專利名稱：局部缺血的診斷標(biāo)志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)量分子濃度來(lái)診斷和監(jiān)測(cè)包括但不限于心肌缺血和腦缺血的局部缺血，所述分子并非是來(lái)自缺血組織，但其在血液和其它流體中的濃度由于局部缺血狀態(tài)而改變。
相關(guān)領(lǐng)域的描述局部缺血是血流量的減少。這種減少的出現(xiàn)可能由多個(gè)原因引起，包括但不限于血栓癥、栓塞、動(dòng)脈瘤、痙攣、或者因惡化作用導(dǎo)致的血管破裂。由于血流量的減少，本應(yīng)被提供養(yǎng)分的組織可能將不再會(huì)得到用來(lái)維持細(xì)胞完整的充足營(yíng)養(yǎng)，同樣可能無(wú)法清除足夠數(shù)量的細(xì)胞廢物，而且可能還會(huì)引起血液氣體如氧氣和二氧化碳交換不充分。無(wú)法將充足的氧氣輸送到細(xì)胞(缺氧)可能具有許多同局部缺血類似的后果，其也可以通過(guò)本發(fā)明要求保護(hù)的相同方法檢測(cè)出來(lái)。
如果局部缺血持續(xù)到了足夠長(zhǎng)的時(shí)間，即，如果氧合的血流沒(méi)有被恢復(fù)，那么由血流正常灌注的組織細(xì)胞將開始死亡。這種情況可能會(huì)隨著時(shí)間流逝而逐漸出現(xiàn)，而且在直到因足夠的細(xì)胞破壞而引起有機(jī)體機(jī)能被顯著破壞之前，這種情況可能會(huì)被忽視。一個(gè)實(shí)例可以是在糖尿病中出現(xiàn)的四肢或者身體其它部分循環(huán)的逐步惡化。同樣可能更急性地出現(xiàn)對(duì)血流的破壞作用。這種破壞包括但不限于導(dǎo)致通過(guò)冠狀動(dòng)脈的血流減少的血栓形成、腦缺血中的栓塞沉積、和在腎臟和肢中的類似事件。
對(duì)于漸進(jìn)的或者急性的時(shí)間過(guò)程，越早檢測(cè)出局部缺血的/含氧量低的情況，就可以越快地進(jìn)行姑息治療，對(duì)組織或者有機(jī)體的結(jié)果也就越好。例如，對(duì)糖尿病介導(dǎo)的四肢局部缺血的早期檢測(cè)可以避免截肢，對(duì)心臟或腦急性阻塞的早期檢測(cè)和緩解明顯地降低了死亡率和發(fā)病率。
令人遺憾的是，局部缺血/缺氧的早期檢測(cè)通常是不可能的。例如，用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征的主要早期診斷工具——ECG，其靈敏性小于40％。對(duì)于中風(fēng)患者，可用的工具僅為CT掃描或者M(jìn)RI，這兩種工具都只能確定患者是否在癥狀開始后的最初幾個(gè)小時(shí)有出血。只有在很晚以后，在晚得無(wú)法給予缺血發(fā)作的唯一治療——溶栓治療的時(shí)候，這些圖像方法才能夠確定是否已經(jīng)發(fā)生了缺血性發(fā)作。溶栓治療必須要在癥狀出現(xiàn)的3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予。對(duì)于其它器官，尚沒(méi)有充分制定用于早期檢測(cè)局部缺血的完善方法。因此，對(duì)于患者的診斷和治療，需要一種靈敏、準(zhǔn)確和快速的局部缺血測(cè)試方法。
在局部缺血的最后階段，當(dāng)細(xì)胞開始死亡(壞死)時(shí)，它們可能將它們的一些組分釋放到血液中。這些組分主要是細(xì)胞內(nèi)蛋白，它們被釋放出來(lái)的原因是因?yàn)榕c死亡相關(guān)的生化改變破壞了容納其的正常屏障—細(xì)胞膜。這些分子通常是組織特異的，例如對(duì)心臟而言是心臟肌鈣蛋白。雖然這些分子準(zhǔn)確地反映出疾病的存在，但是它們卻通常在癥狀出現(xiàn)后需要幾個(gè)小時(shí)才能達(dá)到在血液中有意義的水平，并且它們只從死亡或者瀕死的細(xì)胞中被釋放出來(lái)。因此，除了靈敏性和準(zhǔn)確性以外，局部缺血測(cè)試的另一個(gè)重要特征是其早在壞死之前檢測(cè)局部缺血狀態(tài)的能力。
除了從缺血組織中釋放作為壞死標(biāo)志的分子，缺血事件還可能產(chǎn)生一系列生化變化，這些變化可以引起并非源自缺血組織中的血液和其它流體中的分子濃度發(fā)生變化。在本發(fā)明中，這些分子被稱作缺血標(biāo)志。缺血標(biāo)志在例如下面的情況下發(fā)生當(dāng)缺血組織產(chǎn)生這樣的分子時(shí)此分子隨后被非缺血組織轉(zhuǎn)換成不同的分子；或者當(dāng)缺血組織產(chǎn)生這樣的分子時(shí)此分子激活非缺血組織的不同分子，使其釋放入體液。這些情況的實(shí)例是通過(guò)缺血的心臟或腦組織產(chǎn)生去甲腎上腺素、TNFα和促尿鈉排泄肽。如此產(chǎn)生的去甲腎上腺素、TNFα和促尿鈉排泄肽在脂肪組織中激活脂解作用，導(dǎo)致血液中游離脂肪酸升高。在另一個(gè)實(shí)例中，從缺血心肌中釋放出來(lái)的鞘氨醇在血小板中被轉(zhuǎn)換成鞘氨醇-1-磷酸酯，并且可以隨后在血液中檢測(cè)出來(lái)(Yatomi，等.(1997)Journ.Biol.Chem.272卷5291-5297頁(yè)；美國(guó)專利號(hào)6,210,976)。
除了診斷疾病的出現(xiàn)，缺血標(biāo)的水平志還可以預(yù)測(cè)未來(lái)有害事件的風(fēng)險(xiǎn)。另外，這些分子在足夠的水平時(shí)，本身可以介導(dǎo)引起有害結(jié)果的細(xì)胞反應(yīng)。例如，對(duì)外表健康的人進(jìn)行大量長(zhǎng)期研究，研究結(jié)果揭示盡管在正常范圍內(nèi)，但是增加總血清游離脂肪酸(FFA)的水平與22年后猝死的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。據(jù)推測(cè)，這種死亡增加率是FFA誘導(dǎo)的心律失常的結(jié)果。在另一個(gè)實(shí)例中，對(duì)患有急性心肌梗塞的患者使用葡萄糖—胰島素—鉀合劑(GIK)，相對(duì)于沒(méi)有接受GIK的患者，使用GIK的患者的死亡率顯著降低。此有益效果的一個(gè)原理是GIK引起血清總FFA降低。因此，存在這樣的需要能夠監(jiān)測(cè)缺血標(biāo)志以評(píng)價(jià)疾病的較長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)，并且能夠幫助確定治療干預(yù)的類型以降低增加的風(fēng)險(xiǎn)，該風(fēng)險(xiǎn)與可能是慢性缺血狀態(tài)相關(guān)。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了測(cè)量并非源自缺血組織的分子在血液和/或其它流體中的濃度在局部缺血的診斷和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。這些分子被稱作缺血標(biāo)志。相對(duì)于非缺血疾病，這些缺血標(biāo)志在濃度上的變化表現(xiàn)出某些缺血類型。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出局部缺血的疾病的方法，該方法包括下列步驟(a)測(cè)量來(lái)自哺乳動(dòng)物流體的測(cè)試樣品中的缺血標(biāo)志的水平。
(b)確定測(cè)試樣品中所測(cè)的缺血標(biāo)志的水平與哺乳動(dòng)物中局部缺血之間是否存在關(guān)聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人。測(cè)試樣品所用的流體可以選自但不限于血液、血清、血漿、唾液、膽汁、胃液、腦脊液、淋巴液、間質(zhì)液或者尿液。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于測(cè)試樣品的流體是血液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，缺血標(biāo)志是脂類。脂類可以選自但不限于鞘脂類、溶脂類(lysolipid)、糖脂、類固醇、和類花生酸，其包括白細(xì)胞三烯、前列環(huán)素、前列腺素和血栓烷。在一個(gè)實(shí)施方案中，被用作缺血標(biāo)志的鞘脂可以是鞘氨醇，或者其代謝物，其代謝物例如包括神經(jīng)酰胺(Cer，N-酰基鞘氨醇)、鞘氨醇-1-磷酸酯、鞘氨基磷酸膽堿(sphingosylphosphorylcholine)、或者二氫鞘氨醇。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂類是脂肪酸。
