專利名稱：免疫測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用磁性顆粒免疫學(xué)測量(免疫測定)流體(例如生物樣品)中抗原性物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
近年來在醫(yī)院、測試中心等地，由于人力短缺、成本削減目的、處理大量樣品的需要等，一直嘗試各種測試(包括臨床檢驗(yàn))的自動(dòng)化和/或節(jié)約大量的測試時(shí)間。對于適合自動(dòng)化的技術(shù)，其中利用不溶性磁性載體顆粒對抗原性物質(zhì)進(jìn)行定性或定量測定的方法引人注目。利用這種不溶性磁性載體顆粒的目的之一在于，在測定中利用磁場作用容易實(shí)現(xiàn)無法避免的B/F分離。
此外，在利用這種不溶性磁性載體顆粒的免疫化學(xué)領(lǐng)域，一直使用結(jié)合抗原或抗體的不溶性磁性顆粒(致敏的不溶性磁性顆粒)，其中該磁性載體攜帶與待測目標(biāo)分析物相同的抗原或抗體。就測定流體(檢驗(yàn)樣品)、例如生物樣品中的抗原性物質(zhì)而言，本領(lǐng)域公知(例如JP，A，06-160387(1994)和JP，A，07-72,155(1995)所述)其包含以下兩個(gè)步驟，所述的檢驗(yàn)樣品與預(yù)先吸附和攜帶能夠特異性結(jié)合所述抗原性物質(zhì)或其片段的不溶性磁性顆?；旌?，然后測定所述抗原性物質(zhì)與不溶性磁性顆粒結(jié)合的程度，從而檢出或定量所述的抗原性物質(zhì)。
然而，如果將抗體等預(yù)先吸附于不溶性磁性顆粒并用于測定，則致敏的不溶性磁性顆粒的穩(wěn)定性問題不可避免。因此，無論如何努力，仍然存在包括試劑的使用期限(best-before-period)、制備困難等難題。此外，如果長期保存還有另一難題，致敏的不溶性磁性顆粒在其懸浮液中容易沉淀。
為了節(jié)約人力或短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品，引入完全自動(dòng)化臨床檢驗(yàn)的測試儀器等，測試中的B/F分離通常需要進(jìn)行洗滌處理。為使測定有效和快速，減少幾個(gè)步驟或者以簡單方式進(jìn)行測定是無法回避的問題。為此目的，近來嘗試開發(fā)利用不溶性磁性顆粒為載體的免疫測定系統(tǒng)，但在洗滌步驟中難免損失所用的不溶性磁性顆粒。這也引起該載體攜帶的寶貴抗體等的消耗。因而，使用磁性顆粒的自動(dòng)化臨床檢驗(yàn)儀器的缺點(diǎn)在于，由于使用相對大量的磁性顆粒而比通常的免疫測定需要更多的抗體等。還有因多次洗滌而損失顆粒的問題。
發(fā)明概述本發(fā)明人通過深入研究成功發(fā)現(xiàn)，對于測定檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)，不使用攜帶可與所述抗原性物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的任何不溶性磁性載體顆粒，而是提供了其上基本不結(jié)合所述抗體等的不溶性磁性載體顆粒，所述抗原性物質(zhì)(待測定的目標(biāo)分析物)自身可以吸附于所述的不含抗體的不溶性磁性載體顆粒，然后與特異性針對所得吸附于所述顆粒的抗原性物質(zhì)的標(biāo)記抗體反應(yīng)，從而能夠以合適的自動(dòng)化方式有效測定檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)。本發(fā)明人因而成功完成了本發(fā)明。
更具體而言，本發(fā)明的免疫測定包含以下步驟提供基本上不含任何抗體等的不溶性磁性載體顆粒，然后將檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合所述的不溶性磁性載體顆粒，以及將得到的混合物與可特異性和所述吸附的抗原性物質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記抗體反應(yīng)，本免疫測定法因而能夠選擇性測定不溶性磁性載體顆粒上攜帶的抗原性物質(zhì)。
為了確保易于定量，本發(fā)明優(yōu)選根據(jù)特定測定項(xiàng)目，選擇包括生物材料濃度以及不溶性載體顆粒懸浮液的緩沖液濃度在內(nèi)的條件，以便生物材料中的抗原性物質(zhì)可與其存在量成比例地吸附于不溶性載體顆粒。
本發(fā)明提供(1)使用不溶性載體顆粒的免疫測定，其包含
(i)使用基本上不含任何吸附的抗原和/或抗體的不溶性磁性載體顆粒，(ii)將檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合所述的不溶性磁性載體顆粒，(iii)將從上述處理(ii)得到的不溶性磁性載體顆粒與特異性和某些所述的抗原性物質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記抗體反應(yīng)，所述抗體特異性與固相形式的抗原性物質(zhì)反應(yīng)，但基本上不與天然形式的抗原性物質(zhì)反應(yīng)，其中所述固相形式的抗原性物質(zhì)附著于所述的不溶性載體顆粒，所述的天然形式的抗原性物質(zhì)則仍然存在于液相中，以及(iv)測定通過所述的固相抗原性物質(zhì)捕獲得到的標(biāo)記抗體上的標(biāo)記作為指標(biāo)。
(2)根據(jù)上述(1)的免疫測定，其中所述的免疫測定包含(A)將所述檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合所述的不溶性磁性載體顆粒，以及(B)然后無需洗滌去除所述的檢驗(yàn)樣品，將捕獲的抗原性物質(zhì)與所述固相抗原性物質(zhì)的特異反應(yīng)性抗體進(jìn)行反應(yīng)；(3)根據(jù)上述(1)或(2)的免疫測定，其中所述的免疫測定包含(a)將所述的標(biāo)記抗體與吸附或結(jié)合檢驗(yàn)樣品中抗原性物質(zhì)的不溶性磁性載體顆粒反應(yīng)，(b)然后在磁場作用下，將未反應(yīng)的標(biāo)記抗體與不溶性磁性載體顆粒分離，以及(c)測定通過固相抗原性物質(zhì)捕獲得到的標(biāo)記抗體上的標(biāo)記作為指標(biāo)。
(4)根據(jù)上述(1)-(3)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的抗體是單克隆抗體；(5)根據(jù)上述(1)-(3)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的抗體是多克隆抗體；(6)權(quán)利上述(1)-(5)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自基本上不溶于水性液體介質(zhì)、并由有機(jī)聚合物材料相和磁性材料相組成的微粒；(7)根據(jù)上述(1)-(6)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述不溶性磁性載體顆粒選自不僅包含由一種或多種有機(jī)聚合物材料組成的表層相、而且包含由一種或多種磁性材料組成的核心相的微粒；(8)根據(jù)上述(1)-(7)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自其(a)平均顆粒大小0.01-20微米以及(b)核心由一種或多種磁性材料組成的膠乳顆粒；(9)根據(jù)上述(1)-(7)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自平均顆粒大小為0.1-6微米以及核心由一種或多種磁性材料組成的膠乳顆粒；(10)根據(jù)上述(1)-(9)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的免疫測定可利用適合磁性顆粒的自動(dòng)化臨床檢驗(yàn)儀器或臨床化學(xué)自動(dòng)分析儀，從分發(fā)檢驗(yàn)樣品到獲得測試結(jié)果以自動(dòng)化形式進(jìn)行；以及(11)根據(jù)上述(1)-(10)中任一項(xiàng)的免疫測定，其中檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)是HbAlc。
