專利名稱：單不飽和脂肪酸總含量增加的植物、種子和油的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及脂肪酸去飽和酶和編碼去飽和酶蛋白的核酸。具體地說，本發(fā)明涉及編碼δ-12和δ-15脂肪酸去飽和酶蛋白的核酸，這些去飽和酶蛋白影響植物中的脂肪酸組成，這些核酸產(chǎn)生的多肽和表達這些核酸的植物。
背景技術(shù)：
已進行許多繁殖研究著力改善蕓苔屬中的脂肪酸組成(分布圖)。Pleines和Freidt,Fat Sci.Technol.,90(5),167-171(1988)報道了C18:3水平降低(2.5-5.8％)且含高油酸(73-79％)的植物品系。Rakow和McGregor,J.Amer.OilChem.Soc.,50,400-403(Oct.1973)討論了與選擇亞油酸和亞麻酸突變體相關(guān)的問題。在Can.J.Plant Sci.,68,509-511(Apr.1988)公開了所產(chǎn)種子油含3％亞麻酸和28％亞油酸的星形夏季油菜(Stellar summer rape)。Roy和Tarr,Z.Pflanzerzuchtg,95(3),201-209(1985)報道了通過種間雜交將基因從蔓芥子轉(zhuǎn)移到歐洲油菜，產(chǎn)生了結(jié)合高亞麻酸和低亞油酸含量的重建品系。Roy和Tarr,PlantBreeding,98,89-96(1987)討論了開發(fā)具有改良的亞麻酸和亞油酸含量的蔓芥子的前景。1989年7月12日出版的歐洲專利申請323,753中公開了油酸含量大于79％且亞麻酸含量小于3.5％的油和種子。Canvin,Can.J.Botany,43,63-69(1965)討論了溫度對幾種種子作物(包括油菜籽)的油中脂肪酸組成的作用。
突變的誘導通常采用極高劑量的輻射和/或化學誘變劑(Gaul,H.RadiationBotany(1964)4:155-232)。超過LD50(通常達到LD90)的高劑量將產(chǎn)生最大的突變率。在蕓苔屬繁殖突變中，單用高劑量的化學誘變劑或與輻射聯(lián)合，誘導了有限數(shù)量的脂肪酸突變體(Rakow，G.Z.Pflanzenzuchtg(1973)69:62-82)。從Rakow突變繁殖程序中衍生的低α-亞麻酸突變體沒有直接的商業(yè)用途，因為種子產(chǎn)量太低。第-個用低c-亞麻酸突變體(1973年衍生的)栽培的商業(yè)品種在1988年作為Stellar品種投放市場(Scarth,R等人，Can.J.Plant Sci.(1988)68:509-511)。在投放市場時，Stellar的產(chǎn)量比商品栽培品種低20％。
另外，期望植物油脂肪酸組成能滿足特殊食品和工業(yè)用途。例如，種子油和這些油的制成品中單不飽和脂肪酸水平(油酸)增加的蕓苔屬canola低芥酸油菜籽突變體，能改善脂類營養(yǎng)。多不飽和脂肪酸低含量和油酸高含量的Canola品系，具有較高抗氧化穩(wěn)定性，這是應用于零售食品業(yè)的有用性狀。應用于工業(yè)的植物油(如潤滑油)的有用性狀包括理想的低溫性狀，如低流動點和低混濁點，以及非常好的抗氧化穩(wěn)定性。
δ-12脂肪酸去飽和酶(也稱為油酸去飽和酶)參與油酸酶促轉(zhuǎn)化成亞油酸。δ-15脂肪酸去飽和酶(也稱為亞油酸去飽和酶)參與亞油酸酶促轉(zhuǎn)化成o-亞麻酸。已克隆了微粒體δ-12去飽和酶，并用T-DNA標記鑒定。Okuley等人，Plant Cell6:147-158(1994)。Lightner等人在WO94/11516中描述了高等植物中編碼微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶的基因的核苷酸序列。Yadav,N等人，Plant Physiol.,103:467-476(1993),WO93/11245和Arondel,V等人，Science,258:1353-1355(1992)中公開了編碼微粒體和質(zhì)體δ-15脂肪酸去飽和酶的高等植物基因的序列。
發(fā)明概述含具有異源長鏈和高單不飽和水平脂肪酸的三酰甘油，可為工業(yè)應用提供有用的特性。含具有高單不飽和水平和異源長鏈的脂肪酸組成的植物，是工業(yè)用油的來源(如潤滑油)。
本發(fā)明一方面涉及蕓苔屬植物及其后代，它們產(chǎn)生的種子含有的長鏈單不飽和脂肪酸至少為82％，芥酸含量至少為15％(總脂肪酸組成中)。種子中油酸和二十碳烯酸在總脂肪酸組成中分別占至少37％和14％。這些種子的飽和脂肪酸含量小于7％，多不飽和脂肪酸含量小于11％。
在一些實施例中，植物的單不飽和脂肪酸含量約為85％-90％，芥酸含量至少為15％(總脂肪酸組成中)。在這些植物中，油酸的含量至少約為42％，具體地說約為47％-56％(總脂肪酸組成中)。芥酸的含量約為17％-31％，二十碳烯酸的含量約為15％-21％。
本發(fā)明還涉及蕓苔屬種子油，其所含的長鏈單不飽和脂肪酸含量至少為82％，芥酸含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)。這些油中油酸和二十碳烯酸的含量分別至少為14％和37％(總脂肪酸組成中)。飽和脂肪酸含量可能小于約7％，如小于4％或約2-4％。多不飽和脂肪酸含量小于約11％，在一些實施例中小于9％(總脂肪酸組成中)。α-亞麻酸的含量可以為約1％-2％。
在一些實施例中，蕓苔屬種子油中所含的長鏈單不飽和脂肪酸含量約為85％-90％。在這些油中，油酸的含量植物約為42％，在一些實施例中約為47％-56％(總脂肪酸組成中)。芥酸和二十碳烯酸含量分別約為17％-31％和15％-21％(總脂肪酸組成中)。還涉及的蕓苔屬種子油所含的長鏈單不飽和脂肪酸含量至少為82％，其中神經(jīng)酸、芥酸和二十碳烯酸含量的總和約為50％-66％(總脂肪酸組成中)。這種種子油的油酸含量約為25％-30％。
本發(fā)明涉及產(chǎn)生長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％和芥酸含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)的植物的方法。該方法包括將一種植物品系與第二種植物品系雜交，并挑選具有理想脂肪酸組成的后代。所述的第一種植物品系芥酸的含量至少約為45％。所述的第二種植物品系油酸的含量至少約為84％。
本發(fā)明還涉及制造植物油的方法。該方法包括碾碎蕓苔屬種子，所述的蕓苔屬種子所含的長鏈單不飽和脂肪酸至少約為82％，芥酸含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)，并從碾碎的種子中提取植物油。該方法還包括油的精煉、漂白和脫臭步驟。
本發(fā)明還涉及含蕓苔屬油的潤滑油和液壓液，所述的蕓苔屬油含有含量至少約為82％的長鏈單不飽和脂肪酸、含量至少約為15％的芥酸(總脂肪酸組成中)和添加劑。所述的添加劑可以是抗氧化劑、防銹劑、防腐劑、降凝劑、消泡劑、著色劑、脫垢劑。添加劑的量約為0.01％-20％(重量)。
序列表簡述SEQ ID NO:1顯示了野生型蕓苔屬Fad2-D基因編碼區(qū)域的DNA序列。SEQ IDNO:2是SEQ ID NO:1演繹出的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3顯示了IMC 129突變體蕓苔屬Fad-2D基因編碼區(qū)域的DNA序列。SEQ ID NO:4是SEQ ID NO:3演繹出的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5顯示了野生型蕓苔屬Fad2-F基因編碼區(qū)域的DNA序列。SEQ IDNO:6是SEQ ID NO:5演繹出的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7顯示了Q508突變體蕓苔屬Fad-2F基因編碼區(qū)域的DNA序列。SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:7演繹出的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9顯示了Q4275突變體蕓苔屬Fad-2F基因編碼區(qū)域的DNA序列。SEQ ID NO:10是SEQ ID NO:9演繹出的氨基酸序列。
附圖簡述

圖1顯示了在Q508 X Westar雜交的分離種類中，種子油油酸(C18:1)含量的頻率分布圖。標記為WSGA 1A的條柱代表Westar親代的C18:1的含量。標記為Q508的條柱代表Q508親代C18:1的含量。
圖2顯示了蕓苔屬Fad2-D野生型基因(Fad2-D wt)、IMC129突變體基因(Fad2-D GA316 IMC129)、Fad2-F野生型基因(Fad2-Fwt)、Q508突變體基因(Fad2-FTA515 Q508)和Q4275突變體基因(Fad2-F GA908 Q4275)的核苷酸序列。
圖3顯示了圖2的多核苷酸演繹的氨基酸序列。
圖4顯示了用于產(chǎn)生高芥酸和高油酸含量蕓苔屬植物的繁殖流程圖。
發(fā)明詳述本文所用的所有脂肪酸百分比都是油(其中脂肪酸作為一種成分)的重量百分比。
本文所用的“品系”是指諸個體之間至少一種性狀表現(xiàn)出極少變異或沒有變異的一類植物?？赏ㄟ^幾代自花授粉傳代和挑選，或用組織或細胞培養(yǎng)技術(shù)從一個親代進行營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生這些品系。本文所用的“品種”是指用于商業(yè)生產(chǎn)的品系。
術(shù)語“誘變”是指用誘變劑在個體群中誘導隨機基因突變。然后篩選處理過的群體或該群體的后代，以得到突變的有效性狀?！叭后w”是指一群具有相同基因庫的個體。本文所用的“M0”指未處理的種子。本文所用的“M1”是指接觸過誘變劑的種子(及其生長出的植物)，而“M2”指M1植物自花授粉的后代(種子和植物)，“M3”指M2植物自花授粉的后代，和“M4”指M3植物自花授粉的后代。“M5”指M4植物自花授粉的后代。“M6”、“M7”等均是前一代植物自花授粉的后代。術(shù)語“自交”指自花授粉。
本文所用的“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定”是指對某給定脂肪酸成分而言，代與代之間(至少兩代，較佳地為至少三代)該成分基本保存在同一水平，如較佳地±5％。本發(fā)明的方法產(chǎn)生的品系，代與代之間保持改良的脂肪酸組成穩(wěn)定在±5％。上述穩(wěn)定性可能受溫度、地理位置、應力(環(huán)境)和栽培時間的影響。因此，脂肪酸組成分布的比較應在類似的生長環(huán)境中產(chǎn)生的種子間進行。根據(jù)前一代的數(shù)據(jù)確定穩(wěn)定性。
集約培養(yǎng)產(chǎn)生的某些蕓苔屬植物，其種子油所含的芥酸少于2％。已繁殖了相同的品種，其脫脂粉至多含有30μmol芥子油甙/克。本文所用的“Canola”是指含至多2％芥酸(C22:1)的植物種子或植物油，其脫脂粉中至多有30μmol芥子油甙/克。
申請者發(fā)現(xiàn)了δ-12脂肪酸去飽和酶基因突變的植物。這種植物的種子油中脂肪酸組成有有利的變化。這些突變是指，例如油酸含量增加、亞油酸含量的降低和穩(wěn)定，或既增加油酸含量又降低和穩(wěn)定亞油酸含量。
申請者還發(fā)現(xiàn)了δ-15脂肪酸去飽和酶基因突變的植物。這種植物的種子油中脂肪酸組成有有利的變化，如α-亞麻酸水平的降低和穩(wěn)定。
申請者還發(fā)現(xiàn)分離的核酸片段(多核苷酸)，其含有在δ-12或δ-15脂肪酸去飽和酶編碼序列中攜帶突變的序列。突變賦予了攜帶這種突變的植物種子油中脂肪酸水平的理想改變。已知δ-12脂肪酸去飽和酶是ω-6脂肪酸去飽和酶，有時也稱為Fad2或12-DSE。已知δ-15脂肪酸去飽和酶是ω-3脂肪酸去飽和酶，有時也稱為Fad3或15-DSE。
本發(fā)明的核酸片段可能以RNA的形式或DNA的形式，包括cDNA、合成的DNA或基因組DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，若為單鏈可以是編碼鏈也可以是非編碼鏈。RNA類似物可以是，例如mRNA或和核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。本發(fā)明核酸片段的說明實施例是圖3所示的突變體序列。
本發(fā)明的核酸片段在微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶編碼序列中含有突變或在微粒體δ-15脂肪酸去飽和酶編碼序列中含有突變。這種突變使得所產(chǎn)生的去飽和酶基因產(chǎn)物在植物中無功能(相對于野生型序列編碼的基因產(chǎn)物的功能)。δ-12去飽和酶基因產(chǎn)物的非功能性可從表達該突變序列的植物組織中反應產(chǎn)物(亞油酸)水平的降低和底物(油酸)水平的增加(與表達野生型序列的植物組織中相應的水平相比)推斷出。δ-15去飽和酶基因產(chǎn)物的非功能性可從表達該突變序列的植物組織中反應產(chǎn)物(α-亞麻酸)水平的降低和底物(亞油酸)水平的增加(與表達野生型序列的植物組織中相應的水平相比)推斷出。
本發(fā)明的核酸片段可以含有該編碼序列的一部分，如至少約10個核苷酸，只要該片段在編碼序列中至少含有一個突變。所需片段的長度取決于該片段待用的目的，如PCR引物、定點誘變等。在一實例中，本發(fā)明的核酸片段含有突變體δ-12或突變體δ-15脂肪酸去飽和酶的全長編碼序列，如圖3的突變體序列。在另一實例中，核酸片段的長度約為20-50個核苷酸(或堿基對，bp)，或約50-500個核苷酸，或約500-1200個核苷酸。
