專利名稱：抗人精液特異蛋白p30檢測(cè)試劑條及其含有的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，可直接用于法醫(yī)物證對(duì)人精斑的確證，更具體地，本發(fā)明涉及抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，產(chǎn)生該抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條及試劑條的制備方法。
背景技術(shù)：
在公安法醫(yī)工作中，案件物證的盡快檢驗(yàn)和做出鑒定，對(duì)于案件的及時(shí)偵破、抓捕犯罪分子或釋放犯罪嫌疑人具有決定性的作用。膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條出現(xiàn)前，免疫學(xué)檢驗(yàn)同類技術(shù)采用免疫電泳、免疫擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附分析(即ELISA)等方法進(jìn)行，這些方法或?qū)嶒?yàn)步驟相對(duì)較多、操作復(fù)雜、對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)要求程度高，或檢驗(yàn)所用時(shí)間較長(zhǎng)，而且全都必需在室內(nèi)進(jìn)行。因此，建立一新方法對(duì)上述這些問題和缺點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)、加以克服是很有必要的。膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的研制及使用使得案件物證在現(xiàn)場(chǎng)就能檢驗(yàn)并做出鑒定、甚至可由此確定犯罪嫌疑人，快速破案。但是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)人精斑的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，由于其中的抗人精液特異蛋白P30抗體的特異性沒有完全達(dá)到公安或司法的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，時(shí)有出現(xiàn)檢驗(yàn)錯(cuò)誤的情況，將陰道分泌物鑒定成了人精斑，而眾所周知，公安或司法的檢驗(yàn)是不允許出現(xiàn)錯(cuò)檢的，因?yàn)檫@關(guān)系著某個(gè)人的前途或命運(yùn)。因此研制只對(duì)人精液特異蛋白P30起反應(yīng)、完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求的抗人精液特異蛋白P30的單克隆抗體及試劑條非常迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供對(duì)人精液、純化人P30液和人前列腺液起反應(yīng)的抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，及該試劑條的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供抗人精液特異蛋白P30的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供產(chǎn)生上述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明使用的雜交瘤細(xì)胞株A7，H3F3已經(jīng)于2003年7月1日，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)分別為CGMCC 0971，CGMCC 0972。
本發(fā)明提供了兩種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，它們可以用常規(guī)技術(shù)分別從保藏號(hào)為CGMCC 0971，CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株A7，H3F3中產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，該試劑條包含至少一種本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明提供了抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，該試劑條依次包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的本發(fā)明所述的一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)；反應(yīng)區(qū)，其包含檢測(cè)線和質(zhì)控線；吸附區(qū)；本發(fā)明檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)一端與包含包附膠體金的本發(fā)明所述的一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)的一端與反應(yīng)區(qū)的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的另一端與吸附區(qū)的一端有部分重疊。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸附區(qū)固定在單面膠塑料墊板層上。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有單面膠帶層，其中反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層上標(biāo)有檢測(cè)時(shí)液面可達(dá)最大高度的MAX線。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的一端部分與加樣區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆加樣區(qū)的一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面，反應(yīng)區(qū)的另一端部分與吸附區(qū)上粘有的單面膠帶層可以順延回折包覆吸附區(qū)另一端，并粘附固定在單面膠塑料墊板層的背面。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的本發(fā)明所述一種抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是檢測(cè)線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線是另一抗人精液特異蛋白P30的多或單克隆抗體，其與包附膠體金的本發(fā)明所述抗人精液特異蛋白P30的抗體針對(duì)的是相同的抗原，但當(dāng)其為單克隆抗體時(shí)，其抗原結(jié)合位點(diǎn)或稱抗原決定簇不相同，當(dāng)其為多克隆抗體時(shí)，其抗原結(jié)合位點(diǎn)或稱抗原決定簇既有相同又有不相同。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的本發(fā)明所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體起特異反應(yīng)的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙，本發(fā)明所用濾紙是特定厚度的濾紙。
