈激酶的水平。
除了這些蛋白質(zhì)，描述人蛋白質(zhì)的肽組也在本發(fā)明形成期間進行測試。這些蛋白質(zhì)包括干擾素-β(IFN-β)(在免疫反應(yīng)期間廣泛表達的細胞因子)、血小板生成素(TPO)(其表達限制于骨髓的細胞因子)和可溶的重組細胞因子受體分子(腫瘤壞死因子受體-1；TNF-R1)。對于這所有四種蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)類似于工業(yè)酶的背景數(shù)據(jù)，這暗示供體正在對于這些組中的肽作出響應(yīng)，好像它們未接觸過這些蛋白質(zhì)，或者說對于這些蛋白質(zhì)是“天真的” 這些數(shù)據(jù)與對于這些特定蛋白質(zhì)的外周耐受性的未知機制是一致的。
在另外的實施方案中，進行與測試蛋白質(zhì)相關(guān)的T-細胞和/或B-細胞表位的評估。在進一步的實施方案中，這一評估用于在這樣的表位中進行合理的改變，從而減弱測試蛋白質(zhì)的免疫原性/過敏原性(即產(chǎn)生具有減弱的免疫原性的變體蛋白質(zhì))。然后這些變體蛋白質(zhì)可用于多種應(yīng)用，包括生物產(chǎn)品、蛋白質(zhì)治療劑、食品和飼料、個人護理、去污劑和其他消費者相關(guān)的產(chǎn)品，以及在其他治療方法、診斷等等中使用，但并不局限于此。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法使用作為抗原呈遞細胞的樹突細胞、偏移3個氨基酸從而包含完整的蛋白質(zhì)序列的15聚肽和從樹突細胞供體獲得的CD4+T-細胞。如果對于特定的肽結(jié)合氚化胸苷的平均CPM高于或者等于2.95倍的背景CPM，則記錄下該“陽性”反應(yīng)。對于一個大供體組將對于每個肽的結(jié)果制成表格，這樣的大供體組應(yīng)當能夠反映一般的HLA等位基因頻率(具有一些變化)。基于“線性差異”(difference from linearity)的確定而進行統(tǒng)計學計算，并將該結(jié)構(gòu)值用于將這些蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級。正如此處所表明的，用本發(fā)明的方法獲得的分級結(jié)果接近地反映了當這些蛋白質(zhì)在職業(yè)性暴露的工作者中測定(見Sarlo，如上)或者在GPIT或MINT檢測系統(tǒng)中測定(見Robinson，，如上)時，這些作為呼吸性過敏原的蛋白質(zhì)的免疫原性測定結(jié)果(即通過Sarlo的MID檢測法，，如上)和過敏原性。
在本發(fā)明的形成期間，發(fā)現(xiàn)一組包括三種已知免疫原的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值是比較高的，這表明這些蛋白質(zhì)可能能夠在較大數(shù)量的經(jīng)暴露的人群中引起免疫反應(yīng)。相反地，小鼠VH 36-60基因家族成員的結(jié)構(gòu)值是低的，這與其預(yù)測的免疫原性是一致的(見Olsson，J.Theor.Biol.，151111-122)。最后對于β-2微球蛋白所測定的結(jié)構(gòu)值是低的，這正如預(yù)測的一樣，其中該預(yù)測假定該分子受到外周和中央耐受性機制的影響(見Guery等人，J.Immunol.，154545-554)。
正如此處所描述的，在另外的實驗中，測試25種不同的蛋白質(zhì)。這些數(shù)據(jù)提供了用于證實本發(fā)明的框架；不是想要將本發(fā)明限制于這25種蛋白質(zhì)。實際上，本發(fā)明可用于任何合適的目標群體中對任何合適的目標蛋白質(zhì)進行分析。與進行上述的初始實驗一樣，將蛋白質(zhì)在此處描述的I-MUNE檢測系統(tǒng)中進行測試，并測定結(jié)構(gòu)值。對于這25種蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)值和背景響應(yīng)描繪了在測試群體中具有變化的重要性屬性的四個蛋白質(zhì)亞組。此處描述的分級方法在那些具有低背景響應(yīng)的蛋白質(zhì)上得到了證實。此外，將所有的測試蛋白質(zhì)與那些具有高背景響應(yīng)的蛋白質(zhì)進行比較。除了將蛋白質(zhì)的潛在免疫原性進行分級之外，這些實施方案提供了關(guān)于一般群體出現(xiàn)的抗測試蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)類型的信息。
在本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)中進行測試的蛋白質(zhì)的相對免疫原性假定，蛋白質(zhì)將會在體內(nèi)以同樣的劑量、在同樣的配劑中、在一組相匹配的供體中和經(jīng)過同樣的給藥過程而進行比較。該分析也排除了任何蛋白質(zhì)的加工和/或呈遞差異，以及一般的物理和結(jié)構(gòu)特性(即穩(wěn)定性和活性)。
本發(fā)明提供了易化在任何目標蛋白質(zhì)中進行T-細胞表位定位的方法。例如，在一些優(yōu)選的實施方案中，在不存在對于測試蛋白質(zhì)致敏的個體的情況下測定CD4+T-細胞表位。因此，對肽表位進行修飾，從而可獲得預(yù)測在人中有效的減少的響應(yīng)率，而不需要致敏自愿者。在一些實施方案中，分析對于經(jīng)修飾的肽變體的供體響應(yīng)，這一分析用于計算新蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值。例如，如圖9中所示，構(gòu)建成具有減少的結(jié)構(gòu)值的蛋白酶變體在體外引起比親本蛋白質(zhì)顯著更少的增殖。
本發(fā)明在測定蛋白質(zhì)的免疫原性中提供了明顯的優(yōu)點。與本發(fā)明相反，依靠用大量人供體復制品在體外激起更弱的響應(yīng)來測試設(shè)計為具有更弱的免疫原性的蛋白質(zhì)變體的這一測試方法不能合理地在豚鼠或小鼠中進行。轉(zhuǎn)基因小鼠在它們的使用中是有限制的，這是由于這樣的事實，即它們通常不能表達超過一個的HLA等位基因，甚至該基因常常不能以正確的環(huán)境(context)中進行表達。
雖然蛋白質(zhì)的分級并不意味著任何倍數(shù)的效價差異，但是豚鼠和小鼠模型中的效價差異眾所周知是不準確的，其易受實驗室間以及實驗間可變性的影響，而且在小鼠中是品系依賴的。實際上，動物特別是豚鼠中效價的測定最多只是主觀科學。目前，沒有可靠的方法來測定效價?？墒?，本發(fā)明提供了進行效價測定的方法，其是基于將用本發(fā)明方法測定的數(shù)據(jù)與從動物實驗中獲得的數(shù)據(jù)進行對比而推斷數(shù)據(jù)。這些效價值受到與用于使結(jié)構(gòu)值結(jié)果標準化的動物數(shù)據(jù)一樣的內(nèi)在不準確性的影響，盡管有這樣的事實，本發(fā)明的方法提供了經(jīng)大大改進的方法來評估免疫原性(特別是在人中)，和確定如何最好地減少蛋白質(zhì)的免疫原性。
