專(zhuān)利名稱(chēng)：植物gmp合成酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為除草劑新的靶蛋白的植物GMP合成酶(鳥(niǎo)苷酸合成酶)的鑒定。本發(fā)明還涉及編碼具有GMP合成酶(EC 6.3.5.2)活性多肽的DNA序列。本發(fā)明還涉及利用植物來(lái)源的編碼具有GMP合成酶活性蛋白質(zhì)的核酸產(chǎn)生一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)，用于對(duì)具有除草性的GMP合成酶抑制劑進(jìn)行鑒定，以及通過(guò)此測(cè)試系統(tǒng)所鑒定的植物GMP合成酶抑制劑。本發(fā)明還涉及利用編碼植物GMP合成酶的核酸生產(chǎn)對(duì)GMP合成酶抑制劑抗性增加的植物，以及生產(chǎn)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸含量改變的植物。另外，本發(fā)明涉及消除有害植物生長(zhǎng)的方法，包括利用與GMP合成酶進(jìn)行特異性結(jié)合的化合物處理需要被消除的植物，其中GMP合成酶是由SEQ-ID NO1所示的一段DNA序列編碼，或者是由與此序列雜交的一段DNA序列編碼，化合物抑制GMP合成酶的功能。
植物能夠利用二氧化碳、水和無(wú)機(jī)鹽合成它們的細(xì)胞組分。
這一方法只能通過(guò)生物化學(xué)反應(yīng)合成有機(jī)物，必須在植物中從頭合成作為核酸結(jié)構(gòu)組分的核苷酸。
尤其在快速生長(zhǎng)的植物組織中，必須通過(guò)多級(jí)代謝途徑來(lái)合成作為核酸DNA和RNA結(jié)構(gòu)組分的核苷酸。而且，核苷酸與實(shí)際上所有的代謝途徑都有關(guān)聯(lián)。核苷三磷酸，尤其ATP，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞中的能量消耗反應(yīng)。腺嘌呤核苷酸還可以作為基本輔酶，如輔酶A和尼克酰胺和黃素輔酶的組分，參與許多細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。鳥(niǎo)嘌呤核苷酸能夠指導(dǎo)多種細(xì)胞過(guò)程的反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)翻譯，微管組裝，囊泡運(yùn)輸，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分裂。另外，尤其是在茜草科和茶科的植物中，核苷酸是合成甲基黃嘌呤如咖啡因和可可堿的起始代謝物。
嘌呤核苷酸在微生物、動(dòng)物和植物中同樣是從磷酸核糖焦鱗酸(PRPP)開(kāi)始從頭合成的。IMP是在十步反應(yīng)程序中合成的，在下一步反應(yīng)中通過(guò)腺苷酸琥珀酸合成酶和腺苷酸琥珀酸裂解酶的作用將IMP轉(zhuǎn)化為AMP。在GMP的合成中，IMP首先通過(guò)IMP脫氫酶轉(zhuǎn)化成XMP，然后經(jīng)GMP合成酶的氨化被轉(zhuǎn)化成GMP，參見(jiàn)附

圖1。
已經(jīng)從各種生物體中分離出編碼GMP合成酶[sic]的基因。
至今對(duì)植物中的嘌呤生物合成途徑的區(qū)室作用沒(méi)有作深入的研究，以谷氨酰胺和天冬氨酸的形式固定在豆科植物根瘤中的氮，首先經(jīng)從頭合成途徑轉(zhuǎn)變成嘌呤，這個(gè)途徑位于大豆和豇豆根瘤的質(zhì)體中(Boland andSchubert，Arch.Biochem.Biophys.220(1983)，179＝187；Shelp等，Arch.Biochem.Biophys.224(1983)，429-441)。然而，最近的研究表明，在豇豆根瘤的線粒體中也發(fā)現(xiàn)了嘌呤生物合成途徑的酶活性[sic](Atkins等，植物生理學(xué)(Plant Physiogy)133(1997)，127-135；Smith等，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology 36(1998)，811-820)。
對(duì)合成途徑的調(diào)節(jié)的研究至今僅在微生物和動(dòng)物中進(jìn)行，調(diào)節(jié)作用包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，終產(chǎn)物抑制和別構(gòu)調(diào)節(jié)。反應(yīng)第二步中的磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(PRPP ATASE)既是動(dòng)物，也是植物系統(tǒng)中的關(guān)鍵位點(diǎn)，并且它受到終產(chǎn)物IMP，AMP和GMP的別構(gòu)調(diào)節(jié)(Reynolds等，Archives ofBiochemistng and Biophysics 229(1984)，623-631)。
因?yàn)锳TP是GMP合成酶的底物，所以在鳥(niǎo)苷核苷酸和腺苷核苷酸的平衡合成中，GMP合成酶也起著作用。
由于植物依賴(lài)于功能核苷酸的新陳代謝，所以很明顯這種代謝是新的除草劑的可能的靶目標(biāo)。事實(shí)上已經(jīng)對(duì)具有抑制嘌呤從頭生物合成酶的作用的試劑進(jìn)行了描述，舉列來(lái)說(shuō)有5′-phosphohydantocidin，它抑制植物嘌呤代謝中的一種酶，即腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)(Siehl等，PlantPhysiol，110(1996)，753-758)。
對(duì)于動(dòng)物和微生物，這個(gè)代謝途徑的酶的抑制劑也存在，葉酸類(lèi)似物抑制除了GAR轉(zhuǎn)甲酰酶之外的各種葉酸依賴(lài)性的反應(yīng)，并且具有抗增殖、抗炎癥及免疫抑制的作用。霉酚酸(MPA)，作為IMP脫氫酶的抑制劑，具有抗微生物、抗病毒和免疫抑制的作用(Kitchin等，Journa of the AmericanAcademy of Dermatoloy 37(1997)，445-449)。
例如，可以在轉(zhuǎn)基因植物中利用反義技術(shù)，通過(guò)減少酶活力來(lái)驗(yàn)證一種酶作為除草劑靶目標(biāo)的適宜性。如果這種方法引起植物生長(zhǎng)減慢，就可以推斷出活性被減少的酶是除草劑作用的適宜位點(diǎn)，這一點(diǎn)可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的乙酸乳酸合成酶的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明(Hofgen等，Plant Physioloy107(1995)，469-477)。
本發(fā)明的目的是證明植物中的GMP合成酶是合適的除草劑靶蛋白，分離出編碼GMP合成酶的完整植物cDNA，并在細(xì)菌或真核細(xì)胞中進(jìn)行功能性表達(dá)，產(chǎn)生一個(gè)有效而簡(jiǎn)捷的GMP合成酶測(cè)試系統(tǒng)，用于開(kāi)展抑制劑-酶結(jié)合的研究。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本目的可以通過(guò)分離編碼植物GMP合成酶的基因，生產(chǎn)出GMP合成酶的反義構(gòu)建體，并在細(xì)菌或真核細(xì)胞中功能性表達(dá)GMP合成酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的一方面是涉及對(duì)煙草(Nicotiana tabacum)中的編碼功能性谷氨酰胺水解的GMP合成酶(EC6.3.5.2)的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分離。