本發(fā)明的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，包括以下步驟1)人精液特異蛋白P30單克隆抗體的制備將保藏號(hào)為CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3按常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)，分別注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；2)分離純化本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進(jìn)行；3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；4)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟2)中制得的一種單克隆抗體加入膠體金溶液中，攪拌使抗體包附在膠體金顆粒表面上；5)試劑條原材料的預(yù)處理對(duì)與檢測(cè)過程直接相關(guān)的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進(jìn)行預(yù)處理；6)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟4)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；7)在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線；8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的步驟5)處理過的空白玻璃纖維區(qū)及步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)的玻璃纖維一端與反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；9)將8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；10)檢測(cè)試劑條的性能，確定其是否合格。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟4)攪拌后，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況，加BSA(牛血清白蛋白)和PEG(聚乙二醇)溶液，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護(hù)液1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.1％BSA，0.01％NaN3，(pH 7.4)重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟5)是用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，現(xiàn)用現(xiàn)泡，以無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，以無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法的一個(gè)特征是其中步驟6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20,000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的本發(fā)明所述CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
本發(fā)明所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
本發(fā)明保藏號(hào)為CGMCC 0971的雜交瘤細(xì)胞株A7和保藏號(hào)為CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及制成的試劑條的靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但是特異性優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，或與最好的國(guó)外產(chǎn)品相同，完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求，有利于迅速，準(zhǔn)確地檢驗(yàn)鑒定案件物證，快速破案，利國(guó)利民。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖2是加拿大IND公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖3是美國(guó)Pan Probe公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖4是美國(guó)Acon公司(杭州加工)抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖5是美國(guó)Medyl公司抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條靈敏度和特異性的測(cè)試結(jié)果。
圖6是對(duì)保存不同年限(分別為1985年、1995年和1998年的人精斑，分別編號(hào)為一、二、三號(hào))的陳舊人精斑進(jìn)行檢驗(yàn)，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液特異蛋白P30膠體金試劑條進(jìn)行測(cè)定的檢驗(yàn)結(jié)果。
圖7是從人血痕、常見十種動(dòng)物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來自案件的人血痕等共32份中隨機(jī)抽取20份，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的產(chǎn)品A檢測(cè)的結(jié)果。
圖8是本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的最佳示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 產(chǎn)生抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7和CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3的制備按張琦、嚴(yán)紅、王香菊《中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志》1990；5(2)72-76頁“分泌抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立和初步應(yīng)用”一文進(jìn)行。經(jīng)檢測(cè)，制備出了只與人精液、純化人P30液和人前列腺液起反應(yīng)的多個(gè)雜交瘤細(xì)胞株，其中包括CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7和CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3。產(chǎn)生抗體均是小鼠IgG1亞類，效價(jià)分別是，H3F3培養(yǎng)上清320倍，腹水1.28×105倍；A7培養(yǎng)上清32倍，腹水1.0×104倍。