本領(lǐng)域技術(shù)人員從以下公開內(nèi)容顯而易見本發(fā)明的上述目的及其它目的、特征、優(yōu)點(diǎn)以及各個(gè)方面。然而應(yīng)當(dāng)理解，本說明書的描述，包括以下實(shí)施本發(fā)明的最佳方式、實(shí)施例等，是闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并只為說明目的而提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚，根據(jù)本說明書以下部分及其它部分公開內(nèi)容的知識，可能對本發(fā)明進(jìn)行大量的變化和/或改變(或修飾)，而不背離其此處公開的實(shí)質(zhì)和范圍。此處引用的所有專利出版物以及參考文獻(xiàn)均為了說明目的，其公開內(nèi)容在此引入供參考。
附圖簡述

圖1顯示在利用標(biāo)記的抗-HbAlc mAb的HbAlc測定中(包括HbAlc吸附于磁性膠乳顆粒的步驟)，不溶性磁性載體顆粒與所得信號之間顆粒的表面積-信號關(guān)系。
圖2顯示利用標(biāo)記的抗-HbAlc mAb的HbAlc測定中(包括HbAlc吸附于磁性膠乳顆粒的步驟)，所得信號與系統(tǒng)中存在的抗體之間的信號-抗體數(shù)量關(guān)系。
圖3顯示在利用標(biāo)記的抗-HbAlc mAb的HbAlc測定中(包括HbAlc吸附于磁性膠乳顆粒的步驟)，使用可直接檢測的標(biāo)記的結(jié)果。
圖4顯示膠乳凝集方法與利用標(biāo)記的抗-HbAlc mAb的HbAlc測定方法(包括HbAlc吸附于磁性膠乳顆粒的步驟)之間的相關(guān)性。
圖5顯示使用不同的不溶性磁性載體顆粒，對利用標(biāo)記的抗-HbAlc mAb的HbAlc測定(包括HbAlc吸附于磁性膠乳顆粒的步驟)的影響。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在本發(fā)明中，標(biāo)記的抗體(標(biāo)記Ab)、特別是標(biāo)記的單克隆抗體(標(biāo)記mAb)，有可能選擇性地與吸附或附著于不溶性磁性載體的特定抗原性物質(zhì)反應(yīng)，而所述的標(biāo)記Ab(特別是所述的標(biāo)記mAb)基本上不與仍存在于液相中的所述的特定抗原性物質(zhì)反應(yīng)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，其有可能將檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附于不溶性載體，然后與上述免疫測定中的抗所述抗原性物質(zhì)的mAb反應(yīng)，而無需洗滌去除所述的檢驗(yàn)樣品。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，此處所用mAb選自與吸附于不溶性載體顆粒的抗原反應(yīng)、而基本上不與液相中存在的未吸附(未結(jié)合)的抗原性物質(zhì)反應(yīng)的mAb，從而如今有可能基本上排除未吸附(未結(jié)合)成分的干擾作用。
(抗原性物質(zhì))本發(fā)明的待測的抗原性物質(zhì)包括能夠吸附(或附著)于不溶性磁性載體的任何抗原性物質(zhì)，只要有可能制備或獲得該特定抗原性物質(zhì)的至少一種多克隆或單克隆抗體，而不限于此處確定的抗原性物質(zhì)范圍。然而，為了便于吸附到不溶性磁性載體，優(yōu)先選擇生物樣品中包含的不少于100μg/mL(進(jìn)一步不少于1mg/mL)或不少于1％(占總蛋白質(zhì)重量)的物質(zhì)。另外，為了便于制備上述多克隆和/或單克隆抗體，優(yōu)選上述抗原性物質(zhì)應(yīng)是分子量不低于10,000的物質(zhì)(例如蛋白質(zhì))。
本發(fā)明的免疫測定的待測的“抗原性物質(zhì)”包括可制備或獲得針對該目標(biāo)抗原性物質(zhì)的至少一種多克隆或單克隆抗體的任何″抗原性物質(zhì)″。該″抗原性物質(zhì)″包括各種物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多肽以及利用基因工程技術(shù)制備的重組蛋白質(zhì)。它們可能為免疫測定領(lǐng)域所公知或者是全新的物質(zhì)。代表性的抗原性物質(zhì)是HbAlc。
(抗原性物質(zhì)的特異性抗體)此處所用術(shù)語″與抗原性物質(zhì)特異性反應(yīng)的抗體″可涵蓋任何多克隆抗體和/或單克隆抗體，及其完整分子或片段和衍生物，包括F(ab’)2、Fab’和Fab片段。制備單克隆抗體的優(yōu)選技術(shù)包括，例如使用雜交瘤細(xì)胞的方法(G.Kohler和C.Milstein，Nature，256，pp.495-497(1975))；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，New York(1987))等，此外，下列文件或其中引用的文件可能舉例說明相關(guān)抗體J.J.Langone等人(ed.)，″Methodsin Enzymology″，卷121(Immunochemical Techniques，Part IHybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)，AcademicPress，New York(1986)，其公開內(nèi)容在此引入供參考。
可以適當(dāng)?shù)夭捎肒oehler & Milstein(Nature，256，495-497，1975)報(bào)告的細(xì)胞融合技術(shù)等制備單克隆抗體。該方法本身是常規(guī)方法。因此不需要特別說明；然而該方法需要選擇有效產(chǎn)生目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。所謂的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)容易處理大量樣品，所以經(jīng)常用來進(jìn)行這種選擇，其中預(yù)定抗原固相化于96孔板，然后與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)，再與酶標(biāo)抗小鼠免疫球蛋白反應(yīng)。在抗原固相化的情況下，如果能夠組成使抗體在此固相抗原狀態(tài)下反應(yīng)的測定系統(tǒng)，則可以接受該選擇方法，但某些情況下，經(jīng)ELISA選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體中存在于測定系統(tǒng)中非反應(yīng)性的抗體，則該測定系統(tǒng)在液相中進(jìn)行抗原-抗體相互作用，正如放射免疫測定(RIA)一樣。