本發(fā)明公開的方法可以用于在任何器官或者組織中檢測(cè)局部缺血，這些器官和組織包括但不限于心臟、腦、腎臟或者肢。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)溶于含水緩沖液中的缺血標(biāo)志的組分。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，檢測(cè)不溶于含水緩沖液中的缺血標(biāo)志的組分。
可以用分光鏡方法檢測(cè)缺血標(biāo)志，包括但不限于UV/VIS、紅外線、微波、射線、吸收或者發(fā)射分光鏡。本發(fā)明同樣包括色譜分析程序，包括但不限于HPLC、低壓色譜法、中壓色譜法、和氣相色譜法。本發(fā)明還包括通過(guò)使用自旋標(biāo)記的電子自旋共振來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以用抗體或者受體分子、免疫測(cè)定或者酶測(cè)定來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的方法可以包括一個(gè)篩選出現(xiàn)缺血癥狀的哺乳動(dòng)物的初始步驟。在一些實(shí)施方案中，如果缺血標(biāo)志的水平與所述哺乳動(dòng)物中的局部缺血相關(guān)聯(lián)，所述的方法還可以包括給予抗缺血治療的步驟。抗缺血治療包括一種降低血清脂肪酸水平的方法。在一些實(shí)施方案中，抗缺血治療是在再灌注治療、抗溶血栓治療、血管生成治療(angiogenic therapy)或者外科手術(shù)。
在一些實(shí)施方案中，在所述缺血標(biāo)志的所述測(cè)量水平與所述標(biāo)志水平的預(yù)定值之間的比較，是決定步驟。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)志水平的預(yù)定值表現(xiàn)出非缺血疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，缺血標(biāo)志是未結(jié)合的或者水溶性游離脂肪酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使用結(jié)合脂肪酸的蛋白質(zhì)來(lái)檢測(cè)未結(jié)合的或者水溶性游離脂肪酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合未結(jié)合的或者水溶性游離脂肪酸的蛋白質(zhì)是發(fā)熒光的，而且其結(jié)合和未結(jié)合脂肪酸的時(shí)候顯示出不同的熒光。在一些實(shí)施方案中，此蛋白是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)家族中的一種，該家族具有的分子量在13,000和16,000道爾頓之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)ABP是大鼠腸FABP。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用阿奎羅丹(acrylodan)在FABP的27位進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，阿奎羅丹標(biāo)記的FABP是亮氨酸72到丙氨酸的突變體。
在一些實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的水平的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。在一些實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的水平的平均值高大約2倍的未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。在一些實(shí)施方案中，大于大約5nM的未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，結(jié)合未結(jié)合或者水溶性游離脂肪酸的蛋白質(zhì)是白蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用7一羥基香豆素或者氨茴酰來(lái)共價(jià)標(biāo)記白蛋白。
在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，缺血標(biāo)志是全部游離脂肪酸。在一個(gè)備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸水平的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的全部游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。在一個(gè)備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸水平的平均值高大約2倍的全部游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，缺血標(biāo)志是全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
在一些實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率表現(xiàn)出缺血疾病。在一些實(shí)施方案中，比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率的平均值高大約2倍的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率表現(xiàn)出缺血疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種確定患者對(duì)缺血治療的反應(yīng)的方法，該方法包括上述的檢測(cè)局部缺血的步驟，以及確定缺血標(biāo)志是否趨向于在非缺血疾病中的標(biāo)志水平的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療方法是再灌注治療，其包括但不限于血管成形術(shù)或者給予血栓溶解劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種在接受再灌注治療后鑒定高危出血患者的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自患者的體液樣品中的脂類組分水平；將所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與脂類組分的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與閾值水平的比率；和使所述的比率與再灌注治療后出血的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸、和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種鑒定在缺血事件以后，3年內(nèi)患者高風(fēng)險(xiǎn)死亡率的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自患者的體液樣品中的脂類組分水平；將所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與脂類組分的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與閾值水平的比率；和使所述的比率與缺血事件以后3年內(nèi)的死亡率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸、和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種鑒定患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自患者的體液樣品中的脂類組分；將所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與脂類組分的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與閾值水平的比率；和使所述的比率與出血的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸、和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種在接受了再灌注治療后，治療患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟使用上述的方法，鑒定再灌注治療后患者高風(fēng)險(xiǎn)出血；和用抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種在缺血事件以后，3年內(nèi)患者高風(fēng)險(xiǎn)死亡率的治療方法，該方法包括下列步驟使用上述的方法，鑒定缺血事件后，3年內(nèi)患者的高風(fēng)險(xiǎn)死亡率；和用抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種治療患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟使用上述的方法，鑒定患者高風(fēng)險(xiǎn)出血；和用抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種在非急性患者中評(píng)價(jià)長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自患者的體液樣品中的脂類組分；將所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與脂類組分的閾值水平相比較，其中的閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自患者的脂類組分水平與閾值水平的比率；和使所述的比率與死亡率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
從下面優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的另一些方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)更加清楚。


現(xiàn)在參照優(yōu)選實(shí)施方案的附圖對(duì)本發(fā)明的這些和其它的特點(diǎn)進(jìn)行描述，其目的是為了闡明而不是為了限制本發(fā)明。
圖1顯示了血液樣品中未結(jié)合的游離脂肪酸的水平，這些血液樣品來(lái)自對(duì)AMI患者的心肌梗塞溶栓療法II(TIMI II)的研究。將此研究中包括的患者在癥狀出現(xiàn)后的4小時(shí)內(nèi)送入急診室。柱形示意圖顯示了首批250位患者中每一位患者的血液中[FFAu]測(cè)量的結(jié)果，血液是在時(shí)間0(進(jìn)入急診室的時(shí)間)、50分鐘、5小時(shí)和8小時(shí)抽取的，用ADIFAB2測(cè)定。
圖2顯示了對(duì)AMI患者的TIMI II研究中的FFAu結(jié)果。柱形示意圖顯示了使用ADIFAB2測(cè)量的第二組250位患者的測(cè)量結(jié)果。這些結(jié)果實(shí)際上與圖1的首批250位患者的結(jié)果相同。
圖3顯示了在TIMI II患者中的在下列時(shí)間點(diǎn)時(shí)的肌酸激酶(CK)水平時(shí)間0(入院時(shí))(實(shí)心方塊■)、4小時(shí)(實(shí)心三角▲)。由TIMI研究者來(lái)確定相應(yīng)于組群(shipment)1和組群2的患者的數(shù)值。確定每天的測(cè)量和每個(gè)研究點(diǎn)的正常上限(空心方塊□)。
圖4顯示了TIMI II患者在入院時(shí)的死亡率隨[FFAu]值增加。在入院時(shí)對(duì)這組500位患者中大約400位抽取血液。對(duì)FFAu水平進(jìn)行分類并且確定每個(gè)四分值的死亡數(shù)目。結(jié)果產(chǎn)生了正相關(guān)，該正相關(guān)從最低到最高四分值增加了超過(guò)2倍(p＜0.042)。每個(gè)四分值的中值[FFAu]顯示在條塊中。
圖5顯示了TIMI II患者在入院時(shí)的[FFAu]與嚴(yán)重出血事件之間的關(guān)聯(lián)。顯示了FFAu水平的嚴(yán)重出血事件數(shù)目/四分值。條塊中的數(shù)目是以nM計(jì)的中值[FFAu]。結(jié)果顯示從最低到最高四分值增加了超過(guò)3倍的風(fēng)險(xiǎn)，p＜0.01。
發(fā)明詳述盡管被描述的實(shí)施方案代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在不離開本發(fā)明精神的情況下進(jìn)行修改。因此僅通過(guò)后附的權(quán)利要求來(lái)確定本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明描述了測(cè)量并非源自缺血組織的分子在血液和/或其它流體中的濃度在局部缺血的診斷和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。這些分子被稱作缺血標(biāo)志。相對(duì)于非缺血疾病，這些缺血標(biāo)志的濃度上的變化表現(xiàn)出某些缺血類型。標(biāo)記被認(rèn)為并非源自缺血組織，即使某部分可能有如此的起源，只要該部分代表出現(xiàn)在樣品中的標(biāo)志的僅一小部分，例如20％，10％，5％，2％，1％或者更少。
在一個(gè)實(shí)施方案中，缺血標(biāo)志是脂類組分例如脂肪酸?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法，例如在下面專利中教導(dǎo)的方法來(lái)確定全部脂肪酸美國(guó)專利號(hào)4,071,413，美國(guó)專利號(hào)5,512,429，美國(guó)專利號(hào)5,449,607，和美國(guó)專利號(hào)4,369,250。所有這些專利文獻(xiàn)通過(guò)參考結(jié)合于此?？梢詫⑼ㄟ^(guò)這些方法獲得的全部脂肪酸水平，與從正常個(gè)體中獲得的全部脂肪酸水平相比較，以檢測(cè)個(gè)體中的缺血疾病。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定全部脂肪酸對(duì)白蛋白的比率并將其與正常群體作比較。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用下面描述的方法在體液中測(cè)定未結(jié)合的游離脂肪酸水平。未結(jié)合的游離脂肪酸(FFAu)是溶于水相的游離脂肪酸部分。在多數(shù)體液中，游離脂肪酸(FFA)主要與蛋白質(zhì)例如白蛋白和膜相結(jié)合，很少數(shù)是未結(jié)合(FFAu)和溶于水相的。FFAu也被稱作水溶性游離脂肪酸。
體液可以選自腦脊液、血液、血清、血漿、尿液、唾液、淋巴液、胃液、間質(zhì)液或者膽汁。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于測(cè)試樣品的體液來(lái)自血液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在檢測(cè)缺血疾病的診斷方法中，可以使用任何這樣的分析手段，這些分析手段提供了相對(duì)于無(wú)癥狀群體，體液中的未結(jié)合游離脂肪酸(FFAu)水平的指征。優(yōu)選地，從沒(méi)有缺血疾病的正常群體中確定閾值。在一個(gè)實(shí)施方案中，閾值是體液中的FFAu濃度，該體液中的FFAu濃度明顯高于沒(méi)有缺血疾病的對(duì)照群體的體液中的FFAu濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，閾值是在比沒(méi)有缺血疾病的對(duì)照群體體液中的FFAu平均濃度至少高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的體液中的FFAu濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)FAu在體液中的閾值濃度至少是5nM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)FAu在體液中的閾值濃度是沒(méi)有缺血疾病的對(duì)照群體體液中FFAu平均濃度的至少2倍。