可用核酶在植物種子油的脂肪酸水平中產(chǎn)生理想的變化?？刹捎迷O計成能切割δ-12或δ-15去飽和酶mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子，來防止δ-12或δ-15去飽和酶的表達。雖然可用各種核酶(在特異性位點識別序列處切割mRNA)來破壞去飽和酶mRNA，但錘頭核酶是特別有用的。錘頭核酶在(與靶mRNA形成互補堿基對)的側(cè)翼區(qū)域所轄部位切割mRNA。唯一的要求就是靶RNA含有5’-UG-3’核苷酸序列。錘頭核酶的構(gòu)建和生成是本領域熟知的。見如美國專利No.5,254,678?？蓪㈠N頭核酶序列包埋到穩(wěn)定的RNA中(如轉(zhuǎn)運RNA,tRNA)，以增加體內(nèi)切割效率。Perriman,R等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92(13):6175-6179(1995)；deFeyter,R.和Gaudron,J.,Methods in Molecular Biologv.Vol.74，第43章，“植物中核酶的表達”,Turner P.C，編輯，Humana Press Inc.,Totowa,NJ。也可用RNA內(nèi)切核糖核酸酶，如在噬熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中天然產(chǎn)生的，Cech和其合作者對其有廣泛描述。見美國專利No.4,987,071。
本發(fā)明核酸片段中的突變可以在該編碼序列中的任何一個部位(導致得到的基因產(chǎn)物無功能)。適合的突變類型包括(但并不限于)核苷酸的插入、核苷酸的缺失、或野生型編碼序列的轉(zhuǎn)換或顛換。這些突變將導致相應基因產(chǎn)物中一個或多個氨基酸的插入、一個或多個氨基酸的缺失、和保守性氨基酸取代。在一些實例中，核酸片段的序列可以含有多個突變或多種類型的突變。
編碼序列中氨基酸的插入或缺失可能，例如破壞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的基本α-螺旋或β-折疊片層區(qū)域的構(gòu)象。氨基酸的插入或缺失也可能破壞對基因產(chǎn)物活性而言非常重要的結(jié)合或催化位點。本領域已知大量毗鄰氨基酸的插入或缺失非?？赡軐е禄虍a(chǎn)物無功能(與較小數(shù)量插入的或缺失的氨基酸相比)。非保守性氨基酸的取代可能用不同類型的氨基酸取代某類型的氨基酸。非保守性取代將基本改變基因產(chǎn)物的電荷或疏水性。非保持性氨基酸取代也可能基本改變殘基側(cè)鏈的體積大小，如異亮氨酸殘基被丙氨酸殘基取代。
非保守性取代的例子包括堿性氨基酸替代非極性氨基酸、極性氨基酸替代酸性氨基酸。因為基因中只有20種編碼氨基酸，可用突變的常規(guī)試驗(將不同類型的氨基酸加入到目標基因產(chǎn)物的該區(qū)域中)，確定導致無功能基因產(chǎn)物的取代。
優(yōu)選的突變是在編碼氨基酸序列基序(在δ-12脂肪酸去飽和酶或δ-15脂肪酸去飽和酶中保守的基序)，如His-Xaa-Xaa-Xaa-His基序(表1-3))的核酸域中。適合的區(qū)域的例子是在相應于擬南芥屬和蕓苔屬δ-12去飽和酶序列氨基酸105-109的核苷酸中，在相應于大豆δ-12去飽和酶序列的氨基酸101-105的核苷酸中和相應于玉米δ-12去飽和酶序列氨基酸111-115的核苷酸中的保守HECGH基序。如見WO94/115116；Okuley等人，Plant Cell 6:147-158(1994)。本文所用的單字母氨基酸命名見Alberts,B等人，Molecular Biology of the Cell，第三版，Garland Publishing,New York,1994。側(cè)接該基序的氨基酸在δ-12和δ-15去飽和酶中也是高度保守的，也是本發(fā)明片段突變的適合候選。
本發(fā)明核酸片段突變的說明性實例是在蕓苔屬微粒體δ-12去飽和酶序列的HECGH基序中Lys取代Glu(D型或F型)。該突變導致序列HECGH改變成HKCGH,見SEQ ID NO:2(野生型D)與SEQ ID NO:4(突變型D)的比較可考慮。在其它Fad-2序列中作類似突變，產(chǎn)生無功能的基因產(chǎn)物。
可在擬南芥屬微粒體δ-15脂肪酸去飽和酶的氨基酸101-105中，以及在相應的油菜和大豆去飽和酶中發(fā)現(xiàn)類似的基序(表5)。如見WO93/11245；Arondel,V等人，Science,258:1153-1155(1992)；Yadav,N等人，Plant Physiol.,103:467-476(1993)。質(zhì)體δ-15脂肪酸含有類似的基序(表5)。使得到的基因產(chǎn)物無功能的HECGH基序突變類型是非保守性替代。非保守替代的說明性例子是甘氨酸殘基替代第一或第二組氨酸。這種替代用非極性殘基(甘氨酸)替代了帶電的殘基(組氨酸)。另一使得到的基因產(chǎn)物無功能的突變類型是插入突變，如在HECGH基序的半胱氨酸和谷氨酸殘基中插入甘氨酸。
其它具有適合的保守的氨基酸基序的區(qū)域包括表2所示的HRRHH基序、表6所示的HRTHH基序和表3所示的HVAHH基序。如見WO94/115116；Hitz,W等人，Plant Physiol,105:635-641(1994)；Okuley,J等人，同上；和Yadav,N等人，同上。表3所示區(qū)域中突變的說明性例子是在相應于甘氨酸密碼子(歐洲油菜氨基酸303)的核苷酸的突變。非保守性Glu替代Gly導致氨基酸序列DRDYGILNKV變化成DRDYEILNKV(將SEQ ID NO:6的野生型F與SEQ ID NO:10的突變體Q4275相比，圖3)。
另一適于在δ-12去飽和酶序列中突變的區(qū)域在相應于蕓苔屬去飽和酶序列氨基酸171-175的核苷酸中含有基序KYLNNP。突變的說明性例子是該區(qū)域His替換Leu，產(chǎn)生氨基酸序列(表4)KYHNN(將SEQ ID NO:6的野生型Fad2-F與SEQ IDNO:8的突變體相比)?？煽紤]在其它Fad-2氨基酸序列中作類似的突變，產(chǎn)生無功能的基因產(chǎn)物。
表1微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表2微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表3微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表4微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表5質(zhì)粒和微粒體δ-15脂肪酸去飽和酶的保守氨基酸的對比
a質(zhì)粒的序列表6質(zhì)粒和微粒體δ-15脂肪酸去飽和酶的保守氨基酸的對比
a質(zhì)粒的序列氨基酸基序及其相關(guān)位點的保守表明，可能在其它品種的相應區(qū)域中突變的δ-12或δ-15脂肪酸去飽和酶區(qū)域(能在某一品種中突變產(chǎn)生無功能的去飽和酶)，在該品種中產(chǎn)生無功能的δ-12去飽和酶或δ-15去飽和酶基因產(chǎn)物。
表1-6中任一區(qū)域的具體突變以及那些與本文所列舉突變基本相同的突變(如上所述，只要這些突變使得到的去飽和酶基因產(chǎn)物無功能)都包括在本發(fā)明的范圍中。
可用本領域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生含突變序列的核酸片段。這些技術(shù)包括(但并不限于)野生型序列的定點誘變和用自動DNA合成儀直接合成。
也可通過誘導植物種子或再生的植物種子突變(如用乙基磺酰甲烷、X-射線或其它誘變劑)，產(chǎn)生含突變序列的核酸片段。誘變后，用已知的方法鑒定種子中具有所需脂肪酸表型的突變植物，從突變品系的基因組DNA或RNA分離出含所需突變的核酸片段。然后通過δ-12去飽和酶或δ-15去飽和酶基因編碼區(qū)域的測序，確定特異性突變的部位。另外，可用對所需突變有特異性的標記的核酸探針迅速篩選誘變的群體。
本文公開的方法可用于所有蕓苔屬油菜籽和各品種春季和冬季成熟的類型。誘導突變可用物理誘變劑，包括(但并不限于)X-射線、UV射線和其它導致染色體損傷的物理處理，和其它化學誘變劑，包括(但并不限于)溴化乙錠、亞硝基胍、雙環(huán)氧丁烷等。也可在植物發(fā)育的其它階段進行誘變處理，包括(但并不限于)細胞培養(yǎng)、胚芽、小芽胞和根尖。
本文所用的“穩(wěn)定的突變”是指在最少三代內(nèi)維持所選的改變的脂肪酸組成的M5或其更后代品種，包括最少在田地條件下的兩代，而且最少兩代超過設定的統(tǒng)計域值(用氣相層析分析測定最少10個隨機選擇的種子批)。另外，可用相同的方法與后代作比較衡量穩(wěn)定性。對于后代，穩(wěn)定性的定義是在基本類似的條件下生長時，種子中脂肪酸組成與前代或后代的組成相似。
突變繁殖通常產(chǎn)生的植物除具有感興趣的性狀外，還具有多種有害的性狀，如植物活力和繁殖力的降低。這些性狀將直接影響脂肪酸組成，產(chǎn)生不穩(wěn)定的突變；和/或降低產(chǎn)量，并因此降低本發(fā)明的商業(yè)價值。為了消除有害突變的發(fā)生和降低植物攜帶的突變負荷，用低誘變劑劑量進行種子處理產(chǎn)生LD30群體。從而可以在農(nóng)業(yè)背景中進行脂肪酸性狀單基因突變的快速選擇(產(chǎn)生可接受的產(chǎn)量)。
以下為美國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的一些不同脂肪酸品系的種子，以及它們的登錄號。
在一些植物種類或品種中，可以發(fā)現(xiàn)多種形式的內(nèi)源性微粒體δ-12去飽和酶。在雙二倍體中，每種形式都是從親代基因組(組成研究的種類)的一個形式衍生的。含有兩種形式突變的植物與僅含有一種形式突變的植物脂肪酸特性不同。這類植物的例子是歐洲油菜品系Q508，它是一種含有D型突變的δ-12去飽和酶(SEQ ID NO:3)和F型突變的δ-12去飽和酶(SEQ ID NO:7)的雙誘變品系。另一例子是品系Q4275，其含有D型突變的δ-12去飽和酶(SEQ ID NO:3)和F型突變的δ-12去飽和酶(SEQ ID NO:9)。見圖2-3。
引入本發(fā)明核酸片段的優(yōu)選宿主或受體生物是產(chǎn)油的品種，如大豆(Glycinemax)、油菜籽(如歐洲油菜、蔓芥子和蕪菁(B.juncea))、向日葵(Helianthusannus)、蓖麻子(Ricinus communis)、玉米(Zea mays)和紅花(Carthamustinctorius)。
本發(fā)明的核酸片段還包括其它核酸。例如，可將編碼一分泌或前導氨基酸序列的核酸連接于突變?nèi)ワ柡兔负怂崞紊?，這樣該分泌或前導序列以讀框融合于突變δ-12或δ-15去飽和酶多肽的氨基端。本領域還知道編碼用于以讀框融合于本文所公開的突變?nèi)ワ柡兔付嚯牡陌被嵝蛄械钠渌怂崞巍Ｒ娒绹鴮＠鸑o.5,629,193，本文納入作為參考。核酸片段也可含有一個或多個與其可操作性連接的調(diào)節(jié)元件。
本發(fā)明還包括與突變?nèi)ワ柡兔感蛄羞x擇性雜交的核酸片段。這種核酸片段通常長度最少為15個核苷酸。雜交通常包括Southern分析(Southern印跡)，該方法通過與標記的寡核苷酸或DNA片段探針雜交來鑒定靶核酸混合物中某DNA序列的存在。Southern分析通常包括在瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA消化物，電泳分離后DNA的變性，和將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維、尼龍或其它合適的膜支持物上以用放射標記的、生物素標記的或酶標記的探針(見Sambrook等人，(1989)MolecularCloning，9.37-9.52章節(jié)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview；NY)。
在中等嚴謹條件下或較佳地在高度嚴謹條件下，將核酸片段與突變的去飽和酶序列雜交。用高度嚴謹條件鑒定與探針高度同源的核酸。高度嚴謹條件包括，用低電離離子強度和高溫洗滌，例如0.015M NaCl/0.0015 M檸檬酸鈉(0.1X SSC)、0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS),50-65℃。另外，在雜交時可用變性劑如甲酰胺，例如含0.1％牛血清白蛋白的50％甲酰胺/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉(pH6.5)和750mM NaCl、75mM檸檬酸鈉(42℃)。另一例子是用50％甲酰胺、5XSSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5XDenhardt溶液、超聲處理過的鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％葡聚糖硫酸酯(42℃)，用0.2X SSC和0.1％SDS洗滌(42℃)。
中等嚴謹條件是指用于鑒定與探針相同性程度較低(與在高度嚴謹條件下鑒定的核酸相比)的核酸的雜交條件。中等嚴謹條件包括用較高離子強度和/或較低溫度(與高度嚴謹條件的離子強度和溫度相比)洗滌雜交膜。例如，50℃用包含0.060M Nacl/0.0060 M檸檬酸鈉(4X SSC)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的洗滌液，最后一次洗滌用1X SSC(65℃)。另外，可用37℃ 1X SSC洗滌雜交物。
也可用Northern分析(Northern印跡)進行雜交，該方法用于鑒定與已知探針(如寡核苷酸、DNA片段、cDNA或其片段、或RNA片段)雜交的RNA。探針可用放射線同位素如32P標記，或用生物素或酶標記。待分析的RNA通常在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維、尼龍或其它適合的膜上，再與探針雜交(用本領域熟知的標準方法，如Sambrook等人，同上，7.39-7.52章節(jié)所述)。
本發(fā)明的多肽包含具有突變氨基酸序列的分離的多肽以及其衍生物和類似物。如見，圖3中的突變氨基酸序列?！胺蛛x的”指在天然表達和產(chǎn)生多肽的環(huán)境以外的環(huán)境表達和產(chǎn)生的多肽。例如，在細菌或真菌中表達和產(chǎn)生時，所分離的植物多肽。本發(fā)明的多肽還包括本文所公開的突變?nèi)ワ柡兔付嚯?上述)的變體。
在本發(fā)明的一個實施例中，一種植物同時含有δ-12去飽和酶突變和δ-15去飽和酶突變。這種植物的脂肪酸組成包含高水平的油酸和低水平的α-亞麻酸。通過在δ-12去飽和酶和δ-15去飽和酶單突變品系之間進行基因雜交，可以將δ-12去飽和酶和δ-15去飽和酶突變聯(lián)合在一植物中。將含有δ-12脂肪酸去飽和酶突變的一種植物與含有δ-15脂肪酸去飽和酶突變的第二種植物雜交或匹配。栽培這種雜交產(chǎn)生的種子，并將得到的植物自交，以獲得其后代的種子。然后篩選這些后代種子，以鑒定出同時攜帶兩種突變基因的那些種子。