此外，本發(fā)明提供了在人受試者(或者其他動物)中測定蛋白質(zhì)的相對免疫原性的方法，其不需將受試者暴露于目標蛋白質(zhì)。因此，為了進行測定，不會有使得個體對于具有潛在過敏原性/免疫原性的物質(zhì)致敏的風險。重要的是，本發(fā)明提供了方法來對蛋白質(zhì)相互之間的免疫原性進行分級，以及評估群體的免疫反應(yīng)特性。實際上，本發(fā)明提供了方法來選擇和/或開發(fā)具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)，和指導蛋白質(zhì)的合理修飾，以創(chuàng)造和測試免疫原性減退的變體，這些變體適合于在人和任何其他動物中使用，特別是人。
實驗下面的實施例用于舉例說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，而不要將其解釋為限制本發(fā)明的范圍。
在下面的實驗相關(guān)內(nèi)容中，使用下列縮寫eq(當量)；M(摩爾/升)；μM(微摩爾/升)；N(常態(tài))；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；h(小時)；min(分鐘)；sec(秒)；msec(毫秒)；×g(倍重力)；Ci(居里)；OD(光密度)；Dulbecco’s磷酸緩沖溶液(DPBS)；HEPES(N-[2-羥乙基]哌嗪-N-[2-乙基磺酸])；HBS(HEPES緩沖鹽水)；SDS(十二烷基硫酸鈉)；Tris-HCl(三[羥甲基]氨基甲烷-鹽酸)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；EGTA(乙二醇雙(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；SPT+(皮膚針刺測試陽性)；SPT-(皮膚針刺測試陰性)；ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)；Cedar Lane(Cedar Lane實驗室，Ontario，加拿大)；Gibco/Life Technologies(Gibco/Life技術(shù)公司，GrandIsland，NY)；Sigma(Sigma化學制劑公司，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia生物技術(shù)公司，Piscataway，NJ)；Procter & Gamble(Procter和Gamble公司，Cincinnati，OH)；Genencor(Genencor國際公司，Palo Alto，CA)；Endogen(Endogen公司，Woburn，MA)；Cedarlane(Cedarlane公司，Toronto，加拿大)；Dynal(Dynal公司，挪威)；Novo(Novo工業(yè)A/S公司，Copenhagen，丹麥)；Biosynthesis(Biosynthesis公司，Louisville，TX)；TriLux Beta(TriLuxBeta公司，Wallac，芬蘭)；DuPont/NEN(DuPont/NEN研究產(chǎn)品公司，Boston，MA)；TomTec(Hamden，CT)；和Stratagene(Stratagene公司，La Jolla，CA)。
肽所有的肽從商業(yè)來源(Mimotopes，San Diego，CA)獲得。對于此處描述的I-MUNE檢測系統(tǒng)，以多針方式(multipin format)來合成偏移3個氨基酸從而描述了完整的目標蛋白質(zhì)序列的15聚肽(見Maeji等人，J.Immunol.Meth.，13423-33)。將肽以大約1-2mg/ml重新懸浮在DMSO中，并在使用之前貯存于-70℃。每個肽至少分成兩份進行測試，但是對于小的肽組(例如Bere1)，這些肽通常分成三份進行測試。將每個肽的結(jié)果求平均值，并對于每個肽計算出刺激系數(shù)(SI)。
蛋白質(zhì)序列用本發(fā)明的方法測試來自下面經(jīng)良好表征的工業(yè)酶的氨基酸序列，并進行分級排序。這些蛋白質(zhì)的序列可以公開地從數(shù)據(jù)庫中獲得，例如Medline。此處描述得最詳細的蛋白質(zhì)包括遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(Swissprot收錄號P29600)、BPN’Y217L(Swissprot收錄號P00782)、ALCALASE酶(Swissprot收錄號P00780)和α-淀粉酶(Swissprot收錄號P06278)。
人供體血液樣品從兩個商業(yè)來源獲得志愿者供體的人血液棕黃層樣品(Stanford血液中心，Palo Alto，CA和Sacramento醫(yī)學基金會，Sacramento，CA)。通過密度分離而進一步純化棕黃層樣品。將每個樣品用商購得到的基于PCR的試劑盒(Bio-Synthesis)進行HLA分型為HLA-DR和HLA-DQ。確定供體庫中HLA DR和DQ的表達與北美參考標準(Mori等人，Transplant.，641017-1027)沒有顯著的差異?？墒?，供體庫顯示出對于舊金山海灣地區(qū)常見種族劃分所出現(xiàn)的輕微富集的證據(jù)。
樹突細胞和CD4+T-細胞的制備通過粘附到AIM V培養(yǎng)基(Gibco/Life Technologies)中的塑料上而純化出單核細胞。將粘附細胞在含有500單位/ml重組人IL-4(Endogen)和800單位/ml重組人GM-CSF(Endogen)的AIM V培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。在第5天，分別以50單位/ml和0.2單位/ml加入重組人IL-1α(Endogen)和重組人TNF-α(Endogen)。在第7天，完全成熟的樹突細胞于37℃用50μg/ml絲裂霉素C(Sigma)處理1小時。經(jīng)處理的樹突細胞用50mM EDTA移入PBS中，然后在AIM V培養(yǎng)基中進行洗滌，并計數(shù)，再以2×105細胞/ml重新懸浮在AIM V培養(yǎng)基中。
通過使用Collect CD4柱(Cedarlane)從人外周血單核細胞(PBMC)的冷凍等分試樣中進行負選擇而純化出CD4+T-細胞。用錐蟲藍(Sigma)排除法進行判斷，CD4+T-細胞群體一般＞80％為純的，和＞95％為有活力的。將CD4+T-細胞以2×106細胞/ml重新懸浮在AIM V培養(yǎng)基中。
I-MUNE檢測條件將CD4+T-細胞和樹突細胞置于圓底96孔形式的平板中，其數(shù)量為每孔100μl每種細胞混合物。加入肽直至0.25-0.5％DMSO中大約5μg/ml的最終濃度。對照細胞含有0.5％DMSO，而沒有加入肽。每個肽分成兩份進行測試。將培養(yǎng)物于37℃在5％CO2中培養(yǎng)5天。在第5天，向每個孔中加入0.5μCi的氚化胸苷(NEN DuPont)。在第6天，用TomTec手動收獲器(TomTec)在玻璃纖維墊上收獲培養(yǎng)物，然后進行處理以用于閃爍計數(shù)。通過測定每一組兩個一樣的孔(TriLuxBeta)的平均每分鐘計數(shù)(CPM)值而對增殖進行評估。該方法也在U.S.專利No.6,218,165和Stickler等人，J.Immunother.23654-660中進行了描述，這兩個文獻在此處引用作為參考。