盡管本領(lǐng)域公知或常見這種現(xiàn)象，但在使用這樣的單克隆抗體時(shí)，本發(fā)明的免疫測定能夠與不溶性載體顆粒上固相化的目標(biāo)抗原性物質(zhì)特異性反應(yīng)，而沒有任何由于抗原性物質(zhì)仍存在于液相中的抑制作用。
代表性的單克隆抗體包括，例如日本專利NO.2,677,753公開的單克隆抗體。特別代表性的單克隆抗體是，例如日本專利NO.2,677,753公開的單克隆抗HbAlc抗體(抗HbAlc mAbs)。
盡管通常使用的抗體是IgG，但也可能包括F(ab’)2、Fab’、Fab等在內(nèi)的抗體片段，其是來自親本抗體經(jīng)過消化酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)處理、有時(shí)經(jīng)過還原劑(例如二硫蘇糖醇和巰基乙醇)還原的低級分子。
另外可能使用IgM而非IgG，或者使用來自親本IgM經(jīng)過與IgG同樣處理的低級分子。此外可能使用識別表位互不相同的兩種或多種單克隆抗體的組合。
(抗體的標(biāo)記)可利用適當(dāng)?shù)臉?biāo)志標(biāo)記此處所用抗體。
標(biāo)記可能包括酶、酶底物、酶抑制劑、輔基、輔酶、酶前體、脫輔基酶、熒光物質(zhì)、色素、化學(xué)發(fā)光化合物、發(fā)光物質(zhì)、顏料物質(zhì)、磁性物質(zhì)、金屬微粒例如膠體金、放射性物質(zhì)等。酶可能包括脫氫酶、氧化還原酶例如還原酶和氧化酶；催化功能基團(tuán)(例如氨基、羧基、甲基、?；土姿峄?轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移酶；水解各種鍵(例如酯、糖苷、醚和肽鍵)的水解酶；裂解酶；異構(gòu)酶；連接酶等?？赡芤越Y(jié)合形式使用多種酶進(jìn)行檢測。
例如，也可以利用酶的循環(huán)。用于標(biāo)記的代表性酶包括過氧化物酶，例如辣根過氧化物酶；半乳糖苷酶，例如大腸桿菌(E.coli)β-D-半乳糖苷酶；馬來酸脫氫酶；葡糖-6-磷酸脫氫酶；葡萄糖氧化酶；葡糖淀粉酶；乙酰膽堿酯酶；過氧化氫酶；堿性磷酸酶，例如牛腸堿性磷酸酶和大腸桿菌堿性磷酸酶等。使用堿性磷酸酶時(shí)，通過監(jiān)測或檢查底物(例如傘形酮衍生物包括4-甲基傘形苯磷酸鹽(4-methyl-umbellipheryl phosphate)、磷酸化苯酚衍生物例如硝基苯基磷酸鹽、螢光素衍生物和二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)衍生物)；利用NADP的酶循環(huán)系統(tǒng)等產(chǎn)生的熒光、發(fā)光等進(jìn)行測定。也可能利用螢光素/螢光素酶系統(tǒng)。如果利用過氧化氫發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生氧，則可以利用電極等進(jìn)行檢測。電極可能是玻璃電極、使用不溶性鹽膜的離子電極、液膜型電極、聚合物膜電極等。酶標(biāo)記可能替換為生物素標(biāo)記和酶標(biāo)親和素(鏈親和素)。對于標(biāo)記，可以使用多種不同類型的標(biāo)記或標(biāo)志。在這種情況下，有可能連續(xù)、或不連續(xù)、和/或同時(shí)、或分別進(jìn)行多種測定。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用酶-試劑組合形成信號，例如辣根過氧化物酶或其它過氧化物酶與選自4-羥基苯乙酸、1，2-苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺等之一的組合；β-D-半乳糖苷酶或葡糖-6-磷酸脫氫酶與選自傘形苯(umbelliferyl)半乳糖苷、硝基苯半乳糖苷等之一的組合等。利用能夠酶學(xué)形成醌醇(quinole)化合物(例如氫醌、羥基苯醌(hydroxybenzoquinone)和羥基蒽醌)；硫醇化合物，例如硫辛酸和谷胱甘肽；苯酚衍生物；二茂鐵衍生物等的物質(zhì)形成信號。
熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光化合物可能包括異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate)；羅丹明(Rhodamine)衍生物，例如羅丹明B異硫氰酸鹽和四甲羅丹明異硫氰酸鹽；丹磺酰氯(dancylchloride)(5-(二甲基氨基)-1-萘磺酰氯)、丹磺酰氟(dancylfluoride)、熒光胺(4-苯基螺[呋喃-2(3H)，1’-(3’H)-異苯基呋喃]-3，3’-二酮(4-phenylspiro[furan-2(3H)，1’-(3’H)-isobenzofuran]-3，3’-dione))；藻膽蛋白，例如藻青蛋白和藻紅蛋白；吖啶翁(acridinium)鹽；氨基苯二酰一肼化合物，例如螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白；咪唑；草酸酯；稀土元素例如銪(Eu)、鋱(Tb)和釤(Sm)的螯合物；香豆素衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素等。
抗體和標(biāo)記的偶聯(lián)可以通過下列方法進(jìn)行物理方法，例如吸附；化學(xué)方法，使用偶聯(lián)劑等或活化的反應(yīng)物；使用化學(xué)相互作用的偶聯(lián)方法?？梢酝ㄟ^硫醇基與馬來酰亞胺基反應(yīng)、吡啶二硫基與硫醇基反應(yīng)、氨基與醛基反應(yīng)等，進(jìn)行標(biāo)記。另外，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以從公知的方法中適當(dāng)選擇易于實(shí)施的方法、技術(shù)及其任何變化的方法。偶聯(lián)劑包括，例如甲醛、戊二醛、己二異氰酸酯、己二異硫氰酸酯、N，N’-聚亞甲基雙碘乙酰胺、N，N’-乙烯雙馬來酰亞胺、乙二醇二琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、雙重氮聯(lián)苯胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺、琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-硫代琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯、N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯、N-琥珀酰亞胺基4-(1-馬來酰亞胺苯基)丁酸酯、N-(ε-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺(EMCS)、巰醇亞胺(iminothiolane)、S-乙酰巰基琥珀酸酐、甲基-3-(4’-二硫代吡啶)丙亞胺酯(propionimidate)、甲基-4-巰基-丁?；野孵?butyrylimidate)、甲基-3-巰基丙亞胺酯、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰巰基乙酸酯等。