另外，也可誘變攜帶δ-12去飽和酶或δ-15去飽和酶突變的品系，以產(chǎn)生同時含有δ-12去飽和酶和δ-15去飽和酶突變的植物成植物品系。例如，IMC 129品系在D型微粒體δ-12去飽和酶結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)域(Glu106變?yōu)長ys106)具有一個突變。可誘變該品系的細胞(如種子)，以在δ-15去飽和酶基因中誘導一個突變，產(chǎn)生攜帶δ-12脂肪酸去飽和酶基因突變又攜帶δ-15脂肪酸去飽和酶基因突變的植物或植物品系。
后代包括特定植物或植物品系的后代，例如直接從植物得到的種子。植物的后代也包括F1、F2、F3形成的種子和其后代植物或BC1、BC2、BC3形成的種子及其后代植物。
本發(fā)明的植物較佳地含有改變的脂肪酸組成。例如，從這種植物種子得到的油可含有約69-90％油酸(總脂肪酸組成中)。這種油較佳地含有約74-90％油酸，更佳的是含有約80-90％油酸。在一些實施例中，從本發(fā)明的植物種子得到的油含有約2.0％-5.0％飽和脂肪酸(總脂肪酸組成中)。在一些實施例中，從本發(fā)明種子得到的油含有約1.0-14.0％亞油酸或約0.5％-10.0％α-亞麻酸。
通常通過碾碎批量種子樣品(如，10個種子)并從中提取脂肪酸來分析油的組合成。水解種子中的脂肪酸甘油三酯，并將其轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯?？捎帽绢I域技術(shù)人員已知的方法鑒定含改變的脂肪酸組成的那些種子，如氣液層析(GLC)分析批量種子樣品、單粒種子或半粒種子。半粒種子分析是本領域熟知的，因為保留了種子胚胎的活力，因此可種植那些含有所需脂肪酸組成的種子以產(chǎn)生下一代。但已知半粒種子分析不是被分析種子基因型的精確代表。而批量種子分析通常得到某給定基因型脂肪酸組成的更精確的代表。然而，一群種子的半粒種子分析是獲得所需脂肪酸組成可能性的可靠指示方法。也可測定較大樣品，如中試或商業(yè)規(guī)模提煉、漂白和脫臭種子中內(nèi)源性油時得到的油的脂肪酸組成。
可用本發(fā)明的核酸片段作為植物基因圖和植物繁殖程序中的標記。這些標記可能包括如限制片段長度的多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性測定(RAPD)、聚合酶鏈式反應(PCR)或自身維持的序列復制(3SR)標記。在繁殖過程中可用標記輔助的繁殖技術(shù)鑒定和跟蹤所需的脂肪酸組成。此外標記輔助的繁殖技術(shù)可用作鑒定方法的一種替代法、或其它分類法。標記輔助的繁殖例子是用PCR引物，其能特異性擴增含有所需δ-12去飽和酶或δ-15去飽和酶突變的序列。
本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生具有所需的脂肪酸組成以及優(yōu)良農(nóng)業(yè)性能的植物或植物品系(與具有改變的種子脂肪酸組合物的品系相比)。優(yōu)良的農(nóng)業(yè)特性包括，種子發(fā)芽率提高、幼苗活力增加、對幼苗真菌疾病(猝倒病、根腐病等)抗性的增加、產(chǎn)量的增加和穩(wěn)定性的改善。
另一方面，涉及的蕓苔屬植物產(chǎn)的種子含有的長鏈單不飽和脂肪酸含量約為82％，油酸含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)。本文所用的“長鏈”是指16個碳原子或更長的鏈，如16-24個的鏈。長鏈單不飽和脂肪酸主要是油酸、二十碳烯酸和芥酸。種子油三酰甘油中長鏈單不飽和脂肪酸的異源性質(zhì)賦予該油所需性能?？山档涂傦柡椭舅岷?或總多不飽和脂肪酸的水平，以增加長鏈單不飽和脂肪酸的含量，即油酸、二十碳烯酸、芥酸和神經(jīng)酸。
將本文所述的高油酸品系與高芥酸品系雜交，產(chǎn)生含長鏈單不飽和脂肪酸含量高(種子中)的蕓苔屬植物。在實施例5和表17中描述了適合的高油酸品系，含有約82-85％油酸(總脂肪酸組成中)。適合的高芥酸品系含有約45％芥酸或更多(總脂肪酸組成中)。蕓苔屬植物HEC01是特別有用的高芥酸品系，并以Hero商標名出售。也已知其它高芥酸品種，如命名為Venus、Mercury、Neptune、S89-3673、Dwarf Essex、Reston、Bridger或R-500的品種。McVetty,P.B.E.等人，Can.J.Plant Sci.,76(2):341-342(1996)；Scarth,R.等人，Can.J.Plant Sci.,75(1):205-206(1995)；和McVetty,P.B.E.等人，Can J.Plant Sci.,76(2):343-344(1996)。
本發(fā)明種子所含的油酸和二十碳烯酸的含量分別至少為37％和14％(總脂肪酸組成中)。總飽和脂肪酸含量至少約為7％。本文所用的“總飽和脂肪酸含量”是指總豆蔻酸(14∶0)、棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、花生酸(20∶0)、三萮酸(22∶0)和木蠟酸(24∶0)。總多不飽和脂肪酸的含量不到11％(總脂肪酸組成中)。本文所用的“總多不飽和脂肪酸含量”是指亞油酸(18∶2)、α-亞麻酸(18∶2)和二十碳二烯酸(20∶2)之和占總脂肪酸含量的百分比。
在一些實施例中，種子中長鏈單不飽和脂肪酸的含量約為85％-90％。這些種子中油酸的含量約為42％或更多，較佳地約為47％-56％。芥酸和二十碳烯酸的含量分別約為17-31％和15-21％。
在一些實施例中，種子中長鏈單不飽和脂肪酸的含量至少約為82-90％。這些種子中油酸的含量至少約為25-33％。芥酸和二十碳烯酸的含量分別約為44-50％和10-13％。
種子油中長鏈單不飽和的含量至少約為82％，芥酸的含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)。可提取這些油，例如從上述含有合適的脂肪酸組成的蕓苔屬種子的一個品系中提取。這些油的油酸和二十碳烯酸的含量分別至少約為37％和14％(根據(jù)總脂肪酸組成)。這些油的飽和和多不飽和脂肪酸總含量分別至多約為7％和11％。較佳地，多不飽和脂肪酸含量至多約為9％。在一些實施例中，油的單不飽和脂肪酸含量約為85％-90％。這些油的油酸含量至少約為42％或更多，更佳的是約47％-56％。這些油的芥酸含量約為17％-31％，二十碳烯酸的含量約為15％-21％。
在一些實施例中，這些油中長鏈單不飽和脂肪酸含量約為82％-90％，其中油酸含量約為25％-30％，芥酸含量約為44％-50％，二十碳烯酸含量約為10％-13％。這些油中神經(jīng)酸、芥酸和二十碳烯酸含量的總和約為50％-66％。
另外，設想可將高芥酸菜籽油(HEAR)和含至少約87％油酸(較佳地是約90％-95％油酸)(總脂肪酸組成中)的油混合獲得本發(fā)明的油。HEAR油的芥酸含量約為49％，油酸含量約為16％。
含長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％的油出乎意料地具有低溫特性，這對工業(yè)應用而言是非常理想的，如可作潤滑油。尚不知道這些特性的基礎，但可能是本發(fā)明油中三酰甘油的異源鏈長度阻止順次堆積，因為未端的甲基在分子體積錯配，誘導了范德華相互作用。每種脂肪酸的雙鍵位于酰鏈的不同碳位置，可能破壞了堆積，也誘導了毗鄰脂肪酸鏈之間的π-π電子相互作用。認為高單不飽和脂肪酸含量提供了改善的抗氧化穩(wěn)定性以及高流動性。本發(fā)明油中多不飽和脂肪酸的低水平也增進高抗氧化穩(wěn)定性，因為20℃亞油酸和亞麻酸的氧化速率分別是油酸氧化速率的12-20倍和25倍。
按AOCS Official Method Cd 12b-92(1993年頒布)，用抗氧化穩(wěn)定性指數(shù)裝置(Omnion,Inc.,Rockland,MA)測定抗氧化穩(wěn)定性。這種方法是活性氧法(AOM)流程(AOCS Official Method Cd12-57)自動化的替代。含長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％的油的氧化穩(wěn)定性約為40AOM小時-100AOM小時(不添加抗氧化化劑時)。與其相比，半油酸canola油(約76％油酸)和高芥酸菜籽油的抗氧化穩(wěn)定性分別約為38AOM小時和16AOM小時(不添加抗氧化劑時)。
本發(fā)明的油具有理想的功能特性，如低溫特性和高粘度指數(shù)以及高抗氧化穩(wěn)定性。高分子量脂肪酸的存在增加了三酰甘油的分子量，使油具有較高的閃點和較高的燃燒點。分子量的增加也改善了油的粘度指數(shù)。粘度指數(shù)是表明潤滑油粘度隨溫度變化的一任意數(shù)。可從40℃和100℃觀察到的潤滑油的粘度計算Dean和Danis粘度指數(shù)；可得到的粘度指數(shù)值的范圍在0-200以上。較高的粘度指數(shù)值表明油的粘度隨溫度改變的變化較小。換言之，粘度指數(shù)越高，潤滑油在低溫和高溫之間粘度的差異越小。
通過向含長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％和芥酸含量至少約為15％(總脂肪酸組成中)的油中加入一種或多種添加劑，可將本發(fā)明的油配制成工業(yè)應用的油，如發(fā)動機潤滑油或液壓液。例如，可制造用于柴油機的傳輸液，其包括抗氧化劑、消泡劑、抗磨劑、防腐劑、分散劑、脫垢劑、和酸中和劑，或它們的組合。液壓油組合物可包括抗氧化劑、防銹劑、抗磨劑、降凝劑、粘度指數(shù)改善劑、和消泡劑，或它們的組合。特殊的油配方根據(jù)該油的最終用途而不同，最終用途特殊的適合配方可用標準方法評估。
抗氧化劑通常包括二硫代磷酸鋅、二硫代氨基甲酸甲酯、受阻酚、硫化酚、金屬酚硫化物、水楊酸金屬、芳香胺、磷-硫化脂肪和烯烴、硫化烯烴、硫化脂肪和脂肪衍生物、硫化煤油、硫化羧酸、雙水楊醛(disamieylal)-1,2-丙二酰胺、2,4-二(烷基二硫代-1,3,4-thiadiazole)和二月桂基硒化物?？寡趸瘎┩ǔ４嬖诘牧繛榧s0.01％-5％(組合物重量)。具體地說，在本發(fā)明的油中加入約0.01-1.0％抗氧化劑。見美國專利No.5,451,334中可添加的抗氧化劑。
防銹劑保護表面抗銹，包括烷基丁二酸類型的有機酸及其衍生物、烷基硫代乙酸及其衍生物、有機胺、有機磷酸鹽、多元醇、磺酸鈉和磺酸鈣?？鼓┪皆诮饘偕希峁┮粚幽ど鷾p少金屬與金屬的接觸。通常，抗磨劑包括二烷基二硫代磷酸鋅、磷酸三(甲苯酯)、二月桂基亞磷酸、硫化鯨油、硫化萜和二烷基二硫代氨基甲酸鋅，使用的量為約0.05％-4.5％。
防腐劑包括二硫代磷酸鹽，具體地說是二硫代磷酸鋅、金屬磺酸鹽、金屬酚鹽硫化物、脂肪酸、酸式磷酸脂和烷基丁二酸。
降凝劑使油組合物在低于未修飾潤滑油的凝固點流動。普通降凝劑包括聚甲基丙烯酸酯、蠟烷基化萘聚合物、蠟烷基化酚聚合物和氯化聚合物，存在的量約為1％或更低。見美國專利No.4,451,334和No.5,413,725。加入聚異丁烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、乙烯-丙烯共聚物、苯乙烯-異戊二烯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物和苯乙烯-馬來酸酯共聚物，能增加粘度指數(shù)。
消泡劑可減少或預防穩(wěn)定性表面泡沫的形成，通常存在的量約為0.00003％-0.05％。消泡劑的非限制性例子為聚甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸酯、烷基亞烷基二硫代磷酸鹽、戊基丙烯酸鹽調(diào)聚物、和聚(2-乙基己基丙烯酸酯)-丙烯酸乙酯共聚物。
脫垢劑和分散劑是提供清洗功能的極性物質(zhì)。脫垢劑包括金屬磺酸鹽、金屬水楊酸鹽和金屬硫代磷酸酯。分散劑包括聚胺琥珀酰亞胺、羥基芐基聚胺、聚胺琥珀酸胺、聚羥基琥珀酸酯和聚胺酰胺咪唑啉。
本發(fā)明可以有各種改進和變化形式，其中一些特殊的實例見以下常規(guī)方法和實施例的描述。例如本發(fā)明可用于所有蕓苔屬，包括蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)和白芥(B.hirta)，產(chǎn)生基本類似的結(jié)果。應理解這些實施例不是將本發(fā)明限制在某一公開形式，相反本發(fā)明包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有改進、等效和替代。包括所有的體細胞克隆變體；植物部分的物理或化學誘變；染色體倍增后的花藥、小孢子或子房培養(yǎng)，；或自花或異花授粉傳遞脂肪酸性狀，或與其它性狀聯(lián)合，產(chǎn)生的新的蕓苔屬品系。
實施例1誘變用Westar的種子(一種加拿大歐洲油菜春季canola品種)作化學誘變。Westar是一種帶canola性質(zhì)的登記過的加拿大春季品種。自1982年以來，田間栽培的Westar脂肪酸組成為，3.9％C16:0、1.9％C18:0、67.5％C18:1、17.6％G18:2、7.4％C18:3、＜2％C20:1+C22:1在商品中保持穩(wěn)定，有＜±10％偏差。
誘變前，將30,000粒歐洲油菜cv.Wester種子，以300粒種子/批在濕潤的濾紙上預浸潤2小時，以軟化種皮。將預浸潤的種子置于80mM甲磺酸乙酯(EMS)中4小時。誘變后，用蒸餾水淋洗種子三次將這些種子播種到含Pro-Mix的48孔板上。68％誘變的種子萌芽。在溫室中將植物保持在25℃/15℃,14/10小時(白天/黑夜)的條件下。開花后，單獨自花授粉每株植物。
分別分類和保藏每株植物的M2種子，將約15,000個M2品系種植在日光苗圃(Carman,Manitoba)中。以3米(列)6英寸(行)播種每個自花授粉植物的種子。種植Westar作為核對品種。用袋子照住每株植物的主要總狀花序，使田間選定的品系自花授粉。成熟時，分別收獲自花授粉植物，分類并保藏種子以確保知道每個種子的來源。
用氣相層析分析自花授粉M3種子和Westar對照種子的(以10粒種子為一樣品)脂肪酸組成。用以1/10,000的嚴謹水平的Z-分布建立每種脂肪酸成分的統(tǒng)計學閾值。測定田間未誘變的Westar對照群體的平均值和標準差。群體的平均值±標準差，乘以Z-分布確定每種脂肪酸統(tǒng)計學的上和下閾值。按10,000群體量，置信區(qū)間為99.99％。