本發(fā)明首先涉及的一方面是如SEQ-ID NO1所示的一段DNA序列，它具有煙草的植物GMP合成酶的編碼區(qū)，參見(jiàn)實(shí)施例1。
本發(fā)明的另一方面是如SEQ-ID NO3所示的一段DNA序列，它具有展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的植物GMP合成酶編碼區(qū)的一部分，參見(jiàn)實(shí)施例2。
本發(fā)明的另一方面是從SEQ ID NO1或SED IN NO3所示序列或與這兩種中的一種序列的雜交序列衍生得到的DNA序列，它們編碼的蛋白具有GMP合成酶的生物活性。
對(duì)含有GMP合成酶反義構(gòu)建體的Nicotiana tabacum cv.Samsun NN系中的煙草的特點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)研究，這種植物顯示出不同程度的生長(zhǎng)延遲。轉(zhuǎn)基因品系，以及第一和第二子代在土壤中的生長(zhǎng)減慢，在生產(chǎn)減慢的植株中，可以利用RNA印跡檢測(cè)到GMP-7M RNA的量比野生型減少，也可以利用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因品系中的GMP合成酶蛋白量比野生型減少，參見(jiàn)實(shí)施例7。可以發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)延遲和GMP合成酶蛋白量的減少具有相關(guān)性，這種明顯的關(guān)聯(lián)首次證實(shí)GMP無(wú)疑是除草劑合適的靶蛋白。
為了能夠找到植物GMP合成酶有效的抑制劑，必須提供測(cè)試系統(tǒng)，以進(jìn)行抑制劑-酶結(jié)合的研究。為此，例如將煙草中GMP合成酶的全cDNA序列克隆到一個(gè)表達(dá)載體(pQE，Qiagen)，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，參見(jiàn)而且還可以在例如其它細(xì)胞、酵母、真菌、藻類(lèi)、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)具有如SPQ ID NO1所示DNA序列的表達(dá)序列盒，參見(jiàn)實(shí)施例5。
借助本發(fā)明的表達(dá)序列盒表達(dá)的GMP合成酶蛋白尤其適合于尋找GMP合成酶的特異性抑制劑。
為此，可將植物GMP合成酶應(yīng)用于酶檢測(cè)，在被檢測(cè)試劑存在或不存在時(shí)對(duì)GMP合成酶的活力進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)比較兩種條件下的活力測(cè)定值，可以得到有關(guān)被檢測(cè)試劑的抑制性能的定性和定量信息，參見(jiàn)實(shí)施例8。
利用本發(fā)明的酶測(cè)試系統(tǒng)能夠快速簡(jiǎn)便的測(cè)檢大量化學(xué)化合物的除草性。這一方法允許從大量底物中重復(fù)性地篩選出那些具有潛在效應(yīng)的底物，以便今后對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行為技術(shù)人員所熟悉的，其它更深入的檢測(cè)。
本發(fā)明的另一方面是用于鑒定具有除草作用的物質(zhì)的方法，此類(lèi)物質(zhì)抑制植物GMP合成酶活性，方法包括a)制備轉(zhuǎn)基因植物，植物組織或植物細(xì)胞，它們包含一段編碼具有GMP合成酶活性的酶的附加DNA序列，并且能夠過(guò)量表達(dá)具有酶活性的GMP合成酶。
b)將一種物質(zhì)施用于轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分，以及未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分；c)測(cè)定施用化學(xué)物質(zhì)后轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率；以及d)比較施用化學(xué)物質(zhì)后轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率；未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率受抑制，而轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率沒(méi)有受到抑制，這說(shuō)明了b)中的物質(zhì)表現(xiàn)出除草的活性，抑制了植物GMP合成酶的活性。
本發(fā)明的另一方面是通過(guò)克隆植物GMP合成酶基因，并在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)序列盒中引發(fā)過(guò)表達(dá)的方法，對(duì)具有潛在除草作用的植物GMP合成酶抑制劑進(jìn)行鑒定。例如在昆蟲(chóng)細(xì)胞中，先破碎細(xì)胞，將細(xì)胞提取物直接應(yīng)用于測(cè)試系統(tǒng)或?qū)饪s或分離出來(lái)的GMP合成酶應(yīng)用于測(cè)試系統(tǒng)，測(cè)定在低分子量的化學(xué)化合物存在時(shí)的酶活力。
本發(fā)明的另一方面包括具有除草作用的化合物，可以通過(guò)上述的測(cè)試系統(tǒng)對(duì)它進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的另一方面是清除有害植被的方法，包括用化合物處理需要被清除的植物，這種化合物特異性的與植物GMP合成酶進(jìn)行結(jié)合并且抑制此酶的功能。
具有除草作用的植物GMP合成酶可以被用作脫葉劑，干燥劑，稻草殺劑，尤其是可用作野草殺劑。野草，從廣義上來(lái)講，是指生長(zhǎng)在不被需要的地方的所有植物。根據(jù)本發(fā)明中的檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的試劑是作為完全性的殺草劑還是作為選擇性的除草劑主要取決于所施用率。
具有除草作用的GMP合成酶抑制劑可以用于，例如，抗以下野草雙子葉的野草類(lèi)白芥屬，獨(dú)行菜屬，豬殃殃屬，繁縷屬，母菊屬，春黃菊屬，牛膝菊屬，藜屬，蕁麻屬，千里光屬，莧屬，馬齒莧屬，蒼耳屬，旋花屬，番薯屬，琴屬，田菁屬，豚草屬，薊屬，飛廉屬，苦苣菜屬，茄屬，菜屬，節(jié)節(jié)菜屬，球梳霉屬，野芝麻屬，婆婆納屬，苘麻屬，Emex，曼陀羅屬，黃鼠狼花屬，罌粟屬，矢車(chē)菊屬，三葉草屬，毛茛屬，蒲公英屬。
單子葉的野草類(lèi)稗屬，狗尾草屬，黍?qū)伲R唐屬，梯牧草屬，早熟禾屬，羊茅屬，蟋蟀草屬，臂刊草屬，黑麥草屬，雀麥屬，燕麥屬，莎草屬，蜀黍、高粱屬，冰草屬，絆根草屬，雨久花屬，飄拂草屬，慈茹屬，荸薺屬，莞草屬，雀稗屬，鴨嘴草屬，尖瓣花屬，龍爪茅屬，剪股穎屬，春麥娘屬，Apera。
本發(fā)明的另一方面包括表達(dá)序列盒，它們的序列編碼一種煙草的GMP合成酶或它的同功能酶。與此相關(guān)的核酸序列可以是，如DNA或cDNA序列。
本發(fā)明的另一方面是具有DNA序列SEQ ID NO.3的表達(dá)盒，該DNA序列編碼部分展葉劍蘚的植物GMP合成物。