數(shù)據(jù)分析對于每個單個棕黃層樣品，分析所有肽的平均CPM值。每個肽的CPM值除以對照(只有DMSO)孔的平均CPM值，以確定“刺激系數(shù)”(SI)。用每個肽組測試供體，直至匯集平均每個肽至少兩個響應(yīng)。將每個蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)繪制成圖，以顯示出在該組內(nèi)對于每個肽的響應(yīng)者百分數(shù)。如果SI值等于或大于2.95，則比較陽性響應(yīng)。當其接近正常群體分布中三個標準偏差的差異時，選擇出該值。對于每個進行評估的蛋白質(zhì)，匯集單個供體對于單個肽的陽性響應(yīng)。為了測定對于給定蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)，將對于該組中每個肽的響應(yīng)者百分數(shù)求平均值，并計算出標準偏差。匯集每個供體對于每個肽組的SI值，并報告出響應(yīng)者百分數(shù)。通過將對于該組中所有肽的響應(yīng)百分數(shù)求平均值而計算出對于每個肽組的平均背景響應(yīng)率。用Poisson統(tǒng)計學計算出對于數(shù)據(jù)組內(nèi)每個肽的響應(yīng)者數(shù)目的統(tǒng)計學顯著性。如此處的描述，使用不同的統(tǒng)計學方法。如果對于肽作出響應(yīng)的供體數(shù)目與數(shù)據(jù)組所定義的Poisson分布具有p＜0.05的差異，則認為對于肽的響應(yīng)是顯著的。
肽結(jié)合分析除了上述的I-MUNE檢測，也進行肽結(jié)合檢測。在本發(fā)明的形成期間使用的肽結(jié)合檢測在本領(lǐng)域中是已知的(Southwood等人，J.Immunol.1603363-3373 )。簡要的說，從一組用EBV轉(zhuǎn)化的細胞系中純化出HLA-DR和HLA-DQ分子。用經(jīng)表征的標準肽和未知的肽進行競爭檢測。然后測定為了競爭50％的標準肽結(jié)合所需的未知肽的數(shù)量(標記為IC50)。
統(tǒng)計學方法*基于Poisson統(tǒng)計學計算出肽響應(yīng)的統(tǒng)計學顯著性?；陧憫?yīng)的總數(shù)量和組中肽的數(shù)量，響應(yīng)者平均頻率用于計算Poisson分布。如果p＜0.05，則認為響應(yīng)是顯著的。另外，進行具有不同變量的two-tailed Student’s t檢驗。對于使用具有低背景響應(yīng)率的數(shù)據(jù)的表位測定，使用基于保守Poisson的公式=1-e(-n(1-Σλxe-λx!)),]]>其中n＝組中肽的數(shù)目，x＝對于目標肽的響應(yīng)頻率，和λ＝數(shù)據(jù)組內(nèi)的響應(yīng)頻率的中值。對于基于具有高背景響應(yīng)率的數(shù)據(jù)的表位測定，使用基于嚴格性更小的Poisson的測定1-(Σi=0xλxe-λx!),]]>其中λ＝數(shù)據(jù)組內(nèi)的響應(yīng)頻率的中值，和x＝對于目標肽的響應(yīng)頻率。
在另外的實施方案中，基于下面的公式計算出結(jié)構(gòu)確定值Σ|f(i)-1p|]]>
其中∑(大寫字母西格馬)為對于每個肽的響應(yīng)頻率減去該肽在組中的頻率的絕對值之和；f(i)定義為對于單個肽的響應(yīng)頻率；和p為肽組中肽的數(shù)量。
該等式得出了0-2的值，其等于“結(jié)構(gòu)值”。0的值表明結(jié)果是完全沒有結(jié)構(gòu)，2.0的值表明所有的結(jié)構(gòu)是圍繞單個的區(qū)域高度結(jié)構(gòu)化的。越接近2.0的值，蛋白質(zhì)就具有越強的免疫原性。因此，低的值表明具有較弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
供體庫中的HLA類型分析HLA-DR和HLA-DQ類型以確定它們與對于指定的表位肽的響應(yīng)之間的聯(lián)系。以一個自由度進行x方分析，以便用于確定顯著性。于等位基因在響應(yīng)者和非響應(yīng)者庫兩者中都存在的情況下，計算出相對風險。
對于大約185個隨機個體測定HLA-DRB1等位基因的表達。用低嚴格性PCR測定法進行HLA分型。按照制造商(Bio-Synthesis)的指導進行PCR反應(yīng)。將匯集的對于Stanford和Sacramento樣品的數(shù)據(jù)與發(fā)表的“高加索人”HLA-DRB1頻率(見Marsh等人，HLA FactsBook，The Academic出版社，San Diego，CA，第398頁，圖1)進行比較。在這些社區(qū)中的供體群體富含HLA-DR4和HLA-DR15?？墒牵@些群體中這些等位基因的頻率很好地位于報道的這兩個等位基因的范圍(對于HLA-DR4為5.2-24.8％，對于HLA-DR15為5.7-25.6％，)之內(nèi)。類似地，對于HLA-DR3、HLA-DR7和HLA-DR11，它們的頻率低于平均的高加索人頻率，但是在報道的這些等位基因的范圍之內(nèi)。還要注意的是，發(fā)現(xiàn)HLA0DR15在大量出現(xiàn)于舊金山海灣地區(qū)的種族群體中具有更高的頻率。
實施例1對于四種已知的呼吸性過敏原所匯集的結(jié)果在該實施例中，描述了用上述本發(fā)明的I-MUNE檢測和分析方法獲得的并用于測試四種已知的呼吸性過敏原的結(jié)果。
A.α-淀粉酶在這些實驗中，用來自α-淀粉酶序列的肽測試82個個體。對于該組中肽的背景響應(yīng)為2.80+/-3.69％，其很好地位于3.16+/-1.57這一在用11種工業(yè)酶的測試中獲得的總平均值(數(shù)據(jù)未顯示)之內(nèi)。α-淀粉酶的34-48、160-174和442-456位氨基酸具有顯著響應(yīng)(見圖2)。所有這三個響應(yīng)相對于背景響應(yīng)是高度顯著的(p＜0.0001)。
B.遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶在這些實驗中，用該蛋白質(zhì)的兩個重復的肽組測試65個個體，并匯集結(jié)果。發(fā)現(xiàn)對于該肽組的背景為3.45+/-2.90％，但是其位于設(shè)定的范圍之內(nèi)。160-174位氨基酸具有顯著響應(yīng)(p＝0.0003)(見圖3)。
C.BPN’Y217L在這些實驗中，用兩個肽組測試113個個體。對于該數(shù)據(jù)組所匯集的平均值為3.62％。70-84和109-123位氨基酸具有顯著響應(yīng)(見圖4)。響應(yīng)區(qū)域也存在于154位氨基酸周圍。
D.ALCALASE酶在這些實驗中，用來自該酶的肽測試92個個體。發(fā)現(xiàn)對于該蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)是低的(2.35％)。同樣的肽組在兩個短暫間隔的分析中進行測試，并匯集數(shù)據(jù)。另外，在對于該蛋白質(zhì)的組中，有明顯更多的肽沒有產(chǎn)生響應(yīng)。19-33位氨基酸具有顯著響應(yīng)(p＜0.0001)(見圖5)。