實(shí)施例2 抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的制備①腹水單抗制備從液氮中取出A7和H3F3細(xì)胞株，常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)。分別將培養(yǎng)好的適當(dāng)數(shù)量的A7和H3F3培養(yǎng)細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)，7～10天后或觀察可以宰殺時(shí)處死小鼠、分別收集小鼠腹水。
②分離純化的抗人精液特異蛋白P30抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法進(jìn)行，后者具體是小鼠腹水中加入1/10體積的1.0mol/L Tris-HCI，pH 8.0緩沖液，而后再加入飽和硫酸銨溶液或固體硫酸銨至50％飽和度，放置2hr后，離心，沉淀以生理PBS(20mmol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，0.1mol/L NaCI，pH7.4)緩沖液重溶并對(duì)該緩沖液充分透析。以透析緩沖液平衡HiTrapTMProtein GHP柱，透析后蛋白溶液上柱，而后先以平衡柱的緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白，再以0.1mol/L甘氨酸-HCI，pH2.7緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，測(cè)A280值，合并該值在0.1以上的組份，此即為純化的CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7和CGMCC0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，SDS-PAGE(即SDS聚丙烯酰胺凝膠變性電泳)測(cè)純度，對(duì)5mMNaCI溶液透析，濃縮至適宜的濃度，待用。
③膠體金制備稱取Sigma公司產(chǎn)氯金酸(貨號(hào)G-4022)并配成1％濃度，取適量加入超純水中，加熱煮沸，快速加入1％的檸檬酸鈉溶液，煮至溶液變?yōu)樽霞t色。冷卻，以0.2mol/L K2CO3調(diào)pH至8.0～8.2，0.45μm過濾。取適量稀釋1倍，測(cè)A530值為1.915。
④膠體金-本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30抗體結(jié)合物制備按25μg/ml將純化的CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加入到膠體金溶液中，攪拌20～30分鐘，以10％NaCI鑒定其穩(wěn)定情況。加BSA(牛血清白蛋白)和PEG(聚乙二醇)溶液適量，12,000r/min離心50分鐘，沉淀以保護(hù)液(1.0mmol/L四硼酸鈉-HCI，0.1％BSA，0.01％NaN3，pH 7.4)重懸，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> ⑤試劑條原材料處理為保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性，對(duì)與檢測(cè)過程直接相關(guān)的材料要進(jìn)行預(yù)處理。具體是以含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，以無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，以無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并涼干。(注所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌)⑥膠體金-抗人精液特異蛋白P30抗體結(jié)合物的處理和載入玻璃纖維以含0.2％牛IgG、0.5％PVP40(或30)、0.1％PEG20,000、0.5BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4的稀釋液將膠體金-單抗結(jié)合物稀釋8倍，均勻地加到處理過的玻璃纖維上，37℃烘干。
⑦在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線將步驟②純化的CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體(含量在3mg/ml以上)溶液(含0.2～1％蔗糖)1μl點(diǎn)在硝酸纖維素膜(寬約20mm)上，點(diǎn)距硝酸纖維素膜相近的寬度邊約6～8mm；在距該點(diǎn)約4～5mm的地方點(diǎn)1μl的羊抗鼠IgG(含量1mg/ml，也含0.2～1％蔗糖)；涼干后，膜置封閉液(PBS配制的1.0-10％脫脂奶粉)中，37℃溫育1小時(shí)，取出再以洗滌液(20mM磷酸緩沖液，pH7.0)洗兩次，涼干。(注以機(jī)器點(diǎn)樣時(shí)，兩個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)為約1mm寬噴涂而成的線，其中噴CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的線稱為檢測(cè)線，而噴羊抗鼠IgG的線稱為質(zhì)控線。)⑧組裝試劑條在單面膠塑料墊板層(寬約80mm、厚約0.8mm)上，先粘貼⑦處理好的硝酸纖維素膜(注意不要粘貼有樣品的一面)，使其點(diǎn)或噴有CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體即檢測(cè)線的一端距該墊板臨近的寬度邊約30mm，點(diǎn)或噴有羊抗鼠IgG即質(zhì)控線的一端距墊板另一寬度邊也約30mm，形成反應(yīng)區(qū)；將⑥處理好的材料覆蓋點(diǎn)或噴有CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體一端的硝酸纖維素膜約2mm，其余部分粘貼于墊板上；以⑤處理過的玻璃纖維(寬25mm)一端同墊板寬度邊找齊并向上粘貼，其余部分覆蓋已粘貼于墊板的⑥處理好的材料，形成加樣區(qū)；在已粘貼的硝酸纖維素膜的另一端，以Whatman3M或浙江產(chǎn)新華厚濾紙(寬約30mm)覆蓋約2mm，其余部分粘貼于墊板上形成吸附區(qū)；以單面膠膠帶(其上應(yīng)標(biāo)示有指示檢測(cè)時(shí)液面可達(dá)的最大高度的MAX線，該線應(yīng)距墊板臨近寬度邊約15mm)在粘有玻璃纖維的墊板一端覆蓋約33-35mm再回折并粘貼于墊板背面，在粘有濾紙的墊板另一端以單面膠膠帶(通常帶不同顏色)覆蓋約33mm也回折并粘貼于墊板背面，注意膠帶與硝酸纖維素的兩個(gè)相接端一定要粘貼結(jié)實(shí)。由此而制成母版膠體金試劑條，而后按3～4mm寬度順墊板寬度方向裁切，所得即為成品抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條，如圖8所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果成品試劑條的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)1 靈敏度測(cè)定以6人份凍存混合人精液，SIGMA公司產(chǎn)人PSA(ProstateSpecificAntigen前列腺特異抗原)(貨號(hào)P-3338)純化蛋白為抗原，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人精液特異蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)，結(jié)果見圖1到圖5，及表1。