(不溶性磁性載體顆粒)此處所用不溶性磁性載體顆粒優(yōu)選微粒，其中該微?；旧喜蝗苡谒砸后w介質(zhì)，并包含有機(jī)聚合物材料相和磁性材料或物質(zhì)相。代表性的不溶性磁性載體顆粒為微粒，其均不僅包含由一種或多種有機(jī)聚合物材料組成的表層相，也包含由一種或多種磁性材料或物質(zhì)組成的核心相。所述的不溶性磁性載體顆?？赡馨?，例如包含一種或多種選自四氧化三鐵(Fe3O4)、三氧化二鐵(γ-Fe2O3)、各種鐵酸鹽、金屬例如鐵、錳、鎳、鈷和鉻、合金例如鈷合金、鎳合金、錳合金等的微粒；其中包含磁性顆粒的膠乳顆粒、明膠顆粒、脂質(zhì)體顆粒等。適當(dāng)?shù)?，所述的不溶性磁性載體顆粒包括由膠乳表層包裹磁性材料或物質(zhì)的核心構(gòu)成的膠乳顆粒。術(shù)語膠乳最初是指橡膠樹經(jīng)切割或受傷滲出的乳狀樹液，但此處所用膠乳也指水溶液中懸浮或分散不連續(xù)微粒的懸浮液或乳劑。此處所用不溶性磁性顆粒優(yōu)選包括但不限于所述的磁性顆粒核心的表面經(jīng)過有機(jī)物質(zhì)等進(jìn)行表面處理的微粒。
進(jìn)行定量免疫測定時(shí)，這種膠乳顆粒通常要求其顆粒大小均勻性或一致性、其表面狀態(tài)控制、其內(nèi)部結(jié)構(gòu)選擇等處于高水平。這種適用于檢測試劑的高質(zhì)量膠乳顆粒可以選自商品化供應(yīng)的產(chǎn)品?？梢杂脕順?gòu)成上述顆粒的有機(jī)聚合物材料可包括但不限于現(xiàn)有技術(shù)公開的有機(jī)聚合物材料微粒(例如JP，A，58-11575(1983))。該有機(jī)聚合物材料包括，例如疏水性聚合物，如聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚己酰胺(polycapramide)和聚對苯二甲酸乙二酯；交聯(lián)的親水聚合物，例如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯醇)、聚(2-乙氧基丙烯酸酯)、聚(2-乙氧基甲基丙烯酸酯)、聚(2，3-二丙氧基丙烯酸酯)、聚(2，3-二丙氧基甲基丙烯酸酯)和聚乙二醇甲基丙烯酸酯；包含大約2-4種每種單體的共聚物等。雖然不特別限于膠乳材料，優(yōu)選使用苯乙烯類型膠乳，例如聚苯乙烯膠乳、丙烯酸類型膠乳等。為便于順利吸附蛋白質(zhì)或肽，優(yōu)選使用表面疏水性強(qiáng)的膠乳(例如聚苯乙烯膠乳)。根據(jù)需要，也可能使用各種類型的變性膠乳(例如羧酸變性膠乳)。此處所用上述不溶性載體優(yōu)選包括膠乳，例如聚苯乙烯膠乳。特別優(yōu)選的膠乳顆粒是使用非乳化劑通過乳化聚合方法制備的聚苯乙烯顆粒。由于表面上的負(fù)電荷彼此相斥，這種膠乳即使沒有任何乳化劑也能穩(wěn)定存在。商品化供應(yīng)的代表性不溶性磁性載體顆粒為Dynabeads M-270 Epoxy、Dynabeads M-270Amine、Dynabeads M-270 Carboxylic Acid、Dynabeads M-270Tosylactivated、Dynabeads M-450 Epoxy和Dynabeads M-450Tosylactivated(VERITAS Corporation，Japan)、IMMUTEX-MAG(JSR Corporation，Japan)以及SMG-11(Fujikura Kasei Co.，Ltd.，Japan)。載體顆粒還可得自Bangs Laboratories，Inc.等。
此處所用不溶性磁性載體顆粒的顆粒大小為0.01μm-20μm。優(yōu)選顆粒大小0.1μm-6μm的不溶性磁性顆粒。將抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合不溶性磁性顆粒的方法可能包括檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)物理吸附或結(jié)合或化學(xué)結(jié)合。適當(dāng)?shù)?，這是物理吸附或結(jié)合。
為了將檢驗(yàn)樣品中包含的抗原性物質(zhì)吸附于膠乳顆粒，對于懸浮該膠乳顆粒的緩沖液，可利用基本上等同于將抗原吸附ELISA平板等的方法。某些膠乳顆粒易發(fā)生自然聚集。如果這樣，考慮到穩(wěn)定性，優(yōu)選懸浮于弱堿性甘氨酸緩沖液或硼酸緩沖液。至于膠乳的濃度，優(yōu)選使用按重量計(jì)0.05-1％的懸浮液。
(抗原-抗體相互作用)在本發(fā)明中，將檢驗(yàn)樣品中包含的抗原性物質(zhì)固相化(或固定化)，然后與可特異性和該固相化的抗原性物質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記Ab反應(yīng)，以標(biāo)記在由膠乳等組成的不溶性磁性載體上捕獲的抗原性物質(zhì)。為此使用的水溶液優(yōu)選包含包含大約0.1-0.3％表面活性劑(例如Tween20)，以防止該抗體吸附于膠乳等組成的不溶性載體。
本發(fā)明對于進(jìn)行反應(yīng)的容器沒有特別限制。有可能使用普通的管狀形式容器(試管；例如聚苯乙烯試管)。如果考慮容易同時(shí)處理數(shù)以千計(jì)或數(shù)以百計(jì)的樣品，使用具有復(fù)孔的ELISA板、例如96孔ELISA板(NUNC-IMMUNO PLATE等)極為方便。下文將會述及，為了易于利用光學(xué)方法測定，優(yōu)選使用基本透明的容器進(jìn)行反應(yīng)。如果使用下文所述自動(dòng)分析儀，應(yīng)注意通常在該分析儀的反應(yīng)器中進(jìn)行反應(yīng)。
(測定)對測定不溶性磁性載體顆粒標(biāo)記水平的方法沒有特別限制。例如，如果定性或半定量測定標(biāo)記，有可能根據(jù)與已知樣品濁度水平的比較，目視判斷上述不溶性載體顆粒的標(biāo)記水平。如果定量測定所述的標(biāo)記，為了簡單方便，優(yōu)選進(jìn)行光學(xué)測量。
對于由膠乳等組成的不溶性磁性載體顆粒上的標(biāo)記的光學(xué)測量方法，可以使用常規(guī)已知的方法。
在本發(fā)明中，有可能進(jìn)行檢驗(yàn)樣品的測量處理；從樣品分發(fā)處理直到測定結(jié)果采集步驟，利用自動(dòng)化儀器、例如磁性顆粒的臨床檢驗(yàn)自動(dòng)分析儀。這種臨床檢驗(yàn)的自動(dòng)化儀器(系統(tǒng))包括ADVIATM(商品名，Bayer)、ARCHITECTTM(商品名，Dinabbot)、IMxTM(商品名，Dinabbot)、AccessTM(商品名，Beckmann)、ECLusysTM(商品名，Roche Diagnostics)、LUMIPULSETM(商品名，F(xiàn)UJIREBIO)等。這種儀器已經(jīng)廣泛用于免疫測定系統(tǒng)(利用抗原-抗體相互作用)，只要是這樣的儀器，本發(fā)明就可以沒有任何限制地采用。這些儀器的特征在于具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有利條件，包括能夠以隨機(jī)存取方式測定多個(gè)對象、測定靈敏度高、可能測定的范圍廣、能夠短時(shí)間內(nèi)完成測定，由于從分發(fā)到獲得測定結(jié)果的所有步驟均以自動(dòng)化方式進(jìn)行，因而測定精度高，由于使用獨(dú)立的反應(yīng)管而很少污染等。
如果在普通樣品中測定抗原，則在常規(guī)的自動(dòng)化臨床檢驗(yàn)儀器中使用抗體致敏的磁性顆粒，其中步驟包含(a)第一步反應(yīng)(1)磁性顆粒與樣品中抗原反應(yīng)，以及(2)然后洗滌，(b)第二步反應(yīng)(3)將得到的產(chǎn)物與針對所述抗原的第二抗體反應(yīng)(使用例如酶或熒光物質(zhì)等標(biāo)記作為標(biāo)志)，以及(4)然后洗滌，以及(c)第三步反應(yīng)(5)將得到的產(chǎn)物與所述標(biāo)志的底物反應(yīng)，以及(6)然后測定。