實施例2結(jié)構(gòu)計算該實施例描述了對于進行測試的四種酶所獲得的結(jié)構(gòu)值。結(jié)構(gòu)值依賴于測試個體的數(shù)量。數(shù)據(jù)組的大部分的零響應(yīng)率導致～1.0的結(jié)構(gòu)值。對于每個肽的同樣響應(yīng)數(shù)量產(chǎn)生0的結(jié)構(gòu)值。因此，重要的是對肽組進行測試直至數(shù)據(jù)組的大部分的響應(yīng)得到累積，以便數(shù)據(jù)能夠準確地反映對于特定的肽和肽區(qū)域的響應(yīng)率。結(jié)構(gòu)值隨著測試供體數(shù)目的增加而減少，直至達到通常為每個肽2-3個響應(yīng)的穩(wěn)定水平(見圖6)。必須將穩(wěn)定結(jié)構(gòu)值用于比較結(jié)構(gòu)值。
對于每一個進行測試的酶，將在數(shù)據(jù)組中匯集的響應(yīng)用于計算結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)值為對于淀粉酶為0.81、對于ALCALASE酶為0.72、對于遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶為0.64和對于BPN’Y217L為0.53，這些顯示在表1中。
表1.四種呼吸性過敏原的結(jié)構(gòu)測定
這些結(jié)果表明，當通過導致2.95或更高的SI的增殖水平來測量CD4+T-細胞的活化時，與用其他肽組測量的活性相比，淀粉酶肽組引起更高的活性。對于BPN’Y217L的結(jié)果表明來自該蛋白質(zhì)序列的肽組具有最低的活性，其具有最低的結(jié)構(gòu)數(shù)量。這四種測試蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值分級順序為淀粉酶＞ALCALASE酶＞遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶＞BPN’Y217L實施例3與動物模型的比較正如上面所指明的，兩種動物模型已經(jīng)用于預(yù)測工業(yè)蛋白質(zhì)的過敏原性和免疫原性。因此，在該實施例中，描述了在這兩種動物模型和本發(fā)明的方法之間所作的比較。豚鼠(GPIT)和BDF1小鼠(MINT)模型這兩者都將蛋白質(zhì)分級為下列順序淀粉酶＞ALCALASE酶＞遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶＞BPN’Y217L。但是相對值不同。圖7顯示了對于GPIT(板塊A)和MINT(板塊B)效價值進行作圖的結(jié)構(gòu)值。通過使用本發(fā)明的方法而獲得的基于人細胞的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明了兩種方法之間的相關(guān)性(R2值分別為0.86和0.84)。
實施例4附加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值在該實施例中，描述了對于附加蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值。例如，對于Bere1(即巴西堅果中發(fā)現(xiàn)的主要過敏原)、人干擾素-β(IFN-β)、人血小板生成素(TPO)、小鼠VH 36-60家族成員和人β-2微球蛋白計算出結(jié)構(gòu)值(見表2)。
表2.選定的附加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值
人IFN-β、TPO和Bere1都已知可在人中引起免疫反應(yīng)(見Scagnolari等人，J.Interferon Cytokine Res.，22207-213；和Sicherer和Sampson，Curr.Opin.Pediatr.，12567-573；和Li等人，Blood 983241-3248)。IFN-β、TPO和Bere1的結(jié)構(gòu)值都是比較高的。小鼠VH區(qū)域的值是比較低的，這暗示了該蛋白質(zhì)比較沒有免疫原性。該結(jié)果與小鼠重鏈家族的潛在免疫原性的結(jié)構(gòu)分析(見Olsson等人，，如上)是一致的。另外，β-2微球蛋白的結(jié)果是低的，這與對于該遍在表達的蛋白質(zhì)引起的耐受性是一致的(Guery等人，，如上)。
實施例5基于群體的免疫反應(yīng)在該實施例中，描述了用于評估基于群體的群體免疫反應(yīng)的實驗。如上面所指明的，從Stanford和Sacramento獲得供體血液，因為該群體具有與一般的美國“高加索人”群體沒有顯著差異的分布。將來自這些供體血液的樣品在上述的I-MUNE檢測系統(tǒng)中進行測試。計算出結(jié)構(gòu)值，并對于在I-MUNE檢測中測試的每一個蛋白質(zhì)進行比較，對于該檢測每個肽有超過兩個的響應(yīng)。進行測試的蛋白質(zhì)為Bere1(巴西堅果過敏原)、scFv(抗體的單鏈V區(qū)域；VH和VL片段)、BLA(β-內(nèi)酰胺酶)、IFN-β(干擾素-β)、FNA(枯草桿菌蛋白酶-BPN’Y217L)、α-淀粉酶、E6(在HPV株系16、18、31和33中的人乳頭狀瘤病毒E6蛋白質(zhì))、E7(在HPV株系16、18、31、33、45和52中的HPV E7蛋白質(zhì))、eglin(水蛭蛋白酶抑制劑；GenBank收錄號CAA25380)、RECK(人蛋白酶抑制劑；實際上是測試在971個氨基酸的RECK蛋白質(zhì)[GenBank收錄號NP_066934])中的一個小結(jié)構(gòu)域)、鏈激酶、TPO(人血小板生成素)、ecotin(來自大腸桿菌(E.coli)K12的絲氨酸蛋白酶抑制劑；GenBank收錄號NP_416713)、ALCALASE酶、灑維奈斯、人β-2微球蛋白、sTNFR1(可溶的腫瘤壞死因子受體1)。這些實驗的結(jié)果顯示在表3中。在該表中，數(shù)據(jù)表示有多少供體對于肽組中的每個肽作出響應(yīng)(即顯示出具有SI＞2.95的增殖響應(yīng))。
表3.結(jié)果
確定暴露的四個區(qū)域和免疫反應(yīng)水平。圖10提供了顯示出對于這些蛋白質(zhì)的相對結(jié)構(gòu)值和背景百分數(shù)的圖。象限“1”反映了群體中未接觸測試蛋白質(zhì)的個體的數(shù)量(用1數(shù)據(jù)點[◆]來代表)，而象限“2”反映了群體中已經(jīng)接觸了測試蛋白質(zhì)的個體的數(shù)量，其中接觸是更新近的、頻繁的和/或在性質(zhì)上更具有免疫原性的，象限“3”反映了群體中對于測試蛋白質(zhì)具有耐受性和/或測試蛋白質(zhì)沒有免疫原性的個體的數(shù)量，和象限“4”反映了群體中已經(jīng)接觸了測試蛋白質(zhì)(但是這一接觸是很久以前發(fā)生的或者是不頻繁地發(fā)生的)和/或測試蛋白質(zhì)在性質(zhì)上具有較弱免疫原性的個體的數(shù)量。
