專利名稱：大豆品種抗光氧化的快速篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大豆抗光氧化特性的快速篩選方法，適用于作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆[Glycine max (L. )Merr.]是當(dāng)今世界上重要的植物蛋白和植物油來源， 大豆產(chǎn)量在世界食品構(gòu)成和國際油料生產(chǎn)中占有重要地位，目前的世界大豆年產(chǎn)量約占世 界油料生產(chǎn)的35%。大豆不僅是重要的蛋白質(zhì)和油料兼用作物，還是重要的用地養(yǎng)地作物。大豆的 根系富含根瘤，根瘤里面的根瘤菌可以將空氣中的游離氮素通過一系列生物還原過程，轉(zhuǎn) 變?yōu)榭梢员蛔魑镂盏牡亍?jù)研究，種過一季大豆的田塊，其土壤的肥力提高程度相當(dāng)于 增施了 50斤硫酸銨。大豆根瘤腐爛后產(chǎn)生的多種有機酸，還能明顯改變土壤的物理和化學(xué) 性質(zhì)，利于其他作物的高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)。大豆在高溫、干旱等逆境下會產(chǎn)生光氧化現(xiàn)象，光氧化直接影響大豆的光合 作用效率，不同大豆品種和育種材料的光氧化特性差異很大，抗(耐)光氧化的大豆種質(zhì)資 源和育種材料，在高溫、干旱等逆境下，光合作用下降的速度和強度遠低于不耐光氧化的種 質(zhì)。因此，認真篩選抗(耐)光氧化的種質(zhì)，讓這些抗性種質(zhì)參與大豆抗(耐)光氧化的遺傳 重組，并在分離的雜交后代中注重選出抗(耐)光氧化的優(yōu)良個體和家系，是大豆高光效育 種的重要內(nèi)容。大豆光氧化是和光合作用密切相關(guān)的生理特性，根據(jù)田間生長的表型特征基本上 無法篩選出抗(耐)光氧化材料。在實驗室，人們主要是通過測定與光氧化有關(guān)的酶的活性 和生化產(chǎn)物來評價大豆的光氧化抗性的，常用的酶類有多酚氧化酶，過氧化物酶、過氧化氫 酶、超氧物歧化酶等，有關(guān)的生化產(chǎn)物包括葉黃素、抗壞血酸、玉米黃素、類胡蘿卜素、維生 素E等。測定這些酶的活性和生化產(chǎn)物不僅費工、費時、而且速度很慢、工作效率很低，大量 的實驗室污水還會在一定程度上造成環(huán)境污染。因此，通過實驗，盡快創(chuàng)建一套高效、節(jié)本、 低污染的大豆光氧化特性測定技術(shù)是大豆品種改良刻不容緩的工作。1997年開始，在江蘇 省科委的支持下，我們開始了這方面的探索，以我院保存的我省1500份大豆種質(zhì)資源和國 外引進的200份大豆品種為試驗材料，在夏季高溫強光照條件下，將頂端第四張大豆葉片 進行批量光氧化處理，并將用此法選出來的不同類型的抗性材料進行酶活性和酶類產(chǎn)物測 定，檢驗快速批量篩選技術(shù)的有效性，事實說明該法是行之有效的。作物的抗光氧化研究，最早開始于上世紀(jì)七十年代。焦德茂等人首先用快速篩選 法鑒定了部分水稻品種資源，并對光氧化的生理基礎(chǔ)進行了一系列研究。大豆抗光氧化種 質(zhì)的快速篩選技術(shù)操作簡單、省工、省本、運作高效，是一項非常有用的實踐技術(shù)，它不僅可 以運用于大豆種質(zhì)資源的抗性批量篩選，還可用于雜交后代的分離群體選擇。它不僅可以 運用于大豆，在小豆和豇豆的抗光氧化篩選上也可運用。因為該技術(shù)人為的創(chuàng)造了一個加 速光氧化的條件，在對多種作物進行抗光氧化特性的篩選時均可參考。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
在夏季高溫強光照季節(jié)，人為創(chuàng)造加速作物光氧化的條件，通過大豆葉片的葉綠素氧 化褪色程度，評價大豆的抗光氧化差異，進而選出抗光氧化種質(zhì)和雜交后代材料。技術(shù)方案