然而，根據(jù)本發(fā)明，可以如下減少洗滌次數(shù)(a)第一步反應(yīng)(1)磁性顆粒與樣品中抗原反應(yīng)，(b)第二步反應(yīng)(2)將得到的產(chǎn)物與針對所述抗原的第二抗體反應(yīng)(使用例如酶或熒光物質(zhì)的標(biāo)記作為標(biāo)志)，以及(3)然后洗滌，以及(c)第三步反應(yīng)(5)將得到的產(chǎn)物與所述標(biāo)志的底物反應(yīng)，以及(6)然后測定。
因此本發(fā)明能夠大大防止顆粒損失。
在光學(xué)檢測膠乳顆粒聚集的方法中，必須使用相對大量的顆粒。然而本發(fā)明可以檢測與顆粒結(jié)合的物質(zhì)數(shù)量。因此，本發(fā)明較常用方法可以測定十分之一乃至更少數(shù)量的顆粒以及標(biāo)志標(biāo)記的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，有可能避免與常規(guī)方法中使用的抗體復(fù)合物的制備難題，其中難題包括制備方法中的困難、在實(shí)際使用濃度下的不穩(wěn)定性等。因此，本發(fā)明只使用單個(gè)Ab便改善了物質(zhì)的穩(wěn)定性，而且制備批次之間沒有差異，從而能夠穩(wěn)定、可靠地制備。只使用mAb可以利用其優(yōu)點(diǎn)。例如，有可能排除抗體批次之間的差異，并提供高度可靠的質(zhì)量穩(wěn)定試劑。
由于本發(fā)明的不溶性載體顆粒試劑從未用抗原等致敏，試劑盒極大改善了顆粒批次差異的問題。另外，顆粒不僅包含由磁性材料或物質(zhì)組成的核心，而且包含由塑料組成的表層，其抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合特性良好。
本發(fā)明可以使用的適用于不溶性磁性載體顆粒的測定儀器包括，例如FUJIREBIO LUMIPULSTM(ALP-AMPPDTM)；Beckmann CoulterAccessTM(ALP-LumigenTMPPD)；Beckmann Coulter LUMIWARDTM(ALP-LumigenTMPPD)；Nippon DPC Corporation″Immulize″TM(ALP-AMPPDTM)；Bayer ACSTM(吖啶鎓酯(acridiniumm ester))；Ortho Clinical Diagnostics VITROSTMECi(HRP-Luminol)；Precision System Science Co.，Ltd.HiMICOTM；DinabbotARCHITECTTM(吖啶鎓酯)；Roche PicolumiTM(釕復(fù)合物)；TosohAIA-600II(ALP-4MUP)等。這些儀器可能還包括利用酶化學(xué)發(fā)光、釕復(fù)合物電化學(xué)發(fā)光、吖啶鎓酯化學(xué)發(fā)光等的儀器。
(血紅蛋白Alc的測定實(shí)施方案)下文描述了血紅蛋白Alc(HbAlc)的測定實(shí)施例，作為較好說明本發(fā)明免疫測定特征的實(shí)施方案，盡管本發(fā)明的免疫測定不限于血紅蛋白Alc測定。
上述″血紅蛋白Alc″是指一種特定類型的糖基化(或糖化)血紅蛋白，通過葡萄糖非酶促吸附到血紅蛋白(Hb)β-鏈N端氨基酸殘基纈氨酸的α-氨基而形成。血液血紅蛋白Alc的數(shù)量反映了糖尿病相對長期的血糖控制狀況。因此，為了評價(jià)糖血的控制，測定HbAlc臨床意義極大(參看例如Nippon-Rinsho，48，Special Issue，315-322(1990))。
血紅蛋白是異四聚體，基本由兩條α-鏈和兩條β-鏈組成。血紅蛋白Alc的特征在于兩條β-鏈之一的N端α-氨基糖基化。因此，在血紅蛋白Alc上有一個(gè)特征性反應(yīng)位點(diǎn)。換句話說，鑒于與血紅蛋白Alc特異性mAb的反應(yīng)性，血紅蛋白Alc起一價(jià)抗原的作用。
在本發(fā)明的免疫測定中，例如為了測定血紅蛋白Alc，檢驗(yàn)樣品(例如通過在全血中加入凈化水(purified water)而制備的溶血樣品)可以吸附于不溶性磁性載體顆粒(包被膠乳的磁性顆粒)，然后與標(biāo)記的抗血紅蛋白Alc mAb反應(yīng)，選擇性標(biāo)記膠乳層上的血紅蛋白Alc。測定所述的選擇性標(biāo)記的標(biāo)志水平，可以定量測定血紅蛋白Alc。
例如，利用本發(fā)明的免疫測定同時(shí)定量通過HPLC或其它方法測定的血紅蛋白Alc百分率已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線，有可能確定未知樣品中血紅蛋白Alc的％值。
(抗HbAlc的單克隆抗體)此處所用抗HbAlc mAb包括只要基本上與吸附或固相化的HbAlc反應(yīng)、基本上不與固相化的HbAO反應(yīng)的任何抗HbAlc mAb，而沒有任何特別限制(優(yōu)選地，該抗HbAlc mAb另外基本上不與仍存在于液相中的HbAlc或HbAO反應(yīng))。使用糖化肽作為免疫原制備mAb時(shí)，可以獲得這樣的單克隆抗體?？梢詼y定與HbAlc和HbAO的反應(yīng)性，例如按日本專利No.2,677,753公開的方式。
如日本專利No.2,677,753所述，按照免疫讀板機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明優(yōu)選該所述的抗HbAlc mAb的HbAlc反應(yīng)性不少于1.0(更優(yōu)選不少于2.0)。按照該標(biāo)準(zhǔn)，還優(yōu)選所述的抗-HbAlc mAb的HbAO反應(yīng)性不多于0.1(更優(yōu)選不多于0.05)。
本發(fā)明優(yōu)選所述的抗-HbAlc mAb、甚至是10μg/mL(或更進(jìn)一步20μg/mL)的抗HbAlc mAb在液相中不與非變性HbAlc、HbAO、變性HbAO等反應(yīng)，但是1μg/mL(或更進(jìn)一步0.5μg/mL)或更少的抗HbAlc mAb在液相中與變性HbAlc反應(yīng)。
此處將公開本發(fā)明測定HbAlc的優(yōu)選實(shí)施方案。
在本發(fā)明中，通常將大約1μl-20μl(或2μl-5μl)溶血的血溶液分發(fā)到各管中，作為檢驗(yàn)樣品。還可以使用甘氨酸緩沖液等，按5-10倍稀釋度稀釋檢驗(yàn)樣品(例如1mL凈化水加入50μl全血))，獲得此處實(shí)際使用的溶血的血溶液。
此后，每管中加入一等份(大約100-300μl(或150-200μl))的磁性膠乳顆粒懸浮液(例如0.12μm磁性顆粒包被的膠乳懸浮液，濃度0.2％)，然后37℃靜置大約1-30分鐘(或3-20分鐘)，以便樣品中HbAlc吸附于膠乳。優(yōu)選如此使用的磁性膠乳顆粒懸浮液是利用甘氨酸緩沖液等稀釋磁性膠乳顆粒原液的產(chǎn)物。
然后，將一等份(大約100-300μl(或150-200μl))利用適當(dāng)標(biāo)志標(biāo)記的抗HbAlc mAb(例如小鼠腹水來源的mAb)加入吸附于乳膠的HbAlc中，使混合物37℃靜置(溫育)大約2-30分鐘(或3-10分鐘)，以便HbAlc與所述的標(biāo)記的mAb反應(yīng)。優(yōu)選最佳設(shè)置此處使用的mAb溶液的濃度，例如根據(jù)制備的系列稀釋的抗HbAlc mAb。用來稀釋的緩沖液可能包括0.05-0.1M甘氨酸緩沖液(GBS甘氨酸緩沖鹽溶液；pH8.1-8.5，包含0.15M NaCl)等。為此使用的緩沖液優(yōu)選包含大約0.1-0.5％(或0.2-0.3％)的表面活性劑(例如Tween 20)，以防止膠乳表面上mAb的物理性吸附作用。
