專利名稱：抗嗎啡單抗細(xì)胞株的建立和嗎啡雙面檢測(cè)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗嗎啡單抗細(xì)胞株的建立和嗎啡雙面檢測(cè)試紙的制作方法，具體地說(shuō)，涉及一種半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙的制作方法。
濫用藥物已成為世界公害，是當(dāng)今世界嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題之一，其中毒品特別是海洛因、嗎啡等物質(zhì)的危害很大，它嚴(yán)重威脅著人類的健康和安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至1997年底，全世界有1000萬(wàn)人因卷入吸毒而喪失勞動(dòng)能力。因而世界范圍內(nèi)的公安部門，正在把嚴(yán)厲打擊販毒作為一項(xiàng)重要工作來(lái)做。為配合這種工作，一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適于大規(guī)模普查和易于野外操作的檢測(cè)方法的建立就顯得尤其必要。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)尿中海洛因排泄物嗎啡的檢測(cè)，一般采用薄層色譜、色質(zhì)聯(lián)用、高壓液相色譜、酶聯(lián)免疫吸附分析等方法。這些方法有的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，有的依賴儀器，而在實(shí)際使用時(shí)，都存在明顯的缺點(diǎn)。盡管新近有一種較方便的嗎啡免疫層析試紙上市，但這種試紙一是只能定性檢測(cè)，二是一條試紙不能同時(shí)檢測(cè)游離嗎啡和總嗎啡，因而假陰性的存在是不可避免的，而且是難以克服的。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有嗎啡檢測(cè)方法的缺陷，而提供一種抗嗎啡單抗細(xì)胞株的建立和嗎啡雙面檢測(cè)試紙的制作方法，且用該方法制備的雙面檢測(cè)試紙是一種半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙。
本發(fā)明的半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙的制作方法包括如下步驟①N位、3位和6位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備；②抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株的建立及抗嗎啡多克隆抗體和單克隆抗體的制備；③免疫親和層析固定相的制備；④免疫親和純化多克隆抗體和單克隆抗體，及交叉純化多克隆抗體；⑤膠體金標(biāo)記抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體和抗N位嗎啡單克隆抗體復(fù)合物的制備；⑥用于免疫層析試紙的層析膜的制備；⑦組裝雙面免疫層析試紙，以便半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡。
本發(fā)明的半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙的制作方法，其中N位嗎啡-蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的將1—10克嗎啡，5—10克氯甲酸酯和1—10克碳酸鹽溶于50—100mL溶劑，回流，過(guò)濾，蒸餾產(chǎn)物，然后加入1—20mL64％—97％的水合肼，回流2—10小時(shí)，冷至室溫，過(guò)濾得降嗎啡，熔點(diǎn)為272℃—274℃；取0.1—10克降嗎啡、0.2—20克溴代胺和0.1—15克碳酸鹽，溶于10—50mL二甲亞砜，加水合肼10mL，回流，純化收集產(chǎn)品；取該產(chǎn)品0.1—10克溶于10—50mL水，加入牛血清白蛋白100—900mg，將pH調(diào)到3—7，再加入5—25克碳二亞胺，反應(yīng)4—24小時(shí)，得到N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物；同上法，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白得到N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物；3位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的1-10克嗎啡溶于10—100mL二甲基亞砜中，加入氫氧化鉀5—50克，溴乙酸1—10克，攪拌2小時(shí)，倒入冰水，水溶液用鹽酸酸化至pH2—7，收集固體，得3位羧甲基嗎啡，重結(jié)晶產(chǎn)物的熔點(diǎn)為292℃～293℃；取0.5—10克羧甲基嗎啡溶于10—100mL二氧六環(huán)中，加入0.2—50mL氯甲酸酯和0.4mL三級(jí)胺，攪拌，得溶液A；0.5％牛血清白蛋白50—200mL與二氧六環(huán)混合，調(diào)pH至堿性，得溶液B；將溶液A上清緩慢加入到溶液B中，攪拌2—4小時(shí)，濃縮至20～30mL，對(duì)生理鹽水透析，得到3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物；同上，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白，即可得到3位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物；6位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的1.0—10克嗎啡溶于10—100mL苯中，加入1.0—10克琥珀酸酐，回流1—10小時(shí)，冷卻到室溫，固體溶于10—200mL水中，調(diào)pH1—6，過(guò)濾，調(diào)pH至7—12，過(guò)濾，再調(diào)pH至酸性，得產(chǎn)品；取該產(chǎn)品0.1—5克溶于二氧六環(huán)，加入10—50μl氯甲酸酯，10—100μl三級(jí)胺，攪拌30分鐘，得到A液；1％牛血清白蛋白與二氧六環(huán)混合，調(diào)pH為8—12，得到B液；然后將A的上清液緩慢加入B液，冷卻；濃縮，透析，得到6位嗎啡-牛血清白蛋白復(fù)合物；同上法，用雞卵清白蛋白代替牛血清白蛋白，得到6位嗎啡-雞卵清白蛋白復(fù)合物。
抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株及抗嗎啡單克隆抗體是這樣建立和制備的(1)分泌抗嗎啡單克隆抗體的細(xì)胞株的建立，①動(dòng)物免疫取1～10mgN位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原，用生理鹽水稀釋成0.5mL，再與等量的完全福氏佐劑混合，經(jīng)腹腔免疫Balb/C小鼠，2周后再用同量N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原與等量不完全福氏佐劑混合，加強(qiáng)免疫，2周后再加強(qiáng)免疫一次，第二次加強(qiáng)免疫后2周即可考慮作細(xì)胞融合，融合前3天，直接用1—5mg N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原脾內(nèi)追加免疫一次，②細(xì)胞融合細(xì)胞融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合前一天取飼養(yǎng)細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合當(dāng)天，收集SP2/0細(xì)胞，取脾細(xì)胞，用50％聚乙二醇融合，置于鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第15天取上清篩選雜交瘤，③陽(yáng)性抗嗎啡單克隆抗體的篩選包被用0.05MpH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物稀釋至1～10μg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過(guò)夜，然后棄去孔內(nèi)的液體，用生理鹽水—吐溫洗滌緩沖液洗3次，拍干，加樣將有克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)上清按順序加入，100μL/孔，37℃溫育1小時(shí)，洗滌3次，甩干，加二抗用吐溫洗滌液稀釋辣根酶標(biāo)羊抗鼠，100μL/孔，置37℃溫育一小時(shí)；洗滌、拍干，顯色加新配制的底物工作液100μL/孔，37℃溫育10～30分鐘，終止反應(yīng)每孔加2M