專利名稱：氫自由基的檢測方法和定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水、特別是電解還原水或水溶液中氫自由基的檢測方法、和氫自由基濃度地定量分析方法。
背景技術(shù)：
由氫氧化鈉等電解質(zhì)溶液電解、在陰極室得到的所謂電解還原水一直被認(rèn)為在人體內(nèi)具有消除活性氧的活性和抑制DNA鏈切斷的活性。據(jù)認(rèn)為這是由于電解還原水中所含的活性氫的還原性引起的。
由于電解還原水中所含的氫自由基濃度對人體內(nèi)消除活性氧的活性有影響，因此需要確立氫自由基的檢測方法和定量分析方法。
這里的“活性氫”是指容易由紫外線照射或放電等方法發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成的氫自由基，在酸作用于金屬或電解時從陰極側(cè)產(chǎn)生的氫也是反應(yīng)性高的氫自由基?；钚詺涫菇饘購膲A金屬鹽中游離出來，并且容易使各種金屬元素的氧化物、硫化物等還原為金屬。還與砷、磷、氧、鹵素、銻、錫等形成氫化物；與一氧化碳和二氧化碳形成甲醛。還與各種有機(jī)化合物發(fā)生加成、置換、氫原子消去反應(yīng)，向不飽和有機(jī)化合物加氫。氫自由基雖然本身較為穩(wěn)定，但是一旦接觸金屬表面就會非常容易放出很多的熱，變回通常的分子。
它的檢測方法有利用高濃度時的壓力差或微量時氧化鎢的變色等。但是，在氣體中產(chǎn)生時的檢測方法不能用于測定水中的氫自由基。如果能用水溶性的自由基俘獲劑捕獲氫自由基來將其檢測和定量，就能證明電解還原水中存在氫自由基，從而發(fā)展旨在確立檢測法和定量法的研究。
用電子自旋共振裝置(ESR)僅測定水試樣、或使水溶性自由基俘獲劑5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)與水溶液試樣反應(yīng)后測定ESR光譜，看不到氫自由基的光譜。
而用芬頓(Fenton)試劑產(chǎn)生氫氧根從而由ESR光譜確定因水溶液試樣的還原性而引起的氫氧根減少，則看不到明顯的差異。據(jù)認(rèn)為這是由于電解還原水中氫自由基的濃度低，所以難以用檢測靈敏度低的方法檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了高精度地檢測存在于水或水溶液中的氫自由基的方法和對其定量分析的方法。發(fā)明人嘗試將大量水試樣中和，使其與自由基俘獲劑3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)反應(yīng)，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯示出消除活性氧的活性的電解還原水試樣中呈現(xiàn)出橙色的著色。而超純水(Milli Q水)或其它礦泉水或工業(yè)用水卻未看到著色。據(jù)認(rèn)為這是由于DBNBS與電解還原水中的活性氫新反應(yīng)產(chǎn)生著色物質(zhì)的緣故。認(rèn)為利用這種現(xiàn)象就能高精度地檢測水溶液中的氫自由基，并開發(fā)了氫自由基檢測法和定量分析法。本發(fā)明基于上述認(rèn)識，提供了在電解還原水中使用自由基俘獲劑3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)來檢測氫自由基的方法和對其定量分析的方法。
本發(fā)明是水或水溶液中氫自由基的檢測方法，它包括在試樣中加入3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(以下稱為DBNBS)，使其與氫自由基反應(yīng)生成DBNBS偶氮化合物，通過由該化合物的吸收特性所產(chǎn)生的著色來檢測氫自由基。
所述的水或水溶液適合使用電解還原水。