當(dāng)應(yīng)用于被選擇的患者群體時(shí)，本發(fā)明的方法特別有價(jià)值。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將方法應(yīng)用于來(lái)自局部缺血風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的樣品，這些風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體例如糖尿病患者、或者手術(shù)患者、或者具有家族或生活方式危險(xiǎn)因素的患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將方法應(yīng)用于表現(xiàn)符合局部缺血或缺血事件癥狀學(xué)的患者，或者局部缺血疑似患者?？梢赃x擇的具體患者亞群包括具有符合心臟缺血、腦缺血、腎臟缺血、肢缺血、或者其它臨床意義上的缺血的癥狀學(xué)的患者?？梢詫⒎椒ㄟx擇性地應(yīng)用于呈現(xiàn)出與一種具體類型局部缺血相符合或者不相符合的癥狀學(xué)的患者。非限制性的實(shí)例可以選自具有除了心臟缺血以外缺血癥狀的患者，或者具有除了腦缺血以外癥狀的患者，或者具有除了周圍或糖尿病相關(guān)的局部缺血以外癥狀的患者。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)幕颊呷后w，可以將本發(fā)明的方法類似地用于檢測(cè)無(wú)心肌梗塞的心臟病患者體內(nèi)的局部缺血。在本發(fā)明任何方法的實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，在具體實(shí)施方案中，患者是人。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括一個(gè)治療步驟。這樣，首先測(cè)試患者的缺血疾病，其表現(xiàn)為此處所討論的一種標(biāo)志的升高。隨后用任何適當(dāng)類型的抗缺血治療來(lái)治療具有升高水平標(biāo)志的患者，例如使用再灌注治療、抗溶血栓治療、血管生成治療、外科術(shù)或者類似方法。例如，可以有利地在缺血事件或者癥狀的10，7，5，或者3小時(shí)內(nèi)對(duì)患者進(jìn)行測(cè)試，并且可以隨后在測(cè)試的3，2，或者優(yōu)選1小時(shí)之內(nèi)接受抗缺血治療。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用熒光標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)來(lái)測(cè)量與缺血疾病相關(guān)的體液樣品中增加量的未結(jié)合游離脂肪酸(FFAu)，其方法是通過(guò)定量檢測(cè)熒光變化進(jìn)行的，這種變化與FFAu分子同熒光標(biāo)記FABP的結(jié)合相關(guān)。在血清中，游離脂肪酸(FFA)大部分與白蛋白結(jié)合，但是很少數(shù)是未結(jié)合(FFAu)和溶于水相的。本發(fā)明使用的方法主要描述于美國(guó)專利號(hào)5,470,714中，該專利文獻(xiàn)通過(guò)參考結(jié)合于此。可以使用各種FABP和熒光標(biāo)記來(lái)檢測(cè)體液如血液中的FFAu水平。它們包括但不限于，大鼠腸FABP(I-FABP)、人脂肪細(xì)胞FABP(A-FABP)和大鼠心臟FABP(H-FABP)。這些FABP的位點(diǎn)特異的突變體類型在所述方法中同樣有用，在這些所述的突變體類型中有一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)發(fā)生改變(插入、缺失、和/或取代)，包括例如在I-FABP的27，81，82，84位置的Cys取代，在I-FABP的殘基72的Ala取代，和在H-FABP的殘基27的Lys取代。FABP分子可以通過(guò)使用多種已知的標(biāo)記物進(jìn)行熒光標(biāo)記，這些標(biāo)記物包括但不限于阿奎羅丹，丹子基氮丙啶(danzylaziridine)，4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基]-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑酯(IANBDE)，和4-[N-[(2-碘乙酰氧基)乙基]-N-甲氨基-7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑(IANBDA)?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)踐中使用任何標(biāo)記物，只要其能夠在與游離脂肪酸結(jié)合的時(shí)候檢測(cè)到可以測(cè)量得到的差別。例如，可以監(jiān)測(cè)在波長(zhǎng)、信號(hào)強(qiáng)度、或者極化、或者壽命上的差別。可以使用的標(biāo)記物的另外實(shí)例包括但不限于產(chǎn)生吸光度或者旋光性改變的生色團(tuán)，和其變化可以通過(guò)電子自旋共振檢測(cè)到的自旋標(biāo)記物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記的FABP是阿奎羅丹源的重組大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白(被稱為ADIFAB)。主要使用在先前描述過(guò)的方法(美國(guó)專利號(hào)5,470,714 & Richieri，G.V，等.，J.Biol.Chem.，(1992)27623495-23501)進(jìn)行阿奎羅丹的衍生作用，而且ADIFAB可以商購(gòu)(FFA Sciences LLC，San Diego，CA.)?？梢酝ㄟ^(guò)FFAu與熒光標(biāo)記的脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的結(jié)合來(lái)確定FFAu的濃度。當(dāng)沒(méi)有FFA結(jié)合熒光標(biāo)記的FFAB時(shí)，顯示出不同的熒光?？梢詮臒晒獾牟顒e確定FFAu的濃度。熒光標(biāo)記的FABP發(fā)出的波長(zhǎng)，取決于所使用的標(biāo)記物和蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是I-FABP或者在其位置72處Ala取代Leu的I-FABP，標(biāo)記物是阿奎羅丹。這些種類分別被稱為ADIFAB和ADIFAB2。
簡(jiǎn)而言之，用如下方法獲得ADIFAB2。首先，用攜帶Ala72突變和合適互補(bǔ)末端的限制性酶切片段來(lái)替代野生型限制性酶切片段，此片段跨越I-FABP cDNA序列211位置的SalI位點(diǎn)(Alpers，等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.81313-317)和291位置的PmeI位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)特異誘變來(lái)將其引入。此突變的限制性酶切片段是通過(guò)退火部分互補(bǔ)的、攜帶所需序列的合成寡核苷酸，用DNA聚合酶Klenow片段“填補(bǔ)”單鏈區(qū)，和用SalI與PmeI消化以得到適當(dāng)末端而構(gòu)建的。將Ala72取代的I-FABP cDNA插入pET11載體中并且在BL21(DE3)株系中表達(dá)。基本使用Lowe等的方法(Lowe，等.(1987)J.Biol.Chem.2625931-5937頁(yè))純化突變的I-FABP并且每公升大腸桿菌培養(yǎng)物生產(chǎn)出大約100mg的純化蛋白質(zhì)。如前所述(見美國(guó)專利號(hào)5,470,714，通過(guò)參考結(jié)合于此)對(duì)ADIFAB進(jìn)行阿奎羅丹的衍生作用。使用Lipidex-5000色譜法來(lái)去除游離的阿奎羅丹。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ADIFAB2的結(jié)合親和力大約比ADIFAB大10倍。這些熒光標(biāo)記的FABP發(fā)出的波長(zhǎng)是大約420-470nm。結(jié)合到熒光標(biāo)記的FABP的FFA的發(fā)射波長(zhǎng)是大約495-580nm。應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地在本發(fā)明公開的分析方法中使用其它熒光標(biāo)記的FABP。
