專利名稱：?jiǎn)螒B(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)試技術(shù)，更詳細(xì)地是單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法。
目前常用的自由基研究方法主要有以下幾種1、電子自旋共振(ESR)利用自由基具有順磁性的物理特性，即順磁物質(zhì)在固定微波和一定磁場(chǎng)作用下可吸收微波能量，使未成對(duì)電子產(chǎn)生共振，因此可獲得自由基吸收微波能量程度隨磁場(chǎng)變化的ESR波譜。
2、脈沖射解法即用一個(gè)脈沖式電離輻射源照射待研究的化合物溶液，可產(chǎn)生自由基，因?yàn)樵S多自由基的吸收光譜與原化合物不同，所以可以利用吸收光譜進(jìn)行檢測(cè)。
3、分光光度法利用自由基的反應(yīng)活性，使其和特定的底物反應(yīng)生成具有顏色的復(fù)合物，通過比色可以計(jì)算復(fù)合物產(chǎn)量的多少，從而對(duì)溶液中的自由基進(jìn)行定量。
4、化學(xué)發(fā)光法利用具有高反應(yīng)活性的自由基與特定的化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)的反應(yīng)產(chǎn)物，用光電倍增管或CCD記錄發(fā)光的強(qiáng)度、時(shí)間過程及空間分布，用以間接反映活性自由基產(chǎn)生情況及其隨時(shí)間的變化。
上述方法不同程度的存在如下缺點(diǎn)要用到高檔儀器，一般試驗(yàn)室難以達(dá)到；靈敏度低，難以做到單態(tài)氧和超氧陰離子的低濃度檢測(cè)；操作復(fù)雜，要用到多種儀器及藥品等。
本發(fā)明中所提出的單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法是在濃度為1-100μm/L的化學(xué)發(fā)光探針溶液中加入濃度為1-100μm/L的白蛋白。
最適的反應(yīng)濃度為化學(xué)發(fā)光探針10um/L，白蛋白5um/L。
所述白蛋白可以是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或蛋清蛋白。
所述化學(xué)發(fā)光探針主要采用海螢熒光素類似物，例如FCLA或MCLA，二者是用海螢的熒光物質(zhì)人工合成的海螢熒光物質(zhì)衍生物，購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。
所述化學(xué)發(fā)光探針可與單態(tài)氧或超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。若用超微弱發(fā)光探測(cè)系統(tǒng)單獨(dú)檢測(cè)FCLA的水溶液，只能看到有極微弱的光子產(chǎn)生；但若向其中加入白蛋白，則可觀察到有強(qiáng)烈的發(fā)光，發(fā)光的峰值位于525nm，當(dāng)通過通氮?dú)獾姆椒ǔM體系中的氧后，發(fā)光也隨之消失。因此，加入的蛋白催化了FCLA與單態(tài)氧或超氧陰離子之間的反應(yīng)，降低了FCLA檢測(cè)單態(tài)氧和超氧的閾值，使其靈敏度大大增加，因此能夠檢測(cè)到FCLA水溶液中由于氧氣自氧化和環(huán)境中弱的電離輻射所產(chǎn)生的單態(tài)氧分子和超氧陰離子。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明對(duì)單態(tài)氧和超氧陰離子檢測(cè)靈敏度高，可檢測(cè)的到自然狀態(tài)下由于分子氧自氧化和弱的電離輻射所產(chǎn)生的微量的單態(tài)氧分子和超氧陰離子，比常規(guī)方法的靈敏度要高出約20倍。
2、本發(fā)明中所使用的白蛋白是一種生物體內(nèi)普遍存在的化學(xué)組分，所以在活體使用時(shí)，不會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒害作用，具有安全、無損傷的特點(diǎn)。
3、本發(fā)明所采用的測(cè)量裝置簡(jiǎn)單，投資少，容易實(shí)現(xiàn)，操作簡(jiǎn)便。


圖1是用生物超微弱發(fā)光探測(cè)系統(tǒng)測(cè)量得到的FCLA溶液和FCLA-HSA體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的示意圖。
圖2是FCLA-HSA體系化學(xué)發(fā)光光譜的測(cè)量結(jié)果。
圖3是在不同生物組織溶液中，F(xiàn)CLA化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的比較圖。