所述的著色利用的是3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)與氫自由基反應(yīng)生成DBNBS偶氮化合物的著色反應(yīng)。因此，著色是由于波長426～450納米處的吸收峰而產(chǎn)生的。
本發(fā)明還是包括以下(1)～(4)步驟的水或水溶液中定量分析氫自由基的方法。
(1)于鉑黑的存在下，以恒定(constant)的速度向517納米附近有吸收峰的1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)溶液和3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)的溶液中吹入氫氣，繪出517納米附近的吸光度減少與氫氣吹入時間的相關(guān)曲線(繪制標(biāo)定曲線A)。
(2)使半胱氨酸與DPPH反應(yīng)，繪出517納米附近DPPH的吸光度減少與半胱氨酸濃度的相關(guān)曲線(繪制標(biāo)定曲線B)。這里除了半胱氨酸以外也可用抗壞血酸等還原劑。
(3)在和前述(1)相同的條件下，于鉑黑的存在下，以恒定的速度向3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)溶液中吹入氫氣一定時間后，測定450納米附近的吸光度，繪出該吸光度值與由標(biāo)定曲線A和標(biāo)定曲線B算出的每單位氫氣吹入時間內(nèi)氫自由基產(chǎn)生濃度的相關(guān)曲線(繪制標(biāo)定曲線C)。
(4)在試樣中加入3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)，測定450納米附近的吸光度，由該吸光度值從前述標(biāo)定曲線C讀取氫自由基的濃度。
這里的水或水溶液最好濃縮至10～500倍的氫自由基濃度。
下面，基于本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。
本發(fā)明中的氫自由基檢測方法利用的是基于以下所示的反應(yīng)的吸光特性。即，3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)與氫自由基反應(yīng)生成DBNBS偶氮化合物。DBNBS偶氮化合物在波長425～450納米處有吸收峰，因此能通過它的著色來檢測氫自由基。
如反應(yīng)式所示，DBNBS(式A)與水或水溶液中的氫自由基反應(yīng)生成DBNBS-H·(式B)，它的兩個分子反應(yīng)成二聚體(式C)。然后在加熱下脫水生成DBNBS氧化偶氮化合物(式D)。再脫去一個氧而生成穩(wěn)定的DBNBS偶氮化合物。通過檢測由該DBNBS偶氮化合物產(chǎn)生的425～450納米處的吸收，就能對氫自由基進(jìn)行定性分析。上述式A～式E的一系列反應(yīng)雖然是由本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)的新反應(yīng)，但由硝基苯和亞硝基苯的還原反應(yīng)來生成氧化偶氮苯和偶氮苯的類似反應(yīng)是已知的。(A.Streitwieser，Jr.&C.H.HeathcockIntroduction to Organic Chemistry，第960～965頁，Macmillan Publishing co.，Inc.，紐約(1976))。氧化偶氮苯與偶氮苯可由氧化還原反應(yīng)而相互轉(zhuǎn)化。
下面用以下方法對水或水溶液中的氫自由基進(jìn)行定量分析。