象限“1”中的蛋白質(zhì)為BLA、IFN-β、FNA、淀粉酶、HPV33 E6、HPV45 E7、TPO、ALCALASE酶和GG36；而象限“2”中的蛋白質(zhì)為Bere1、HPV16 E6、HPV18 E6、HPV31 E6、HPV16 E7、HPV31E7、HPV33 E7、HPV45 E7、HPV52 E7和ecotin；象限“3”中的蛋白質(zhì)為HPV18 E7和β-2微球蛋白；和象限“4”中的蛋白質(zhì)為scFv、eglin、RECK、鏈激酶和sTNFR1。因此，清楚的是，本發(fā)明提供了用于評估任何蛋白質(zhì)的基于群體的免疫反應(yīng)的方法。
實施例6形成具有減少的結(jié)構(gòu)值的變體在該實施例中，提供了用于形成具有減少的結(jié)構(gòu)值的變體的方法。如何將結(jié)構(gòu)分析用于計算設(shè)計為減弱了在人中的免疫原性的變體蛋白質(zhì)的總免疫原性，作為這樣的例子，對于變體計算出結(jié)構(gòu)值，該變體中對于BPN’Y217L中的70-84和109-123位氨基酸的顯著響應(yīng)減弱為背景水平的響應(yīng)。用BPN’Y217L的70-84和109-123區(qū)域的肽變體測試48個個體的有限數(shù)據(jù)組。發(fā)現(xiàn)對于變體的響應(yīng)位于背景水平。通過將對于70-84和109-123的響應(yīng)減弱為背景水平而對113個個體的完整數(shù)據(jù)組進行修飾，以用于結(jié)構(gòu)計算。以這種方式計算出結(jié)構(gòu)，以便預(yù)測如果113個個體用親本分子進行測試，那么結(jié)構(gòu)值將會是多少。因為從計算中去除了響應(yīng)，所以將相同數(shù)量的響應(yīng)隨機分散于數(shù)據(jù)組中，以保持同樣的總響應(yīng)率。計算出經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)變體的結(jié)構(gòu)值為0.40(見表4)。
表4.潛在蛋白酶變體的結(jié)構(gòu)計算值
另外，體外數(shù)據(jù)表明具有較低結(jié)構(gòu)值的蛋白酶變體引起較少的增殖。在這些實驗中，來自30個社區(qū)供體的PMBC用完整的蛋白質(zhì)親本酶(BPN’Y217L)或者變體蛋白酶以不同的參數(shù)進行測試。將酶失活，并在5-40μg/ml的范圍內(nèi)進行測試。對于每個蛋白質(zhì)所達到的最大SI值顯示在圖9中。親本蛋白酶具有0.53的結(jié)構(gòu)值，變體具有0.40的結(jié)構(gòu)值。在這30個供體上進行測試的兩個蛋白質(zhì)的最佳SI值之間的差異是顯著的，其具有p＜0.01的two-tailed參量t檢驗值。這些結(jié)構(gòu)表明，將結(jié)構(gòu)值從0.53減少至0.40對于分子的體外抗原性具有很大的影響。
在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，當將變體蛋白質(zhì)與親本蛋白質(zhì)在體外或體內(nèi)進行比較時，優(yōu)選地將這些蛋白質(zhì)以同樣的劑量、在同樣的配劑中、在一組相匹配的供體中和經(jīng)過同樣的給藥曲線進行比較。變體蛋白質(zhì)應(yīng)當保持了親本蛋白質(zhì)的一般物理和結(jié)構(gòu)特性，例如穩(wěn)定性和活性。另外，結(jié)構(gòu)分析排除了親本蛋白質(zhì)與其變體之間的加工差異。
實施例7CD4+T-細胞表位的標明在該實施例中，給出了來自未暴露和暴露的供體的數(shù)據(jù)。除了上面實施例中的數(shù)據(jù)之外還提供了這些數(shù)據(jù)。
未暴露的供體65個供體用一組經(jīng)合成而覆蓋遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶序列的15聚肽進行測試。該65個供體對于每個肽的響應(yīng)百分數(shù)顯示在圖12的板塊A中。相應(yīng)于160-174位氨基酸的#54位置上的顯著響應(yīng)是明顯的。在23和31肽位置(67-81和91-105位氨基酸)上的另一個顯著的區(qū)域也是明顯的。對于組中的肽的響應(yīng)頻率顯示在圖12的板塊B中。清楚的是，在160-174位氨基酸上對于肽的響應(yīng)頻率不同于對于該組中其他肽的響應(yīng)頻率。可是，必須測定在67-81和91-105位氨基酸上的響應(yīng)顯著性。顯著性可通過下面的方法測定建立頻率數(shù)據(jù)的Poisson分布，然后確定這樣的可能性，即含有由組中肽的數(shù)目代表的值數(shù)目的數(shù)據(jù)組將包括該值作為其最高的成員的可能性。對于160-174位氨基酸代表的肽，該可能性為p＝0.0004。對于其他兩個肽，該可能性為p＝0.50。
作為表位選擇標準的試驗，將經(jīng)用皮膚針刺測試證實已經(jīng)接觸了遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的一組7個供體也用此處描述的I-MUNE檢測系統(tǒng)進行測試。顯示了所有7個供體對于每個肽的響應(yīng)數(shù)目(見圖13)。發(fā)現(xiàn)只有一個肽引起超過兩個響應(yīng)。對于163-177位氨基酸肽的三個響應(yīng)者包括兩個HLA-DR2(15)陽性供體。以前注意到了對于該肽的響應(yīng)與HLA-DR2(15)之間的聯(lián)系(Stickler等人，J.Immunother.，23654-660)。有兩個供體對于包括67-81區(qū)域在內(nèi)的6個肽區(qū)域作出了響應(yīng)。來自暴露供體數(shù)據(jù)的其他肽在未暴露供體數(shù)據(jù)中是不顯著的。67-81區(qū)域與相關(guān)蛋白酶中已知的CD4+T-細胞表位具有高度的同源性(14/15個氨基酸的同一性)，這些供體的一半對于該第二蛋白酶也是SPT+的。因此，作為保守的估計，在未暴露的供體群體中發(fā)現(xiàn)一個經(jīng)證實的表位，而且發(fā)現(xiàn)該表位在一組被經(jīng)證實暴露于蛋白質(zhì)的供體所識別的表位中是顯著的。
對于來自解淀粉芽孢桿菌的另一種相關(guān)枯草桿菌蛋白酶也觀察到類似的結(jié)果。描述了高度顯著的兩個顯著表位區(qū)域，也在一組經(jīng)證實SPT+的供體中發(fā)現(xiàn)這兩個表位(數(shù)據(jù)未顯示)。如上所述，在來自經(jīng)暴露的供體的匯集數(shù)據(jù)中見到了更顯著的表位區(qū)域，并且在未暴露的供體組中所限定的表位肽是這些的一個亞組。