表1 靈敏度及與國(guó)外同類產(chǎn)品比較抗原稀 A B C D E釋倍數(shù) 1030 1030103010301030100 + + + + + + + + + +2000+ + + + + + + + - -5000+ + + + + + + + - -10000 + + + + + + + + - -50000 + + + + + + + + - -100000 + + + + + + + + - -200000 + + + + + + + + - -300000 + + + + + + + + - -抗原定量濃度(ng/ml)500 + + + + + + + + - -100 + + + + + + + + - -50 + + + + + + + + - -10 + + + + + + + + - -4 + + ± ± + + + + - -2 ± ± - - + + + + - -注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的靈敏度相當(dāng)或優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)2 準(zhǔn)確性、特異性測(cè)定以人陰道分泌物斑、混合人血清、唾液和初乳為抗原，用本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、Pan Probe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)，結(jié)果見圖1到圖5，及表2。
表2準(zhǔn)確性、特異性、國(guó)外同類產(chǎn)品比較抗原及A B C D E稀釋倍數(shù) 10301030103010301030陰 20- - - - - - - ± + +道分 100 - -- - - - - - + +泌物 1000 - -- - - - - - ±±人 20- -- - - - + + ±±血 100 - -- - - - + + ±±清 1000 - -- - ± + - - - -人 20- -- - - - - - - -唾 100 - -- - - - - - - -液 1000 - -- - - - - - - -人 20- -- - + + - - - -初 100 - -- - + + - - - -乳 1000 - -- - ± ± - - - -生理鹽水 - -- - - - - - - -注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的準(zhǔn)確性和特異性優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)3 陳舊人精斑檢驗(yàn)對(duì)保存不同年限(分別為1985年、1995年和1998年的人精斑，分別編為一、二、三號(hào))的陳舊人精斑進(jìn)行檢驗(yàn)；用本發(fā)明實(shí)施例2制得的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條(A)，同時(shí)與加拿大IND公司(B)、美國(guó)Acon(在杭州加工制作)(C)、Medyl(D)、PanProbe(E)公司的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)，結(jié)果見圖6，及表3。
表3與國(guó)外同類產(chǎn)品對(duì)陳舊人精斑的檢測(cè)比較不同年 ABC D E代人精斑 530 530 103010301030一++ ++ + + + + + +二++ ++ + + + + + +三++ ++ ± + + + ± +注表中“+”代表陽性；“-”代表陰性；“±”似陰似陽；5、10和30單位為分鐘，表示觀察時(shí)間。
結(jié)論抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條在檢測(cè)陳舊人精斑方面性能相當(dāng)或優(yōu)于國(guó)外同類產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)4隨機(jī)盲測(cè)從人血痕、常見十種動(dòng)物(豬、羊、牛、馬、驢、狗、兔、雞、鴨、鵝)血痕及其混合血痕、空白檢材、人精斑、人唾液斑、人初乳斑、陰道分泌物以及來自案件的人血痕等共32份中隨機(jī)抽取20份，對(duì)本發(fā)明所研制抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。
表4盲測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果編號(hào) 檢材名稱 結(jié)果 編號(hào) 檢材名稱 結(jié)果1 人血斑 - 11 人精斑 +2 唾液斑 - 12 狗血痕 -3 陰道分泌物 - 13 雞血痕 -4 人精斑 + 14 人血斑 -5 兔血痕 - 15 豬血痕 -6 空白檢材 - 16 王輝血樣 -7 人初乳 - 17 人精斑 +8常見十種動(dòng)物混合血斑- 18 羊血痕 -9 死者賈繼兵血樣 - 19 陰道分泌物 -10 人精斑 + 20 牛血痕 -
結(jié)論本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條對(duì)盲測(cè)檢材做出了準(zhǔn)確檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的抗人精液蛋白P30膠體金檢測(cè)試劑條靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但特異性則優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，國(guó)外產(chǎn)品都或多或少存在非特異反應(yīng)；而對(duì)陳舊人精斑的檢驗(yàn)也說明其達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平；對(duì)實(shí)際檢材的盲測(cè)完全正確。證明了其在法醫(yī)學(xué)上的獨(dú)特價(jià)值。
權(quán)利要求
1.具有保藏號(hào)為CGMCC 0971的雜交瘤細(xì)胞株A7。
2.具有保藏號(hào)為CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株H3F3。
3.抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，其可以從具有保藏號(hào)為CGMCC 0971的雜交瘤細(xì)胞株A7產(chǎn)生。
4.抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體，其可以從具有保藏號(hào)為CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株H3F3產(chǎn)生。
5.抗人精液特異蛋白P30的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條，其特征是該試劑條中包含權(quán)利要求4所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑條，其特征在于其包括加樣區(qū)，其包括空白惰性材料區(qū)及包含包附膠體金的權(quán)利要求4所述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體區(qū)；反應(yīng)區(qū)，其包含檢測(cè)線和質(zhì)控線；吸附區(qū)。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑條，其特征是加樣區(qū)包附膠體金的權(quán)利要求4所述抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體加載在玻璃纖維中，加樣區(qū)的空白惰性材料區(qū)是玻璃纖維。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑條，其特征是檢測(cè)線和質(zhì)控線加載在硝酸纖維素膜上。