H2SO4終止液50μL，結(jié)果判斷陰性對(duì)照孔無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，測(cè)定OD值，以空白對(duì)照孔調(diào)零，OD值大于或等于陰性對(duì)照2.1倍即為陽(yáng)性，對(duì)其中陽(yáng)性的上清再作游離嗎啡的阻斷實(shí)驗(yàn)，篩選出特異陽(yáng)性細(xì)胞，及時(shí)擴(kuò)大、凍存、轉(zhuǎn)種并進(jìn)行有限稀釋法純化，即可獲得抗嗎啡單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，(2)接種雜交瘤細(xì)胞在接種雜交瘤細(xì)胞前1周，先給Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟；將抗嗎啡單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106—2×106/mL，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.5mL；(3)采集腹水接種雜交瘤細(xì)胞后第10天，用注射器抽取腹水，300g離心15分鐘，收集上清，即得抗嗎啡單克隆抗體；抗3位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的將6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔，每足注射0.1—1mL3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后加強(qiáng)免疫，用同劑量3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清；抗6位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的將6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔，每足注射0.1—1mL6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后加強(qiáng)免疫，用同劑量6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清。
免疫親和層析固定相是這樣制備的N位嗎啡—Sepharose4B的制備取活化的Sepharose4B20—50mL，加入由權(quán)利要求2中制備的嗎啡衍生物50—100mg，用碳酸鹽調(diào)pH＝8.0—12.0，攪拌3小時(shí)，然后取0.2—1.0克硼氫化鉀溶于20—40mL水，攪拌下加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)5小時(shí)，即得N位嗎啡—Sepharose4B免疫親和層析固定相；3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B的制備取活化的Sepharose4B40—80mL，調(diào)pH8.0—12.0，攪拌3小時(shí)，然后取0.5—2.0克硼氫化鉀溶于40mL水，攪拌下加入反應(yīng)體系，pH維持在6.0～8.0，反應(yīng)5小時(shí)，用蒸餾水洗滌后，平分為兩份，一份加入權(quán)利要求2中制備的3—羧甲基嗎啡50—100mg，另一份加入權(quán)利要求2中制備的6—琥珀酰嗎啡60—100mg，調(diào)pH至3—7，再分別加入碳二亞胺50—200mg，室溫反應(yīng)3小時(shí)，即分別得到3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相和6位嗎啡—Sepharose4B免疫親和層析固定相；以上得到三種嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相，分別是N位嗎啡—Sepharose4B、3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B。
免疫親和純化多克隆抗體和單克隆抗體，及交叉純化多克隆抗體是這樣進(jìn)行的①抗N位嗎啡單克隆抗體和抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體的預(yù)處理將1—10mL血清或腹水用磷酸緩沖液稀釋一倍，經(jīng)0.22μm微孔膜過(guò)濾，4℃、10000g離心；②辛酸—硫酸銨法純化向1—10毫升預(yù)處理的抗血清或腹水中加入2—10毫升0.06MpH4.0的乙酸緩沖液，調(diào)pH至4.8，于攪拌下30分鐘內(nèi)緩慢加入辛酸33—300μL，4℃靜置2小時(shí)，15000g、4℃離心30分鐘，棄沉淀，上清加入1/10體積的0.1MpH7.4磷酸緩沖液，調(diào)pH至7.4，30分鐘內(nèi)加入飽和硫酸銨，使成45％飽和度，靜置1小時(shí)，4℃下10000g離心30分鐘，沉淀溶于1/2量pH7.4磷酸鹽緩沖液中，對(duì)上述緩沖液透析，4℃下10000g離心30分鐘，—20℃保存；
③免疫親和層析純化單克隆抗體和多克隆抗體及交叉純化多克隆抗體將經(jīng)辛酸—硫酸銨純化的抗體用上述制備的與之對(duì)應(yīng)的N位、 3位及6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相25cm*2cm作免疫親和層析純化，色譜柱均先用0.5M氯化鉀-0.01MpH7.4的磷酸緩沖液平衡，上樣后，用0.5M氯化鉀-0.01MpH7.4磷酸緩沖液洗脫雜蛋白，再用0.5M氯化鉀-0.1MpH0.5的甲酸洗脫液洗脫抗體峰，得純化抗體，用于標(biāo)記，其中抗N位嗎啡單克隆抗體純化用N位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化；抗3位嗎啡多克隆抗體純化先用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化，收集的抗體峰再用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化，收集既能識(shí)別3位衍生嗎啡又能識(shí)別6位衍生嗎啡的抗體；而抗6位嗎啡多克隆抗體則先用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化，收集的抗體峰再用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化，收集既能識(shí)別6位衍生嗎啡又能識(shí)別3位衍生嗎啡的抗體。
膠體金標(biāo)記抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體和抗N位嗎啡單克隆抗體復(fù)合物是這樣制備的取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加熱至沸騰，加入8mL 1％檸檬酸三鈉水溶液，煮沸5分鐘，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為20nm；各取50mL膠體金三份，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將三份金溶膠分別與免疫親和純化的抗3位嗎啡多克隆抗體和抗6位嗎啡多克隆抗體及抗N位嗎啡單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇20M水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品6000g離心45分鐘，離心后，沉淀物用生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存；將按上述方法制備的膠體金標(biāo)記的以1∶5混合的兩類多克隆抗體及單克隆抗體分別分散在厚度1mm的三張玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