用于確定含水樣品中FFAu水平的測(cè)定方法，測(cè)量從第一波長(zhǎng)到第二波長(zhǎng)的熒光中的變化強(qiáng)度，其中在第一波長(zhǎng)時(shí)衍生的FABP在沒(méi)有FFA結(jié)合的時(shí)候發(fā)熒光，在第二波長(zhǎng)時(shí)FABP在FFA的分子被結(jié)合時(shí)發(fā)熒光；而后從兩種熒光波長(zhǎng)強(qiáng)度的比率(“R”值)來(lái)確定FFAu的濃度，如美國(guó)專利號(hào)5,470,714和Richieri，等.(1995)J.Lipid Research，36卷229-240頁(yè)中所述，這兩篇文獻(xiàn)通過(guò)參考結(jié)合于此。簡(jiǎn)單的說(shuō)，用下面的公式來(lái)計(jì)算比率 其中，I(1)和I(1)空白分別是在波長(zhǎng)“1”時(shí)，對(duì)含有ADIFAB或ADIFAB2的樣品和含有除了ADIFAB或ADIFAB2之外所有試劑的空白樣品所測(cè)的熒光強(qiáng)度；I(2)和I(2)空白分別是在波長(zhǎng)“2”時(shí)的相應(yīng)的熒光強(qiáng)度。對(duì)于ADIFAB，波長(zhǎng)“1”優(yōu)選(不是絕對(duì)的)范圍在495-515nm，波長(zhǎng)“2”在422-442nm。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)熒光強(qiáng)度的測(cè)定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，在適當(dāng)?shù)臈l件下，所述方程式中的I空白強(qiáng)度可以忽略不計(jì)。
對(duì)高過(guò)在正常健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)的體液FFAu水平的體液FFAu水平的定量檢測(cè)，可以被用于診斷缺血疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，用體液樣品中未結(jié)合或水溶的游離脂肪酸的濃度來(lái)指征缺血疾病，此濃度明顯地高于在沒(méi)有缺血疾病的對(duì)照群體的體液樣品中的未結(jié)合或水溶的游離脂肪酸的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，用體液樣品中未結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸的水平來(lái)檢測(cè)缺血疾病，此水平超出體液樣品中的未結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸平均正常水平大約2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超過(guò)約5nM的未結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸水平表現(xiàn)出缺血疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超過(guò)從非缺血群體體液樣品中確定的未結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸的平均值大約兩倍的體液樣品中的未結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸水平表現(xiàn)出缺血疾病。體液樣品中非結(jié)合或者水溶的游離脂肪酸的升高的水平也可以被檢測(cè)到，這些水平是相當(dāng)高的。
本發(fā)明的診斷方法基于這樣的發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷缺血疾病的患者，與健康個(gè)體中正常的體液FFAu水平相比，在體液如血液中具有升高的脂類例如FFAu水平。雖然診斷方法可以在任何時(shí)間進(jìn)行，但是優(yōu)選地，在缺血事件的24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，在缺血事件的10小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。最優(yōu)選地，在缺血事件的3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，這樣可以啟動(dòng)治療。為了有效，許多缺血疾病如心臟缺血的治療必須要快速啟動(dòng)(數(shù)小時(shí)之內(nèi))。沒(méi)有正確診斷的治療可能對(duì)患者是最有害的。能夠快速診斷缺血疾病是此處描述的本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
簡(jiǎn)而言之，如下進(jìn)行FFAu的分析和確定。將血樣在緩沖液中(20mMN-2-羥乙基-哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)，150mM NaCl，5mM KCl和1mM Na2HPO4，調(diào)節(jié)到pH＝7.4)稀釋100倍，產(chǎn)生大約6μM的血清白蛋白濃度。將加上ADIFAB或ADIFAB2的不含脂肪酸的白蛋白溶液作為陰性對(duì)照。對(duì)于每個(gè)供體，制備兩等分試樣的血清一個(gè)是1％血清的“背景”或者“空白”樣品，一個(gè)是1％血清加上ADIFAB或者ADIFAB2的“實(shí)驗(yàn)”樣品。在22℃或者37℃測(cè)量陰性對(duì)照，空白和實(shí)驗(yàn)樣品。
對(duì)每個(gè)樣品，對(duì)ADIFAB在大約432nm和505nm、對(duì)ADIFAB2在大約450nm和550nm收集強(qiáng)度對(duì)的多次測(cè)量，在減去空白樣品的強(qiáng)度以后確定R值。在不同的日子對(duì)每個(gè)血清樣品至少進(jìn)行兩次分別的測(cè)定，確定FFAu濃度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。為了確定測(cè)量組之間的差別的概率，使用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)者測(cè)試(Student′s test)評(píng)價(jià)平均差值，其中小于0.05的p值被認(rèn)為是有意義的。
本發(fā)明公開的用于檢測(cè)局部缺血的方法還可以包括采取措施以降低缺血標(biāo)志水平的步驟。本發(fā)明還包括一種方法，該方法通過(guò)檢測(cè)本發(fā)明所公開的局部缺血來(lái)確定局部缺血治療以后患者的預(yù)后，并且確定缺血標(biāo)志的水平是否趨向于在非缺血疾病中的水平。所公開的方法還包括與升高的缺血標(biāo)志相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，或者因?yàn)檫@些標(biāo)記的升高反映了潛在的病理狀態(tài)和/或因?yàn)檫@些缺血標(biāo)記本身是有害的。
實(shí)施例1在患有不同類型心肌缺血的、呈送到急診室(ED)的患者中，[FFAu]先于肌鈣蛋白I升高為了確定患者體內(nèi)未結(jié)合游離脂肪酸[FFAu]的濃度，我們對(duì)送到Hennepin縣醫(yī)療中心(明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州)急診室的患者的FFAu水平進(jìn)行了測(cè)量，所述的患者患有大范圍的“天然”缺血損傷。對(duì)29位患者在入院時(shí)和后來(lái)若干次抽取樣品。主要通過(guò)ST段變化，這些患者中每個(gè)人都被診斷為具有心臟缺血。對(duì)這些患者的診斷包括急性心肌梗塞(AMI)，充血性心力衰竭(CHF)，不穩(wěn)定型心絞痛、心臟挫傷、心臟手術(shù)，高血壓和可卡因誘導(dǎo)的局部缺血。在每一個(gè)診斷為患有心臟缺血的患者中，F(xiàn)FAu顯著升高，平均比正常高20倍(此研究還包括48位“正?！被颊?，這些患者的平均FFAu水平是3nM)。
在每位患者中，F(xiàn)FAu水平在最早抽取(進(jìn)入急診室)時(shí)升高，在此研究中包括9位AMI患者(表)。相反，這9位AMI患者中的7位顯示心臟標(biāo)志肌鈣蛋白I(TnI)在入院時(shí)沒(méi)有升高。在這7位患者中，TnI變高發(fā)生在入院后4-32小時(shí)。此外，多數(shù)非AMI患者沒(méi)有顯示出升高的TnI水平，這與[FFAu]在壞死前作為缺血標(biāo)志相符合。
這些結(jié)果的另一個(gè)值得注意的特點(diǎn)是沒(méi)有再灌注治療，在最初的缺血事件后，F(xiàn)FAu水平長(zhǎng)時(shí)期(達(dá)數(shù)天)保持上升(表)。這樣，F(xiàn)FAu對(duì)缺血事件響應(yīng)迅速但是緩慢地(可能由于局部缺血消退)回到基線，從而提供了獨(dú)特廣泛的診斷窗口。