9.如權(quán)利要求6或8所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線是另一抗人精液特異蛋白P30多或單克隆抗體，其與包附膠體金的權(quán)利要求4所述抗人精液特異蛋白P30抗體針對(duì)的是相同的抗原。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的權(quán)利要求3所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求6或8所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線是與包附膠體金的權(quán)利要求4所述的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體起特異反應(yīng)的物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的檢測(cè)試劑條，其特征是反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
13.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑條，其特征是吸附區(qū)是濾紙。
14.一種制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，包括以下步驟1)人精液特異蛋白P30單克隆抗體的制備將保藏號(hào)為CGMCC 0971雜交瘤細(xì)胞株A7或CGMCC 0972雜交瘤細(xì)胞株H3F3按常規(guī)方法復(fù)蘇并培養(yǎng)，分別注入小鼠腹腔內(nèi)，處死小鼠，收集腹水；2)分離純化步驟1)制備的本發(fā)明抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體以常規(guī)正辛酸加硫酸銨法或者親和層析法等進(jìn)行；3)膠體金的制備將氯金酸(HAuCl4)以還原劑加熱制成膠體金溶液；4)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物制備將步驟2)中制得的一種單克隆抗體加入膠體金溶液中，攪拌使抗體包附在膠體金顆粒表面上；5)試劑條原材料的預(yù)處理對(duì)與檢測(cè)過程直接相關(guān)的材料玻璃纖維和硝酸纖維素膜進(jìn)行預(yù)處理；6)膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物處理及載入玻璃纖維用稀釋液稀釋步驟4)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物，然后用稀釋后的該結(jié)合物飽和浸泡玻璃纖維，然后干燥；7)在處理好的反應(yīng)區(qū)硝酸纖維素膜上噴涂檢測(cè)線和質(zhì)控線；8)組裝試劑條在單面膠塑料板層上粘貼固定有加樣區(qū)的步驟5)處理過的空白玻璃纖維區(qū)及步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和浸泡的玻璃纖維，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜及吸收區(qū)的濾紙；加樣區(qū)的空白玻璃纖維區(qū)一端與步驟6)制得的膠體金—抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體結(jié)合物飽和的玻璃纖維區(qū)一端有部分重疊；加樣區(qū)的玻璃纖維一端與反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端有部分重疊，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端與吸收區(qū)濾紙的一端有部分重疊；其中反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的一端部分與加樣區(qū)的玻璃纖維上粘有單面膠帶層，反應(yīng)區(qū)的硝酸纖維素膜的另一端部分與濾紙上粘有單面膠帶層；9)將8)所制成的母版試劑條裁剪成成品試劑條；10)檢測(cè)試劑條的性能，確定其是否合格。
15.如權(quán)利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是其中步驟5)是用含0.5％吐溫80的50mM Tris-HCI，pH8.0緩沖液浸泡玻璃纖維過夜，現(xiàn)用現(xiàn)泡，無菌超純水漂洗去鹽，無菌高效過濾器下吹干；以含0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽生理鹽水緩沖液，pH7.4，浸泡硝酸纖維素膜1至2小時(shí)，無菌超純水漂洗去鹽，亦現(xiàn)用現(xiàn)泡并吹干，并且所有緩沖液均以0.45μm濾器過濾除菌。
16.如權(quán)利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是其中步驟6)中的稀釋液是0.2～1.0％牛IgG、0.1～0.5％PVP40或30、0.05～0.1％PEG20,000、0.5～2.0％BSA、0.02％NaN3的生理PBS緩沖液，pH7.4。
17.如權(quán)利要求14所述的制備抗人精液特異蛋白P30膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條的方法，其特征是反應(yīng)區(qū)的檢測(cè)線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，反應(yīng)區(qū)的質(zhì)控線噴涂的是含有0.2-1％蔗糖的羊抗鼠IgG抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了保藏號(hào)為CGMCC 0971和CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株A7和H3F3，以及其產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及含有該抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)試劑條及該試劑條的制備方法。本發(fā)明由保藏號(hào)為CGMCC 0971和CGMCC 0972的雜交瘤細(xì)胞株A7和H3F3產(chǎn)生的抗人精液特異蛋白P30單克隆抗體及制成的試劑條的靈敏度與國(guó)外最高水平的同類產(chǎn)品相當(dāng)；但是特異性優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，或與最好的國(guó)外產(chǎn)品相同，完全符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求，有利于迅速，準(zhǔn)確地檢驗(yàn)鑒定案件物證，快速破案，利國(guó)利民。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1490408SQ0315344
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者李兆隆, 王儉, 徐秀蘭, 張英蘭, 張琦, 常彩琴, 嚴(yán)紅, 王香菊, 孫云青, 陳東風(fēng) 申請(qǐng)人:公安部第二研究所