免疫層析試紙的層析膜是這樣制備的將硝酸纖維素膜按25×100mm的尺寸剪裁A、B兩塊。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析、濃度調(diào)整為0.02mg/mLN位嗎啡一雞卵清白蛋白溶液在A膜上每隔2mm等距離噴涂5條帶；，再將按1∶5混合的0.05mg/mL的3位、6位嗎啡一雞卵清白蛋白經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析后在B膜上每2mm等距離噴涂5條帶，然后再在A、B膜的末端各噴涂一條羊抗鼠和羊抗兔的混合帶，室溫干燥30分鐘，將膜置于含1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封貯藏。
雙面免疫層析試紙的組裝是這樣進(jìn)行的取一塊尺寸為80mm×100mm，厚度約0.8mm的硬質(zhì)塑料底板，分別在其正反兩面粘貼25mm×100mmA膜和B膜及5mm×100mm凍干金標(biāo)單抗和混合多抗，再在兩面的兩端順次粘貼250mm×100mm吸水紙，其中在A膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體而在B膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，再按縱向切成寬度4mm的條狀，最后用鋁泊袋干燥封裝。
本發(fā)明所述的制作方法的優(yōu)點(diǎn)在于用其制作的免疫層析試紙是一種半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的免疫層析試紙。使用這種試紙可快速、簡(jiǎn)便地得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，并能最大限度地避免假陰性。
下面對(duì)本發(fā)明所述制作方法的每一步驟作詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明所述制作方法的第1步，其中N位嗎啡-蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的將1克嗎啡，5.5克氯甲酸甲酯和4.2克碳酸氫鈉溶于50mL氯仿中，回流20小時(shí)，過(guò)濾，氯仿洗凈，合并濾液，用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得1.47克中間產(chǎn)物，然后加入1mL 97％的肼，再加入2mL 97％的肼，再加入4mL 64％的肼，回流63小時(shí)，冷至室溫，過(guò)濾，依次用水、丙酮和氯仿洗滌，得到0.5克降嗎啡，其熔點(diǎn)為272℃—274℃。取0.5克降嗎啡、0.8克4—溴丁基鄰苯二甲酰亞胺和0.3克無(wú)水碳酸鈉，溶于12mL二甲基甲酰胺中，回流2小時(shí)，然后減壓、濾除固體碳酸鈉，蒸除溶劑后，加入90％水合肼10mL，1mL烯丙醇，回流1小時(shí)，然后過(guò)硅膠柱純化收集4—氨基丁基嗎啡0.4克；取4—氨基丁基嗎啡100mg溶于10mL水，加入牛血清白蛋白100mg，將pH調(diào)到5.5，再加入100—500mg碳二亞胺，反應(yīng)4小時(shí)，然后透析，冷凍干燥，得到N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物。
同上法，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白得到N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物。
3位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的將1克嗎啡溶于10mL二甲基亞砜中，加入氫氧化鉀5克，攪拌5分鐘，再加入溴乙酸1克，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，然后倒入100mL的冰水中，過(guò)濾除去不溶物，其水溶液用2M鹽酸酸化至pH≈5左右，收集固體，洗滌，干燥得到3位羧甲基嗎啡0.8克，經(jīng)無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到0.5克產(chǎn)物，其熔點(diǎn)為292℃～293℃。
取0.5克羧甲基嗎啡溶于50mL二氧六環(huán)中，加入0.2mL氯甲酸異丁酯和0.4mL三丁胺，混合攪拌30分鐘，得溶液A；稱取牛血清白蛋白0.5克，溶于100mL水中，加100mL二氧六環(huán)，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.5，冰水浴至5℃左右，得溶液B。將溶液A上清緩慢加入到溶液B中，然后補(bǔ)加二氧六環(huán)50mL，在5℃下攪拌4小時(shí)，減壓濃縮至20～30mL，裝入透析袋對(duì)生理鹽水透析48小時(shí)，其間換水3～5次。然后冰凍干燥，得到3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物。
同上，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白，即可得到3位嗎啡·雞卵清白蛋白復(fù)合物。
6位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的將1.3克嗎啡溶于20mL苯中，加入1.3克琥珀酸酐，加熱回流2小時(shí)，再補(bǔ)加1.3克琥珀酸酐，繼續(xù)回流1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻到室溫，棄上清，固體剩余物溶于10mL水中，用2M鹽酸調(diào)pH等于2，過(guò)濾，濾液用2.5M氫氧化鈉調(diào)pH等于9，過(guò)濾，濾液再調(diào)pH等于5，過(guò)濾，收集固體，干燥，得到琥珀酰嗎啡1.0克；取0.129克琥珀酰嗎啡溶于8.5mL二氧六環(huán)中，加入33μl氯甲酸異丁酯，66μl三丁胺，在室溫下攪拌30分鐘，得到A液，同時(shí)稱取0.17克牛血清白蛋白液溶于35mL水中，緩慢加入35mL二氧六環(huán)，加完后調(diào)pH為8.5，冷卻至4℃，得到B液。然后將A清液，緩慢加到B液中，再加入8.5mL水，放入冰箱過(guò)夜；減壓40℃蒸餾濃縮上述溶液至17mL，透析，換液3次，冷凍，干燥得到6位嗎啡-牛血清白蛋白復(fù)合物。
同上法，用雞卵清白蛋白代替牛清白蛋白，得到6位嗎啡-雞卵清白蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明所述制作方法的第2步，其中抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株和抗嗎啡單克隆抗體是這樣建立和制備的(1)分泌抗嗎啡單克隆抗體的細(xì)胞株的建立，①動(dòng)物免疫取10mgN位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原，用生理鹽水稀釋成0.5mL，再與等量的完全福氏佐劑混合，充分乳化，經(jīng)腹腔初次免疫8周齡雌性Balb/C小鼠，2周后再用10mgN位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原以生理鹽水稀釋成0.5mL，與等量的不完全福氏佐劑混合，充分乳化，加強(qiáng)免疫，2周后再加強(qiáng)一次。第二次加強(qiáng)免疫后2周即可考慮作細(xì)胞融合，融合前3天，直接用5mgN位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原脾內(nèi)追加免疫一次。②細(xì)胞融合細(xì)胞融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，供融合用。