將選定的M3種子以及Westar對照種植溫室中。將這些種子播種到含Pro-Mix泥土的4英寸罐中，在溫室中植物保持在25℃/15℃,14/10小時(白天/黑夜)循環(huán)條件下。開花后，套袋進行頂生總狀花序自花授粉。成熟時，分別收獲每株自花授粉植物的種子M4，標記并保藏以確保知道每個種子的來源。
分析10粒種子為一樣品的M4種子。用以1/800的Z-分布從259個對照樣品建立每種脂肪酸成分的統(tǒng)計學閾值。在Carman,Manitoba田間以3米(列)6英寸(行)間距種植選定的M4品系。每一列選10個M4植物進行套袋自花授粉。成熟時，單獨收獲自花授粉的植物，分列批量收獲自然授粉的植物。對單株選定植物的種子M5以10粒種子一批樣品進行分析，分列批量收獲的種子以50粒種子一批樣品進行分析。
將選定的M5品系以及Westar對照種植在溫室中。種子的培養(yǎng)如上述。開花后，用袋子套住頂生總狀花序進行自花授粉。成熟時，從每株植物單獨收獲自花授粉的M6種子，以10粒種子一批樣品分析脂肪酸組成。
將選定的M6品系種植到Eastern愛達荷州的試驗田。選擇生長條件大不相同的4個試驗位置。地理位置包括Burley、Tetonia、Lamont和shelley(表7)。以3米每列8英寸間距種植這些品系，每個苗圃重復4次。用Randomized CompleteBlock Design確定種植方案。用商業(yè)栽培品系Westar作為對照栽培品系。成熟時，收獲每個苗圃確定產(chǎn)量。取四次重復的統(tǒng)計平均值確定試驗田的產(chǎn)量。用最小顯著差數(shù)檢驗(Least Significant Difference Test)對試驗田從隨機化完整區(qū)組設計評級。
表7所選脂肪酸突變株的試驗田位置
為了確定試驗田培養(yǎng)品種的脂肪酸組成，對每個苗圃的植物套袋進行自花授粉。以10粒種子一批樣品分析單株植物的M7種子的脂肪酸。
為了確定所選脂肪酸突變株的遺傳關(guān)系進行了雜交。雜交中采用M6或后來產(chǎn)生的突變的花。收獲F1種子，并分析其脂肪酸組成，以確定基因作用的模式。在溫室中種植F1后代。將得到的植物自花授粉，收獲F2種子，分析其脂肪酸組成，進行等位性研究。在溫室中種植F2種子和親代品系的種子，每株植物進行自花授粉。如上所述，用10粒種子一批的樣品測試每株植物的F3種子的脂肪酸組成。
在分析某些遺傳關(guān)系時從F1雜交的小孢子制備了雙單倍體群體。用如上所述的方法分析雙單倍體植物自花授粉種子的脂肪酸。
對于化學分析，用玻棒在15ml聚丙烯管中手工研磨10粒種子一批的樣品，以1.2ml用1∶1醚/甲醇配制的0.25N KOH提取。將樣品渦流攪拌30秒，加熱60秒(在60℃水浴鍋中)。加入4ml飽和的NaCl和2.4ml異辛烷，再次渦流攪拌混合物。分相后，將上層有機相移液入單獨的小瓶中，在-5℃氮氣中保存。將1μl樣品注入Supelco SP-2330熔融石英毛細管柱(0.25mm ID,30M長，0.20μm df)。
在180℃進行氣相層析5.5分鐘，然后以2℃/分鐘程序加溫至212℃，并保持此溫度1.5分鐘。總跑樣時間共23分鐘。層析設置為柱頭壓-15psi，柱流速(He)-0.7ml/分鐘，輔助流速-33ml/分鐘，氫氣流速-33ml/分鐘，空氣流速-400ml/分鐘，注射器溫度-250℃，探測器溫度-330℃，分流通風率-1/15。
表8列出了每個感興趣脂肪酸的統(tǒng)計域值的上限和下限。
表8對照Westar植物的特定脂肪酸的統(tǒng)計域值
*Sats=總飽和含量實施例2高油酸Canola品系在實施例1的研究中，M3代有31個品系超出了油酸統(tǒng)計域值的上限(≥71.0％)。品系W7608.3含有71.2％油酸。在M4代，其自交的后代(W7608.3.5，命名為A129.5)持續(xù)超出C18:1的統(tǒng)計學域值的上限(78.8％油酸)。品系A129.5(ATCC40811)的五個自花授粉植物的M5代平均含75.0％油酸。單株植物選擇，A129.3含有75.6％油酸。表9總結(jié)了這種高油酸突變的脂肪酸組成，無論在田地還是溫室條件下，能穩(wěn)定持續(xù)到M7代。該品系也穩(wěn)定地保留了其突變脂肪酸組成物至多處地理位置試驗田的M7代。所有地理位置自花授粉植物(A129)平均含78.3％油酸。每個愛達荷州試驗田位置A129的脂肪酸組成總結(jié)于表10。在多處地理位置重復試驗田中，田地中A129與親代栽培品種Westar的差異不明顯。
商品加工后，發(fā)現(xiàn)A129的canola油與Westar相比具有優(yōu)良的抗氧化穩(wěn)定性(用加速氧法(AOM)，脂肪穩(wěn)定性的American Oil Chemists’Society OfficialMethod Cd 12-57；Active Oxygen Method(1989頒布))。Westar的AOM為18AOM小時，A129為30AOM小時。
表9通過種子誘變產(chǎn)生的高油酸Canola品系的脂肪酸組成脂肪酸百分比
Sats=總飽和含量表10在愛達荷州的不同試驗田高油酸品系的脂肪酸組成脂肪酸百分比
Sats=總飽和含量高油酸突變體A129與其它油酸去飽和酶的遺傳關(guān)系，通過將商品canola栽培品種和低亞麻酸突變株雜交證明。將A129與商品栽培品種Global(C16:0-4.5％、C18:0-1.5％、C18:1-62.9％、C18:2-20.0％、C18:3-7.3％)雜交。分析了約200個F2個體的脂肪酸組成。表11歸納了結(jié)果。1∶2∶1比率的分離度表明單共顯性基因了高油酸上表型的遺傳。
表11A129X Global的遺傳研究
進行了低亞麻酸品種的A129與IMC01的雜交(C16:0-4.1％、C18:0-1.9％、C18:1-66.4％、C18:2-18.1％、C18:3-5.7％)，以確定油酸去飽和酶和亞油酸去飽和酶的遺傳。在F1雜交中，油酸和亞油酸去飽和酶基因都達到親代中位值，表明共顯性基因有作用。F2個體的脂肪酸分析證明兩個獨立共顯性基因的分離度1∶2∶1∶2∶4∶2∶1∶2∶1(表12)。從A129和IMC 01雜交選擇一品系，命名為IMC130(ATCC登錄號為No.75446)，如美國專利申請No.08/425,108所述，本文納入作為參考。
表1微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表2微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表3微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶氨基酸序列的對比
a從質(zhì)粒pRF2-1C采樣表13通過種子誘變產(chǎn)生的低亞油酸Canola品系的脂肪酸組成脂肪酸百分比
a第二位十進位小數(shù)點前的數(shù)字和字母表示植物的品系。第二個十進位小數(shù)點后的數(shù)字表示一個體植物。
bSats=總飽和含量實施例4低亞油酸和亞麻酸的Canola在實施例1的研究中M3代有57個品系超出了亞麻酸統(tǒng)計域值的下限(≤7.3％)。品系W14749.8含5.3％亞麻酸和15.0％亞油酸。M4和M5代(自交后代)[W14749.8命名為M3032(ATCC 75021)]持續(xù)超出低C18:3的統(tǒng)計域值，分別含2.7％和2.3％亞麻酸水平，亞麻酸和亞油酸的總和分別為11.8％和12.5％。表14中總結(jié)了該低亞麻酸加亞油酸突變體的脂肪酸組成，其在田地以及溫室條件下穩(wěn)定至M5代。在多處位置的重復試驗田里，田地中M3023與親代栽培品種Westar沒有明顯差異。
表14通過種子誘變產(chǎn)生的低亞麻酸Canola品系的脂肪酸組成脂肪酸百分比
Sats=總飽和含量實施例5Canola品系Q508和Q4275用甲基N-亞硝基胍(MNNG)誘變歐洲油菜品系IMCl29的種子。MNNG處理包括三個部分預浸泡、加誘變劑和洗滌。用0.05M Sorenson磷酸緩沖液維持預浸泡和誘變劑處理(pH6.1)。在培養(yǎng)皿(100mm×15mm)中濾紙(Whatman#3M)上一次處理200粒種子。將種子在15ml 0.05M Sorenson緩沖液中預浸泡，pH6.1，持續(xù)攪拌2小時。在預浸泡結(jié)束時，除去平板中的緩沖液。
事先用0.05M Sorenson緩沖液配制好10mM濃度的MNNG(pH6.1)。將15ml 10mMMNNG加入到每個平板中的種子上。在22℃±3℃黑暗處培養(yǎng)種子4小時(持續(xù)攪拌)。培養(yǎng)結(jié)束時，除去誘變劑溶液。
用蒸餾水以10分鐘為間隔洗滌種子3次。第四次為30分鐘。如此處理產(chǎn)生LD60群體。
將處理過的種子置于標準溫室盆栽土中，并將它們種植到控制環(huán)境的溫室中。植物在16小時光照下生長。開花時，用袋子套住總狀花序，以產(chǎn)生自交種子。成熟時，收獲M2種子。給每個M2品系一個鑒定號碼。將整個MNNG處理的種子群體命名為Q系。
將收獲得到的M2種子種植在溫室中。生長條件如上述控制。用袋子套住總狀花序進行自交。成熟時，收獲自交的M3種子，分析脂肪酸組成。如實施例1所述批量分析每個M3種子品系(約10-15粒種子)。
以＞82％油酸和＜5.0％亞油酸為截斷值，從M3群體中選出高油酸-低亞油酸的M3品系。從第一批1600個M3品系篩選(脂肪酸組成)中鑒定出了Q508。在溫室中培養(yǎng)Q508 M3代，產(chǎn)生M4代。表15列出了Q508和IMC129的脂肪酸組成。M4自交種子保持了所選的高油酸-低亞油酸表型(表16)。
表15A129和高油酸M3突變體Q508的脂肪酸組成品系 16:0 18:0 18:118:2 18:3A129a4.02.477.77.84.2O508 3.92.184.92.42.9*A129的脂肪酸組成是50個由M3代自花授粉生長植物的平均值。
與Westar相比，M4代Q508植物的農(nóng)藝學品質(zhì)較差。與Westar相比這些植物通常生長得較慢、缺乏早期營養(yǎng)活力，成熟時較矮，易萎黃，而且莢果也短小。Q508的產(chǎn)量比Westar低許多。
溫室中M4代Q508植物與Westar相比活力有降低趨勢。但溫室中生長的Q508比田地中生長的Q508產(chǎn)量高。
表16溫室生長的Q508、IMC129和Westar的種子油中脂肪酸組成
a50粒自花授粉植物的平均值b實施例1的數(shù)據(jù)c50粒自花授粉植物的平均值還鑒定了九種其它M4高油酸低亞油酸品系Q3603、Q3733、Q4249、Q6284、Q6601、Q6761、Q7415、Q4275和Q6676。這些品系中有些具有很好的農(nóng)藝學性狀，種子中油酸水平提高到約80％-84％。
將Q4275與品種Cyclone雜交。自交七代后，從93GS34-179，Q4275×Cyclone雜交的后代品系收獲成熟的種子。如表17所示，批量的種子樣品的脂肪酸組成顯示93GS34保留了Q4275的種子脂肪酸組成。93GS34-179還保持了理想的農(nóng)業(yè)特性。
在Q4275自交7代后，將Q4275、IMC129和93GS34植物在田地中生長(夏季)。在隨機分組設計的4個重復苗圃(5英尺×20英尺)中進行選擇。自然授粉植物。沒有產(chǎn)生自花授粉的種子。成熟時收獲每個苗圃，分析每個品系批量收獲種子的樣品的脂肪酸組成(如上述)。表17顯示了所選品系的脂肪酸組成。
表17田地生長的IMC129、Q4275和93GS34種子的脂肪酸組成
表17顯示的結(jié)果表明在田地環(huán)境下，Q4275保持了所選的高油酸-低亞油酸表型。Q4275植物的農(nóng)藝學性狀也優(yōu)于Q508的。
用Westar作為母本，將M4代Q508植物與Westar雙單倍體雜交。得到的F1種子命名為92EF群體。選出約126個F1個體(比Q508親本表現(xiàn)出更好的農(nóng)藝學性狀)進行自交。將單個植物的一部分F2種子再種入田地。讓每個F2植物自交，分析部分得到的F3種子的脂肪酸組成。F3種子中油酸的含量范圍為59％-79％。沒有回收到高油酸(＞80％)的有良好農(nóng)藝學性狀的單個植物。
將92EF群體的部分F2種子種植在溫室中，分析Q508品系的遺傳學。分析380F2個體的F3種子。圖1顯示了溫室試驗中F3種子的C18:1水平。測試得到的數(shù)據(jù)與假設(Q508含有兩個半顯性和加成性的突變基因起源的IMC129突變以及另一突變)相反。該假設還猜測純合Q508含有85％以上的油酸，純合Westar含有62-67％油酸。如下命名Q508和Westar雜交中每個基因的可能有的基因型AA=Westar Fad2aBB=Westar Fad2b
aa=Q508 Fad2a-bb=Q508 Fad2b-假設獨自分離，預計表型比例為1∶4∶6∶4∶1。假設雜合植物的表型是不能分辨的，因此測試的數(shù)據(jù)純合Westar雜合植物純合Q508為1∶14∶1。
表型#
用卡方(X2)分析，油酸數(shù)據(jù)為1∶14∶1比例。結(jié)論是Q508與Westar的不同在于兩個主要基因上，它們是半顯性和加成性的，且獨自分開。通過比較，IMC129的基因型為aaBB。
表18顯示了種子油中油酸含量85％以上的代表性F3個體的脂肪酸組成?？梢钥闯雠cWestar相比，這些植物中飽和脂肪酸的水平降低。
表18種子油中C18:1＞85％的92EF F3個體
實施例6Canola品系IMC-129、Q508和Westar葉子和根的脂肪酸組成在溫室中培養(yǎng)Q508、IMC129和Westar植物。在6-8葉片發(fā)育階段收獲成熟的葉子、主要展開葉片(primary expanding leaf)、葉柄和根，在液氮中冷凍，-70℃保藏。如實施例1所述，用GLC分析脂類提取物。表19顯示了脂肪酸組成數(shù)據(jù)。表19中的數(shù)據(jù)表明Q508總?cè)~子脂質(zhì)的C18:1含量比C18:2加C18:3高。而Westar和IMC129則是相反的情況。Q508和IMC129之間總?cè)~子脂質(zhì)的差異與Q508中第二個Fad2基因突變了的假設相一致。
所有三個品系的總脂質(zhì)組分中C16:3的含量幾乎相同，表明質(zhì)體FadC基因產(chǎn)物不受Q508突變的影響。為了證明FadC基因沒有突變，分離出葉綠體脂質(zhì)作分析。在這三個品系中沒有檢測到葉綠體C16:1、C16:2或C16:3脂肪酸的變化。Q508、Westar和IMC129質(zhì)體葉子脂質(zhì)相類似，這與Q508中第二個突變影響微粒體Fad2基因但不影響質(zhì)體FadC基因的假設相一致。