圖4是利用通氮?dú)獾姆椒ǔCLA-HSA體系中的溶解氧后，該體系化學(xué)發(fā)光的衰減圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
濃度為10um的FCLA溶液100ul，濃度為5um的HSA溶液100ul，三蒸水100ul，混和放在測(cè)量皿中，用溶解氧分析儀測(cè)量其氧濃度為5.4mg/L，再用生物超微弱發(fā)光探測(cè)系統(tǒng)測(cè)量該體系的化學(xué)發(fā)光，得到圖1中曲線B的測(cè)量結(jié)果。通過通氮?dú)鈦沓CLA-HSA體系中的溶解氧，分別通氮?dú)?5sec，30sec，1min，2min，4min和6min后，體系中剩余的氧濃度分別為2.9mg/L，2.2mg/L，1.6mg/L，0.8mg/L，0.4mg/L，0.1mg/L。隨著體系中氧濃度的降低，發(fā)光強(qiáng)度也隨之下降，發(fā)光衰減趨勢(shì)見圖4。
如圖所示，圖1是用生物超微弱發(fā)光探測(cè)系統(tǒng)測(cè)量得到的FCLA溶液(A)和FCLA-HSA體系(B)化學(xué)發(fā)光的結(jié)果圖。由圖可看出，混和體系的化學(xué)發(fā)光與單純的FCLA溶液相比，強(qiáng)度要增加幾十倍，充分體現(xiàn)了本發(fā)明方法檢測(cè)單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏性。
圖2是用RF-540型熒光儀所測(cè)量的FCLA-HSA體系的化學(xué)發(fā)光光譜。測(cè)量時(shí)，關(guān)閉激發(fā)光源，接收一側(cè)的狹縫寬度為30nm。測(cè)量得到的光譜其峰值在525nm。
圖3是在不同白蛋白溶液中，F(xiàn)CLA化學(xué)發(fā)光的比較圖。其中，bk為FCLA溶液的發(fā)光計(jì)數(shù)，作為背景；A為FCLA溶液中加入牛血清白蛋白后的發(fā)光計(jì)數(shù)，B為FCLA溶液中加入牛血清后的發(fā)光計(jì)數(shù)，C為FCLA溶液中加入人血清后的發(fā)光計(jì)數(shù)，D為FCLA溶液中加入人血清白蛋白后的發(fā)光計(jì)數(shù)。從圖中可以看出，HSA可以最佳的催化FCLA與單態(tài)氧或超氧陰離子之間的反應(yīng)。
圖4是利用通氮?dú)獾姆椒ǔCLA-HSA體系中的溶解氧后，該體系化學(xué)發(fā)光的衰減圖。實(shí)驗(yàn)中，共測(cè)量了20個(gè)點(diǎn)，并對(duì)所得到的結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式擬和。從圖中可以看出，隨著體系中溶解氧濃度的降低，單態(tài)氧的含量也相應(yīng)減少，整個(gè)體系的發(fā)光強(qiáng)度也隨之衰減；當(dāng)體系中的氧濃度接近于零，即切斷了單態(tài)氧或超氧陰離子的轉(zhuǎn)化來源時(shí)，體系的發(fā)光也隨之消失。
權(quán)利要求
1.一種單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，其特征在于是在濃度為1-100um/L的化學(xué)發(fā)光探針溶液中加入濃度為1-100um/L的白蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，其特征在于反應(yīng)濃度為化學(xué)發(fā)光探針10um/L，白蛋白5um/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，其特征在于所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、或蛋清蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光探針是海螢熒光素類似物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光探針是FCLA或MCLA。
全文摘要
本發(fā)明涉及測(cè)試技術(shù)，更詳細(xì)地是單態(tài)氧和超氧陰離子的高靈敏度檢測(cè)方法，是在濃度為1－100um/L的化學(xué)發(fā)光探針溶液中加入濃度為1－100um/L的白蛋白，該方法具有所需樣品少，操作簡(jiǎn)便，不需用到貴重儀器及藥品，靈敏度高，可以做到低濃度檢測(cè)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK1448708SQ0311365
公開日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月23日
發(fā)明者邢達(dá), 郝敏 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)