(評(píng)價(jià)試驗(yàn))至于圖像在高濕度條件下的模糊(洋紅出血)，制備打印圖案，其中排列四個(gè)每個(gè)大小為3cm×3cm的洋紅正方形圖案以形成兩行和兩列的表格形狀，各個(gè)正方形圖案之間有1-mm白色間隙，在將該圖像樣品在25℃和90％RH的條件下貯存72小時(shí)后，觀察洋紅染料在白色間隙中的出血。當(dāng)如通過(guò)Status A洋紅濾色片測(cè)量，基于打印即刻后的密度白色間隙中的洋紅密度增加小于0.01時(shí)將樣品評(píng)定為A，當(dāng)為0.01-0.05時(shí)評(píng)定為B，當(dāng)大于0.05時(shí)評(píng)定為C。
獲得的結(jié)果在下表中顯示。

從表中結(jié)果可以看出，使用本發(fā)明墨水組的系統(tǒng)在洋紅出血方面優(yōu)于個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。該結(jié)果清楚地證實(shí)[FFAu]在缺血事件初期高度升高。使用5nM的截?cái)?，在入院時(shí)使用FFAu，AMI檢測(cè)的預(yù)測(cè)的靈敏度是91％(在入院和50分鐘時(shí)使用FFAu，靈敏度增加到＞98％)。結(jié)果顯示，當(dāng)包括前兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(只有第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)大于91％)在內(nèi)時(shí)，大于98％的患者的FFAu水平比正常水平高大于3標(biāo)準(zhǔn)差。
同時(shí)，在時(shí)間0的CK值通常小于正常上限(圖3)。入院時(shí)的肌酸激酶水平在小于19％的患者中升高而且即使是在這些患者中，也只是適度的增加，平均起來(lái)以小于50％的幅度超過(guò)測(cè)試正常上限。直到入院4小時(shí)以后，肌酸激酶水平才在大多數(shù)患者中充分升高。
在50分鐘，平均FFAu(22nM)充分高于已經(jīng)升高的初始值。在給予t-PA大約50分鐘后獲得這些樣品(圖1和2)。這些顯著較高的平均FFAu水平可能反映了再灌注效應(yīng)和局部缺血介導(dǎo)的[FFAu]隨時(shí)間增加而增加。無(wú)論在哪種事件中，此時(shí)間進(jìn)程似乎由于t-PA治療而發(fā)生突然變化，因?yàn)樵?和8小時(shí)的FFAu水平再灌注后顯示了明顯的降低；在8小時(shí)時(shí)的平均值顯著(p＜0.05)低于入院時(shí)的FFAu水平。這種兩相響應(yīng)似乎與再灌注相關(guān)，因?yàn)樵贖ennepin研究中的、沒(méi)有接受再灌注治療的AMI患者，顯示出[FFAu]保持升高超過(guò)24小時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些發(fā)現(xiàn)——FFAu可能響應(yīng)于再灌注而升高并且在隨后的5小時(shí)內(nèi)降低——表明FFAu水平可以被用于評(píng)價(jià)再灌注治療的成果。
這些患者的[FFAu]響應(yīng)似乎是內(nèi)在的和獨(dú)立的病理學(xué)特性。圖1和圖2揭示了在4個(gè)不同取樣時(shí)間的[FFAu]分布測(cè)量，對(duì)250位患者的2組不同的分布產(chǎn)生了實(shí)際上相同的參數(shù)；組群1和組群2中的樣品對(duì)應(yīng)兩組不同的患者。而且，基本上所有被證實(shí)有MIs的患者顯示FFAu(50分鐘)＞[FFAu](入院時(shí))，而多數(shù)沒(méi)有證實(shí)MI的大約3.3％的患者顯示[FFAu](50分鐘)≤[FFAu](入院時(shí))。
實(shí)施例3入院時(shí)在TIMI-II試驗(yàn)樣品中高水平的[FEAu]與入院后3年較高的死亡率相關(guān)入院時(shí)的[FFAu]值與超過(guò)2倍的死亡率增加相關(guān)。對(duì)在入院時(shí)間的抽取標(biāo)本的[FFAu]值(500位患者中大約400位)進(jìn)行分類并分成四等份。計(jì)算每個(gè)四分值在入院大約3年后死亡的數(shù)量，不管是什么死亡原因。死亡的主要原因是心血管疾病(75％)。結(jié)果顯示死亡率從最低到最高四分值的增加超過(guò)兩倍，p值＜0.025(圖4)。相反，在大多數(shù)這些患者中(＞80％)，作為心臟標(biāo)志的肌酸激酶在入院時(shí)間是正常的(圖3)。此外，[FFAu]值與年齡、性別、種族、重量、其它疾病、藥療方法或者入院時(shí)的收縮期血壓不相關(guān)。這些結(jié)果顯示除了它們的其它診斷特性，在進(jìn)入急診室時(shí)測(cè)量的FFAu水平，可以依照患者的致死性風(fēng)險(xiǎn)將其用于患者的劃分(Kleinfeld，等.(2002)J.Am.Coll.Cardiol.39312A)。
實(shí)施例4.在入院時(shí)TIMI-II試驗(yàn)樣品中高水平的[FFAu]與t-PA治療后嚴(yán)重出血率的增加相關(guān)入院時(shí)的[FFAu]同時(shí)還能預(yù)測(cè)t-PA治療以后增加的嚴(yán)重出血事件率。對(duì)嚴(yán)重出血事件所進(jìn)行的分析與對(duì)死亡率所進(jìn)行的分析(實(shí)施例3)類似。對(duì)每個(gè)四分值確定經(jīng)歷嚴(yán)重出血事件的患者的數(shù)目(圖5)。結(jié)果顯示在入院時(shí)(t-PA開始給予之前)，從最低到最高[FFAu]值分布的四分值，嚴(yán)重出血事件率的增加超過(guò)3倍，p＜0.01。這些結(jié)果引起的一個(gè)最大可能性是如果降低FFAu水平，可能會(huì)降低t-PA介導(dǎo)的出血率。
雖然圖4和5的結(jié)果沒(méi)有顯示是否升高的FFAu水平會(huì)直接、獨(dú)立地導(dǎo)致死亡率和出血率的增加，充分的體外研究工作證實(shí)升高的FFA是許多細(xì)胞功能的有效干擾物。另外，許多研究工作強(qiáng)烈提示了FFA直接作用的臨床證據(jù)，這些研究工作針對(duì)其致心律失常作用及其在心血管疾病中的潛在作用。來(lái)自我們TIMI II試驗(yàn)中的結(jié)果同時(shí)提示[FFAu]是不利結(jié)果的強(qiáng)獨(dú)立因素。因此，[FFAu]并不是簡(jiǎn)單地反應(yīng)這個(gè)患者群體的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)；沒(méi)有觀察到例如年齡、性別、種族或者重量的相關(guān)性。而且，[FFAu]在入院時(shí)與死亡率和出血事件的相關(guān)性似乎是獨(dú)立的；盡管經(jīng)歷過(guò)嚴(yán)重缺血事件的患者死亡率較高(對(duì)所有患者22％比11％)，但是只有15％的死亡是由出血引起的。
實(shí)施例5.缺血患者的FFA血液水平不源自缺血組織人體中的腦缺血和心肌缺血，引起血漿FFA的水平增加超過(guò)正常的7倍(Kleinfeld，等.(1996)Amer.J.Cardiol.781350-1354；Kurien，等.(1966)The Lancet 16122-127；Oliver，等.(1994)The Lancet 343155-158)。同樣眾所周知，F(xiàn)FA在缺血組織的細(xì)胞內(nèi)累積，至少在分離出來(lái)的器官中累積(Bazan，等.(1970)Biochim.Biophys Acta 2181-10；Van der Vusse，等.(1997)Prostaglandins，Leukotrienes和Essential Fatty Acids 5785-93)。但是缺血組織產(chǎn)生的FFA不是在局部缺血中觀察到的血漿FFA增加的原因。這是因?yàn)槿毖M織產(chǎn)生的FFA的量與正常血漿FFA水平相比，即使是在整個(gè)器官完全缺血的條件下也是可以忽略不計(jì)的，更不要說(shuō)在缺血患者中觀察到超過(guò)7倍的增加。例如，在正常條件下，血漿FFA的每?jī)煞昼姼乱淮?，?正常)血漿中大約500μM的全部[FFA]每分鐘轉(zhuǎn)化成為大約0.2g的FFA。缺血組織中產(chǎn)生的FFA源自磷脂(Bazan，等.(1970)Biochim.Biophys Acta 2181-10；Goto，等.(1988)Stroke 19728-735；Jones等.(1989)Am.J.Pathol.135541-556)，其含有小于1％典型(非脂肪)細(xì)胞(濕)重量。因此，在全部FFA高于正常水平2-7倍的缺血疾病情況下，超過(guò)20g/分鐘的組織將被用于維持觀察水平的FFA。這與生命現(xiàn)象不符合而且表明血漿FFA的增加源自非缺血組織。