本發(fā)明的表達(dá)序列盒中還包含調(diào)節(jié)核酸序列，它們調(diào)控宿主細(xì)胞的編碼序列的表達(dá)。在優(yōu)化的具體實(shí)施案例中，本發(fā)明的表達(dá)序列盒包括一個(gè)啟動(dòng)子上游，即5′-末端的編碼序列，和一個(gè)聚腺苷酰化作用信號(hào)下游，即3′-末端，以及適當(dāng)情況下，還包括與位于上下游之間的GMP合成酶基因編碼序列進(jìn)行可操縱性地連接的其它調(diào)節(jié)元件?？刹倏v性地連接的含義是指啟動(dòng)子、編碼序列、終止子，以及適當(dāng)情況下，其它的調(diào)節(jié)元件，按照一定的順序排列，以便在編碼序列進(jìn)行表達(dá)時(shí)，每一個(gè)調(diào)節(jié)元件能夠各盡其能。
本發(fā)明的表達(dá)序列盒是通過(guò)適當(dāng)?shù)膯?dòng)子與適當(dāng)?shù)腉MP合成酶DNA序列和聚腺苷?；饔玫男盘?hào)融合在一起得到的，采用的技術(shù)是常規(guī)的重組和克隆技術(shù)，例如參見(jiàn)J.Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗(yàn)(Experiments with Gene Fusions)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.And Wiley-Interscience(1987)。
本發(fā)明另一方面包括功能等同DNA序列，它編碼GMP合成酶并且在DNA序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)，與SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性為40至100％。
本發(fā)明優(yōu)選的方面包括功能等同DNA序列，它編碼GMP合成酶并且在DNA序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)，與SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性為60至100％。
本發(fā)明特別優(yōu)選的方面包括功能等同DNA序列，它編碼GMP合成酶并且在DNA序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)，與SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示DNA序列的序列同源性為80至100％。
本發(fā)明中的編碼GMP合成酶的功能等同DNA序列是指，盡管核苷酸序列發(fā)生了改變，但仍具有所需要功能的序列。因此功能等同序列包括了自然發(fā)生的這里所述序列的變異體，也包括人工合成的核苷酸序列，例如經(jīng)過(guò)化學(xué)合成，按照植物中實(shí)際使用的特定密碼子進(jìn)行改造得到的功能等同序列。
功能等同序列也可以指，具體的來(lái)說(shuō)，最初被分離出的編碼GMP合成酶的天然或人工突變體，它仍具有所需要的功能。突變作用包括取代、加入，刪除，交換或者插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸殘基。因此，舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明也包括對(duì)這個(gè)核苷酸序列修飾后得到的那些核苷酸序列。修飾的目的可以是，如界定所包含的編碼序列，或者插入更多的限制性酶切位點(diǎn)。
功能等同序列也可以是這樣的變異體，與原始基因或基因片斷相比，它們的功能被增強(qiáng)或被減弱。
另外，本發(fā)明的表達(dá)序列盒也可應(yīng)用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌，藍(lán)細(xì)菌，酵母，絲狀真菌和藻類(lèi)，以生產(chǎn)出充足的GMP合成酶。
本發(fā)明的另一方面是來(lái)自煙草的具有SEQ-ID NO2所示的氨基酸序列的一種蛋白質(zhì)，或者這個(gè)蛋白具有GMP合成酶活性的衍生體或部分。
本發(fā)明的另一方面包括具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與煙草GMP合成酶的氨基酸序列具有20-100％同源性。
優(yōu)選的具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與煙草GMP合成酶的氨基酸序列具有50-100％同源性。
更優(yōu)選的具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與煙草GMP合成酶的氨基酸序列具有80-100％同源性。
本發(fā)明的另一方面包括具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與展葉劍葉蘚GMP合成酶的氨基酸序列具有20-100％同源性。
優(yōu)選的具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與展葉劍葉蘚GMP合成酶的氨基酸序列具有50-100％同源性。
更優(yōu)選的具有GMP合成酶活性的植物蛋白質(zhì)，與展葉劍葉蘚GMP合成酶的氨基酸序列同源體具有80-100％同一性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在植物中過(guò)表達(dá)GMP合成酶基因，以產(chǎn)生可以耐受GMP合成酶抑制劑的植物。
在植物中過(guò)表達(dá)如SEQ-ID NO1所示的編碼GMP合成酶的基因序列可以導(dǎo)致對(duì)GMP合成酶抑制劑的抗性增加。以這種方式產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物同樣是本發(fā)明的一個(gè)方面。
對(duì)轉(zhuǎn)基因后被表達(dá)的GMP合成酶基因的表達(dá)功效，可以通過(guò)芽分裂組織的繁殖或發(fā)芽試驗(yàn)來(lái)體外測(cè)定。另外，GMP合成酶基因的性質(zhì)和表達(dá)水平發(fā)生的變化，以及這一變化對(duì)GMP合成酶抑制劑的抗性效應(yīng)的影響，可以從溫室實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)植物檢測(cè)出來(lái)。
本發(fā)明另一方面包括轉(zhuǎn)基因植物，它們是由本發(fā)明中具有SEQ-ID NO1序列的表達(dá)序列盒轉(zhuǎn)化得到，由于SEQ-ID NO1序列的附加的表達(dá)使得這些植物能夠耐受GMP合成酶抑制劑的作用，本發(fā)明還包括這種植物的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，組織，部分以及繁殖材料。提供的特別優(yōu)選的相關(guān)轉(zhuǎn)基因作物有，如大麥，小麥，黑麥，玉米，大豆，水稻，棉花。甜菜，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，煙草，西紅柿，油菜籽，紫花苜蓿，萵苣以及各種樹(shù)木，堅(jiān)果，葡萄，豆類(lèi)。
植物中核苷酸含量發(fā)生改變可以具有很多益處，例如，將核苷酸添加到以植物為基礎(chǔ)的嬰兒食品中以獲得與母乳相似的營(yíng)養(yǎng)溶液。另外，在腸胃病人的飲食中優(yōu)化核苷酸含量是明智的，適當(dāng)減少植物食物中嘌呤核苷酸的含量適用于痛風(fēng)病人的飲食。核苷酸還具有形成味道和強(qiáng)化味道的作用，因此改變核苷酸的含量對(duì)植物的品味具有影響。
本發(fā)明的另一方法因此包括這樣的植株，在植株中表達(dá)如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的DNA序列之后，具有修飾含量的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的植株。