DPPH是在517納米附近的波長處具有特殊吸收的穩(wěn)定自由基。DDPH與氫自由基定量地反應(yīng)，517納米附近的吸收消失。另一方面，粒狀鉑黑具有大的表面積，使氣體狀的氫分子轉(zhuǎn)化為氫自由基(原子狀氫)并保持該狀態(tài)。因此，通過在鉑黑的存在下將氫氣吹入溶液中，能容易地產(chǎn)生氫自由基。通過在鉑黑的存在下于一定條件下將氫氣吹入給定濃度的DPPH水溶液中，就可繪出表明該吹入時間與517納米附近DPPH的吸光度減少之間關(guān)系的標(biāo)定曲線(A)。
然后，為了算出每單位氫氣吹入時間內(nèi)的氫自由基產(chǎn)生濃度，使已知的定量反應(yīng)的還原性物質(zhì)(例如半胱氨酸)和DPPH反應(yīng)，繪出表明半胱氨酸濃度與517納米附近DPPH的吸光度減少之間關(guān)系的標(biāo)定曲線(B)。假定1摩爾的半胱氨酸與1摩爾的氫自由基相當(dāng)，由標(biāo)定曲線(A)算出每單位氫氣吹入時間內(nèi)所產(chǎn)生的氫自由基濃度。
另一方面，如前所述的DBNBS(式A)與氫自由基反應(yīng)，經(jīng)式B的二羥基中間體(DBNBS-H·)及其二聚體(式C)生成DBNBS偶氮化合物(式D)。于是就可將該DBNBS偶氮化合物的450納米附近的特殊吸收用于定量分析中。如前所述，在鉑黑的存在下吹入氫氣時產(chǎn)生氫自由基，因此通過求出450納米附近的吸光度與氫氣吹入時間之間的關(guān)系，利用標(biāo)定曲線(A)和標(biāo)定曲線(B)，就能繪出表明450納米附近吸光度與氫自由基濃度之間關(guān)系的標(biāo)定曲線(C)。
為求出試樣中的氫自由基濃度，在試樣溶液中加入給定濃度的DBNBS，使DBNBS與氫自由基反應(yīng)生成DBNBS偶氮化合物，然后測定其在450納米附近的吸光度，由前述標(biāo)定曲線(C)測定氫自由基濃度。
在用電解還原水作為試樣時，最好將其濃縮至10～500倍后再使用。例如，在125毫升電解還原水中，加入200微升的DBNBS保存液，攪拌后，在60℃的恒溫槽中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮干燥。將濃縮干燥物溶解于1毫升超純水(Milli Q水)中并回收。然后在60℃的恒溫槽中保溫約1小時，于冰上靜置5分鐘，以例如12000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心分離，獲得上層清液。
附圖簡述


圖1是BNBS偶氮化合物的吸收特性曲線圖。
圖2是表明450納米處吸光度與氫氣吹入時間之間關(guān)系的曲線圖。
圖3是表明電解還原水與氫自由基反應(yīng)值之間關(guān)系的曲線圖。
圖4是表明氯化鈉濃度與氫自由基反應(yīng)值之間關(guān)系的曲線圖。
圖5是DBNBS非加熱處理反應(yīng)物的HPLC(高效液相色譜)測定結(jié)果圖。
圖6是DBNBS非加熱處理反應(yīng)物的紫外可見吸收光譜圖。
圖7是DBNBS加熱處理反應(yīng)物的HPLC測定結(jié)果圖。
圖8是DBNBS加熱處理反應(yīng)物的紫外可見吸收光譜圖。
圖9是DBNBS非加熱處理反應(yīng)物的質(zhì)譜測定圖。
圖10是DBNBS加熱處理反應(yīng)物的質(zhì)譜測定圖。
圖11是DBNBS非加熱處理反應(yīng)物的NMR光譜測定圖。
圖12是DBNBS加熱處理反應(yīng)物的NMR光譜測定圖。
圖13是顯示標(biāo)定曲線A的曲線圖。
圖14是顯示標(biāo)定曲線B的曲線圖。
圖15是小時標(biāo)定曲線C的曲線圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式
實(shí)施例1用DBNBS檢測由鉑黑-氫所產(chǎn)生的氫自由基
1-1試劑
DBNBS由Labo Tech株式會社制造，鉑黑由石福金屬礦業(yè)(株)制造，氫氣由大洋Sanso株式會社制造。將DBNBS以2.5毫克/毫升的濃度溶解于超純水(Milli Q水)中，在4℃下保存，在2周內(nèi)用完。