表19
實施例7歐洲油菜的突變型和野生型δ-12脂肪酸去飽和酶的序列以逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，用FAD2結(jié)構(gòu)基因的特異性引物來克隆D和Fδ-12去飽和酶基因的整個開放讀框(ORE)。用標準方法分離IMC129、Q508和Westar植物種子的RNA，用作模板。RT-擴增的片段用于核苷酸測序。用標準雙脫氧測序方法，測定每個品系的每個基因DNA序列(雙鏈)。
測序分析顯示與Westar序列相比，IMC129和Q508中的D基因在316核苷酸(翻譯起始密碼子)G被顛換成A。這種顛換使該位點的密碼子從GAG變化成AAG，導致谷氨酸(一種酸性殘基)非保守性取代了堿性殘基賴氨酸。由于Q508品系是從IMC129衍生的，可以期望在這兩個品系中存在相同的突變。當將葉組織的RNA用作模板時，在Q508和IMC129中還檢測到相同的堿基變化。
通過測定含有直接從IMC129和Westar基因組DNA擴增的片段的幾個獨立克隆的序列，證明了在316核苷酸的G-A突變。這些結(jié)果消除了在RT-PVR過程的逆轉(zhuǎn)錄和PCR中引入稀有突變的可能性?？梢缘玫揭韵陆Y(jié)論IMC129的突變是因為在油菜籽微粒體δ-12去飽和酶的D基因編碼區(qū)域的316核苷酸上發(fā)生了單個堿基的顛換。
與Westar的序列相比，在Q508中檢測到F基因的515核苷酸上單個堿基轉(zhuǎn)換(T到A)。這種突變改變了該位點的密碼子(CTC到CAC)，導致在產(chǎn)生的基因產(chǎn)物中非極性殘基(亮氨酸)非保守性取代了成極性殘基(組氨酸)。與Westar的F基因序列相比，IMC129的F基因序列中沒有發(fā)現(xiàn)突變。
這些數(shù)據(jù)支持以下結(jié)論δ-12去飽和酶基因序列中的突變導致含該突變基因的植物的脂肪酸組成改變。另外，數(shù)據(jù)顯示當一植物品系或?qū)俸袃蓚€δ-12去飽和酶基因座時，含有兩個突變基因座的個體的脂肪酸組成與含有一個突變基因座個體的脂肪酸組成不同。
基因圖中29和Q508 D基因中突變位于含有在克隆的δ-12和δ-15膜結(jié)合去飽和酶中發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸基序(His-Xaa-Xaa-Xaa-His)的區(qū)域中(表20)。
表20克隆的Canola膜結(jié)合去飽和酶的氨基酸序列的對比
(FadD=質(zhì)體δ-15,Fad3=微粒體δ-15),(FadC=質(zhì)體δ-12,Fad2=微粒體δ-12)a單字母氨基酸碼；保守性取代加下劃線；非保守性取代為粗體字。
實施例8微粒體δ-12脂肪酸去飽和酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯用RT-PCR分析了發(fā)育Ⅱ期和Ⅲ期種子和葉組織的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。用于特異性擴增上述組織RNA的δ-12去飽和酶F基因RNA的引物是有義引物5’-GGATATGATGATGGTGAAAGA-3’和反義引物5’-TCTTTCACCAT CATCATATCC-3’。用于特異性擴增上述組織的δ-12去飽和酶D基因RNA的引物是有義引物5’-GTTATGAAGCAAAGAAGAAAC-3’和反義引物5’-GTTTCTTCTTTGCTTCATAAC-3’。結(jié)果表明在IMC129、Q508和野生型Westar植物的種子和葉組織中均表達D和F基因的mRNA。
體外轉(zhuǎn)錄和翻譯分析顯示產(chǎn)生了一個約46kD的肽。根據(jù)每個基因推導的氨基酸序列的和以及加上微粒體膜肽的共翻譯，這46KD是D基因產(chǎn)物和F基因產(chǎn)物二者的預計尺寸。
這些結(jié)果排除了無義或移碼突變，從而在突變D基因或突變F基因中存在截短的多肽基因產(chǎn)物的可能性。將這些數(shù)據(jù)與實施例7的數(shù)據(jù)結(jié)合，支持以下結(jié)論Q508和IMC129中的突變是在編碼去飽和酶的δ-12脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)基因中的，而不是在調(diào)節(jié)基因中的突變。
實施例9開發(fā)基因特異性PCR標記根據(jù)上述IMC129的突變D基因中單個堿基的改變，設計了兩種5’PCR引物。這兩種引物的核苷酸序列只在3’端的堿基(Westar為G,IMC129為A)有差異。這種引物使得可以在DNA為基礎的PCR試驗中，區(qū)別突變體fad2-D和野生型Fad2-D等位基因。由于5’PCR引物中只有一個堿基差異，PCR試驗對PCR條件(如退火溫度、循環(huán)次數(shù)、用量和所用DNA模板的純度)非常敏感。所建立的試驗條件是用IMC129和野生型植物的基因組DNA作為模板，區(qū)分突變基因和野生型基因。還可通過改變PCR參數(shù)，尤其是用可變化的粗DNA樣品進一步最佳化條件。將野生型基因與IMC129單堿基突變區(qū)分開來的PCR試驗以及脂肪酸組成分析，提供了簡單分離和選擇分析基因雜交(涉及具有δ-12脂肪酸去飽和酶突變植物)的方法。
實施例10突變型和野生型Fad3基因的轉(zhuǎn)化用突變型和野生型Fad3基因來轉(zhuǎn)化歐洲油菜栽培品種Westar，以證明canola胞質(zhì)亞油酸去飽和酶δ-15去飽和酶的突變Fad3基因是沒有功能的。按WO94/11516所描述的方法，用根癌土壤桿菌進行轉(zhuǎn)化和再生。
工程改造兩種無能(disarm)的土壤桿菌菌株，每種都含有Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有連接于種子特異性啟動子的適當基因和相應的終止序列。第一種質(zhì)粒pIMC110，是將全長野生型Fad3基因插入到(以有義方向)無能的Ti載體中制備的(WO93/11245公開的SEQ ID NO:6的208-1336核苷酸)，并將napin啟動子序列側(cè)接于Fad3基因的5’位點，napin終止子序列側(cè)接于Fad3基因的3’位點。歐洲專利0255378中描述了油菜籽napin啟動子。
第二種質(zhì)粒pIMC205是通過將突變的Fad3基因插入到(以有義方向)無能的Ti載體中制備的。這種突變的序列含有微粒體Fad3基因的411和413核苷酸上的突變(見WO93/11245)，從而將密碼子96的序列從GAC改變成AAG。因此密碼子96的基因產(chǎn)物氨基酸也從天冬氨酸變成賴氨酸。見表20。將菜豆(菜豆Phaseolus vulgaris)云扁豆蛋白(7S種子儲藏蛋白)啟動子片段(495個堿基對)置于突變Fad3基因的5’，云扁豆蛋白終止子序列置于突變Fad3基因的3’。Doyle等人，(1986)J.Biol.Chem.261:9228-9238和Slightom等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1897-1901中描述了云扁豆蛋白的序列。
工程改造適合的質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)移到土壤桿菌LBA4404菌株中。用每種改造的菌株感染5mm Westar種子下胚軸外植體節(jié)段(共培養(yǎng))。將感染的下胚軸轉(zhuǎn)移到胼胝體培養(yǎng)基中，然后再轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中。一旦從胼胝體長出看得見的莖，就切下芽，將其轉(zhuǎn)移到延伸培養(yǎng)基中。切下延伸的嫩枝，浸泡在RootoneTM中，在瓊脂培養(yǎng)基中生根，移植到盆栽土中，到的能育的植物T1。將得到的T1植物自交得到T2種子。
如上所述，進行T2種子的脂肪酸分析。表21列出了結(jié)果。用pIMC110質(zhì)粒得到的40個轉(zhuǎn)化體中，有17個植物證明具有野生型脂肪酸組成，16個證明為過量表達。當將功能基因轉(zhuǎn)化到植物(以有義方向)中時，期望一部分轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出過量表達的表型。
具有pIMC205基因的307個轉(zhuǎn)化植物中，沒有一個表現(xiàn)出脂肪酸組成過量表達。這一結(jié)果表明突變型fad3基因產(chǎn)物是沒有功能的，因為如果基因產(chǎn)物具有功能的話，某些轉(zhuǎn)化體將表現(xiàn)出過量表達的表型。
表21用pIMC205或pIMC110轉(zhuǎn)化的Westar群體中的過量表達和共抑制
表22列出了典型轉(zhuǎn)化植物的脂肪酸組成。品系652-09和663-40是含pIMC110植物的代表，而且分別表現(xiàn)出過量表達和共抑制表型。品系205-284是含pIMC205的植物的代表，含有突變fad3基因。
表22用pIMC205或pIMC110轉(zhuǎn)化的Westar的T2種子的脂肪酸組成
實施例11野生型和突變型Fad2-D和Fad2-F的序列從Q4275(實施例5)的葉子中分離出高分子量的基因組DNA。將這種DNA用于聚合酶鏈式反應(PCR)擴增Fad2-D和Fad2-F基因的模板。PCR擴增的總體積為100μl，其中含有0.3μg基因組DNA、200μM脫氧核糖核苷三磷酸、3mMMgSO4、1-2單位的DNA聚合酶和1X緩沖液(由DNA聚合酶供應商提供)。循環(huán)條件為95℃1分鐘一輪，然后94℃ 1分鐘、55℃ 2分鐘、73℃ 3分鐘30輪。
用Elongase(Gibco-BRL)擴增Fad2-D基因一次。該基因5’和3’端的PCR引物分別為CAUCAUCAUCAUCTTCTTCGTAGGGTTCATCG和CUACUACUACUATCATAGAA GAGAAAGGTTCAG。
單獨擴增Fad-2F基因四次，兩次用Elongase，兩次用Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)。用于該基因5’和3’端的PCR引物分別為5’CAUCAUCAUCAUCATGGGTGCACGTGGAAGAA3’和5’CUACUACUACUA TCTTTCACCATCATCATATCC3’。
在瓊脂糖凝膠中溶解擴增的DNA產(chǎn)物，用Jet Sort純化然后通過在引物兩端的(CAU)4和(CAU)4序列退火入pAMP1(Gibco-BRL)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。
按制造商的說明書，以合成引物AmpliTaqDNA聚合酶和染料終止子，用ABI PRISM 310自動測序儀(Perkin-Elmer)測定Fad2-D和Fad2-F插入片段在兩條鏈上的序列。
發(fā)現(xiàn)Fad2-D基因具有一個在ATG起始密碼子上游的內(nèi)含子。如所預計的，該基因的編碼序列在316核苷酸上含有突變，A變成G(從IMC129衍生的)(圖2)。
與野生型F基因序列相比(圖2)，在Q4275擴增產(chǎn)物的F基因序列中檢測到在908核苷酸上單個堿基的顛換(從G變化成A)。這一突變使303氨基酸的密碼子從GGA變成GAA，導致谷氨酸殘基非保守性取代了甘氨酸(表3和圖3)。植物中突變Q4275 Fad2-Fδ-12去飽和酶基因的表達，改變了脂肪酸組成(如本文所述)。
實施例12高芥酸、高油酸油菜籽圖4列出了為在油菜籽中產(chǎn)生新脂肪酸組成所設計的繁殖程序。通常，將高芥酸品系和高油酸品系雜交。命名為HEC01(以商品名Hero出售)的高芥酸品系含有約45.5％芥酸(表23)。高油酸品系命名為93GS66A-130和93GS34A-179，它們是從93GS衍生的。見實施例5和表17。這些品系的種子油中含有約84％油酸(表24)。
表23HEC01的脂肪酸組成
表2493GS66A-130和93GS34A-179的脂肪酸組成
分別將HEC01×93GS66A-130和HEC01×93GS34A-179雜交的F1代命名為96.801和96.804。讓F196.801和96.804植物自交產(chǎn)生F2種子。隨機分析總共622粒F2種子的脂肪酸組成。表25列出了這622粒種子的單不飽和脂肪酸總含量、油酸、二十碳烯酸、芥酸、多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸總含量的平均百分比以及標準偏差。
表25
這些數(shù)據(jù)的分析表明正態(tài)分布中頻率分布偏離。長鏈單小飽和脂肪酸含量的頻率分布略偏向右(-0.0513)，二十碳烯酸含量的頻率分布嚴重偏向右(1.715)。油酸和芥酸含量的頻率分布嚴重偏向左(分別為0.397和0.177)。用Windows的Lotus1-2-3(5.0版本)計算偏斜度。
表26顯示了種子總?cè)褐兴x群體的特征。例如，151種種子的長鏈單不飽和脂肪酸含量大于82％(表26,B列)。該群體中，平均油酸、二十碳烯酸和芥酸含量分別為48％、16％和19％?？偠嗖伙柡椭舅岷?C18:2、C18:3和C20:2)約為9％，總飽和脂肪酸含量至多為7％。
622種種子中有47種的長鏈單不飽和脂肪酸含量大于85％(表26，C列)。這些種子的平均油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分別為51％、17％和17％。總飽和和總多不飽和脂肪酸分別至多為7％。
23種種子二十碳烯酸的含量大于19％(表26，列F)。這些種子的平均油酸和芥酸含量分別約為44％和19％?？偠嗖伙柡椭舅嵝∮?0％，總飽和脂肪酸小于7％。
表26
A=長鏈單不飽和含量＞80％,n=247；B=＞82％總長鏈單不飽和含量，n=151；C=＞85％總長鏈單不飽和含量，n=47；D=＞15％芥酸，n=318；E=＞15％二十碳烯酸；F=＞19％二十碳烯酸，n=23表27列出了所選的單種種子的脂肪酸組成。V800655.334是一長鏈單不飽和脂肪酸含量約為84％的單粒種子。油酸、二十碳烯酸和芥酸的含量分別為33.48％、17.14％和32.23％?？偠嗖伙柡椭舅岬暮考s為10％。亞油酸、α-亞麻酸和芥酸的含量分別為3.54％、6.01％和0.15％。