具有修飾含量的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的植株是依據(jù)，例如在植株中以有義或反義方向表達(dá)如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的附加DNA序列。鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的修飾含量是指在以有義方向進(jìn)行表達(dá)時(shí)可以產(chǎn)生鳥(niǎo)嘌呤核苷酸含量增加的植株，以及在以有義方向(共抑制)或反義方向進(jìn)行表達(dá)時(shí)產(chǎn)生鳥(niǎo)嘌呤核苷酸含量減少的植株。
增加鳥(niǎo)嘌呤核苷酸含量意味著，例如，在本發(fā)明的范圍內(nèi)與沒(méi)有進(jìn)行遺傳處理的至少一代植株相比，由于過(guò)表達(dá)植物GMP合成酶基因使鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的生物合成增加的這種人為實(shí)用能力。
本發(fā)明的另一方面是利用植物GMP合成酶改變植株中甲基黃嘌呤的濃度。
特別優(yōu)選的序列是那些能夠確保定向進(jìn)入質(zhì)外體，質(zhì)體，液泡，線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列，或者那些，由于缺少適當(dāng)?shù)牟倏v序列，能夠確保產(chǎn)物保留在生產(chǎn)區(qū)室，即胞液中的序列(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)。
例如，可以將植物的表達(dá)序列盒整合到煙草轉(zhuǎn)化載體上(pBinAR)(參見(jiàn)實(shí)施例6)。
適用于本發(fā)明表達(dá)序列盒的啟動(dòng)子，原則上，是任何能夠調(diào)控外源基因在植物中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。尤其優(yōu)選植物的啟動(dòng)子或從植物病毒衍生的啟動(dòng)子，特別優(yōu)選的是煙草花葉病毒CaMV 35S啟動(dòng)子(Frank等，細(xì)胞21(1980)，285-294)。這個(gè)啟動(dòng)子包含轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子的各種識(shí)別序列，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子從整體上導(dǎo)致引入基因的永久表達(dá)和組成型表達(dá)(Benfey等，EMBOJ.8(1989)，2195-2202)。
本發(fā)明的表達(dá)序列盒也可以包含一個(gè)可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，它能夠在一個(gè)特定的時(shí)間點(diǎn)調(diào)控外源GMP合成酶基因在植物中進(jìn)行表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子例如PRP1啟動(dòng)子(Ward等，Plant.Mol.Biol.(1993)22，361-366)，水楊酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(WO 95/19443)，苯硫酰胺誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(EP 388186)，四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Gatz等，Plant J.(1992)2，397-404)，脫葉酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(EP 0335528)，乙醇或環(huán)己酮誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(WO 93/21334)，在文獻(xiàn)中都有描述而且可以應(yīng)用。
而且，特別優(yōu)選的啟動(dòng)子，是那些在進(jìn)行嘌呤或其前體物生物合成的組織或植株部分能夠確保表達(dá)的啟動(dòng)子，尤其是能夠確保葉片特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯胞液果糖二磷酸酶啟動(dòng)子或馬鈴薯ST-LSI啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBO J.，(1989)8，2445-2451)。
利用種子特異性啟動(dòng)子，外來(lái)蛋白可以在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的種子中穩(wěn)定的被表達(dá)，并且其含量占全部可溶性種子蛋白質(zhì)的0.67％(Fiedler andConrad，Bio/Technology(1995)10，1090-1094)。因此本發(fā)明的表達(dá)序列盒可以包含一個(gè)種子特異性啟動(dòng)子(優(yōu)選云扁豆蛋白啟動(dòng)子，USP或LEB4啟動(dòng)子)，LEB4信號(hào)肽，被表達(dá)的基因，以及一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持信號(hào)。
編碼GMP合成酶的插入核苷酸序列可以通過(guò)合成產(chǎn)生，或者從天然獲得，或者由合成的或天然的DNA組分混合形成。通常，生產(chǎn)合成核苷酸序列優(yōu)選植物密碼子，這類(lèi)植物優(yōu)選密碼子可以通過(guò)在大多數(shù)所研究的植物種類(lèi)中具有最高表達(dá)頻率的蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)的密碼子來(lái)確定。在制備表達(dá)序列盒時(shí)，為了獲得能夠以正確的方向方便閱讀并且配有一個(gè)正確的閱讀框的一段核苷酸序列，可以利用各種DNA片斷。為使DNA片斷彼此相連，可以將接合體或接頭接到片斷框架上。
其它適用的DNA序列可以是人工構(gòu)建的DNA序列，如以上實(shí)例所描述的，只要它們能夠提供所需要的特性，即通過(guò)在農(nóng)作物中過(guò)表達(dá)GMP合成酶基因來(lái)增加植物中鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的含量。例如，可以通過(guò)對(duì)具有GMP合成酶活性并且由分子模型構(gòu)建的蛋白質(zhì)進(jìn)行反翻譯，或者通過(guò)體外篩選找到這樣的人工DNA序列。特別適用的編碼DNA序列，是按照宿主特異性使用的密碼子反翻譯出的一段多肽序列。熟悉植物遺傳學(xué)方法技術(shù)人員可以很容易通過(guò)計(jì)算機(jī)分析其它的被轉(zhuǎn)化植物的已知基因，找到實(shí)際使用的特定密碼子。