1-2由鉑黑-氫產(chǎn)生氫自由基
氫氣在鉑表面上成為原子狀氫。然后，向20毫升含有0.01毫克/毫升鉑黑的2.5毫克/毫升DBNBS溶液以45毫升/分鐘吹入氫氣。在5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘后各回收200微升，以12000轉(zhuǎn)/分離心分離5分鐘后，將上層清液于60℃恒溫槽中保溫1小時。用未吹入氫氣的物質(zhì)作為參照物，于60℃下保溫處理1小時。
1-3氫自由基的檢測
將反應(yīng)后的參照物的DBNBS水溶液標(biāo)定為DBNBS本身的吸光度為0，掃描各DBNBS試樣的350～600納米的波長得到示差譜。該示差譜的測定用于檢測出DBNBS由鉑黑-氫處理而轉(zhuǎn)變成新的物質(zhì)。為調(diào)查由鉑黑-氫處理而生成的氫自由基與DBNBS是否發(fā)生特殊反應(yīng)，還僅用鉑黑、僅用氫氣、僅用氮?dú)?、以及用鉑黑-氮?dú)馓幚碓嚇印?br> 由鉑黑-氫反應(yīng)得到的DBNBS偶氮化合物試樣的吸收光譜如圖1(Pt-H2)所示，顯示出從425納米到450納米有峰的光滑可見吸收光譜。該試樣著色為橙色。這說明DBNBS由鉑黑-氫處理成為新的橙色物質(zhì)、即DBNBS偶氮化合物。它的峰高如圖2所示，隨著吹入的氫氣量而增加，在45分鐘吹入時達(dá)到最大，然后減少。
為調(diào)查鉑黑-氫反應(yīng)的特殊性而僅用鉑黑、僅用氫氣、僅用氮?dú)?、以及用鉑黑-氮?dú)馓幚淼脑嚇尤繘]有顯示出顏色，紫外部吸收中也沒有看到波形變化。與氫自由基反應(yīng)而得的物質(zhì)的吸收光譜中450納米處的吸光值即為氫自由基反應(yīng)值(AH值)。
實(shí)施例2用DBNBS檢測電解還原水中的氫自由基
2-1試劑
使用和實(shí)施例1相同的物質(zhì)。
2-2電解還原水
用日本Trim公司制造的電解還原水裝置TI-8000，以4級(5A)電解還原0.01％NaCl水，在陰極側(cè)得到電解還原水。
2-3氫自由基的檢測
在125毫升電解還原水中，加入200微升DBNBS保存液，攪拌后，在60℃恒溫槽中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮干燥。將濃縮干燥物溶解于1毫升的超純水(Milli Q水)中并回收。然后在60℃恒溫槽中保溫1小時，于冰上靜置5分鐘，以12000轉(zhuǎn)/分離心分離，得到上層清液。把同樣用上述超純水處理的DBNBS試樣作為參照物進(jìn)行標(biāo)定，掃描DBNBS試樣在350～600納米的波長，得到示差譜。
確定電解還原水的光譜和實(shí)施例1求得的吸收光譜相同(圖1電解還原水)，由此確定電解還原水中存在氫自由基。
實(shí)施例3電解還原水的濃度與氫自由基反應(yīng)值之間的關(guān)系、以及電解強(qiáng)度與氫自由基反應(yīng)值之間的關(guān)系
對電解還原水的濃度與氫自由基量是否具有相關(guān)關(guān)系進(jìn)行試驗(yàn)。用超純水(Milli Q水)稀釋電解還原水，以測定各試樣的氫自由基反應(yīng)值。為調(diào)查電解強(qiáng)度與氫自由基反應(yīng)值之間的關(guān)系，準(zhǔn)備NaCl濃度從0.0001％到0.01％的水，分別測定各試樣在電解還原后的水的活性氫反應(yīng)。電解還原水是用日本Trim公司制造的電解還原水裝置TI-8000以4級(5A)電解還原而成的在陰極側(cè)得到的還原水。
在通過稀釋制成電解還原水的體積百分?jǐn)?shù)為25、50、75、100％的水以測定氫自由基反應(yīng)值時，如圖3所示，氫自由基反應(yīng)值隨電解還原水的濃度而上升，由此可知該測定體系即使在電解還原水試樣中也有定量性。為了通過在由電解得到電解還原水時改變電解強(qiáng)度而制成的水溶液，通過改變水溶液的鹽濃度(NaCl濃度)而得的電解還原水如圖4所示，其氫自由基反應(yīng)值也隨電解強(qiáng)度(NaCl濃度)而上升。這意味著電解強(qiáng)度越強(qiáng)，氫自由基產(chǎn)生得也越多。
