專利名稱：香菇多糖分子量及分子量分布測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子量及分子量分布測定方法，具體地說是一種香菇多糖分子量及分子量分布測定方法。
本發(fā)明的原理系根據(jù)Mark-Houwink經(jīng)驗公式[η＝KMα]來進(jìn)行的，式中η為特性粘數(shù)，M為分子量，K、α為系數(shù)。
一、本發(fā)明產(chǎn)品香菇多糖的分子量、分子式、化學(xué)結(jié)構(gòu)式1、分子量測定經(jīng)高效凝膠滲透色譜，采用普適校正曲線方法測定分子量大多在40～80萬之間。
2、碳核磁共振譜(見表1)表1

3、紅外光譜圖(見

圖1)4、分子式經(jīng)微量元素分析結(jié)果表明，分子式為(C6H10O5)n5、化學(xué)結(jié)構(gòu)式經(jīng)高碘酸氧化及Smith降解等化學(xué)反應(yīng)結(jié)合光譜分析法，香菇多糖的一級結(jié)構(gòu)式如下 本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到一種香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用高效凝膠滲透色譜法—HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5M硝酸鈉，0.1～0.5M醋酸鈉和磷酸鹽緩沖溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用一～四根，分離范圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1ml/min～1.0ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是Dextran或者Pullulan；繪制HPGPC普適校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為香菇多糖的分級分離產(chǎn)品。
本發(fā)明的目的還可以通過以下措施來達(dá)到采用普適校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定香菇多糖的分子量及其分布；采用堿液溶解香菇多糖；所用堿液可以是氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉；所用堿液的濃度可以是0.1～1MNaOH，0.1～1MKOH，0.5～1MNa2CO3，0.1～1MNaHCO3；HPGPC的流動相選用0.1mol/L的醋酸鈉和磷酸鹽緩沖液為好；所述的醋酸鈉和磷酸鹽的PH可以是6.0～8.0；HPGPC的分析柱優(yōu)化的組合方式為三根不銹柱串聯(lián)，分離范圍為2,000,000～1000道爾頓；HPGPC分析柱的優(yōu)選柱溫以30℃為佳；HPGPC的流速保持0.4ml/min為佳；香菇多糖分級分離產(chǎn)品的重均分子量道爾頓分別為1、62.4×104，2、53.4×104，3、18.4×104，4、10.6×104，5、7.72×104；測得香菇多糖K值為0.0535～0.0543，α值為0.6～0.8；優(yōu)化的香菇多糖K值為0.0539，α值為0.607。
本發(fā)明采用普適校正曲線對香菇多糖分子量進(jìn)行校正所獲得的分子量及分子量分布與用光散射法所測結(jié)果相似，誤差較小，精確度提高。
本發(fā)明進(jìn)一步地采用香菇多糖分級分離產(chǎn)品測定其特性粘數(shù)，并用光散射法測定其分級分離品的分子量，建立普適校正曲線，建立以Dextran或Pullulan為標(biāo)準(zhǔn)的通用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定香菇多糖分子量及其分布的方法。
本發(fā)明是建立在二十五批香菇多糖(商品名天地欣，下同)分子量及分子量分布(簡稱分布，下同)實驗研究所得數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上的。參見表2K、α值的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表。
香菇多糖K、α值的測定為了測定香菇多糖K、α值，選取五個不同分子量的香菇多糖分級分離樣品，用光散射法測定分子量62.4×104、53.4×104、18.4×104、10.6×104、7.72×104。依據(jù)中國藥典(2000年版)附錄的規(guī)定，在0.1mol/L醋酸鈉和磷酸鹽緩沖液(PH7.8～8.0)、30℃條件下測定特性黏數(shù)，應(yīng)用η＝KMα公式計算K、α值，共測定了25組K、α值(每次新配磷酸鹽緩沖液并測定PH值，詳細(xì)數(shù)值見下表)，分別計算K、α的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，用Grubbs檢驗法判斷數(shù)值的取舍。
表2 K、α值的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