大豆品種抗光氧化的快速篩選方法，其特征在于在夏季溫度超過30°C時，選擇晴好 天氣，在大豆初花后，于早上6點在田間摘取大豆頂部第四片復(fù)葉的中間小葉，每個品種摘 葉八張，置于深度為4厘米的白色磁盤，葉面朝上，不要重疊，在葉片上蓋上厚度為4毫米的 透明普通玻璃片，磁盤加滿自來水，然后將裝有葉片的磁盤置于高溫(30-40度)、強光(夏 天晴天自然光)下曝曬，(每天早上6點鐘將磁盤里面的水倒掉，換上新鮮的自來水)，連續(xù)四 晝夜后，調(diào)查大豆葉片的葉綠素氧化情況，將其褪色情況分為四級葉片90%-100%保持綠 色的定為1級，劃為抗性品種；綠色部分75%-89%以上的定為2級，劃為耐性品種；綠色部 分50%-74%定為3級，劃為耐性較差品種；綠色部分低于49%的定為4級，劃為耐性最差品 種。大豆葉片的面積按照下列方法計算卵園型和橢圓型葉片的面積是(葉片長X葉片 寬)X2 + 3 .長橢圓型和披針型葉片的面積是(葉片長X葉片寬)X4 + 7。大豆抗光氧化的快速篩選方法可在大豆品種抗旱性篩選中應(yīng)用。其中所述大豆品 種對光氧化的抗性定為抗性的，則該大豆品種在抗旱性鑒定中表現(xiàn)為抗性；所述大豆品種 對光氧化的抗性定為耐性的，在抗旱性鑒定中表現(xiàn)為耐性；所述大豆品種在光氧化的抗性 鑒定中定為耐性較差的，在抗旱性鑒定中表現(xiàn)為耐性較差；所述大豆品種在光氧化抗性鑒 定中定為耐性最差的，在抗旱性鑒定中也表現(xiàn)為耐性最差。有益效果 本發(fā)明的技術(shù)思路是
1.大豆抗光氧化能力和大豆本身的遺傳性有關(guān)，也和大豆生長過程的逆境因子的內(nèi) 容、強度有關(guān)，遺傳性是相對穩(wěn)定的，逆境因子的數(shù)量和強度是可以人為設(shè)計和控制的。我 們設(shè)計的快速測定法就是人為的給予大豆一個加速光氧化的逆境條件，使其在較短的時間 內(nèi)，讓批量大豆的抗光氧化能力得以表達。從而大大提高大豆抗光氧化批量篩選的速度和 效果。2.導(dǎo)致大豆光氧化的逆境很多，但是高溫、強光照和缺氧是最有效、最經(jīng)濟、最容 易人為獲得的逆境，所以我們采用了這種逆境。3.測定光氧化抗性的方法有很多種，包括酶活性測定、葉綠素類型變化的測定、 其他有關(guān)色素變化的測定，但是綜合考量，我們認為，在快速測定中，觀察葉綠素的氧化程 度是最方便和直觀的，所以我們選用了這種觀察方法。4.為了檢驗快速測定效果，我們經(jīng)常將快速測定結(jié)果和經(jīng)典的酶活性測定法結(jié) 果進行比對，確保兩種結(jié)果的同步性和一致性。本發(fā)明主要技術(shù)效果
1.極大的提高了測定速度，同樣數(shù)量的樣本，采用快速測定法，只要經(jīng)典測定方法20% 的時間。2.大大減少了測定成本，同樣數(shù)量的樣本，只要花費20%的測定費用和人力。3.因為沒有使用生化物質(zhì)，因此沒有造成酶活性測定過程中不可避免的化學(xué)物 質(zhì)污染。
4
4.因為速度快、成本低、可以對大量種質(zhì)資源和育種中間材料進行批量篩選和鑒 定，從而提高了農(nóng)作物生理育種的可能性和普及性。
具體實施方式
1.準(zhǔn)備一批深度為4厘米，長寬一致的新磁盤；準(zhǔn)備一批新的、厚度為4毫米的透 明普通玻璃片；尋找一塊沒有任何遮檔的水泥曬場，保證所有樣本接收到輻射強度幾乎完 全一致的陽光。
2.在夏季溫度超過30°C時，選擇晴好天氣，在大豆初花后，于清早在田間摘取大 豆頂部第四片復(fù)葉的中間小葉，每個品種摘葉八張，裝入事先準(zhǔn)備好的保溫桶內(nèi)，帶回試驗 場。
3.將大豆葉片平鋪在白色磁盤里，葉面朝上，不要重疊，在葉片上蓋上透明玻璃 片，然后在磁盤里放滿干凈的自來水，將磁盤放在沒有任何遮陽設(shè)備的水泥場上曝曬。每天 早上6點將前一天的水全部倒掉，換上新鮮的自來水。
4.上述處理四晝夜后，調(diào)查大豆葉片的葉綠素氧化情況，我們將其褪色情況分為 級，葉片90-100%保持綠色的定為1級，綠色部分75-89%以上的定為2級，綠色部分50-74% 的定為3級，綠色部分低于49%的定為4級。然后，我們將1級的定為抗性品種，1+—— 2-級，定為耐性品種，3級為耐性較差品種。4級是耐性最差品種。
驗證快速篩選技術(shù)的準(zhǔn)確性和可行性。將上述方法選出的代表性品種，進行酶活 性和生化產(chǎn)物分析，檢驗生理測定和快速測定結(jié)果的一致性和同步性。結(jié)果表明S0D活性 強的大豆品種，其抗光氧化能力就強；反之，SOD活性弱的大豆品種，其抗光氧化能力就弱。