本發(fā)明的其它適用的等同核酸序列可以是編碼融合蛋白的序列，融合蛋白其中的一個(gè)組分是植物GMP合成酶多肽，或者是GMP合成酶多肽的一部分功能性等同體。融合蛋白的第二部分可以是其它具有酶活力的多肽，或是抗原多肽序列，借助它可以用來(lái)檢測(cè)GMP合成酶的表達(dá)(如myc tag或his tag)。然而，它最好是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白序列如，信號(hào)或轉(zhuǎn)移肽，能夠?qū)MP合成酶蛋白引導(dǎo)至所需要的作用位點(diǎn)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)和終止子區(qū)最好應(yīng)該，沿著轉(zhuǎn)錄的方向，配備一個(gè)接頭或多接頭，接頭中包含一個(gè)或多個(gè)用于插入序列的限制性酶切位點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，接頭具有1-10，多數(shù)是1-8，最好是2-6個(gè)限制性位點(diǎn)。通常，調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的接頭小于100bp，常見(jiàn)的是小于60bp，但是至少是5bp。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是來(lái)自宿主，或與宿主同源的，也可以是外來(lái)的與宿主異源的啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)序列盒沿著5′-3′轉(zhuǎn)錄方向包含本發(fā)明的啟動(dòng)子，任一指示轉(zhuǎn)錄終止的序列和區(qū)域組成。各種終止區(qū)可以根據(jù)需要彼此進(jìn)行交換。
可以使用操縱作用來(lái)提供適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，或者除去多余的DNA或多余的限制性酶切位點(diǎn)。在適于進(jìn)行插入、刪除、取代，包括轉(zhuǎn)換和顛換的情況下，也可以使用體外的致突變，引物修復(fù)，限制性作用或連接作用。在使用如限制性作用、chewing back、或填補(bǔ)平末端的懸垂部分這些操縱作用時(shí)，可利用片斷的互補(bǔ)性末端來(lái)連接片斷。
優(yōu)選的聚腺苷?；饔眯盘?hào)是植物聚腺苷?；饔眯盘?hào)，尤其是那些實(shí)質(zhì)上與根癌土壤桿菌T-DNA聚腺苷酰化作用信號(hào)相一致的信號(hào)，尤其是Ti質(zhì)粒p TiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)835 ff)中T-DNA(章魚(yú)肉堿合成酶)的基因3，或者它的功能等同基因。
為了利用編碼GMP合成酶基因轉(zhuǎn)化宿主植物，本發(fā)明的表達(dá)序列盒采取如插入的方式整合到重組載體，載體DNA包含附加的功能調(diào)節(jié)信號(hào)，例如用來(lái)復(fù)制或整合的序列。適用的載體在“植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法”(CRC Press)，Chapter 6/7，pp.71-119，一文中有描述。
將外來(lái)基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組稱(chēng)為轉(zhuǎn)化作用。利用上述的方法將用于暫時(shí)的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化作用的植物組織和細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且再生出植株。適用的方法是原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，它可以通過(guò)聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA吸收，利用基因槍的生物彈射學(xué)法，電穿孔，DNA溶液中的干胚胎誘導(dǎo)，顯微注射，土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行。以上方法的描述參見(jiàn)B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(Techniques for Gene Transfer)in轉(zhuǎn)基因植物(TransgenicPlants)，Vol.1，工程和應(yīng)用(Engineering and Utilization)，edited byS.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)。將被表達(dá)的構(gòu)建體優(yōu)先克隆到適于轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的載體，如pBin19中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
利用本發(fā)明表達(dá)序列盒轉(zhuǎn)化的土壤桿菌，同樣可以被用來(lái)去轉(zhuǎn)化植物，尤其是下列植物谷類(lèi)，玉米，大豆，水稻，棉花，甘蔗，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，西紅柿，油菜籽，紫花苜蓿，萵苣，以及各種樹(shù)木，堅(jiān)果，葡萄，豆類(lèi)。轉(zhuǎn)化的方法是，如將受傷的葉片或葉片的一部分浸泡在土壤桿菌的懸浮液中，然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
嘧啶的合成部位一般是在葉片組織，所以GMP合成酶基因的葉片-特異性表達(dá)很有用處。然而，很明顯嘧啶的生物合成不必被限制在葉片組織，而是以組織特異性的方式，可以在植物所有其它部位發(fā)生，如在富含脂肪的種子里。
而且外源GMP合成酶基因的組成型表達(dá)是有利的，另一方面，也需要誘導(dǎo)性表達(dá)。
利用上述的重組和克隆技術(shù)，本發(fā)明的表達(dá)序列盒可以被克隆到適當(dāng)?shù)妮d體，并使它得到復(fù)制，如克隆到大腸桿菌。適用的克隆載體包括有pBR332，pUC系列，M13mp系列，和pACYC184。特別適用的載體是在大腸桿菌和土壤桿菌中都能夠進(jìn)行復(fù)制的二元載體。
本發(fā)明另一方面涉及利用本發(fā)明的表達(dá)序列盒來(lái)轉(zhuǎn)化植物，植物細(xì)胞，植物的組織或植物的一部分。該用途的優(yōu)選目標(biāo)是提高植物中的GMP合成酶的含量。
本發(fā)明可以包括，根據(jù)啟動(dòng)子的選擇不同，特異性發(fā)生在葉片，種子或植物的其它部位進(jìn)行的表達(dá)。這樣的轉(zhuǎn)基因植物，它們的繁殖材料以及它們植物細(xì)胞、組織或部分也是本發(fā)明研究的另一方面。
利用下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，但不限于此實(shí)施例實(shí)施例所依據(jù)的遺傳工程方法普通克隆方法克隆方法，舉例來(lái)說(shuō)包括限制性酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA片斷的純化，核酸轉(zhuǎn)移到硝化纖維和尼龍膜，連接DNA片斷，埃希氏大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，細(xì)菌培養(yǎng)，以及重組DNA的序列分析，這些方法可以按照Sambrook等的描述進(jìn)行操作(Sambrook等(1994)Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0-87969-309-6)。
重組DNA的序列分析可以利用ABI激光熒光DNA序列分析儀按照Sanger等的方法對(duì)重組DNA分子進(jìn)行測(cè)序(Sanger等，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)。由聚合酶鏈反應(yīng)所得片斷要進(jìn)行測(cè)序和校對(duì)，以避免在被表達(dá)的構(gòu)建體中發(fā)生聚合酶錯(cuò)誤。