在本領(lǐng)域中，如果將膠乳顆粒用作不溶性磁性載體顆粒，不容易制備質(zhì)量完全一致的膠乳試劑(其上攜帶抗原、抗體等的乳膠)，也不容易保持制品的穩(wěn)定狀態(tài)，防止發(fā)生非特異性聚集和沉淀。
相反，本發(fā)明的不溶性磁性載體(膠乳等)未被抗原和抗體致敏，可以應(yīng)用商品化供應(yīng)的本身未致敏的磁性膠乳作為不溶性磁性載體。此外，并非總是需要抗體是純品。另外，由于試劑簡單，有可能保持較高的儲存穩(wěn)定性，從而還有利于制備。如上所述，本發(fā)明試劑可以簡單、容易地制備，因而如今有可能提供使用高儲存穩(wěn)定性試劑的方法。
在本發(fā)明免疫測定的應(yīng)用中，通過采納一般由本領(lǐng)域技術(shù)人員在適合每種方法的通用條件和操作的基礎(chǔ)上提出的技術(shù)思考，可能構(gòu)造適于本發(fā)明的目標(biāo)或與其活性基本相同的目標(biāo)物質(zhì)的測定系統(tǒng)。
常規(guī)技術(shù)方法的細(xì)節(jié)可參看各種綜述、教材、書籍等。例如，Hiroshi Irie(ed.)，″Radioimmunoassay″，Kodansha Ltd.，Japan，1974；Hiroshi Irie(ed.)，″Zoku-Radioimmunoassay″(Radioimmunoassay；Second Edition)，Kodansha Ltd.，Japan，1979；Eiji Ishikawa等(ed.)，″Koso Meneki Sokuteiho″(EnzymeImmunoassays)，Igaku-Shoin Ltd.，Japan，1978；Eiji Ishikawa等(ed.)，″Koso Meneki Sokuteiho″(Enzyme Immunoassays)(2ndEdition)，Igaku-Shoin Ltd.，Japan，1982；Eiji Ishikawa等(ed.)，’Koso Meneki Sokuteiho″(Enzyme Immunoassays)(3rdEdition)，Igaku-Shoin Ltd.，Japan，1987；H.V.Vunakis等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New York(1980)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.73(Immunochemical Techniques，Part B)，Academic Press，NewYork(1981)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.74(Immunochemical Techniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods inEnzymology″，Vol.84(Immunochemical Techniques，Part DSelected Immunoassays)，Academic Press，New York(1982)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part EMonoclonal Antibodiesand General Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part IHybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies)，Academic Press，NewYork(1986)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology’，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，Academic Press，New York(1989)；M.Wilchek等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.184(Avidin-BiotinTechnology)，Academic Press，New York(1990)；J.J.Langone等(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.203(MolecularDesign and ModelingConcepts and Applications，Part BAntibodies and Antigens，Nucleic Acids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，New York(1991)等；以及上述文件引用的參考文獻(xiàn)，其公開內(nèi)容在此引入供參考。
實(shí)施例利用以下只為說明目的而提供的實(shí)施例、并參考本發(fā)明的特定實(shí)施方案具體描述了本發(fā)明。盡管為了公開本發(fā)明的特定實(shí)施方案而提供這些說明性實(shí)施例，但不應(yīng)認(rèn)為其限制或約束了此處公開的本發(fā)明范圍。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)可以實(shí)施多種不同的形式。
除非另外說明，利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知或常見的標(biāo)準(zhǔn)方法，實(shí)施或能夠?qū)嵤┧械膶?shí)施例。
實(shí)施例1顆粒表面積與產(chǎn)生信號之間的關(guān)系溶血血液從人收集的血紅細(xì)胞(5μl)中加入凈化水(500μl)進(jìn)行溶血，將得到的混合物用作檢驗(yàn)樣品。
生物素標(biāo)記的抗HbAlc mAb將NHS-LC-Biotin(No.21335；Pierce)用作生物素化試劑?？笻bAlc mAb根據(jù)所述生物素化試劑所附說明書進(jìn)行生物素化。重復(fù)透析去除未反應(yīng)的生物素。所用抗HbAlcmAb公開于專利No.2,677,753(該單克隆抗體也可以使用血紅蛋白Alc(HbAlc)檢測試劑″RAPIDIA AUTO HbAlc″(銷售商FUJIREBIO Inc.，Japan；制造商SRL，Inc.，Japan))中包括的抗HbAlc試劑)。
不溶性磁性載體顆粒使用SMG-11(Fujikura Kasei Co.，Ltd.，Japan)。該磁性膠乳顆粒制品具有下列物理特性顆粒大小(nm)990，密度1.58。用水稀釋該不溶性磁性載體顆粒，形成水性稀釋系列2.5％、0.25％和0.025％。
在100μl 2.5％水性磁性膠乳顆粒稀釋液中，顆粒數(shù)目為3.12E+0.9，表面積(m2)為9.59E-03；0.25％稀釋液的顆粒數(shù)目為3.12E+0.8，表面積(m2)為9.59E-04；0.025％稀釋液的顆粒數(shù)目為3.12E+0.7，表面積(m2)為9.59E-05。