超氧物岐化酶SOD活性的測定方法 1.試劑反應(yīng)液含 13X10-3M 甲硫氨酸(MW=149. 21292)，75X10-6MNBT (MW=817. 7), 2父10-611核黃素(麗=376. 36)，100X10-9MEDTA，50X10-3M 磷酸緩沖液，pH7. 8。4. 0962g Na2HPO4. 12H20,0. 1658g NaH2PO4. 2H20 用蒸餾水溶解，加入 0. 484942g 甲硫氨酸、0. 01533g ΝΒΤ、0· 00075272g核黃素(擴大10倍，溶于IOml蒸餾水，取0. 25ml，此2種藥劑現(xiàn)用現(xiàn)加) 及0. 000037224g EDTANa2 (配時擴大100倍，用蒸餾水定容IOOml后，取0. 75ml)，定容至 250ml，4 °C避光保存。
2.操作取30支粗細、厚薄一致的潔凈試管，分別加入3. 98 ul反應(yīng)液，四支加20ul酶液， 另一支不加酶液加同樣體積的提取緩沖液，以1支加酶的不作光照處理的為空白對照，于 4000Lux照光20-25分鐘后測0D560，每提取液重復(fù)3次，取平均值。
3.計算在上述條件下，抑制50%NBT光化還原的酶量定為一個酶單位，按 Constantine N. et al 1977 (PI. Physiol. 59:309-314)方法計算酶比活力。
SOD units/mg protein = {[ 0D560 (不加酶)/ 0D560 (加酶)_1] X 稀釋倍數(shù) X4 (反應(yīng)液體積)} /
抗壞血酸的測定原理在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰胼-2-羥基丁酰內(nèi)酯衍 生物。在最大吸收波長420nm處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。
1.試劑
1. 1乙酸溶液(2mol/L)吸取11. 6mL冰乙酸，加水稀釋至IOOmL ； 1. 2乙酸溶液(0. 5mol/L)吸取2. 9mL冰乙酸，加水稀釋至IOOmL ； 1. 3乙二胺四乙酸二鈉溶液(0.25mol/L):稱取9.3g乙二胺四乙酸二鈉 [C10H14N2O8Na2]于水中，加熱使之溶解后，放冷，并稀釋至IOOmL ； 1. 4蛋白沉淀劑
1. 4. 1乙酸鋅溶液(220g/L)稱取22. Og乙酸鋅[Zn (CH3COO)2]，加3mL冰乙酸溶于 水，并稀釋至IOOmL ；
1. 4. 2亞鐵氰化鉀溶液(106g/L)稱取10. 6g亞鐵氰化鉀[K4Fe (CN)6]，加水溶解至 IOOmL ；
1. 5 顯色劑固藍鹽B (Fast Blue Salt B)溶液(2g/L):準(zhǔn)確稱取0.2g固藍鹽B， 加水溶解于IOOmL棕色容量瓶中，并稀釋至刻度(該溶液在室溫下貯存可穩(wěn)定3d以上)；
1. 6抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(2. Og/L)精密稱取0. 2000g抗壞血酸，加20mL乙酸溶 液(2mol/L)溶解后移入IOOmL棕色容量瓶中，用水稀釋到刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng) 于2. Omg抗壞血酸(10°C下冰箱內(nèi)貯存在2d內(nèi)穩(wěn)定)；
1. 7抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(0. lg/L)用移液管精密吸取5. OmL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備 溶液(2. Og/L)于IOOmL棕色容量瓶內(nèi)，加5mL乙酸溶液(2mol/L)，用水稀釋至刻度，混勻。 此溶液每毫升相當(dāng)于100 μ g抗壞血酸(臨用時配制)。2 儀器
分光光度計，搗碎機，離心沉淀機，IOmL具塞玻璃比色管。3分析步驟
3. 1試樣溶液的制備
稱取新鮮大豆葉片20. Og飛0. Og于搗碎機內(nèi)，加同倍量的乙酸溶液(2mol/L)搗成勻 漿。稱取10. 0g^20. Og勻漿(含0. 2g/kg以下抗壞血酸)于IOOmL棕色瓶內(nèi)，加5mL乙酸溶 液(2mol/L)，用水稀釋至刻度，混勻。濾紙過濾，濾液備用。不易過濾的試樣可用離心機離 心后，上清液供測定。3. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密吸取 0，0. ImL, 0. 2mL, 0. 4mL, 0. 6mL, 0. 8mL, 1. OmL, 1. 5mL, 2. OmL 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn) 使用溶液(相當(dāng)于抗壞血酸 0，10. 