除非特別聲明，使用的化學(xué)藥品是購(gòu)自以下公司的分析純產(chǎn)品Fluke(Neu-Ulm)，Merk(Darmstadt)，Roth(Karlsruhe)，Serva(Heidelberg)及Sigma(Deisenhofen)。溶液的制備使用使用的是利用Milli-Q水處理系統(tǒng)(Millipore，Eschborn)制備的無(wú)熱原的水，在下文中稱(chēng)為H2O。限制性核酸內(nèi)切酶，DNA-修飾酶和分子生物學(xué)試劑盒購(gòu)自AGS(Heidelberg)，Amersham(Braunschweig)，Biometra(Gottingen)，Roche(Mannheim)，Genomed(Bad Oeynhausen)，New England Biolabs(Schwalbach/Taunus)，Novagen(Madison，Wisconsin，USA)，Perkin-Elmer(Weiterstadt)，Pharmacia(Freiburg)，Qiagen(Hilden)及Stratagene(Heidelberg)，除非特別說(shuō)明，按照操作說(shuō)明進(jìn)行使用。
在下文中使用的細(xì)菌菌株(E.coli，XL-blue)購(gòu)自Stratagene，E.coliAT 2465購(gòu)自大腸桿菌遺傳貯藏中心(Yale University，New Haven)。用于植物轉(zhuǎn)化的土壤桿菌的菌株(根癌土壤桿菌，C58C1具有質(zhì)粒pGV2260或pGV3850kan)已經(jīng)被Deblaere等進(jìn)行過(guò)描述(Nucl.Acids Res.13(1985)4777)，或者也可以使用土壤桿菌菌株LBA4404(Clontech)或其它合適的菌株?？梢杂糜诳寺〉妮d體有pUC19(Yanish-Perron，Gene33(1985)，103-119)，pBluescript SK-(Stratagene)，pGEM-T(Promega)，pZer0(Invitrogen)，pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711-8720)及pBinAR(Hofgen和Willmitaer，Plant Science 66(1990)221-230)。
擴(kuò)增條件如下退火溫度 52℃，1分鐘變性溫度 92℃，1分鐘延長(zhǎng)溫度 72℃，1.5分鐘循環(huán)次數(shù) 30利用擴(kuò)增得到的片斷對(duì)位于載體ZAP Express的煙草(Nicotianatabacum(品種Samsun NN))的愈傷組織的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。為此，將來(lái)自cDNA文庫(kù)的2.5×105λ噬菌體涂布在含有以大腸桿菌XL1-Blue為細(xì)菌菌株的瓊脂平板上。按照標(biāo)準(zhǔn)的方法(Sambrook等，(1989)；Cold SpringHarbor Laboratory PressISBN 0＝87969-309-6)將噬菌體DNA轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜并且固定在濾膜上。使用的雜交探針是上文描述的經(jīng)過(guò)放射性標(biāo)記的PCR片斷，標(biāo)記是利用multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(AmershamBuchler)，在α-32P-dCTP(比活性3000Ci/mmol)存在下，根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行。在60℃，3 X SSPE，0.1％十二烷基硫酸鈉(w/v)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，0.02％Ficoll 400(w/v)和50mg/ml小牛胸腺DNA中預(yù)雜交12-16小時(shí)后，進(jìn)行膜的雜交(Sambrook等(1989)；Cold Spring HarborLaboratory PressISBN 0-87969-309-6)。然后將膜在2 X SSPE，0.1％十二烷基硫酸鈉(w/v)中，60℃下洗滌60分鐘。陽(yáng)性雜交的噬菌體可通過(guò)放射自顯影術(shù)成像，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化和分離。
可以鑒定和純化13種雜交信號(hào)，經(jīng)過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析，篩選出克隆GMP-6和GMP-7M用于雙鏈的序列測(cè)定。對(duì)測(cè)定的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，表明克隆GMP-7M的長(zhǎng)度為1973bp，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為1614bp完整的閱讀框，它編碼一個(gè)含有538氨基酸的蛋白質(zhì)，計(jì)算得到的此蛋白質(zhì)的分子重量為60.1KDa(SEQ-ID NO.1)。在假設(shè)的起始密碼子之前，有一個(gè)終止密碼子位于同一個(gè)閱讀框，由此建議GMP-7M是完整長(zhǎng)度的cDNA。因此，GMP-7M代表了GMP合成酶的第一個(gè)完整長(zhǎng)度的植物cDNA。GMP-6是一個(gè)部分克隆，它在5′端比GMP-7M短了217個(gè)核苷酸。GMP-7M顯示出與微生物和動(dòng)物中的GMP合成酶具有相似性。除了EST F14426編碼的部分氨基酸序列之外，植物中沒(méi)有其它的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的GMP合成酶具有同源性。GMP-7M與幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)中的GMP合成酶具有最大的相似性(62％)。很明顯位于GMP合成酶C末端的相似性要大于N末端區(qū)域。GMP-7M N末端的氨基酸序列與其它生物體如E.coli和集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis sp.)(附表1)中GMP合成酶的N末端一致。GMP-7M沒(méi)有被標(biāo)記的信號(hào)序列(通過(guò)PSORT程序發(fā)現(xiàn)，Nakai，K.，Institute forMolecular and Cellular Biology，Osaka University，Japan)這一點(diǎn)可能表示蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)。
表1對(duì)煙草(Nicotiana tabacum)(guaA_N.t＝GMP-7M)，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)(guaA_est_A.t，Genbank No.F14426)，E.coli(guaA_e.c，Genbank No.146276)，集胞藍(lán)細(xì)菌屬.(guaA_syn，Genbank No.1001583)，幽門(mén)螺桿菌(guaA_h.p，Genbank No.3122166)，Homo sapiens(guaA_human，Genbank No.1708072)中的GMP合成酶進(jìn)行序列比較。
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guaA_syu---------- ------guaA_h.p---------- ------guaA_humanimydltskpp gttewe