融合前一天取飼養(yǎng)細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞融合當(dāng)天，收集SP2/0細(xì)胞，取脾細(xì)胞，用50％聚乙二醇融合，置于鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第15天取上清篩選雜交瘤。③陽(yáng)性抗嗎啡單克隆抗體的篩選包被用0.05MpH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將純化的用于篩選的N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物稀釋至10μg/mL包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過(guò)夜，然后棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用的生理鹽水—吐溫洗滌緩沖液洗3次，拍干。加樣將有克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)上清按順序加入，100μL/孔，每塊板應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各二孔。37℃溫浴1小時(shí)，洗滌3次，每次5分鐘，甩干。加二抗先用生理鹽水洗滌緩沖液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，再100μL/孔，置37℃溫浴一小時(shí)；然后洗滌、拍干。顯色加新配制的底物工作液100μL/孔，37℃溫浴10～30分鐘。終止反應(yīng)每孔加2M H2SO4終止液50μL。結(jié)果判斷陰性對(duì)照孔無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，于白色背景直接用肉眼觀察結(jié)果，根據(jù)顏色深淺，以“+”、“-”標(biāo)明結(jié)果。測(cè)定OD值，以空白對(duì)照孔調(diào)零，OD值大于或等于陰性對(duì)照2.1倍即為陽(yáng)性。對(duì)其中陽(yáng)性的上清再作游離嗎啡的阻斷實(shí)驗(yàn)，挑出特異陽(yáng)性細(xì)胞，及時(shí)擴(kuò)大、凍存、轉(zhuǎn)種并進(jìn)行有限稀釋法純化，即可獲得抗嗎啡單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(2)接種雜交瘤細(xì)胞在接種雜交瘤細(xì)胞前1周，先給Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟；將抗嗎啡單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)至1～2×106/mL，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.5mL；(3)采集腹水接種雜交瘤細(xì)胞后第10天，用注射器抽取腹水，300g離心15分鐘，收集上清，即得抗嗎啡單克隆抗體。
抗3位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的取6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔。初次免疫時(shí)每足注射0.5mL3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，用0.5mL3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化的抗原注射于四肢肘窩處，同劑量于背部、肩關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)等部位進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫。每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果決定放血的時(shí)間，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清。
抗6位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的取6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔。初次免疫時(shí)每足注射0.5mL6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，用0.5mL6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化的抗原注射于四肢肘窩處，同劑量于背部、肩關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)等部位進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫。每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果決定放血的時(shí)間，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清。
本發(fā)明所述制作方法的第3步，其中所述免疫親和層析固定相是這樣制備的N位嗎啡—Sepharose4B的制備取活化的Sepharose4B20mL，加入由權(quán)利要求2中制備的4—氨基丁基嗎啡50mg用5％碳酸鉀調(diào)pH≈8.0，緩慢攪拌3小時(shí)，然后取0.27克硼氫化鉀溶于20mL水，緩慢攪拌下加入到上述反應(yīng)體系中，反應(yīng)5小時(shí)，然后用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，即為N位嗎啡—Sepharose4B免疫親和層析固定相。
3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B的制備取活化的Sepharose4B40mL，加入3mL二胺，調(diào)pH8.0，攪拌3小時(shí)，然后取0.54克硼氫化鉀溶于20mL水，緩慢攪拌下加入到上述的反應(yīng)體系中，反應(yīng)5小時(shí)，pH維持在6.5～7.5之間，用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，然后平分為兩份，一份加入權(quán)利要求2中制備的3—羧甲基嗎啡50mg，另一份加入權(quán)利要求2中制備的6—琥珀酰嗎啡60mg，均輕攪混勻，調(diào)pH至5.5，再分別加入碳二亞胺100—500mg，室溫反應(yīng)3小時(shí)，再用蒸餾水反復(fù)洗滌5次，即分別得到3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相和6位嗎啡—Sepharose4B免疫親和層析固定相。
以上得到三種嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相，分別是N位嗎啡—Sepharose4B、3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B。