V800655.126是一長鏈單不飽和脂肪酸含量約為85％的單種種子(油酸為42.67％，二十碳烯酸為16.21％，芥酸為25.37％)?？偠嗖伙柡椭舅岷考s為8％(亞油酸為4.87％,α-亞麻酸為3.05％，和二十碳二烯酸為0.13％)。
V800654.9是一長鏈單不飽和脂肪酸含量約為89％的單種種子(油酸為51.53％，二十碳烯酸為16.94％，芥酸為19.24％)。總多不飽和脂肪酸含量約為8％(亞油酸為4.87％,α-亞麻酸為3.05％，和二十碳二烯酸為0.13％)。
將長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82、芥酸含量至少約為15％的單個種子種植在溫室中，長至成熟，進行自花授粉。收獲每株植物的種子(F3代)。分析了每個F2植物的批量種子樣品的脂肪酸組成。
表27所選的單種種子的脂肪酸組成
實施例13用Hero和若干高油酸品系(表28)進行另一雜交，從而通過降低多不飽和脂肪酸含量增加種子芥酸的含量和總單不飽和脂肪酸含量。高油酸品系包括048X058和Q4275X663-40。048X058品系是從兩個分開轉(zhuǎn)化的品系雜交產(chǎn)生的。048X058品系包含因663-40轉(zhuǎn)基因(上述)的導入而產(chǎn)生的共抑制子，以及由轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的另一共抑制子，包括連接于油酸去飽和酶基因的油質(zhì)蛋白啟動子。從Q4275(實施例5和表17)與663-40雜交產(chǎn)生了Q4275X663-40品系。663-40品系含有因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的共抑制子，包括連接于亞油酸去飽和酶基因的napin啟動子。使每個品系的植物在生長室生長，16小時光照，溫度為23℃/17℃(白天/晚上)。開花前先將花朵去雄，蓋住以防止異花授粉。第二天，用選定的花粉供體對去雄花朵的柱頭授粉。收獲莢果中成熟的F1種子。
表28雜交分組
在生長室中培養(yǎng)表28雜交產(chǎn)生的F1種子，得到F2種子。每種雜交各種10粒種子。開花后，用袋子蓋住植物，以確保自花授粉。成熟時收獲F2種子。
室溫暗處使種子在濾紙上萌芽。萌芽開始后的18-24小時，從種子取一片子葉，來提取脂肪酸。用氣相層析確定脂肪酸組成。表29和30顯示了所選的F2一半種子的高芥酸含量。
將F2一半種子種于土中，在生長室條件下培養(yǎng)(如上所述)。開花后，用袋子套住植物進行自花授粉。成熟后，收獲F3種子，并作脂肪酸組成分析。用10-15粒種子樣品進行種子的分析。表31和32顯示了分析結(jié)果。
表29HEHOA[HE101X(048X052)]的F2一半種子的脂肪酸組成
表30HEHIOHE101X(Q4275X663-40)]的一半種子的脂肪酸組成
表3197 HEHOA[HE101X(048X052)]的F3品系的脂肪酸組成
表32HEHOC[HE101X(Q4275X663-40)]F3品系的脂肪酸組成
如上所述，種植HEHOC-214F3種子，在生長室條件下生長，進行自花授粉。成熟時，收獲F4種子，用10-15粒種子量的樣品作脂肪酸組成分析。表33顯示了三個F4品系的種子脂肪酸組成。這三個樣品的長鏈單不飽和脂肪酸含量都大于82％，芥酸含量都大于37％(總脂肪酸組成中)。這些F4代物質(zhì)中影響脂肪酸組成的基因依舊是分開的。選擇后代將固定遺傳組合，產(chǎn)生的品系所含的種子脂肪酸組成中有約25-30％油酸、約3-4％亞油酸、約1-2％α-亞麻酸、約45-50％芥酸和約10-13％二十碳烯酸。
表33HEHOC 214的F4品系的脂肪酸組成
實施例14將表31諸品系的種子種在兩個分開的苗圃中。讓每個苗圃中的植物自然授粉。從每個苗圃產(chǎn)生的種子中提取油，表34列出了油的脂肪酸組成。將每種油的樣品精煉、漂白(長鏈高單不飽和苗圃1)或精煉、漂白和脫臭(長鏈高單不飽和苗圃2)。苗圃1油的總飽和脂肪酸含量為5.55％，長鏈單不飽和脂肪酸含量為85.23％，總多不飽和脂肪酸含量為6.80％。苗圃2油的總飽和脂肪酸含量為5.22％，長鏈單不飽和脂肪酸含量為82.90％，總多不飽和脂肪酸含量為9.56％。苗圃1和2油的碘值分別為79和81.7。未脫臭的苗圃1油含有420ppm生育酚。苗圃2油含有280ppm生育酚。苗圃1和2油的平均抗氧化穩(wěn)定性分別為70AOM小時(n=2、69和71AOM小時)和49.5AOM小時(n=2、48和51AOM小時)。
表34高長鏈單不飽和菜籽油的脂肪酸組成
表35列出了苗圃1和2油的特征，是用Perkin Elmer型號7差式掃描量熱計通過差式掃描量熱確定的。將7-12mg樣品置于樣品盤中，密封，加到自動取樣器中。維持樣品的初始溫度20℃1分鐘，以40℃/分鐘的速度將溫度降至-30℃。維持樣品-30℃10分鐘，然后以5℃/分鐘速度加熱到75℃，得到熔化曲線。保持樣品75℃10分鐘，然后冷卻到-30℃(以5℃/分鐘)得到冷卻曲線。結(jié)果顯示這些長鏈單不飽和脂肪酸含量大于82％、芥酸含量大于15％的油，融點約為2-3℃。與其相比，三芥酸精在室溫下是為固體。
表35長鏈高單不飽和菜籽油的特征
實施例15如實施例5所述，用MNNG誘變歐洲油菜品種IMC129的種子。如實施例5所述，培養(yǎng)處理過的種子，在M3代選擇硬脂酸或棕櫚酸含量降低的種子。將兩個選出的分別命名為ZW1441(棕櫚酸含量降低)和Y30137(硬脂酸含量降低)的品系植株與HE101雜交。選擇種子棕櫚酸含量降低、芥酸含量升高的ZW1441XHE101后代。選擇種子硬脂酸含量降低、芥酸含量升高的Y30137XHE101后代。表36顯示了所選的代表性F4代種子的脂肪酸組成。結(jié)果表明可產(chǎn)生長鏈單不飽和脂肪酸含量約為82％或更多、芥酸含量為15％或更多和總飽和脂肪酸含量小于4％(如約2.0％-4.0％)的種子。
表36F4品系的脂肪酸組成
對于上述未表明的范圍而言，本領域普通技術(shù)人員將會理解本文所描述和說明的各種具體實施例可加入其它實施例的特點進行進一步改進。本文所引用的所有專利、出版物和其它參考文獻，本文全部納為參考。
上述發(fā)明詳述僅是為了提供對本發(fā)明更好的理解，對本發(fā)明無任何限制作用，以及對本領域技術(shù)人員而言，某些改進顯然也是在以下權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的。
序列表<110>Kodali,Dharma R.
Fan,ZhegongDeBonte,Lorin R.
<120>總單不飽和脂肪酸含量提高的植物、種子和油<130>07148/097WO1<156>09/128602<151>1998-08-03<160>18<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1155<212>DNA<213>歐洲油菜<220>
<221>CDS<222>(1)...(1152)<221>未知<222>(133)...(133)<222>Xaa=Pro或Leu<221>未知<222>(194)...(194)<223>Xaa=Leu<221>未知<222>(246)...(246)<223>Xaa=Ile或Val<221>未知<222>(262)...(262)<223>Xaa=Ile或Val<221>未知<222>(345)...(345)<223>Xaa=Tyr<400>1atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aag aag tct 48Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15gaa acc gac acc atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96Glu Thr Asp Thr Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30gtc gga gaa ctc aag aaa gca arc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45atc cct cgc tct ttc tcc tac crc atc tgg gac arc arc ata gcc tcc 192Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Set50 55 60tgc ttc tac tac ntc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240Cys Phe Tyr Tyr Xaa Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc caa ggg tgc gtc 288Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gaa tgc ggc cac cac gcc ttc 336Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110agc gac tac cag tgg ctt gac gac acc gtc ggt ctc atc ttc cac tcc 384Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125ttc ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cgc agc cac 432Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Ser His130 135 140cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg 528Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu165 170 175gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg ccg ttg 576Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190tac tta gcc ttc aac gtc tcg gga aga cct tac gac ggc ggc ttc cgt 624Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Arg195 200 205tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgc gag cgt ctc 672Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220cag ata tac atc tcc gac gct ggc arc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240ttc cgt tac gcc gcc ggc cag gga gtg gcc tcg atg gtc tgc ttc tac 768Phe Arg Tyr Ala Ala Gly Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255gga gtc ccg ctt ctg att gtc aat ggt ttc ctc gtg ttg atc act tac 816Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tac gat tcg tcc gag tgg 864Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285gat tgg ttc agg gga gct ttg gct acc gtt gac aga gac tac gga atc 912Asp Trp Phe Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300ttg aac aag gtc ttc cac aat att acc gac acg cac gtg gcc cat cat 960Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320ccg ttc tcc acg atg ccg cat tat cac gcg atg gaa gct acc aag gcg 1008Pro Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val340 345 350gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt arc tat gtg gaa ccg 1104Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380tga 1155<210>2<211>384<212>PRT<213>歐洲油菜<221>未知<222>(133)...(133)<223>Xaa=Pro或Leu<221>未知<222>(194)...(194)<223>Xaa=Leu<221>未知<222>(246)...(246)<223>Xaa=Ile或Val<221>未知<222>(262)...(262)