實(shí)施例4氫自由基與DBNBS的反應(yīng)過程分析
4-1試劑
DBNBS由Labo Tech株式會社制造，鉑黑由石福金屬礦業(yè)(株)制造，氫氣由大洋Sanso株式會社制造。
4-2 DBNBS的反應(yīng)
在20毫升含有0.01毫克/毫升鉑黑的2.5毫克/毫升DBNBS溶液中，以45毫升/分鐘的吹入速度吹入氫氣1小時，將不經(jīng)加熱處理、以及在60℃下經(jīng)加熱處理1小時的所得物質(zhì)用冰冷卻，使反應(yīng)停止，用由此所得的物質(zhì)作為分析試樣。
4-3分析試樣的調(diào)整
(1)高效液相色譜(HPLC)分析試樣
將分析試樣分別用0.45微米的過濾器過濾，取2000微升使用。
(2)NMR(核磁共振)、TOF-MASS(飛行時間質(zhì)譜)分析中的分析試樣
用乙酸酐(和光純藥株式會社制)將由HPLC分離的非加熱處理的反應(yīng)中間體乙?；?，從而使之穩(wěn)定，并將通過加熱處理而分離的偶氮化合物再次HPLC分離，使分離度完全。
(3)微量元素分析中的分析試樣
非加熱處理的反應(yīng)中間體用經(jīng)HPLC分離的試樣，加熱處理分離的偶氮化合物用和NMR、TOF-MASS分析相同的試樣。
4-4儀器測定條件
(1)HPLC使用Waters公司的Waters 600E，流動相使用Milli-Q水，流速為5毫升/分鐘，注入量是用Waters 717自動采樣機(jī)采取2000微升，柱使用Waters公司制造的Nova-Pak C18 19*300毫米。檢測器使用Waters公司的Waters 996光二極管陣列檢測器在20-600納米的波長領(lǐng)域內(nèi)以1.2納米的間隔采集數(shù)據(jù)。用Compaq V7000個人計(jì)算機(jī)，通過Millennium 32(Waters公司)制作的程序，進(jìn)行光譜色譜圖的分析。
(2)TOF-MASS分析儀使用Voyager(Perceptive，Biosystems公司制造)。Voyager是裝有氮激光(337納米)、加速電壓為20千伏的激光電離化飛行時間質(zhì)譜儀。加速電壓使用20千伏，從而在飛行模式為線型模式下進(jìn)行分析?；|(zhì)使用1.3毫克2-(4-羥基-苯基偶氮)-苯甲酸(HABA)(Aldrich Chemical公司制)溶解于1毫升50∶50水·乙腈中形成的溶液。在試樣載片上涂布0.5微升的試樣，經(jīng)自然干燥后，加入等量的基質(zhì)溶液，再次自然干燥，將其導(dǎo)入離子源。
(3)NMR使用400兆赫NMR(JEOL JNM-GSX400 NMR系統(tǒng)分光計(jì))進(jìn)行1H-NMR測定。溶劑使用二甲亞砜(DMSO)(和光純藥株式會社制)和重水(D2O)(AldrichChemical公司制)。
4-5分析結(jié)果
(A)高效液相色譜(HPLC)測定結(jié)果
(i)分析試樣(1)
在20毫升含有0.01毫克/毫升鉑的2.5毫克/毫升DBNBS溶液中，以45毫升/分鐘的吹入速度吹入氫氣，用0.45微米的過濾器過濾，由裝有光二極管陣列檢測器的HPLC測定該非加熱處理試樣的2000微升。其測定結(jié)果示于圖5。由圖5可知非加熱處理DBNBS反應(yīng)物的保持時間約為9.0分鐘，它的峰如圖6的紫外可見吸收峰所示，在220納米處顯示出吸收峰，在450納米處不顯示出吸收峰，這可推定為相當(dāng)于式C所示的二聚體。
(ii)分析試樣(2)