記憶響應(yīng)對于來自鏈激酶序列的一組肽施行上述的I-MUNE檢測。選擇鏈激酶用于這些實驗是由于這樣的事實，即一般的群體在一段時間內(nèi)積聚對于該蛋白質(zhì)的特異性響應(yīng)(見Warmerdam等人，J.Immunol.，168155-161)。用該蛋白質(zhì)在本發(fā)明的I-MUNE檢測系統(tǒng)中測試一組72個社區(qū)供體。對于鏈激酶組中的肽的響應(yīng)顯示于圖14的板塊A中。在鏈激酶數(shù)據(jù)組中沒有明顯顯著的響應(yīng)。這一點清楚地顯示在頻率數(shù)據(jù)中(見圖4，板塊B)，其中不像遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的數(shù)據(jù)，沒有單個肽積聚一定比率的響應(yīng)，其中該比率明顯不同于對于其他肽的響應(yīng)的分布。可是，位于位置5(13-27位氨基酸)、20和21(58-75位氨基酸)、29(85-99位氨基酸)和36(106-120位氨基酸)的顯著響應(yīng)率是重要的。數(shù)據(jù)組顯示出每個肽4.48個響應(yīng)的這一平均響應(yīng)值(背景＝6.22％；見表5，下面)。如果將該值用于限定Poisson分布的中值，那么保守性較小的分析表明由所有上面概括的顯著肽所顯示的響應(yīng)頻率是顯著的(p＜0.05)。該分析比用于確定在未暴露供體中發(fā)現(xiàn)的表位的顯著性的分析具有小得多的保守性，因為Poisson分布是由背景值的中值限定的，并且來自該值的差異用于確定顯著性。
表5.推測為對供體進行預(yù)暴露的蛋白質(zhì)的背景值
在該表中，“a”表示“不可應(yīng)用的”；“b”表示基于來自顯示在圖11中的11種工業(yè)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)而對于測試供體的數(shù)目所期望的每個肽的響應(yīng)數(shù)目；“c”表示通過實驗測定的對于測試蛋白質(zhì)來說每個肽的響應(yīng)值；“d”表示對于測試蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)值；“e”表示將11種工業(yè)酶的背景值與測試蛋白質(zhì)的背景響應(yīng)進行比較而應(yīng)用的two-tailed不等變量t檢驗；和“f”表示“未測定”。
將在I-MUNE檢測中鑒定的五個表位肽與發(fā)表的表位進行比較，這些發(fā)表的表位是通過使用來自具有對鏈激酶的抗原特異性響應(yīng)的供體的無性繁殖CD4+T-細胞系而確定的(見圖15)。
用來自10個供體的無性繁殖T-細胞確定的區(qū)域即D1、F2、C3、和D4含有核心序列(大多數(shù)響應(yīng)克隆之間的共有肽序列)，所述核心序列分別相當于I-MUNE檢測鑒定的肽5、20、21和36。I-MUNE檢測在位置29(85-99位氨基酸)上鑒定了一個表位肽，其是用CD4+T-細胞克隆未曾檢測到的。該肽與HLA-DR5(11)的存在相聯(lián)系。只有一個對于CD4+T-細胞克隆研究提供了克隆的供體帶有該等位基因，因此其可能被遺漏了。還有一種可能，該肽可能不是從鏈激酶中加工出來的，因此該結(jié)果在I-MUNE檢測數(shù)據(jù)組中可能是假陽性?？墒?，據(jù)以前報道，在蛋白質(zhì)的羧基端的區(qū)域A5被T-細胞克隆所識別(見Warmerdam等人，如上)。I-MUNE檢測在該區(qū)域的一個亞組中定位了一個表位即肽36，其相當于鄰近的D4區(qū)域?？偟膩碚f，在用所描述的保守性較小的表位標明法所發(fā)現(xiàn)的表位與發(fā)表的表位之間進行對比，其結(jié)果是很好的。另外，所報道的HLA相關(guān)性在兩個數(shù)據(jù)組之間是一致的(見圖15)。
陰性對照作為陰性對照，用來自87個社區(qū)供體的樣品也在I-MUNE檢測中測試人β-2微球蛋白。選擇該蛋白質(zhì)作為陰性對照是因為其作為I型HLA分子的一部分而存在于所有體細胞的表面上。另外，β-2微球蛋白于T-細胞發(fā)育期間在胸腺中表達。中央和外周耐受性機制都應(yīng)當會影響T-細胞庫，從而去除任何與β-2微球蛋白來源的肽有明顯交叉反應(yīng)的CD4+T-細胞(見Guery等人，J.Immunol.，154545-554)。最后，在該分子中有最小的等位基因變化。在數(shù)據(jù)庫搜索中發(fā)現(xiàn)一個等位基因變體(未顯示)。結(jié)果顯示于圖16中。對于β-2微球蛋白的平均背景響應(yīng)為3.90+/-1.82％。對于肽的響應(yīng)百分數(shù)顯示于圖16的板塊A中，響應(yīng)頻率顯示于圖16的板塊B中。基于統(tǒng)計學方法，對于具有低背景響應(yīng)率的未暴露供體群體來說，沒有一個肽響應(yīng)是顯著的。
響應(yīng)率的可重現(xiàn)性通過表位肽的重復測試來確定表位肽響應(yīng)的可重現(xiàn)性。肽至少合成兩次，并在多個分立的供體組上進行測試。對于每個測試所用的供體數(shù)量從27至103個供體變化。比較對于肽的平均響應(yīng)百分數(shù)。結(jié)果顯示在表6中。四種表位肽的平均變異系數(shù)(CV)為20％，中值為21％.CV的范圍為9.3-27％。這些值可以有利地與其他基于人細胞的體外檢測(Keilholz等人，J.Immunother.，2597-138；和Asai等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.，7145-154)進行比較。在表6中，“s.d.”是標準偏差，“s.e.”是標準誤差，“s.d./平均*100”是CV百分數(shù)。顯示了對于四種肽的平均值和中值。
表6.表位肽響應(yīng)的可重現(xiàn)性
用結(jié)合研究確認的表位對于在兩個相關(guān)工業(yè)細菌蛋白酶中定義的肽表位來測定對于II型HLA結(jié)合的IC50(見圖17)。將肽在與18種不同的HLA-DR和-DQ蛋白質(zhì)結(jié)合的競爭檢測中進行測試。發(fā)現(xiàn)遲緩芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中的顯著表位以兩個不同的框架(160-174和157-171)結(jié)合一定范圍的HLA-DR和-DQ分子，這表明有著混雜的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)與HLA-DR2(15)結(jié)合的肽是極好的，其具有127nM的IC50。只有HLA-DR1顯示了較低的IC50值。在由I-MUNE檢測于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’Y217L中所定義的兩個表位之中，發(fā)現(xiàn)第二個表位(109-123位氨基酸)在HLA分析和該實施例所描述的結(jié)合分析中都是混雜的。第一個表位(70-84位氨基酸)也結(jié)合大多數(shù)進行測試的II型HLA分子，但是其以0.69nM的IC50結(jié)合HLA-DR6(13)。這可能解釋了在數(shù)據(jù)庫中所看到的對于該肽的響應(yīng)與供體的聯(lián)系(p＝0.00015；相對風險＝7.22，n＝113個測試供體)。認為那些具有小于500nM的值的結(jié)果為良好的結(jié)合物，并在圖17中以粗體加以強調(diào)。還有，在該圖中，簡并性指明了18個進行測試的全部等位基因中II型HLA蛋白質(zhì)的數(shù)目，它們以低于500nM的IC50進行結(jié)合。
權(quán)利要求