擴(kuò)增條件如下退火溫度 50℃，30秒變性溫度 92℃，30秒延長(zhǎng)溫度 72℃，3分鐘循環(huán)次數(shù) 25所得到的約為1670bp的片斷經(jīng)過(guò)NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，酶切位點(diǎn)是由寡聚核苷酸引入載體pTrc99A(Pharmacia)。將所得的構(gòu)建體GMP-7Trc轉(zhuǎn)化到E.coli菌株AT2465(遺傳標(biāo)記thi-1，guaA21，relA1，λ，spoT1)，并且分別平鋪在含有和不含有100μg/ml鳥(niǎo)嘌呤的M9基本培養(yǎng)基上(Sambrook等，(1989)Cold SpringHarbor Laboratoty PressISBN0-87969-309-6)?；九囵B(yǎng)基包含0.4％葡萄糖，0.2％酪蛋白氨基酸，100μg/ml硫胺素，100μg/ml肌苷，100μg/ml生物素，100μg/ml組氨酸，100μg/ml精氨酸，100μg/ml脫氧尿苷，100μM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25μg/ml氨芐青霉素。在平行試驗(yàn)中，將克隆載體pTrc99A轉(zhuǎn)化到AT2465。事實(shí)表明只有含有位于表達(dá)載體pTrc99A上的煙草GMP-7M cDNA的轉(zhuǎn)化細(xì)菌才能夠在不含有鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)(參見(jiàn)附表2)，這一點(diǎn)有力地指明GMP-7McDNA編碼活性的GMP合成酶。由GMP-7M編碼的酶因此代表了從植物中分離的第一個(gè)功能GMP合成酶。表2利用各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli AT2465在37℃，2天后的生長(zhǎng)情況
實(shí)施例4煙草GMP合成酶在E.coli中的過(guò)表達(dá)和抗體生產(chǎn)為了能夠在E.coli中過(guò)表達(dá)，通過(guò)以GMP-7M為模板和寡聚核苷酸GMPA5′-GCAATGGATCCTCAAACACAGGCG-3′和GMPB5′-AAAAGGATCCTACTTTGGTCACC-3′進(jìn)行的PCR反應(yīng)引入BamHI酶切位點(diǎn)，并且能夠在載體pET15b(Novagen)中克隆所得到的片斷。在N-末端具有六個(gè)組氨酸錨定位點(diǎn)的GMP-7M閱讀框就是以這種方式產(chǎn)生的。利用限制性消化對(duì)校對(duì)方向進(jìn)行核對(duì)和經(jīng)過(guò)序列測(cè)定去除聚合酶錯(cuò)誤，然后將所得的構(gòu)建體GMP-7E轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)(Stratagene)。通過(guò)離心收獲IPTG-誘導(dǎo)的一天培養(yǎng)物，將細(xì)胞沉積物進(jìn)行裂解，并且按照操作說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步處理，以進(jìn)行鎳親和色譜分析(“Qia-Express-kit”，Qiagen)?？梢砸赃@種方式純化GMP合成酶，達(dá)到大于95％的純度。按照常規(guī)方法，利用此蛋白質(zhì)在兔子體內(nèi)產(chǎn)生抗血清(依照合約由Eurogentec，Herstal，Belgium執(zhí)行)。
轉(zhuǎn)基因GMP合成酶反義植物及其子代與野生型(WT)的對(duì)照植株相比，生長(zhǎng)退化，次生葉片(sink leave)褪色，這些表型變化發(fā)生在早期生長(zhǎng)階段(參見(jiàn)附圖3)。與野生型相比，在生長(zhǎng)退化的植株中，可以通過(guò)RNA印跡雜交探測(cè)到GMP-7M RNA的量減少。取40μg的次生葉片(sinkleaves)的全RNA用于此項(xiàng)研究，按照Logemann等(Anal.Biochem.163(1987)，21)的描述從植物組織中分離全RNA。每次進(jìn)行分析，先將40μg的RNA分散在含有甲醛的1.5％的瓊脂糖凝膠中分級(jí)分離，再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond，Amersham)。按照Amasino(Anal.Biochem.152(1986)，304)的描述探測(cè)特異性轉(zhuǎn)錄，先產(chǎn)生一個(gè)反義鏈特異性的c-DNA探針，可利用BamHI和BglII酶切質(zhì)粒GMP-7M，分離出1600bp的片斷得到此探針。利用寡聚核苷酸5′-GAT ACG TCG TCA AGG AAC TTG-3′進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，探針雜交按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，參見(jiàn)Hybond用戶信息，Amersham。雜交信號(hào)[sic]可通過(guò)使用Kodak X-OMATAR膠片獲得放射自顯影顯示出來(lái)?？梢钥闯錾L(zhǎng)表型的表達(dá)和GMP-7M RNA含量的減少具有明確的相關(guān)性(附圖3)。
而且在蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)中可以探測(cè)到，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因品系中的GMP合成酶的量減少。試驗(yàn)操作包括從次生葉片(sink leaves)制備總蛋白抽提物，以標(biāo)準(zhǔn)方法在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜。然后利用IgG-堿性磷酸酶共軛體和BCIP/NBT系統(tǒng)(Sigma)進(jìn)行檢測(cè)。
另外，可以通過(guò)實(shí)施例8所描述的體外試驗(yàn)確定，在生長(zhǎng)退化的轉(zhuǎn)基因品系中的GMP合成酶的活力減少。
表達(dá)水平和GMP合成酶活力和生長(zhǎng)表型之間的關(guān)聯(lián)說(shuō)明GMP合成酶是除草劑作用的合適的靶蛋白。
或者，GMP合成酶活力也可以利用一個(gè)新的系統(tǒng)來(lái)測(cè)定，即偶聯(lián)檢測(cè)所產(chǎn)生的谷氨酸。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是較少的偶聯(lián)反應(yīng)步驟并且提供了較大的信號(hào)強(qiáng)度。(GMP-S＝GMP合成酶，GluDH＝谷氨酸脫氫酶，APAD＝3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸)為此，將反應(yīng)混合物(見(jiàn)下)在37℃下培育60分鐘，然后在95℃下培育5分鐘以終止反應(yīng)。通過(guò)光度測(cè)定的方法在363nm下測(cè)定APADH的增加來(lái)檢測(cè)在測(cè)定混合物(見(jiàn)下)中谷氨酸的形成。
反應(yīng)混合物100μL 750mM Tris/HCl緩沖劑pH7.8100μL 100mM MgCl25 100μL 80mM KCl100μL 20mM XMP100μL 200mM L-谷氨酰胺400μL H2O100μL蛋白質(zhì)提取物10 1000μL測(cè)定混合物375μL100mM Tris-HCl緩沖劑pH8.015 75 μL500mM KCl125μL H2O75 μL3mMAPAD100μL反應(yīng)混合物750μL