100μl水性磁性膠乳顆粒稀釋液中加入5μl溶血的血溶液，混合物于室溫靜置5分鐘，使其上吸附抗原性物質(zhì)。然后其中加入50μl0.07mg/ml生物素化的抗HbAlc mAb?；旌衔锸覝仂o置5分鐘，用ALP緩沖液(1％BSA、50mM咪唑、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mMZnCl2、0.05％Tween 20；pH 7.6)洗滌一次，然后加入100μl親和素-ALP(*5000；DAKO D-365)。
得到的混合物室溫靜置5分鐘，因使用生物素-親和素系統(tǒng)而用ALP緩沖液洗滌4次。加入AMPPD(100μl，Lumigen PPD；Wako PureChemical Industries，Ltd.，Japan)以后，將混合物轉(zhuǎn)到白色平板。10分鐘后測定發(fā)光量。結(jié)果如圖1所示。
結(jié)果推測該溶血溶液的蛋白質(zhì)數(shù)量為10μg。因此可以假定，如果顆粒濃度為2.5％，表面積為9.6E-0.3m2，則蛋白質(zhì)的數(shù)量太少，在反應(yīng)期間將發(fā)生聚集，從而不可能測定進(jìn)入載體中的分析物。使用的顆粒大小為1μm時(shí)，表面積值大約9.6E-03m2，似乎較為適當(dāng)。
實(shí)施例2抗體數(shù)量與信號之間的關(guān)系將5μl溶血溶液(按實(shí)施例1同樣方法制備)加入100μl 0.025％水性磁性膠乳顆粒稀釋液(使用與實(shí)施例1不溶性磁性載體顆粒相同的膠乳制品)中，使混合物室溫靜置5分鐘，其中加入一等份生物素化的抗HbAlc mAb(按實(shí)施例1相同方法制備，為0.048mg/mL(50μl，2.4μg)、0.0048mg/mL(50μl，0.24μg)或0.00048mg/mL(50μl，0.024μg))。該混合物室溫靜置5分鐘，用ALP緩沖液(1％BSA、50mM咪唑、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.05％Tween20；pH 7.6)洗滌一次。然后其中加入100μl親和素-ALP(與實(shí)施例1相同的試劑)。得到的混合物室溫靜置5分鐘，因使用生物素-親和素系統(tǒng)而用ALP緩沖液洗滌4次。然后加入100μl AMPPD(與實(shí)施例1相同的試劑)，將混合物轉(zhuǎn)到白色平板。10分鐘后測定發(fā)光量。
結(jié)果如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗HbAlc mAb的足夠量為大約0.25μg。
實(shí)施例3利用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行測定為了簡化測定、提高可重復(fù)性，直接用ALP標(biāo)記抗HbAlc mAb。
(1)用異硫氰酸熒光素(FITC；DOJINDO，Japan)標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP；Oriental Yeast，Co.，Ltd.，Japan)。首先將ALP(10mg/mL，100μl)加入0.1M NaHCO3緩沖液(400μl)中，然后其中加入10μl FITC溶液(4mg FITC溶于二甲基甲酰胺(DMF，1mL)中(ALP∶FITC＝1∶10)?；旌衔锸覝?cái)嚢?0分鐘，利用PD-10(Pharmacia)回收終產(chǎn)物。使用0.1M pH 7.5 NaH2PO4緩沖液洗脫?；厥誇ITC標(biāo)記的ALP(1.7mL)。
將上述制備的FITC標(biāo)記的ALP(ALP-FITC)馬來酰亞胺化。首先利用Centricon 30(Millipore)將以上回收的ALP-FITC濃縮到500μl。其后加入10μl EMCS溶液(N-(ε-馬來酰亞胺己酰氧基)-琥珀酰亞胺(EMCS，6mg)DMF溶液(1mL))(ALP-FITC∶EMCS＝1∶20)。混合物室溫?cái)嚢?0分鐘，利用PD-10(Pharmacia)回收終產(chǎn)物。使用包含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的0.1M NaH2PO4緩沖液，pH 6.3進(jìn)行洗脫。回收馬來酰亞胺化的ALP-FITC溶液(1.7mL)。
同時(shí)將抗HbAlc mAb(與實(shí)施例1所用相同的抗體)轉(zhuǎn)變?yōu)镾H形式。因此將19.1mg抗HbAlc mAb(52.4μl)加入0.1M NaH2PO4，pH7.5緩沖液中(450μl)，然后其中加入10μl AMSA溶液(S-乙酰巰基琥珀酸酐(AMSA，6mg)DMF溶液(1mL))(抗體∶AMSA＝1∶50)?；旌衔锸覝?cái)嚢?0分鐘，然后其中加入包含50mM EDTA的1M Tris緩沖液，pH 7.0(20μl)，以及1M鹽酸羥胺溶液，pH7.0(20μl)。混合物室溫?cái)嚢?5分鐘，利用PD-10(Pharmacia)回收終產(chǎn)物。使用包含5mM EDTA的0.1M NaH2PO4緩沖液，pH 6.3進(jìn)行洗脫?；厥誗H形式的抗體(IgG SH，1.7mL)。
其后將總量的上述制備的馬來酰亞胺化ALP-FITC與總量的上述制備的IgG SH混合。假定混合比為ALP∶IgG＝1.5∶1(摩爾比)。室溫反應(yīng)2小時(shí)以后，利用Centricon(Millipore)濃縮混合物到500μl，通過凝膠過濾(使用的載體SuperoseTM12；Pharmacia)得到ALP標(biāo)記的抗HbAlc mAb。
(2)在100μl 0.025％磁性膠乳顆粒稀釋液(與實(shí)施例1相同的膠乳稀釋液)中加入5μl溶血的血溶液(與實(shí)施例1相同的血液樣品)。混合物室溫靜置5分鐘，然后其中加入ALP標(biāo)記的抗HbAlc mAb?？贵w加入50μl 5μg/mL IgG。還使用利用PBS-Tween稀釋的抗體稀釋液以及利用包含BSA的緩沖液稀釋的另一抗體稀釋液，進(jìn)行比較?；旌衔锸覝仂o置5分鐘，然后用PBS-Tween洗滌4次。加入AMPPD(100μl，與實(shí)施例1相同的試劑)以后，將混合物轉(zhuǎn)到白色平板。15分鐘后測定發(fā)光量。結(jié)果如圖3所示。
存在蛋白質(zhì)時(shí)加入抗體，觀察到背景下降。由于背景下降，可以預(yù)期重復(fù)性提高。已經(jīng)證實(shí)信號較之親和素-ALP提高。圖4顯示檢驗(yàn)血紅蛋白Alc(HbAlc)檢驗(yàn)試劑″RAPIDIA AUTO HbAlc″(銷售商FUJIREBIO Inc.，Japan；制造商SRL，Inc.，Japan)與本發(fā)明膠乳聚集方法之間相關(guān)性的結(jié)果。證實(shí)存在較好的相關(guān)性。
實(shí)施例4不溶性磁性載體顆粒差異的比較使用與實(shí)施例3相同的操作與試劑。實(shí)施例1-3使用的FujikuraKasei膠乳顆粒(Fujikura Kasei Co.，Ltd.，Japan)與VERITAS膠乳顆粒(VERITAS Corporation，Japan)作比較。所用每種磁性顆粒試劑的總表面積設(shè)為相同，進(jìn)行測定。
VERITAS膠乳顆粒的顆粒大小為2.8μm，顆粒濃度為4.0E+09顆粒/mL，面積(計(jì)算值)為2.46E-11，每次測定的表面積為9.59E-05m2/顆粒(調(diào)整到m2需要1μl)。用水稀釋VERITAS膠乳顆粒，形成100倍的稀釋液。使用100μl VERITAS膠乳顆粒稀釋液。