1.用于將第一個蛋白質(zhì)和至少一個附加蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從每個所述附加蛋白質(zhì)中制備至少一個附加的肽組；(b)從單個人血源中獲得含有樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)分化所述樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與所述第一個肽組合并在一起；(e)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與來自所述附加蛋白質(zhì)的所述每個肽組合并在一起；(f)測量所述步驟(d)和(e)中所述T-細胞的增殖，以測定對于所述第一個和附加肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中所述T-細胞對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述附加蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述附加蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)將對于所述第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于所述附加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定所述第一個蛋白質(zhì)和所述附加蛋白質(zhì)的免疫原性分級。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將有最小結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)分級為比有更高結(jié)構(gòu)值的蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少兩種蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。
4.權(quán)利要求1的方法，其中抗所述第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
5.權(quán)利要求1的方法，其中抗所述附加蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
6.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(d)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(e)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將對于每個所述人血源和所述蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值進行比較。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值和背景響應(yīng)百分數(shù)用于分級所述蛋白質(zhì)。
11.用于將兩個蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其中所述第二個蛋白質(zhì)是所述第一個蛋白質(zhì)的一種蛋白質(zhì)變體，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從第二個蛋白質(zhì)中制備第二個肽組；(b)從單個人血源中獲得樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)在所述樹突細胞的溶液中分化所述樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與所述第一個肽組合并在一起；(e)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與所述第二個肽組合并在一起；(f)測量所述步驟(d)和(e)中所述T-細胞的增殖，以測定對于所述第一個和第二個肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中所述T-細胞對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述第二個蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述第二個蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)將對于所述第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于所述第二個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定所述第一個蛋白質(zhì)和所述第二個蛋白質(zhì)的免疫原性分級。
12.權(quán)利要求11的方法，其中將所述第二個蛋白質(zhì)分級為比所述第一個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。
13.權(quán)利要求11的方法，其中將所述第一個蛋白質(zhì)分級為比所述第二個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一個和第二個蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。
15.權(quán)利要求11的方法，其中抗所述第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
16.權(quán)利要求11的方法，其中抗所述第二個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
17.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(d)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
18.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(e)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二個蛋白質(zhì)比所述第一個蛋白質(zhì)少含至少一個顯著區(qū)域。
20.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(e)中所述T-細胞的增殖處于背景水平。
21.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。
22.權(quán)利要求11的方法，其中將對于每個所述人血源和所述蛋白質(zhì)獲得的結(jié)構(gòu)值進行比較。