本發(fā)明所述制作方法的第4步，其中所述免疫親和純化單克隆抗體和多克隆抗體及多克隆抗體的交叉純化是這樣進(jìn)行的①抗N位嗎啡單克隆抗體和抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體的預(yù)處理將1.5mL血清或1mL腹水用生理鹽水稀釋一倍后，用0.22μm孔徑的微孔膜過(guò)濾，再4℃、10000g，15分鐘除去細(xì)胞殘?jiān)约靶☆w粒物質(zhì)；②辛酸—硫酸銨法純化向一份預(yù)處理的抗腹水或血清中加入2份0.06MpH4.0的乙酸緩沖液，用0.1M的鹽酸調(diào)pH至4.8，于室溫?cái)嚢柘略?0分鐘內(nèi)逐滴緩慢加入辛酸，每毫升抗血清或腹水加33μL，4℃靜置2小時(shí)，15000g、4℃離心30分鐘，棄沉淀。上清加入生理鹽水，用1M的氫氧化鈉調(diào)pH至7.4，在4℃下于30分鐘內(nèi)加入飽和的硫酸銨，使成45％飽和度，靜置1小時(shí)，4℃下10000g離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于1/2量pH7.4含137mM氯化鈉、2.6mM氯化鉀的生理鹽水中，對(duì)100倍的上述生理鹽水于4℃透析過(guò)夜。4℃下10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，分裝，-20℃保存；③免疫親和純化單克隆抗體和多克隆抗體及多克隆抗體的交叉純化將經(jīng)辛酸—硫酸銨純化的抗體采用上述制備的與之對(duì)應(yīng)的N位、3位及6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相25cm×2cm作免疫親和層析純化，色譜柱均先用0.5M氯化鉀-0.01MpH7.0的生理鹽水緩沖液平衡，基線平直后，上待純化的抗體樣品，然后0.5M氯化鉀-0.01MpH7.0的生理鹽水緩沖液洗脫除去雜蛋白，再用0.5M氯化鉀-0.1MpH0.5的甲酸洗脫液洗脫，收集抗體峰，得純化的抗體，用于標(biāo)記。其中抗N位嗎啡單克隆抗體純化用N位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相；抗3位嗎啡多克隆抗體純化先用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相，收集的抗體峰再用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化收集既能識(shí)別3位衍生嗎啡又能識(shí)別6位衍生嗎啡的抗體；而抗6位嗎啡多克隆抗體純化則先用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相，收集的抗體峰再用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化收集既能識(shí)別6位衍生嗎啡又能識(shí)別3位衍生嗎啡的抗體。
本發(fā)明所述制作方法的第5步，其中所述膠體金標(biāo)記嗎啡多克隆抗體和單克隆抗體復(fù)合物是這樣制備的取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加熱至沸騰，加入8mL1％檸檬酸三鈉水溶液，煮沸約5分鐘后出現(xiàn)橙紅色。膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定，顆粒直徑為20nm；各取50mL膠體金三份，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將三份金溶膠分別與免疫親和純化抗3位嗎啡多克隆抗體和抗6位嗎啡多克隆抗體及抗N位嗎啡單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇20,000水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品先4℃6000g高速離心45分鐘，除去游離的未結(jié)合的蛋白及未充分穩(wěn)定的金顆粒和凝集物，離心后，小心吸出上清液，沉淀物用生理鹽水混懸，反復(fù)離心2次，再用生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存；將按上述方法制備的膠體金標(biāo)記的以1∶5混合的兩類多克隆抗體及單克隆抗體分別分散在厚度1mm的三張玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
本發(fā)明所述的制作方法第6步，其中所述用于免疫層析試紙的層析膜是這樣制備的將硝酸纖維素膜按25mm×100mm的尺寸剪裁A、B兩塊。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析、濃度調(diào)整為0.02mg/mLN位嗎啡—雞卵清白蛋白溶液在A膜上每隔2mm等距離噴涂5條帶；再將按1∶5混合的0.05mg/mL的3位、6位嗎啡—雞卵清白蛋白經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析后在B膜上每2mm等距離噴涂5條帶，然后再在A、B膜的末端各噴涂一條羊抗鼠和羊抗兔的混合帶，室溫干燥30分鐘，再將膜置于含1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分于37℃蒸發(fā)，置室溫下密封干燥處貯藏。
本發(fā)明所述制作方法的第7步，其中所述雙面免疫層析試紙的組裝是這樣進(jìn)行的取一塊尺寸為80mm×100mm厚度約0.8mm的硬質(zhì)塑料底板，分別在其正反兩面粘貼25mm×100mmA膜和B膜及5mm×100mm凍干金標(biāo)單抗和混合多抗，再在兩面的兩端順次粘貼250mm×100mm吸水紙，其中在A膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體而在B膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，再按縱向切成寬度4mm的條狀，最后用鋁泊袋干燥封裝。
下面說(shuō)明用本試紙條檢測(cè)用健康人的尿稀釋的標(biāo)準(zhǔn)嗎啡的情形將用本發(fā)明所述的制作方法第7步組裝的半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙從鋁泊袋中取出，垂直插入用健康人尿稀釋的300ng/mL，500ng/mL，1μg/mL，3μg/mL，10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)嗎啡溶液中，插入深度不得超過(guò)吸水紙上沿，10秒鐘后從尿液中取出，垂直放置，5分鐘后用檢查試紙條的正反兩面的條帶數(shù)目。當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度為0ng/mL或小于300ng/mL時(shí)，除A、B兩面均出現(xiàn)質(zhì)控線外，還各出5條紅色的檢測(cè)線。當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度為大于300ng/mL而小于500ng/mL時(shí)，除出現(xiàn)質(zhì)控線外，還均出現(xiàn)4條檢測(cè)線；當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度為大于500ng/mL而小于1μg/mL時(shí)，除出現(xiàn)質(zhì)控線外，還出現(xiàn)3條檢測(cè)線；當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度為大于1μg/mL而小于3μg/mL時(shí)，除出現(xiàn)質(zhì)控線外，還出現(xiàn)2條檢測(cè)線；當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度大于3μg/mL而小于10μg/mL時(shí)，除出現(xiàn)質(zhì)控線外，還出現(xiàn)1條檢測(cè)線；當(dāng)尿液中游離嗎啡濃度大于10μg/mL時(shí)，只出現(xiàn)質(zhì)控線，而不出現(xiàn)檢測(cè)線。游離嗎啡濃度(M游離)A、B兩面檢測(cè)線數(shù)目 A、B兩面質(zhì)控線數(shù)目M游離＜300ng/ml5×2 2(均有)300ng/ml≤M游離＜500ng/ml4×2 2(均有)500ng/ml≤M游離＜ 1μg/ml3×2 2(均有)1μg/ml≤M游離＜ 3μg/ml2×2 2(均有)3μg/ml≤M游離＜10μg/ml1×2 2(均有)10μg/ml≤M游離 0 2(均有)下面說(shuō)明如何使用GC—MS確定尿樣中嗎啡總濃度將檢測(cè)尿樣分成各10mL，同時(shí)取正常尿80mL分成八等份，一份作空白對(duì)照，其他的添加1μl、2μl、4μl、8μl、16μl和32μl、64μl的1mg/mL嗎啡，降嗎啡作內(nèi)標(biāo)，均加入濃鹽酸1mL，封口，用15磅蒸氣水解1小時(shí)，冷卻后，加入6mL氯仿提取，棄去氯仿，水中加入12M氫氧化鈉溶液1mL，用碳酸鈉溶液調(diào)pH至9.0，加氯仿—異丙醇(9∶1)10mL提取，離心分離，有機(jī)物于55℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈?，殘?jiān)尤氪佐瓦拎じ?.2mL，加蓋，50℃水浴反應(yīng)30分鐘，氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)尤?0μl氯仿溶解，取1μl溶液進(jìn)樣，每個(gè)樣重復(fù)三次。