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<221>CDS<222>(1)...(1152)<400>5atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15gaa acc gac aac arc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac arc atc ata gcc tcc 192Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc 288Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc 336Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110agc gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc crc arc ttc cac tcc 384Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125ttc ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac 432Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His130 135 140cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac crc aac aac cct ttg 528Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu165 170 175gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg 576Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190tac tta gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc arc tac aac gac cgc gag cgt ctc 672Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240tac cgc tac gct gct gtc caa gga gtt gcc tcg atg gtc tgc ttc tac 768Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255gga gtt ccg crt ctg att gtc aat ggg ttc tta gtt ttg atc act tac 816Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc 912Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960Leu ASn Lys Val Phe His ASn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335ata aag ccg ata ctg gga gag tat tat cag ttg cat ggg acg ccg gtg 1056Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Leu His Gly Thr Pro Val
340 345 350gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380tga 1155<210>6<211>384<212>PRT<213>歐洲油菜<400>6Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His130 135 140His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160Lys Lys Set Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu165 170 175Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335Ile Lys Pro Ile Leu G1y Glu Tyr Tyr Gln Leu His Gly Thr Pro Val340 345 350Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380<210>7<211>1155<212>DNA<213>歐洲油菜<220>
<221>CDS<222>(1)...(1152)<400>7atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15gaa acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc 192Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc 288Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gin Gly Cys Val85 90 95cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc 336Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110agc gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc ctc atc ttc cac tcc 384Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125ttc ctc ctc gtc cct tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac 432Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg Ris130 135 140cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac cac aac aac cct ttg 528Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr His Asn Asn Pro Leu165 170 175gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg 576Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190tac tta gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgc gag cgt ctc 672Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220cag ata tac atc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240tac cgc tac gct gct gtc caa gga gtt gcc tcg atg gtc tgc ttc tac 768Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255gga gtt ccg ctt ctg att gtc aat ggg ttc tta gtt ttg atc act tac 816Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Ash Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga atc 912Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335ara aag ccg ara ctg gga gag tat tat cag ttg cat ggg acg ccg gtg 1056Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Leu His Gly Thr Pro Val340 345 350gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380tga 1155<210>8<211>384<212>PRT<213>歐洲油菜<400>8Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125Phe Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His130 135 140His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr His Asn Asn Pro Leu165 170 175Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205Cys His Phe His Pro ASn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240Tyr Arg Tyr Ala Ala Val Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Leu His Gly Thr Pro Val340 345 350Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380<210>9<211>1155<212>DNA<213>歐洲油菜<220>
<221>CDS<222>(1)...(1152)<400>9atg ggt gca ggt gga aga atg caa gtg tct cct ccc tcc aaa aag tct 48Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15gaa acc gac aac atc aag cgc gta ccc tgc gag aca ccg ccc ttc act 96Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30gtc gga gaa ctc aag aaa gca atc cca ccg cac tgt ttc aaa cgc tcg 144Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser
35 40 45atc cct cgc tct ttc tcc tac ctc atc tgg gac atc atc ata gcc tcc 192Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60tgc ttc tac tac gtc gcc acc act tac ttc cct ctc ctc cct cac cct 240Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80ctc tcc tac ttc gcc tgg cct ctc tac tgg gcc tgc cag ggc tgc gtc 288Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95cta acc ggc gtc tgg gtc ata gcc cac gag tgc ggc cac cac gcc ttc 336Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110agc gac tac cag tgg ctg gac gac acc gtc ggc ctc arc ttc cac tcc 384Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125ttc ctc ctc gtc cyt tac ttc tcc tgg aag tac agt cat cga cgc cac 432Phe Leu Leu Val Xaa Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His130 135 140cat tcc aac act ggc tcc ctc gag aga gac gaa gtg ttt gtc ccc aag 480His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160aag aag tca gac atc aag tgg tac ggc aag tac ctc aac aac cct ttg 528Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu165 170 175gga cgc acc gtg atg tta acg gtt cag ttc act ctc ggc tgg cct ttg 576Gly Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190tac ttr gcc ttc aac gtc tcg ggg aga cct tac gac ggc ggc ttc gct 624Tyr Xaa Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205tgc cat ttc cac ccc aac gct ccc atc tac aac gac cgt gag cgt crc 672Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220cag ata tac arc tcc gac gct ggc atc ctc gcc gtc tgc tac ggt ctc 720Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240tac cgc tac gct gct rtc caa gga gtt gcc tcg atg gtc tgc ttc tac 768Tyr Arg Tyr Ala Ala Xaa Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255gga gtt cct ctt ctg rtt gtc aac ggg ttc tta gtt ttg atc act tac 816Gly Val Pro Leu Leu Xaa Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270ttg cag cac acg