序列表<110>巴斯福股份公司<120>植物GMP合成酶<130>DE 19947490.7<140>0050-50777<141>1999-10-01<160>4<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1973<212>DNA<213>煙草<220><221>CDS<222>(65)..(1678)<400>1gaattcggca cgagatttct ctctatcttt cttcctccca cccaccaccc accctcccct 60agca atg gaa cct caa aca cag gcg aag aaa tca aac ctc gta cta atc 109Met Glu Pro Gln Thr Gln Ala Lys Lys Ser Asn Leu Val Leu Ile1 5 10 15cta gac tac ggt tct cag tac act cac cta atc acc cgc cga atc cga 157Leu Asp Tyr Gly Ser Gln Tyr Thr His Leu Ile Thr Arg Arg Ile Arg20 25 30agc cta tca att ttc tca ctc acc att aac ggc acc tct tcg tta gac 205Ser Leu Ser Ile Phe Ser Leu Thr Ile Asn Gly Thr Ser Ser Leu Asp35 40 45tcc ata aaa gaa ctc gac cca cgt gtc att atc ctc tcg ggt gga ccc 253Ser Ile Lys Glu Leu Asp Pro Arg Val Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro50 55 60cac agc gtc cac gct gac ggc gca ccg tgt ttc cca cct ggg ttc atc 301His Ser Val His Ala Asp Gly Ala Pro Cys Phe Pro Pro Gly Phe Ile65 70 75gaa tac gtc gag tca cgt ggg att cac gtg ttg ggt ata tgt tat ggg 349Glu Tyr 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權(quán)利要求
1.包含植物GMP合成酶編碼區(qū)的一段DNA序列，在這段DNA序列中具有如SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的核苷酸序列。
2.一段DNA序列，它可以與如權(quán)利要求1所述的SEQ-ID NO1或SEQ-ID NO3所示的DNA序列進(jìn)行雜交，或者這些序列的一部分，或者從這些序列經(jīng)插入、刪除或取代作用衍生得到的衍生體，并且它編碼具有GMP合成酶生物活性的蛋白質(zhì)。
3.具有GMP合成酶活性的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列代表SEQ-IDNO2或4所示序列中至少100個(gè)氨基酸的一部分。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列是SEQ-ID NO2或4中50-300的部分序列。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列是如SEQ-IDNO2或4所描述的序列。
6.利用如權(quán)利要求1或2所述的一段DNA序列引導(dǎo)進(jìn)入原核或真核細(xì)胞，這個(gè)序列可選擇性的與確保細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的控制元件相連接，導(dǎo)致可轉(zhuǎn)錄mRNA的表達(dá)，并引發(fā)植物GMP合成酶的合成。
7.利用如權(quán)利要求1或2所述的一段DNA序列以產(chǎn)生一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)，用于鑒定具有除草劑作用的植物GMP合成酶抑制劑。
8.用于尋找抑制植物GMP合成酶活力的一種方法，它包括第一步利用如權(quán)利要求1或2所述的一段DNA序列制備GMP合成酶，第二步在測(cè)試物質(zhì)存在的條件下測(cè)定植物GMP合成酶的酶活力。
9.如權(quán)利要求8所述的一種方法，其中植物GMP合成酶的測(cè)定是以在高量篩選方式(HTS)進(jìn)行的。
10.用于鑒定具有除草作用的物質(zhì)的方法，此類(lèi)物質(zhì)抑制植物GMP合成酶活性，方法包括a)制備轉(zhuǎn)基因植物，植物組織或植物細(xì)胞，它們包含一段編碼具有GMP合成酶活性的附加DNA序列，并且能夠表達(dá)具有酶活性的GMP合成酶；b)將一種物質(zhì)施用于轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分，以及未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分；c)測(cè)定施用化學(xué)物質(zhì)后轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率；以及d)比較施用化學(xué)物質(zhì)后轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率；未轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率受抑制，而轉(zhuǎn)基因的植物，植物細(xì)胞，植物組織或植物部分的生長(zhǎng)和成活率沒(méi)有受到抑制，這說(shuō)明了b)中的物質(zhì)表現(xiàn)出除草的活性，抑制了植物GMP合成酶的活性。
11.一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)，它是建立在表達(dá)如權(quán)利要求1或2所述的SEQ-IDNO1或SEQ-ID NO3所示的一段DNA序列基礎(chǔ)上，用于鑒定具有除草劑作用的植物GMP合成酶抑制劑。
12.如權(quán)利要求11所述的用于鑒定具有除草劑作用的植物GMP合成酶抑制劑的一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)，其中將酶與要被檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)底物一起培育，適當(dāng)反應(yīng)時(shí)間之后，通過(guò)與未受抑制的酶的酶活力進(jìn)行比較，測(cè)定此酶的酶活力。
13.一種植物GMP合成酶抑制劑。
14.利用如權(quán)利要求11或12所述的測(cè)試系統(tǒng)鑒定的一種植物GMP合成酶抑制劑。
15.如權(quán)利要求13或14所述的抑制劑用作除草劑。
16.一種用于清除有害植物生長(zhǎng)的方法，包括利用一種化合物處理需要被清除的植物，此化合物能夠特異性的與由如權(quán)利要求1或2所述的一段DNA序列編碼的GMP合成酶結(jié)合，并且抑制GMP合成酶的功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼具有GMP合成酶(EC6.3.5.2)活性多肽的DNA。本發(fā)明還涉及利用此核苷酸產(chǎn)生一個(gè)測(cè)試系統(tǒng)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1390261SQ00813718
公開(kāi)日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月1日
發(fā)明者J·萊爾希爾, T·埃爾哈德特, U·蘇恩瓦德, R·博爾迪特 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司