GC—MS條件為儀器為HP5890A氣帶色譜儀和HP質(zhì)量選擇檢測(cè)器，HP—1毛細(xì)管柱(25m×0.2mm)，載氣為氦氣，柱頭壓為5psi，柱溫為270度，進(jìn)樣溫度為250度。
同上重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，推算尿樣中總嗎啡濃度，取濃度最高尿樣作為總嗎啡標(biāo)樣，并經(jīng)氮?dú)鉂饪s再用正常人尿稀釋成10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.3μg/mL等5個(gè)梯度供調(diào)整和檢測(cè)用。
下面說(shuō)明用本試紙條檢測(cè)用健康人的尿稀釋的總嗎啡的情形按如下方法檢測(cè)陽(yáng)性人尿配制的總嗎啡將組裝的半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙從鋁泊袋中取出，垂直插入用已知濃度的陽(yáng)性人尿配制的總嗎啡溶液中，插入深度不超過(guò)吸水線上方的標(biāo)線，5秒鐘后從尿液中取出，垂直穿掛起來(lái)，5分鐘后肉眼觀察試條的正反兩面的條帶數(shù)目，質(zhì)控線均出現(xiàn)。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度小于300mg/mL時(shí)，A、B兩面均各出現(xiàn)5條帶。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度大于300ng/mL，小于500ng/mL時(shí)，A面仍出現(xiàn)5條帶，B面出現(xiàn)4條帶。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度大于500ng/mL，小于1μg/mL時(shí)，A面仍出現(xiàn)5條帶，B面出現(xiàn)3條帶。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度大于1μg/mL，小于3μg/mL時(shí)，A面出現(xiàn)5條帶，B面出現(xiàn)2條帶。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度大于3μg/mL而小于10μg/mL時(shí)，A面出現(xiàn)3條帶，B面出現(xiàn)1帶。當(dāng)尿液中總嗎啡濃度大于10μg/mL時(shí)，A面出現(xiàn)2條帶，B面只有質(zhì)控線，不出現(xiàn)檢測(cè)帶。
總嗎啡濃度(M總)A面檢測(cè)線數(shù) B面檢測(cè)線數(shù) 質(zhì)控線
M總≤300ng/ml552 (均有)300ng/ml≤M總＜1μg/ml432 (均有)1μg/ml≤M總＜3μg/ml422 (均有)3μg/ml≤M總＜10μg/ml312 (均有)10μg/ml≤M總 202 (均有)下面說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)健康人尿配制的各種藥物，如何判定交叉反應(yīng)性將各種藥物用健康人尿配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，然后用本發(fā)明制作方法第6步中所述的操作方法觀察結(jié)果如下表標(biāo)準(zhǔn)品名稱 濃 度A面檢測(cè)帶數(shù) B面檢測(cè)帶數(shù) 質(zhì)控線海洛因 10mg/ml 502類似物M110mg/ml 502類似物M210mg/ml 502鹽酸罌粟堿 10mg/ml 552那可丁 10mg/ml 552磷酸可待因 10mg/ml 502鹽酸可卡因 10mg/ml 552硫酸安非他明 10mg/ml 552鹽酸倍他司丁 10mg/ml 552鹽酸麻黃堿 10mg/ml 552注類似物M1為O3—單乙酰嗎啡氨基磺酸鹽；類似物M1為O6—單乙酰嗎啡鹽酸鹽對(duì)總嗎啡測(cè)定有交叉反應(yīng)性的4種類似物作展開試驗(yàn)，以觀察這4種類似物的合適濃度，結(jié)果見下表類似物的濃度A面檢測(cè)帶條數(shù) B面檢測(cè)帶條數(shù)0.3μg/ml 5 40.5μg/ml 5 31.0μg/ml 5 23.0μg/ml 5 110μg/ml 5 00.3μg/ml 5 40.5μg/ml 5 31.0μg/ml5 23.0μg/ml5 110μg/ml5 00.3μg/ml5 40.5μg/ml5 31.0μg/ml5 23.0μg/ml5 110μg/ml5 00.3μg/ml5 40.5μg/ml5 31.0μg/ml5 23.0μg/ml5 110μg/ml 5 0注第一欄為O3—單乙酰嗎啡氨基磺酸鹽；第二欄為O6—單乙酰嗎啡鹽酸鹽；第三欄為海洛因；第四欄為磷酸可待因下面說(shuō)明本試紙檢測(cè)結(jié)果與GC/MS檢測(cè)結(jié)果一致性檢測(cè)實(shí)際尿樣，并與GC/MS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。其中陽(yáng)性尿樣來(lái)源于某戒毒所，陰性尿樣來(lái)源于自愿正常人，結(jié)果如下表尿樣GC/MS 試 紙檢 測(cè) 結(jié) 果編號(hào)結(jié)果A面帶數(shù) 嗎啡濃度M游B面帶數(shù) 總嗎啡濃度M總1 10.301＋21≤M游＜3.01＋0 10≤M總2 0.61 1＋5M游＜0.3 1＋3 0.5≤M總＜1.03 0.25 1＋5M游＜0.3 1＋5 M總＜0.34 5.12 1＋21.0≤M游＜3.0 1＋1 3.0≤M總＜105 3.70 1＋30.5≤M游＜1.0 1＋1 3.0≤M總＜106 0.80 1＋5M游＜0.3 1＋2 0.5≤M總＜1.07 2.53 1＋30.5≤M游＜1.0 1＋2 1.0≤M總＜3.08 1.80 1＋30.5≤M游＜1.0 1＋2 1.0≤M總＜3.09 2.36 1＋30.5≤M游＜1.0 1＋2 1.0≤M總＜3.010 2.90 1＋30.5≤M游＜1.0 1＋2 1.0≤M總＜3.011 4.80 1＋21.0≤M游＜3.0 1＋1 3.0≤M總＜10陰樣5個(gè)0 1＋5 M游＜0.3 1＋5 M總＜0.3通過(guò)對(duì)照說(shuō)明試紙檢測(cè)結(jié)果與GC/MS檢測(cè)結(jié)果基本一致。
下面說(shuō)明本層析試紙?jiān)嚄l的貯藏穩(wěn)定性是如何確定的取某批生產(chǎn)的試條300條，置保干器中，室溫放置。每隔一段時(shí)間取出若干條檢查試紙條的穩(wěn)定性。檢測(cè)樣品為5個(gè)正常人尿稀釋的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)嗎啡(0.05、0.2、0.8、2.4、7.0μg/mL)和5個(gè)陽(yáng)性尿液配制的已知濃度總嗎啡(0.05、0.2、0.8、2.4、7.0μg/mL.)及1個(gè)陰性，每個(gè)樣品重復(fù)三次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該試條在室溫干燥保存一年內(nèi)均穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.