在20毫升含有0.01毫克/毫升鉑的2.5毫克/毫升DBNBS溶液中，以45毫升/分鐘的通氣速度吹入氫氣，于60℃下加熱處理1小時，用冰冷卻使反應(yīng)停止，將所得物質(zhì)用0.45微米的過濾器過濾，由裝有光二極管陣列檢測器的HPLC測定該加熱處理試樣的2000微升。其測定結(jié)果示于圖7。由圖7可知加熱處理DBNBS反應(yīng)物的保持時間約為8.5分鐘，它的峰如圖8的紫外可見吸收峰所示，在320納米和450納米處都可看到吸收峰，顯示出類似于已知的偶氮苯的紫外吸收峰。這相當(dāng)于式E所示的DBNBS偶氮化合物。
(B)質(zhì)譜(基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜，MALDI-TOF-MS)的測定結(jié)果
(i)分析試樣(1)
用質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定上述HPLC測定中得到的、在280納米處有吸收峰的非加熱處理的DBNBS反應(yīng)物。
乙?；挠?80納米處有吸收峰的非加熱處理DBNBS反應(yīng)物的質(zhì)譜圖如圖9所示，在675.449處顯示出離子峰，這與中間體(式C)上脫去Br和Na各一個、式C的中間體的一個羥基經(jīng)乙酰化而得的物質(zhì)相一致。
(ii)分析試樣(2)
用質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測定上述HPLC測定中得到的、在450納米處有吸收峰的加熱處理的DBNBS反應(yīng)物。
于450納米處有吸收峰的加熱處理的DBNBS反應(yīng)物的質(zhì)譜圖如圖10所示，在656.329處顯示出離子峰，與脫去2個Na的DBNBS偶氮化合物(式E)相一致。
(C)NMR測定結(jié)果
(i)分析試樣(1)
用1H-NMR測定上述HPLC測定中得到的、在280納米處有吸收峰的非加熱處理DBNBS反應(yīng)物，其測定結(jié)果示于圖11。由圖11可知乙?；挠?80納米處有吸收峰的非加熱處理的DBNBS反應(yīng)物的光譜圖。同樣地由HPLC分離來采集作為參照物的乙?；兴玫囊宜狒?，對其進(jìn)行測定。參照物乙酸酐的甲基在2.5ppm顯示出信號，與之相比，在化學(xué)位移2.0ppm顯示出存在甲基，由此說明非加熱處理的DBNBS反應(yīng)物的羥基與乙酸酐直接發(fā)生反應(yīng)。
(ii)分析試樣(2)
用1H-NMR測定上述HPLC測定中得到的、在450納米處有吸收峰的加熱處理DBNBS反應(yīng)物，其測定結(jié)果示于圖12。與DBNBS在8.0ppm處顯示出一條峰相比，在450納米處有吸收峰的加熱處理DBNBS反應(yīng)物的質(zhì)子和化學(xué)位移在6.6～6.8ppm，6.7575ppm和6.634ppm處的信號都再分裂成左右各一條的對稱信號。這說明形成偶氮基時，間位的質(zhì)子是不對稱的，而且質(zhì)子間產(chǎn)生偶聯(lián)。
(D)微量元素分析結(jié)果
(i)分析試樣(1)
對上述HPLC測定中得到的、在220納米處有吸收峰的非加熱處理DBNBS反應(yīng)物進(jìn)行微量元素分析，測得碳含量為19.93％(計(jì)算值為19.35％)、氫含量為1.61％(計(jì)算值為1.61％)、氮含量為3.76％(計(jì)算值為3.76％)。這和中間體的三水合物上脫去2個Na所得的物質(zhì)相一致。
(ii)分析試樣(2)
對上述HPLC測定中得到的、在450納米處有吸收峰的加熱處理DBNBS反應(yīng)物進(jìn)行微量元素分析，測得碳含量為21.53％(計(jì)算值為21.43％)、氫含量為1.73％(計(jì)算值為1.79％)、氮含量為3.84％(計(jì)算值為4.17％)。這和中間體的四水合物上脫去Br和Na各一個所得的物質(zhì)相一致。
實(shí)施例5氫自由基的定量分析