23.權(quán)利要求22的方法，其中將所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值和背景響應(yīng)百分數(shù)用于分級所述蛋白質(zhì)。
24.用于將第一個蛋白質(zhì)和至少一個變體蛋白質(zhì)的相對免疫原性進行分級的方法，其包括下列步驟(a)從第一個蛋白質(zhì)中制備第一個肽組和從每個所述變體蛋白質(zhì)中制備肽組；(b)從單個人血源中獲得含有樹突細胞的溶液和原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液；(c)分化所述樹突細胞以產(chǎn)生經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與所述第一個肽組合并在一起；(e)將所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞與從所述變體蛋白質(zhì)中制備得到的每個肽組合并在一起；(f)測量所述步驟(d)和(e)中所述T-細胞的增殖，以測定對于所述第一個肽組和來自所述變體蛋白質(zhì)的每個肽組中的每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(f)中所述T-細胞對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述變體蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于所述第一個蛋白質(zhì)和所述變體蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)將對于所述第一個蛋白質(zhì)所獲得的結(jié)構(gòu)值與對于所述變體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值進行比較，以確定所述第一個蛋白質(zhì)和所述變體蛋白質(zhì)的免疫原性分級。
25.權(quán)利要求24的方法，其中將至少一個所述變體蛋白質(zhì)分級為比所述第一個蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。
26.權(quán)利要求24的方法，其中將所述第一個蛋白質(zhì)分級為比至少一個所述變體蛋白質(zhì)具有更弱的免疫原性。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述第一個和所述變體蛋白質(zhì)選自酶、激素、細胞因子、抗體、結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)合蛋白。
28.權(quán)利要求24的方法，其中抗所述第一個蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
29.權(quán)利要求24的方法，其中抗至少一個所述變體蛋白質(zhì)的陽性響應(yīng)具有大約2.7-大約3.2的刺激系數(shù)值。
30.權(quán)利要求24的方法，其中在步驟(d)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
31.權(quán)利要求24的方法，其中在步驟(e)中所述T-細胞的所述增殖導致大約2.95或更高的刺激系數(shù)。
32.權(quán)利要求24的方法，其中至少一個所述變體蛋白質(zhì)比所述第一個蛋白質(zhì)少含至少一個顯著區(qū)域。
33.權(quán)利要求32的方法，其中在步驟(e)中所述T-細胞對于至少一個變體蛋白質(zhì)的增殖處于背景水平。
34.權(quán)利要求22的方法，其中在步驟(b)中使用至少一個附加的人血源。
35.權(quán)利要求22的方法，其中將對于每個所述人血源和所述蛋白質(zhì)而獲得的結(jié)構(gòu)值進行比較。
36.權(quán)利要求35的方法，其中將所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值和背景響應(yīng)百分數(shù)用于分級所述蛋白質(zhì)。
37.用于測定測試群體抗測試蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)的方法，其包括下列步驟(a)從所述測試蛋白質(zhì)中制備肽組；(b)獲得多個含有人樹突細胞的溶液和原初人CD4+和/或CD8+T-細胞的多個溶液，其中所述人樹突細胞的溶液和原初人CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液從所述測試群體中多個個體之中獲得；(c)分化所述樹突細胞以產(chǎn)生多個含有經(jīng)分化的樹突細胞的溶液；(d)將所述多個經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液與所述肽組合并在一起，其中每一個所述經(jīng)分化的樹突細胞的溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-細胞的溶液來自所述測試群體中的一個個體，并將它們合并在一起；(e)測量步驟(d)中所述T-細胞的增殖，以測定對于所述肽組中每個肽的響應(yīng)；(g)匯集在步驟(e)中所述T-細胞對于所述測試蛋白質(zhì)的響應(yīng)；(h)確定步驟(g)中所匯集的對于所述測試蛋白質(zhì)的響應(yīng)的結(jié)構(gòu)值；和(i)確定所述多個個體對于所述測試蛋白質(zhì)的暴露水平。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述測試蛋白質(zhì)包括至少兩種測試蛋白質(zhì)。
39.權(quán)利要求37的方法，其中將所述多個個體對于所述測試蛋白質(zhì)的暴露水平進行比較。
40.權(quán)利要求37的方法，其中將所述蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)值和背景響應(yīng)百分數(shù)用于分級所述蛋白質(zhì)。
41.權(quán)利要求37的方法，其中修飾所述測試蛋白質(zhì)以產(chǎn)生在所述測試群體中顯示出減弱的免疫原性反應(yīng)的變體蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了評估群體的免疫反應(yīng)特性的方法。特別地，本發(fā)明提供了定性地評估人類群體的免疫反應(yīng)的方法，其中對于針對任何目標蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)進行分析。本發(fā)明進一步提供了基于蛋白質(zhì)的相對免疫原性來將蛋白質(zhì)進行分級的方法。另外，本發(fā)明提供了方法來創(chuàng)造在多種應(yīng)用中使用的具有減弱的免疫原性的蛋白質(zhì)。
文檔編號G01N33/50GK1639571SQ03804559
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月26日
發(fā)明者F·A·哈丁 申請人:金克克國際有限公司