一種抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株的建立和半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙的制作方法，包括如下步驟①N位、3位和6位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備；②抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株的建立及抗嗎啡多克隆抗體和單克隆抗體的制備；③免疫親和層析固定相的制備；④免疫親和純化多克隆抗體和單克隆抗體，及交叉純化多克隆抗體；⑤膠體金標(biāo)記抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體和抗N位嗎啡單克隆抗體復(fù)合物的制備；⑥用于免疫層析試紙的層析膜的制備；⑦組裝雙面免疫層析試紙，以便半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中N位嗎啡-蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的將1—10克嗎啡，5—10克氯甲酸酯和1—10克碳酸鹽溶于50—100mL溶劑，回流，過(guò)濾，蒸餾產(chǎn)物，然后加入1—20mL64％—97％的水合肼，回流2—10小時(shí)，冷至室溫，過(guò)濾得降嗎啡，熔點(diǎn)為272℃—274℃；取0.1—10克降嗎啡、0.2—20克溴代胺和0.1—15克碳酸鹽，溶于10—50mL二甲亞砜，加水合肼10mL，回流，純化收集產(chǎn)品；取該產(chǎn)品0.1—10克溶于10—50mL水，加入牛血清白蛋白100—900mg，將pH調(diào)到3—7，再加入5—25克碳二亞胺，反應(yīng)4—24小時(shí)，得到N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物；同上法，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白得到N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物；3位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的1-10克嗎啡溶于10—100mL二甲基亞砜中，加入氫氧化鉀5—50克，溴乙酸1—10克，攪拌2小時(shí)，倒入冰水，水溶液用鹽酸酸化至pH2—7，收集固體，得3位羧甲基嗎啡，重結(jié)晶產(chǎn)物的熔點(diǎn)為292℃～293℃；取0.5—10克羧甲基嗎啡溶于10—100mL二氧六環(huán)中，加入0.2—50mL氯甲酸酯和0.4mL三級(jí)胺，攪拌，得溶液A；0.5％牛血清白蛋白50—200mL與二氧六環(huán)混合，調(diào)pH至堿性，得溶液B；將溶液A上清緩慢加入到溶液B中，攪拌2—4小時(shí)，濃縮至20～30mL，對(duì)生理鹽水透析，得到3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物；同上，用雞卵清白蛋白替代牛血清白蛋白，即可得到3位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物；6位嗎啡—蛋白質(zhì)復(fù)合物是這樣制備的1.0—10克嗎啡溶于10—100mL苯中，加入1.0—10克琥珀酸酐，回流1—10小時(shí)，冷卻到室溫，固體溶于10—200mL水中，調(diào)pH1—6，過(guò)濾，調(diào)pH至7—12，過(guò)濾，再調(diào)pH至酸性，得產(chǎn)品；取該產(chǎn)品0.1—5克溶于二氧六環(huán)，加入10—50μl氯甲酸酯，10—100μl三級(jí)胺，攪拌30分鐘，得到A液；1％牛血清白蛋白與二氧六環(huán)混合，調(diào)pH為8—12，得到B液；然后將A的上清液緩慢加入B液，冷卻；濃縮，透析，得到6位嗎啡-牛血清白蛋白復(fù)合物；同上法，用雞卵清白蛋白代替牛血清白蛋白，得到6位嗎啡-雞卵清白蛋白復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株及抗嗎啡單克隆抗體是這樣建立和制備的(1)分泌抗嗎啡單克隆抗體的細(xì)胞株的建立，①動(dòng)物免疫取1～10mg N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原，用生理鹽水稀釋成0.5mL，再與等量的完全福氏佐劑混合，經(jīng)腹腔免疫Balb/C小鼠，2周后再用同量N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原與等量不完全福氏佐劑混合，加強(qiáng)免疫，2周后再加強(qiáng)免疫一次，第二次加強(qiáng)免疫后2周即可考慮作細(xì)胞融合，融合前3天，直接用1—5mg N位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合抗原脾內(nèi)追加免疫一次，②細(xì)胞融合細(xì)胞融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，融合前一天取飼養(yǎng)細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞融合當(dāng)天，收集SP2/0細(xì)胞，取脾細(xì)胞，用50％聚乙二醇融合，置于鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，第15天取上清篩選雜交瘤，③陽(yáng)性抗嗎啡單克隆抗體的篩選包被用0.05M pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將N位嗎啡—雞卵清白蛋白復(fù)合物稀釋至1～10μg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過(guò)夜，然后棄去孔內(nèi)的液體，用生理鹽水—吐溫洗滌緩沖液洗3次，拍干，加樣將有克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)上清按順序加入，100μL/孔，37℃溫育1小時(shí)，洗滌3次，甩干，加二抗用吐溫洗滌液稀釋辣根酶標(biāo)羊抗鼠，100μL/孔，置37℃溫育一小時(shí)；洗滌、拍干，顯色加新配制的底物工作液100μL/孔，37℃溫育10～30分鐘，終止反應(yīng)每孔加2M H2SO4終止液50μL，結(jié)果判斷陰性對(duì)照孔無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔明確顯色，測(cè)定OD值，以空白對(duì)照孔調(diào)零，OD值大于或等于陰性對(duì)照2.1倍即為陽(yáng)性，對(duì)其中陽(yáng)性的上清再作游離嗎啡的阻斷實(shí)驗(yàn)，篩選出特異陽(yáng)性細(xì)胞，及時(shí)擴(kuò)大、凍存、轉(zhuǎn)種并進(jìn)行有限稀釋法純化，即可獲得抗嗎啡單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，(2)接種雜交瘤細(xì)胞在接種雜交瘤細(xì)胞前1周，先給Balb/C小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟；將抗嗎啡單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106—2×106/mL，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.5mL；(3)采集腹水接種雜交瘤細(xì)胞后第10天，用注射器抽取腹水，300g離心15分鐘，收集上清，即得抗嗎啡單克隆抗體；抗3位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的將6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔，每足注射0.1—1mL3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后加強(qiáng)免疫，用同劑量3位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清；抗6位嗎啡多克隆抗體是這樣制備的將6個(gè)月左右，體重2.5kg的健康家兔，每足注射0.1—1mL 6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏完全佐劑乳化的抗原，兩周后加強(qiáng)免疫，用同劑量6位嗎啡—牛血清白蛋白復(fù)合物與福氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二、三、四次加強(qiáng)免疫，每次加強(qiáng)免疫后的第5天耳靜脈取血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)免疫應(yīng)答效果，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1∶64以上時(shí)，頸動(dòng)脈放血，離心，收集血清。