5-1繪制標(biāo)定曲線A(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)與氫氣吹入時間之間的關(guān)系)
在1.96毫升0.1M乙酸緩沖液(pH5.5)中，加入乙醇和0.5mM DPPH的DPPH·乙醇溶液1毫升，和1.0毫克/毫升的鉑黑·乙酸緩沖液0.05毫升使總量達(dá)5毫升，以45毫升/分鐘的速度吹入氫氣，每隔固定的時間采集200微升試樣，測定DPPH的特異吸收、即517納米處的吸光度，得到表明吸光度減少與吹入時間之間關(guān)系的曲線(標(biāo)定曲線A)——圖13。
5-2繪制標(biāo)定曲線B
使0～100μM的半胱氨酸與DPPH反應(yīng)，求出517納米附近DPPH的吸光度減少與半胱氨酸濃度之間的相關(guān)曲線。繪出標(biāo)定曲線B的曲線圖——圖14。
5-3繪制標(biāo)定曲線C(3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽偶氮化合物(DBNBS偶氮化合物)的吸光度與氫自由基濃度之間的關(guān)系)
在5毫升含有0.01毫克/毫升鉑的2.5毫克/毫升DBNBS溶液中，以45毫升/分鐘的速度吹入氫氣，在DBNBS與氫自由基起反應(yīng)的同時，每隔一定時間采集200微升試樣，于60℃下加熱1小時后，測定DBNBS與氫自由基的反應(yīng)產(chǎn)物DBNBS偶氮化合物的特異吸收、即450納米處的吸光度，繪出圖15所示的標(biāo)定曲線C。
5-4試樣中氫自由基濃度的測定
(1)試樣配制
將電解還原水調(diào)制成pH為7.0，按照該制造條件調(diào)制成1級～4級的試樣。這里的電解還原水，是向隔著隔膜的陰極室和陽極室分別導(dǎo)入含有NaOH的水溶液，在陰極和陽極之間通電，使前述NaOH水溶液電解，在前述陰極室得到的物質(zhì)。這些試樣的氧化還原電位(0RP)和pH示于表1。用超純水(Milli Q水)作為參照例。
在125毫升的Milli Q水和1～4級的電解還原水中分別加入200微升DBNBS保存溶液(12.5毫克/毫升)，減壓濃縮至125倍。用1毫升Milli Q水洗滌基氏燒瓶的內(nèi)壁，回收靜置了一會兒的溶液。將回收后的溶液于60℃的熱水浴(遮光)中加熱，然后在冰中冷卻以使反應(yīng)停止。以12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心分離5分鐘，采集上層清液。
(2)吸光度的測定
測定上述試樣在頻率450納米處的吸光度。測定方式是對同一試樣分別取3個試樣測定，取其平均值。吸光度的測定結(jié)果示于表1。用HPLC分進(jìn)行分析，結(jié)果判明電解還原水與DBNBS的反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的著色物質(zhì)，是和鉑黑的存在下于氫氣吹入時產(chǎn)生的DBNBS偶氮化合物相同的物質(zhì)，其洗脫位置和紫外可見吸收光譜相同。
(3)氫自由基濃度的測定
從各級別試樣的吸光度中扣除用作參照物的DBNBS的Mili Q水溶液在450納米處的平均吸光度0.0358，由該差值的吸光度值，用標(biāo)定曲線(C)求出氫自由基濃度。濃縮至125倍的電解還原水的氫自由基濃度在1～4級時在7～34μM(微摩爾/升)的范圍內(nèi)。
表1
這次披露的實(shí)施方式和實(shí)施例從所有觀點(diǎn)上都不應(yīng)視作是限制。本發(fā)明的范圍不僅示于如上述說明中，還示于專利的權(quán)利要求范圍中，旨在包括和專利的權(quán)利要求范圍相等的意思和范圍內(nèi)的所有改變。
工業(yè)上的利用領(lǐng)域