在完全腦缺血(斷頭處理)的具體實(shí)例中，經(jīng)30分鐘時(shí)間累積在大鼠腦中的全部FFA量是大約0.8微摩爾(Ikeda，等.(1986)J.Neurochem.47123-132)。在300g大鼠中的血漿FFA總量超過(guò)5微摩爾(＞500μM FFA的10ml血漿)。在可逆大腦中動(dòng)脈局部缺血的大鼠模型中(比斷頭處理的缺血損傷程度輕得多)，總血漿FFA增加了大約2倍，并為此每2分鐘向血漿中加入額外的5微摩爾FFA或者在30分鐘內(nèi)加入額外的大約75微摩爾FFA。這樣，與將血漿水平提高到局部缺血中觀察到的水平所需的FFA量相比較，完全局部缺血在30分鐘內(nèi)產(chǎn)生的這0.8微摩爾FFA是可以忽略的。具有足夠能力產(chǎn)生在腦缺血中觀察到的大量FFA的最可能的組織來(lái)源是脂肪組織。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在腦缺血增加的數(shù)分鐘內(nèi)觀察到了血漿水平的TNFα——一種有效的脂肪溶解活化劑(Ryden，等.(2002)J.Biol.Chem.2771085-1091)而且TNFα與FFAu在血漿中的增加非常相關(guān)。
本發(fā)明的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不離開本發(fā)明的精神的情況下可以作出大量且不同的修改。因此，應(yīng)該清楚地理解，本發(fā)明的形式僅僅是說(shuō)明性的并且不是為了限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出局部缺血的疾病的方法，其包括下列步驟(a)測(cè)量來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的流體的測(cè)試樣品中的缺血標(biāo)志的水平；和(b)確定是否在所述測(cè)試樣品中測(cè)量到的所述缺血標(biāo)志的水平與所述哺乳動(dòng)物中的局部缺血相關(guān)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的哺乳動(dòng)物是人。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的流體選自血液、血清、血漿、唾液、膽汁、胃液、腦脊液、淋巴液、間質(zhì)液和尿液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的流體是血液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的缺血標(biāo)志是脂類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的脂類是脂肪酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的脂類選自鞘脂類、溶脂類、糖脂、類固醇、和類花生酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的脂類選自鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、鞘氨醇-1-磷酸酯、鞘氨基磷酸膽堿、和二氫鞘氨醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中心臟是局部缺血的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腦是局部缺血的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中腎臟是局部缺血的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中肢是局部缺血的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所測(cè)量的缺血標(biāo)志是溶于含水緩沖液的。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所測(cè)量的缺血標(biāo)志是不溶于含水緩沖液的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)UV/VIS、紅外線、微波、射線、吸收或者發(fā)射分光鏡來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用色譜分析程序來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的色譜分析程序選自HPLC、低壓色譜法、中壓色譜法、和氣相色譜法。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)使用自旋標(biāo)記物的電子自旋共振來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)抗體或者受體分子、免疫分析或者酶分析來(lái)檢測(cè)缺血標(biāo)志。
20.權(quán)利要求1的方法，其還包括對(duì)呈現(xiàn)局部缺血癥狀的哺乳動(dòng)物進(jìn)行選擇這一初始步驟。
21.權(quán)利要求1的方法，其還包括這一步驟如果缺血標(biāo)志的水平與所述哺乳動(dòng)物的局部缺血相關(guān)，則給予抗缺血治療。
22.權(quán)利要求21的方法，其中的抗缺血治療包含一種降低血清脂肪酸水平的方法。
23.權(quán)利要求21的方法，其中的抗缺血治療是再灌注治療、抗溶血栓治療、血管生成治療或者外科手術(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的確定步驟是比較所述缺血標(biāo)志的所測(cè)水平與所述標(biāo)記水平的預(yù)定值。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述標(biāo)志的水平的所述預(yù)定值表現(xiàn)出非缺血疾病。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的確定局部缺血的方法，其中的缺血標(biāo)志是未結(jié)合的或者溶于水的游離脂肪酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中通過(guò)使用結(jié)合脂肪酸的蛋白質(zhì)來(lái)檢測(cè)未結(jié)合的或者溶于水的游離脂肪酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述的結(jié)合未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的蛋白是發(fā)熒光的，而且在脂肪酸被結(jié)合時(shí)與脂肪酸未被結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出不同的熒光。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中的蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)家族中的一種，該家族蛋白質(zhì)的分子量在約13,000和16,000道爾頓之間。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中的FABP是大鼠腸FABP。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中使用阿奎羅丹在位置27共價(jià)標(biāo)記FABP。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中阿奎羅丹標(biāo)記的FABP是亮氨酸72到丙氨酸的突變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中比從非缺血群體中確定的未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的水平的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
34.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中比從非缺血群體中確定的未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的水平的平均值高大約2倍的未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
35.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中大于大約5nM的未結(jié)合或者溶于水的游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中的蛋白質(zhì)是白蛋白。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中用7-羥基香豆素或者氨茴酰來(lái)共價(jià)標(biāo)記白蛋白。