在100μl每種磁性顆粒懸浮液(表面積9.59E-11m2)中加入5μl溶血的血溶液，混合物室溫靜置5分鐘。其后將ALP標(biāo)記的抗HbAlcmAb加入混合物中?？贵w加入50μl 5μg/mL IgG?；旌衔锸覝仂o置5分鐘，然后用PBS-Tween洗滌4次，其中加入100μl AMPPD(與實(shí)施例1相同的試劑)。將得到的混合物轉(zhuǎn)到白色平板。15分鐘后測定發(fā)光量。
結(jié)果如圖5所示。使用血紅蛋白Alc(HbAlc)檢驗(yàn)試劑″RAPIDIAAUTO HbAlc″(銷售商FUJIREBIO Inc.，Japan；制造商SRL，Inc.，Japan)作為校準(zhǔn)物。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的免疫測定可以簡單、方便并快速測定檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)，而無需任何麻煩的預(yù)處理，從而大大便于對相當(dāng)大量樣品同時(shí)進(jìn)行平行處理。此外，該測定方法適于全自動(dòng)化儀器的臨床檢驗(yàn)。因此有可能使測定步驟自動(dòng)化，并進(jìn)行批量處理。另外，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)不僅在于測定本身，也在于試劑的制備。通常，制備磁性膠乳試劑(結(jié)合抗原、抗體等的膠乳)時(shí)，并不總是容易制備質(zhì)量相同的試劑。此外，需要防止存儲期間聚集和沉淀的知識。膠乳材料的成本一般只占診斷性膠乳試劑費(fèi)用的小部分，大部分試劑費(fèi)用是生物材料的費(fèi)用，以及生物材料包被膠乳顆粒的步驟所需費(fèi)用。在這方面，根據(jù)本發(fā)明，所述的不溶性磁性載體(例如膠乳)基本上既不用任何抗原、也不用任何抗體致敏，從而能夠?qū)⑸唐坊?yīng)的不溶性磁性載體本身不經(jīng)任何修飾用作檢驗(yàn)試劑，而不必重新制備一種″膠乳試劑″。此外，本發(fā)明的抗體未必要求是純化產(chǎn)品，其需要量也大大減少。因而檢驗(yàn)試劑的制備更為容易，儲存穩(wěn)定性具有很大優(yōu)點(diǎn)。
盡管參照某些實(shí)施方案及其實(shí)施例詳細(xì)具體描述了本發(fā)明，但顯然可能以其它形式實(shí)施。根據(jù)公開內(nèi)容，應(yīng)當(dāng)理解各種修飾和變化也在所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.使用不溶性載體顆粒的免疫測定，其包含(i)使用基本上不含任何吸附的抗原和/或抗體的不溶性磁性載體顆粒，(ii)將檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合所述的不溶性磁性載體顆粒，(iii)將從上述(ii)處理得到的不溶性磁性載體顆粒與特異性和某些所述的抗原性物質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)記抗體反應(yīng)，所述抗體特異性與固相形式的抗原性物質(zhì)反應(yīng)，但基本上不與天然形式的抗原性物質(zhì)反應(yīng)，其中所述固相形式的抗原性物質(zhì)附著于所述的不溶性載體顆粒，所述的天然形式的抗原性物質(zhì)則存在于液相中，以及(iv)測定通過所述固相抗原性物質(zhì)捕獲得到的標(biāo)記抗體上的標(biāo)記，作為指標(biāo)。
2.權(quán)利要求1的免疫測定，其中所述的免疫測定包含(A)將所述檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)吸附或結(jié)合所述的不溶性磁性載體顆粒，以及(B)然后不用洗滌去除所述檢驗(yàn)樣品，將捕獲的抗原性物質(zhì)與所述的與固相抗原性物質(zhì)特異反應(yīng)的抗體進(jìn)行反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的免疫測定，其中所述的免疫測定包含(a)將所述的標(biāo)記抗體與吸附或結(jié)合了檢驗(yàn)樣品中抗原性物質(zhì)的不溶性磁性載體顆粒進(jìn)行反應(yīng)，(b)然后在磁場作用下，將未反應(yīng)的標(biāo)記抗體與不溶性磁性載體顆粒分離，以及(c)測定通過所述的固相抗原性物質(zhì)捕獲得到的標(biāo)記抗體上的標(biāo)記，作為指標(biāo)。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的抗體是單克隆抗體。
5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的抗體是多克隆抗體。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自基本上不溶于水性液體介質(zhì)、并由有機(jī)聚合物材料相和磁性材料相組成的微粒。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自不僅包含由一種或多種有機(jī)聚合物材料組成的表層相、而且包含由一種或多種磁性材料組成的核心相的微粒。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自其具有(a)0.01-20微米的平均顆粒大小以及(b)由一種或多種磁性材料組成的核心的膠乳顆粒。
9.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的不溶性磁性載體顆粒選自其具有0.1-6微米的平均顆粒大小以及由一種或多種磁性材料組成的核心的膠乳顆粒。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的免疫測定，其中所述的免疫測定可利用適合磁性顆粒的臨床化學(xué)自動(dòng)分析儀，從分發(fā)檢驗(yàn)樣品到獲得測試結(jié)果以自動(dòng)化形式進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的免疫測定，其中檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)是HbAlc。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用不溶性磁性載體顆粒進(jìn)行免疫測定的方法，該方法適于節(jié)約人力以及在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品，同時(shí)避免了致敏的不溶性磁性顆粒的穩(wěn)定性及其制備的困難。測定檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)時(shí)，不使用攜帶抗原性物質(zhì)特異的抗體的不溶性磁性顆粒，而是提供了基本上不吸附抗體等的不溶性磁性載體顆粒。然后待測定的抗原性物質(zhì)吸附于不溶性磁性載體顆粒，隨后與特異性針對該吸附的抗原性物質(zhì)的標(biāo)記抗體進(jìn)行反應(yīng)。從而以適合自動(dòng)化的方式有效測定檢驗(yàn)樣品中的抗原性物質(zhì)。
文檔編號G01N33/543GK1491359SQ02804719
公開日2004年4月21日 申請日期2002年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月18日
發(fā)明者櫻井正明, 高梨直樹, 岡昌則, 平田稔, 樹 申請人:愛賜愛兒股份有限公司