如果采用上述氫自由基的檢測方法和定量分析方法，不僅能檢測出水或水溶液中是否存在微量的氫自由基，連濃度也能正確地測定。特別是采用這種分析方法時，能容易地將電解還原水中氫自由基濃度正確定量。因此，這種分析方法可適用于醫(yī)療領(lǐng)域、食品領(lǐng)域、飲料領(lǐng)域等各種制品的用途中，根據(jù)這些用途來調(diào)節(jié)氫自由基(活性氫)濃度制成電解還原水。而且在氫包藏合金的性能評價中也能利用。
權(quán)利要求
1.檢測水或水溶液中的氫自由基的方法，其特征在于它包括在試樣中加入3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽即DBNBS，由試樣著色來檢測氫自由基。
2.如權(quán)利要求1所述的氫自由基的檢測方法，其特征在于，所述的水或水溶液是電解還原水。
3.如權(quán)利要求1所述的氫自由基的檢測方法，其特征在于，所述的著色由3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽即DBNBS與氫自由基反應(yīng)生成的DBNBS偶氮化合物的吸收峰產(chǎn)生。
4.如權(quán)利要求1所述的氫自由基的檢測方法，其特征在于，在波長425～450納米處檢測吸收峰。
5.水或水溶液中氫自由基的定量分析方法，它由以下(1)～(4)步驟組成
(1)于鉑黑的存在下，以恒定的速度向517納米附近有吸收峰的1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼即DPPH溶液和3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽即DBNBS的溶液中吹入氫氣，繪出517納米附近的吸光度減少與氫氣吹入時間的相關(guān)曲線——繪制標(biāo)定曲線A，
(2)使半胱氨酸與DPPH反應(yīng)，繪出517納米附近DPPH的吸光度減少與半胱氨酸濃度的相關(guān)曲線——繪制標(biāo)定曲線B，
(3)在和前述(1)相同的條件下，于鉑黑的存在下，以恒定的速度向3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽即DBNBS溶液中吹入氫氣一定時間后，測定450納米附近的吸光度，繪出該吸光度值與由標(biāo)定曲線A和標(biāo)定曲線B算出的每單位氫氣吹入時間內(nèi)氫自由基產(chǎn)生濃度的相關(guān)曲線——繪制標(biāo)定曲線c，
(4)在試樣中加入3，5-二溴-4-亞硝基苯磺酸鈉鹽即DBNBS，測定450納米附近的吸光度，由該吸光度值從前述標(biāo)定曲線C讀取氫自由基的濃度。
6.如權(quán)利要求5所述的定量分析方法，其特征在于，所述的水或水溶液濃縮至10～500倍。
全文摘要
本發(fā)明是檢測水或水溶液中氫自由基(hydrogenradical)的方法，其特征在于，該方法包括在試樣中加入3，5－二溴－4－亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)，通過由所得溶液的吸收特性所產(chǎn)生的顏色來檢測氫自由基；還有氫自由基的定量分析方法，該方法包括于鉑黑的存在下，以恒定的速度向517納米附近有吸收峰的1，1－二苯基－2－苦基偕腙肼(DPPH)溶液和3，5－二溴－4－亞硝基苯磺酸鈉鹽(DBNBS)的溶液中吹入氫氣，并用表明DBNBS偶氮化合物在450納米附近的吸光度與氫自由基產(chǎn)生濃度之間關(guān)系的標(biāo)定曲線C，來確定氫自由基的濃度。
文檔編號G01N21/80GK1463363SQ0280187
公開日2003年12月24日 申請日期2002年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月29日
發(fā)明者白畑實(shí)隆, 大坪一道 申請人:日本多寧股份有限公司, 白畑實(shí)隆