38.根據(jù)權(quán)利要求25的確定局部缺血的方法，其中的缺血標(biāo)志是全部游離脂肪酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸的水平的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的全部游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸的水平的平均值高大約2倍的全部游離脂肪酸的水平表現(xiàn)出缺血疾病。
41.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中的缺血標(biāo)志是全部脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率的平均值高出2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差單位的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率表現(xiàn)出缺血疾病。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，比從非缺血群體中確定的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率的平均值高大約2倍的全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率表現(xiàn)出缺血疾病。
44.一種方法，該方法通過(guò)檢測(cè)如在權(quán)利要求26中的局部缺血并且確定所述缺血標(biāo)志的水平是否趨向于所述標(biāo)志在非缺血疾病中的水平來(lái)確定患者對(duì)局部缺血治療的反應(yīng)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述的治療是再灌注治療。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述的再灌注治療包含血管成形術(shù)。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述的再灌注治療包含給予血栓溶解劑。
48.一種在接受再灌注治療以后，鑒定患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自所述患者的體液樣品中的一種脂類組分的水平；將所測(cè)的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與一個(gè)脂類組分的閾值水平相比較，其中的所述閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的一種脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與所述閾值水平的比率；和使所述的比率與再灌注治療后出血的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。
49.一種鑒定在缺血事件以后，患者在3年內(nèi)高風(fēng)險(xiǎn)死亡率的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自所述患者的體液樣品中的脂類組分水平；將所測(cè)的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與一個(gè)脂類組分的閾值水平相比較，其中的所述閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與閾值水平的比率；和使所述的比率與缺血事件以后3年內(nèi)的死亡率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。
50.一種鑒定患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自所述患者的體液樣品中的一種脂類組分；將所測(cè)的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與一種脂類組分的閾值水平相比較，其中的所述閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的一種脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與所述閾值水平的比率；和使所述的比率與出血的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。
51.權(quán)利要求48的方法，其中的所述脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
52.權(quán)利要求49的方法，其中的所述脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
53.權(quán)利要求50的方法，其中的所述脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸、全部游離脂肪酸和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
54.一種治療在接受了再灌注治療后，患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟使用權(quán)利要求48的方法，鑒定再灌注治療后患者高風(fēng)險(xiǎn)出血；和用一種抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。
55.一種治療在缺血事件以后，在3年內(nèi)患者高風(fēng)險(xiǎn)死亡率的方法，該方法包括下列步驟使用權(quán)利要求49的方法，鑒定缺血事件后3年內(nèi)患者高風(fēng)險(xiǎn)死亡率；和用一種抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。
56.一種治療患者高風(fēng)險(xiǎn)出血的方法，該方法包括下列步驟使用權(quán)利要求50的方法，鑒定患者高風(fēng)險(xiǎn)出血；和用一種抗缺血治療來(lái)治療所述的高風(fēng)險(xiǎn)患者。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述的抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
58.權(quán)利要求55的方法，其中所述的抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述的抗缺血治療選自葡萄糖-胰島素-鉀組合物和白蛋白組合物。
60.一種在非急性患者中評(píng)價(jià)長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括下列步驟測(cè)定來(lái)自所述患者的一種體液樣品中的一種脂類組分水平；將所測(cè)的來(lái)自所述患者的脂類組分水平與一種脂類組分的閾值水平相比較，其中的所述閾值水平由測(cè)定沒(méi)有局部缺血的正常群體體液中的一種脂類組分而確定；確定所測(cè)得的來(lái)所述自患者的脂類組分水平與所述閾值水平的比率；和使所述的比率與死亡率的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，使高比率指征高風(fēng)險(xiǎn)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述的脂類組分選自未結(jié)合的游離脂肪酸和全部游離脂肪酸對(duì)白蛋白的比率。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)量分子濃度來(lái)診斷和監(jiān)測(cè)包括但不限于心肌缺血和腦缺血的局部缺血，所述分子并非是來(lái)自缺血組織，但其在血液和其它流體中的濃度由于局部缺血狀態(tài)而改變。
文檔編號(hào)G01N21/78GK1630818SQ02802866
公開日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2002年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者艾倫·克萊費(fèi)爾德 申請(qǐng)人:艾倫·克萊費(fèi)爾德