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中免疫親和層析固定相是這樣制備的N位嗎啡—Sepharose4 B的制備取活化的Sepharose4 B20—50mL，加入由權(quán)利要求2中制備的嗎啡衍生物50—100mg，用碳酸鹽調(diào)pH＝8.0—12.0，攪拌3小時(shí)，然后取0.2—1.0克硼氫化鉀溶于20—40mL水，攪拌下加入反應(yīng)體系中，反應(yīng)5小時(shí)，即得N位嗎啡—Sephrose4B免疫親和層析固定相；3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B的制備取活化的Sepharose4B40—80mL，調(diào)pH8.0—12.0，攪拌3小時(shí)，然后取0.5—2.0克硼氫化鉀溶于40mL水，攪拌下加入反應(yīng)體系，pH維持在6.0～8.0，反應(yīng)5小時(shí)，用蒸餾水洗滌后，平分為兩份，一份加入權(quán)利要求2中制備的3—羧甲基嗎啡50—100mg，另一份加入權(quán)利要求2中制備的6—琥珀酰嗎啡60—100mg，調(diào)pH至3—7，再分別加入碳二亞胺50—200mg，室溫反應(yīng)3小時(shí)，即分別得到3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相和6位嗎啡—Sepharose4B免疫親和層析固定相；以上得到三種嗎啡-Sepharose4B免疫親和層析固定相，分別是N位嗎啡—Sepharose4B、3位嗎啡—Sepharose4B和6位嗎啡—Sepharose4B。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中免疫親和純化多克隆抗體和單克隆抗體，及交叉純化多克隆抗體是這樣進(jìn)行的①抗N位嗎啡單克隆抗體和抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體的預(yù)處理將1—10mL血清或腹水用磷酸緩沖液稀釋一倍，經(jīng)0.22μm微孔膜過(guò)濾，4℃、10000g離心；②辛酸—硫酸銨法純化向1—10毫升預(yù)處理的抗血清或腹水中加入2—10毫升0.06MpH4.0的乙酸緩沖液，調(diào)pH至4.8，于攪拌下30分鐘內(nèi)緩慢加入辛酸33—300μL，4℃靜置2小時(shí)，15000g、4℃離心30分鐘，棄沉淀，上清加入1/10體積的0.1MpH7.4磷酸緩沖液，調(diào)pH至7.4，30分鐘內(nèi)加入飽和硫酸銨，使成45％飽和度，靜置1小時(shí)，4℃下10000g離心30分鐘，沉淀溶于1/2量pH7.4磷酸鹽緩沖液中，對(duì)上述緩沖液透析，4℃下10000g離心30分鐘，—20℃保存；③免疫親和層析純化單克隆抗體和多克隆抗體及交叉純化多克隆抗體將經(jīng)辛酸—硫酸銨純化的抗體用上述制備的與之對(duì)應(yīng)的N位、3位及6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相25cm*2cm作免疫親和層析純化，色譜柱均先用0.5M氯化鉀-0.01MpH7.4的磷酸緩沖液平衡，上樣后，用0.5M氯化鉀-0.01MpH7.4磷酸緩沖液洗脫雜蛋白，再用0.5M氯化鉀-0.1MpH0.5的甲酸洗脫液洗脫抗體峰，得純化抗體，用于標(biāo)記，其中抗N位嗎啡單克隆抗體純化用N位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化；抗3位嗎啡多克隆抗體純化先用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化，收集的抗體峰再用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化，收集既能識(shí)別3位衍生嗎啡又能識(shí)別6位衍生嗎啡的抗體；而抗6位嗎啡多克隆抗體則先用6位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相純化，收集的抗體峰再用3位嗎啡-Sepharose4B免疫親和色譜固定相進(jìn)行交叉純化，收集既能識(shí)別6位衍生嗎啡又能識(shí)別3位衍生嗎啡的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中膠體金標(biāo)記抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體和抗N位嗎啡單克隆抗體復(fù)合物是這樣制備的取0.01％四氯金酸水溶液20.0mL加熱至沸騰，加入8mL1％檸檬酸三鈉水溶液，煮沸5分鐘，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測(cè)定為20nm；各取50mL膠體金三份，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH至8.0，攪拌下將三份金溶膠分別與免疫親和純化的抗3位嗎啡多克隆抗體和抗6位嗎啡多克隆抗體及抗N位嗎啡單克隆抗體混合，再加入聚乙二醇20M水溶液，使最終濃度為0.05％；將粗制品6000g離心45分鐘，離心后，沉淀物用生理鹽水混懸至1.5mL，4℃保存；將按上述方法制備的膠體金標(biāo)記的以1∶5混合的兩類多克隆抗體及單克隆抗體分別分散在厚度1mm的三張玻璃纖維紙上，凍干密封干燥保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中免疫層析試紙的層析膜是這樣制備的將硝酸纖維素膜按25×100mm的尺寸剪裁A、B兩塊。將經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析、濃度調(diào)整為0.02mg/mLN位嗎啡—雞卵清白蛋白溶液在A膜上每隔2mm等距離噴涂5條帶；，再將按1∶5混合的0.05mg/mL的3位、6位嗎啡—雞卵清白蛋白經(jīng)生理鹽水緩沖液充分透析后在B膜上每2mm等距離噴涂5條帶，然后再在A、B膜的末端各噴涂一條羊抗鼠和羊抗兔的混合帶，室溫干燥30分鐘，將膜置于含1％牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37℃孵育30分鐘，置室溫下干燥處密封貯藏。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其中雙面免疫層析試紙的組裝是這樣進(jìn)行的取一塊尺寸為80mm×100mm，厚度約0.8mm的硬質(zhì)塑料底板，分別在其正反兩面粘貼25mm×100mmA膜和B膜及5mm×100mm凍干金標(biāo)單抗和混合多抗，再在兩面的兩端順次粘貼250mm×100mm吸水紙，其中在A膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體而在B膜的下游緊鄰貼上的是凍干的膠體金標(biāo)記的多克隆抗體，再按縱向切成寬度4mm的條狀，最后用鋁泊袋干燥封裝。
全文摘要
本發(fā)明的抗嗎啡單抗細(xì)胞株的建立和嗎啡雙面檢測(cè)試紙的制作方法是一種半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡的雙面免疫層析試紙的制作方法,它包括的步驟是①N位、3位和6位嗎啡－蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備;②抗嗎啡單克隆抗體細(xì)胞株的建立及抗嗎啡多克隆抗體和單克隆抗體的制備;③免疫親和層析固定相的制備;④免疫親和純化多克隆抗體和單克隆抗體,及交叉純化多克隆抗體;⑤膠體金標(biāo)記抗3位嗎啡和6位嗎啡多克隆抗體和抗N位嗎啡單克隆抗體復(fù)合物的制備;⑥用于免疫層析試紙的層析膜的制備;⑦組裝雙面免疫層析試紙,以便半定量同時(shí)檢測(cè)尿樣中游離嗎啡和總嗎啡。使用這種試紙可快速、簡(jiǎn)便地得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果,并能最大限度地避免假陰性。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1327158SQ0010905
公開日2001年12月19日 申請(qǐng)日期2000年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者王能東, 陳家華, 張秀, 胡玄, 金聲 申請(qǐng)人:北京大學(xué)