cat cct tcc ctg cct cac tat gac tcg tct gag tgg 864Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285gat tgg ttg agg gga gct ttg gcc acc gtt gac aga gac tac gga arc 912Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290295 300ttg aac aag gtc ttc cac aat atc acg gac acg cac gtg gcg cat cac 960Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320ctg ttc tcg acc atg ccg cat tat cat gcg atg gaa gct acg aag gcg 1008Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335ata aag ccg ata ctg gga gag tat tay cag ttc gat ggg acg ccg gtg 1056Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Xaa Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val340 345 350gtt aag gcg atg tgg agg gag gcg aag gag tgt atc tat gtg gaa ccg 1104Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365gac agg caa ggt gag aag aaa ggt gtg ttc tgg tac aac aat aag tta 1152Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380tga 1155<210>10<211>384<212>PRT<213>歐洲油菜<400>10Met Gly Ala Gly Gly Arg Met Gln Val Ser Pro Pro Ser Lys Lys Ser1 5 10 15Glu Thr Asp Asn Ile Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr20 25 30Val Gly Glu Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser35 40 45Ile Pro Arg Ser Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Ile Ala Ser50 55 60Cys Phe Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro65 70 75 80Leu Ser Tyr Phe Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gln Gly Cys Val85 90 95Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe100 105 110Ser Asp Tyr Gln Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser115 120 125Phe Leu Leu Val Xaa Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His130 135 140His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys145 150 155 160Lys Lys Ser Asp Ile Lys Trp Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu165 170 175G1y Arg Thr Val Met Leu Thr Val Gln Phe Thr Leu Gly Trp Pro Leu180 185 190Tyr Xaa Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Gly Gly Phe Ala195 200 205Cys His Phe His Pro Asn Ala Pro Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu210 215 220Gln Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Ile Leu Ala Val Cys Tyr Gly Leu225 230 235 240Tyr Arg Tyr Ala Ala Xaa Gln Gly Val Ala Ser Met Val Cys Phe Tyr245 250 255Gly Val Pro Leu Leu Xaa Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr260 265 270Leu Gln His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp275 280 285Asp Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile290 295 300Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His305 310 315 320Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala325 330 335Ile Lys Pro Ile Leu Gly Glu Tyr Xaa Gln Phe Asp Gly Thr Pro Val340 345 350Val Lys Ala Met Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro355 360 365Asp Arg Gln Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu370 375 380<210>11<211>21<212>DNA<213>其它核酸<400>11ggatatgatg atggtgaaag a 21<210>12<211>21<212>DNA<213>其它核酸
<400>12tctttcacca tcatcatatc c 21<210>13<211>21<212>DNA<213>其它核酸<400>13gttatgaagc aaagaagaaa c 21<210>14<211>21<212>DNA<213>其它核酸<400>14gtttcttctt tgcttcataa c 21<210>15<211>32<212>DNA<213>其它核酸<400>15caucaucauc aucttcttcg tagggttcat cg 32<210>16<211>33<212>DNA<213>其它核酸<400>16cuacuacuac uatcatagaa gagaaaggtt cag 33<210>17<211>32<212>DNA<213>其它<400>17caucaucauc aucatgggtg cacgtggaag aa 32<210>18
<211>33<212>DNA<213>其它<400>18cuacuacuac uatctttcac catcatcata tcc 3權(quán)利要求
1．一種蕓苔屬植物，其特征在于，所述植物產(chǎn)生的種子總脂肪酸組成中，長鏈單不飽和脂肪酸的含量至少約為82％，芥酸含量至少約為15％。
2．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的種子中油酸含量至少約占總脂肪酸組成的37％。
3．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的種子中二十碳烯酸的含量至少約占總脂肪酸組成的14％。
4．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的單不飽和脂肪酸含量約為85％-90％。
5．如權(quán)利要求4所述的植物，其特征在于，所述的種子中油酸至少約占總脂肪酸組成的42％。
6．如權(quán)利要求5所述的植物，其特征在于，所述的油酸含量約為47％-56％。
7．如權(quán)利要求4所述的植物，其特征在于，所述的種子中芥酸的含量約占總脂肪酸組成的7％-31％。
8．如權(quán)利要求4所述的植物，其特征在于，所述的種子中二十碳烯酸的含量約占總脂肪酸組成的15％-21％。
9．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的種子中飽和脂肪酸含量至多約占總脂肪酸組成的7％。
10．如權(quán)利要求9所述的植物，其特征在于，所述的種子中飽和脂肪酸含量約占脂肪酸組成的4％。
11．如權(quán)利要求10所述的植物，其特征在于，所述的種子中飽和脂肪酸含量約占總脂肪酸組成的2％-4％。
12．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的種子中多不飽和脂肪酸含量至多約占總脂肪酸組成的11％。
13．如權(quán)利要求12所述的植物，其特征在于，所述的種子中多不飽和脂肪酸含量約占總脂肪酸組成的6％-11％。
14．如權(quán)利要求1所述的植物，其特征在于，所述的種子中α-亞麻酸含量約占總脂肪酸組成的1％-2％。
15．權(quán)利要求1所述植物的后代，其特征在于，所述的后代具有所述的長鏈單不飽和脂肪酸含量和所述的芥酸含量。
16．一種蕓苔屬種子油，其特征在于，其總脂肪酸組成中長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％，芥酸含量至少約為15％。
17．如權(quán)利要求16所述的油，其特征在于，所述的油中油酸的含量占總脂肪酸組成的至少37％。
18．如權(quán)利要求16所述的油，其特征在于，所述的油中二十碳烯酸的含量至少約占總脂肪酸組成的14％。
19．如權(quán)利要求16所述的油，其特征在于，所述的單不飽和脂肪酸含量約為85％-90％。
20．如權(quán)利要求19所述的油，其特征在于，所述的油中油酸的含量至少約占總脂肪酸組成的42％。
21．如權(quán)利要求20所述的油，其特征在于，所述的芥酸含量約為47％-56％。
22．如權(quán)利要求19所述的油，其特征在于，所述的油中芥酸的含量占總脂肪酸組成的17％-31％。
23．如權(quán)利要求19所述的油，其特征在于，所述的油中二十碳烯酸的含量約占總脂肪酸組成的15％-21％。
24．如權(quán)利要求16所述的油，其特征在于，所述的油中飽和脂肪酸含量至多約占總脂肪酸組成的7％。
25．如權(quán)利要求16所述的油，其特征在于，所述的油中多不飽和脂肪酸的含量至多約占總脂肪酸組成的11％。
26．如權(quán)利要求25所述的油，其特征在于，油中所述的多不飽和脂肪酸的含量不到9％。
27．一種蕓苔屬種子油，其特征在于，所述的油中長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約占總脂肪酸組成的82％，其中神經(jīng)酸、芥酸和二十碳烯酸的含量總和約為50％-66％。
28．如權(quán)利要求27所述的種子油，其特征在于，其中油酸含量約為25％-30％。
29．一種產(chǎn)生蕓苔屬植物的方法，其特征在于，所述的方法包括將第一種植物品系與第二種植物品系雜交，篩選所述雜交的后代，其中所述的第一種植物品系的芥酸含量至少約占總脂肪酸組成的45％，所述的第二種植物品系的油酸含量至少約占總脂肪酸組成的84％，所述的后代的長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約占總脂肪酸組成的82％，芥酸含量至少約占15％。
30．一種制造植物油的方法，其特征在于，所述的方法包括壓榨蕓苔屬種子，所述的種子的總脂肪酸組成中長鏈單不飽和脂肪酸含量至少為82％，芥酸含量至少約為15％，并從所述的壓榨過的種子中提取所述的植物油。
31．如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括精煉和漂白所述的油。
32．如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括將所述的油脫臭。
33．一種潤滑油，其特征在于，所述的潤滑油包含蕓苔屬油和添加劑，所述的蕓苔屬油的總脂肪酸組成中長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％，芥酸含量至少約為15％。
34．如權(quán)利要求33所述的潤滑油，其特征在于，所述的添加劑選自抗氧化劑、防銹劑、防腐劑、降凝劑、消泡劑、著色劑和脫垢劑。
35．如權(quán)利要求33所述的潤滑劑，其特征在于，所述的添加劑存在的量約為0.01％-20％重量。
36．一種液壓液，其特征在于，所述的液壓液包括蕓苔屬油和添加劑，所述的蕓苔屬油的總脂肪酸組成中長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82％，芥酸含量至少約為15％。
37．如權(quán)利要求36所述的液壓液，其特征在于，所述的添加劑選自抗氧化劑、防銹劑、防腐劑、降凝劑、消泡劑、著色劑和脫垢劑。
38．如權(quán)利要求36所述的液壓液，其特征在于，所述的添加劑存在的量約為0.01％-20％重量。
全文摘要
本發(fā)明描述了長鏈單不飽和脂肪酸含量至少約為82%和芥酸含量至少約為15%的植物、種子和油。還描述了產(chǎn)生具有脂肪酸含量組成特性植物的方法。
文檔編號C10N30/12GK1315826SQ99810256
公開日2001年10月3日 申請日期1999年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月3日
發(fā)明者D·科代利, 樊哲工, L·R·德博內(nèi)特 申請人:嘉吉有限公司