本發(fā)明還采用激光光散射法直接測定6個批號香菇多糖重均分子量進(jìn)行復(fù)核。結(jié)果表明兩種方法所測的數(shù)據(jù)近似，誤差較小。實施例1 儀器高效凝膠滲透色譜儀為美國Waters公司工作站系統(tǒng)，510泵，410示差折光檢測器，Millennium2010系統(tǒng)軟件和GPC專用軟件。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。(1)色譜柱 選用凝膠色譜柱時可選用分離范圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱，可采用三根不銹鋼柱串聯(lián)。例如Ultrahydrogel1000，500和250。(2)流動相 先后以超純水(電阻為18.2M)，0.1mol/L的醋酸鈉和磷酸鹽緩沖溶液(PH＝7.8，按照2000年版中國藥典附錄配制)為流動相，根據(jù)樣品的溶解度、折光率、出峰時間和峰形等因素，優(yōu)化選用磷酸鹽緩沖溶液PH＝7.8為佳。(3)柱溫 先后比較了30℃、35℃、45℃、55℃時的HPGPC圖譜，其中以35℃、30℃較好，尤以30℃的圖譜更佳。(4)流速 比較了0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min時的HPGPC圖譜均可，但以0.4ml/min為優(yōu)。(5)進(jìn)樣量 比較了100μl、200μl、300μl的HPGPC的圖譜較好，但以200μl為優(yōu)。(6)相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 選用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Dextran系列五個，其分子量為17.5×105、74.95×104、41.00×104、27.3×104、4.86×104；或Pullulan系列74.9×104、38×104、21.2×104、10×104、4.8×104、2.37×104亦可。上述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Dextran其在30口的特性粘數(shù)分別為74.8、57.1、48.6、35.5、23.0。根據(jù)公式η＝KMα，計算標(biāo)樣Dextran的K、α值。根據(jù)Dextran的K、α值繪制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線。(7)普適校正曲線的繪制 用5個已知分子量和特性粘數(shù)的Dextran標(biāo)樣，配成1mg/ml濃度的溶液，注入高效液相儀，按公式lgη＝lgK+αlgM，計算出K和α值。輸入計算機，由GPC軟件繪制lg[η]M-V0(淋出體積)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將香菇多糖的K值、α值輸入計算機，得到普適校正曲線，香菇多糖的K值及α值由下述(8)敘述。(8)香菇多糖分級分離產(chǎn)品及其分子量的測定 1)香菇多糖分級產(chǎn)品的分離、純化參見Nature1965 222 687-8頁。所得純化的分級產(chǎn)品用光散射法(由國家技術(shù)監(jiān)督局標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心測定)測得五個產(chǎn)品的分子量分別為62.4×104、53.4×104、18.4×104、10.6×104、7.72×104。上述分級分離產(chǎn)品分別按中國藥典2000年版二部附錄38頁VI G第三法測定其特征粘數(shù)。2)香菇多糖K、α值的測定。根據(jù)公式η＝KMα，測得香菇多糖在上述流動相體系下的K值為0.0539，α值為0.607。香菇多糖K、α值根據(jù)25組實驗測定的數(shù)據(jù)確定的。參見表2。
(9)香菇多糖HPGPC法測定分子量及其分布 香菇多糖供試品5mg加0.5mol/L的氫氧化鈉溶液0.5ml溶脹，再用0.5mol/L的鹽酸調(diào)PH至7.0～8.0，用水定容至5ml搖勻，用0.45μ濾膜過濾即得。吸取上述香菇多糖供試品溶液200μl，注入凝膠色譜儀，流速0.4ml/min，記錄色譜圖。即得普適校正曲線校正后的香菇多糖分子量及其分布圖譜。見表3、4。
表3 香菇多糖(天地欣)一批分子量累積重量分布曲線分片統(tǒng)計表Slice Table showing40 of 3877 slices


(10)普適校正曲線的可靠性和準(zhǔn)確性評價 見表4。
表4 HPGPC法與激光光散射法測定香菇多糖分子量結(jié)果比較表

(11)HPGPC檢測系統(tǒng)重現(xiàn)性考察為考察HPGPC系統(tǒng)的重現(xiàn)性，將一批注射用香菇多糖(天地欣)重復(fù)進(jìn)樣5次，其結(jié)果見圖2和表5。
表5 某批注射用香菇多糖重復(fù)5次的HPGPC圖譜參數(shù)比較

(12)數(shù)據(jù)處理采用Waters公司提供的Millennium2010系統(tǒng)軟件和GPC專用軟件，以上軟件均獲美國FDA認(rèn)可。
權(quán)利要求
1.一種香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用高效凝膠滲透色譜法—HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5M硝酸鈉，0.1～0.5M醋酸鈉和磷酸鹽緩沖溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用一～四根，分離范圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1ml/min～1.0ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是Dextran或者Pullulan；繪制HPGPC普適校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為香菇多糖的分級分離產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用普適校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定香菇多糖的分子量及其分布。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用堿液溶解香菇多糖。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于所用堿液可以是氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鈉，碳酸氫鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于所用堿液的濃度可以是0.1～1MNaOH，0.1～1MKOH，0.5～1MNa2CO3，0.1～1MNaHCO3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于HPGPC的流動相選用0.1mol/L的醋酸鈉和磷酸鹽緩沖液為好。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于所述的醋酸鈉和磷酸鹽的PH可以是6.0～8.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于HPGPC的分析柱優(yōu)化的組合方式為三根不銹銅柱串聯(lián)，分離范圍為2,000,000～1000道爾頓。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于HPGPC分析柱的優(yōu)選柱溫以30℃為佳。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于HPGPC的流速保持0.4ml/min為佳。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于香菇多糖分級分離產(chǎn)品的重均分子量道爾頓分別為1、62.4×104，2、53.4×104，3、18.4×104，4、10.6×104，5、7.72×104。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用香菇多糖分級分離產(chǎn)品測得香菇多糖K值為0.0535～0.0543，α值為0.6～0.8。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于優(yōu)化的香菇多糖K值為0.0539，α值為0.607。
全文摘要
本發(fā)明是建立一種普適校正法測定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布的方法。該方法，其特征在于采用高效凝膠滲透色譜法－HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5M硝酸鈉，0.1～0.5M醋酸鈉和磷酸鹽緩沖溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用1～4根，分離范圍為2,000,000～1000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1ml/min～1.0ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是Dextran或者Pullulan；繪制HPGPC普適校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為香菇多糖的分級分離產(chǎn)品。
文檔編號G01N21/31GK1437019SQ03112908
公開日2003年8月20日 申請日期2003年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者程光, 程培元, 張偉東, 方貽功 申請人:南京振中生物工程有限公司