0 μ g，20. 0 μ g，40. 0 μ g，60. 0 μ g, 80. 0 μ g，100. 0 μ g， 150. 0 μ g，200. 0 μ g)，分別置于IOmL比色管中，各加0. 3mL乙二胺四乙酸二鈉溶液 (0. 25mol/L)、0. 5mL乙酸溶液(0. 5mol/L);l. 25mL固藍鹽B溶液(2g/L)，加水稀釋至刻度， 混勻。室溫(20°C 25°C)下放置20min后，移入Icm比色皿內(nèi)，以零管為參比，于波長420nm 處測量吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)各點吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 3試樣測定
大豆葉片抗壞血酸含量的測定吸取按3. 1制備的試樣溶液0. 5mL 5. OmL (約相當(dāng) 于抗壞血酸200 μ g以下)于IOmL比色管內(nèi)。以下按3. 2加0. 3mL乙二胺四乙酸二鈉溶液 (0. 25mol/L)，試樣吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出抗壞血酸含量與判斷級別間的關(guān)系?？箟难?含量高，則大豆的抗光氧化能力就弱；抗壞血酸含量低，則大豆的抗光氧化能力就強。實施時間1997-1999年
實施地點南京市孝陵衛(wèi)，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)
1. 1997年，對我所保存的1500份大豆種質(zhì)資源進行抗光氧化快速篩選，從中選出抗 性較好的材料28份。2. 1998年，對上年快速鑒定的材料進行一次復(fù)鑒，看看兩年的鑒定結(jié)果是否一 致，事實表明，兩年的結(jié)果有著高度的一致性。對上兩年鑒定出來的28份抗性材料和40份光氧化敏感材料進行抗旱性鑒定，研 究抗光氧化和抗旱之間是否存在明顯的相關(guān)性，結(jié)果指出抗光氧化和大豆抗旱性之間存 在高度正向相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0. 88，初步說明，抗大豆光氧化快速篩選技術(shù)可以作為大豆抗 旱性篩選的一種間接方法。即所述大豆品種對光氧化的抗性定為抗性品種的，則該大豆品 種抗旱性也定為抗性品種；所述大豆品種對光氧化的抗性定為耐性品種的，則該大豆品種 抗旱性也定為耐性品種；所述大豆品種對光氧化的抗性定為耐性較差品種的，則該大豆品 種抗旱性也定為耐性較差品種；所述大豆品種對光氧化的抗性定為耐性最差品種的，則該 大豆品種抗旱性也定為耐性最差品種。實施時間2008-2009年
實施地點江蘇農(nóng)科院溧水植物育種基地
連續(xù)兩年對2006-2007年補充征集的1200份大豆資源進行抗光氧化快速篩選，兩年的 鑒定結(jié)果有著高度的一致性。并用此法對大豆雜交后代進行快速篩選，將快速篩選技術(shù)用 于育種實踐。實施效果
1.大豆品種資源的鑒定增加了一項非常有用的生理性狀——抗光氧化性狀。使得 我們有可能對大樣本大豆種質(zhì)和雜交后代進行批量篩選和鑒定。豐富了我們的資源研究內(nèi) 涵和大田選擇手段。2.大豆的高光效育種由于上述技術(shù)的突破，開始從理論走向?qū)嵺`。使得大豆的大 田育種增加了生理輔助育種的選擇機制。育種實踐表明，將抗光氧化快速鑒定技術(shù)運用于 育種，可明顯提高大豆入選材料的光合作用能力。3.上述快速篩選技術(shù)節(jié)工、省本、高效、可靠，是一項非常有效的快速測定技術(shù)， 其他作物的抗光氧化種質(zhì)篩選和鑒定也可借鑒。
權(quán)利要求
1.大豆品種抗光氧化的快速篩選方法，其特征在于在夏季溫度超過30°c時，選擇晴 好天氣，在大豆初花后，于早上6點在田間摘取大豆頂部第四片復(fù)葉的中間小葉，每個品種 摘葉八張，置于深度為4厘米的白色磁盤，葉面朝上，不要重疊，在葉片上蓋上厚度為4毫米 的透明普通玻璃片，磁盤加滿自來水，然后將裝有葉片材料的磁盤置于強光下曝曬，每天早 上6點換上新鮮自來水，繼續(xù)放在高溫30-40度、夏天晴天自然光下曝曬，連續(xù)四晝夜后，調(diào) 查大豆葉片的葉綠素氧化情況，將其褪色情況分為四級葉片90%-100%保持綠色的定為1 級，定為抗性品種；綠色部分75%-89%以上的定為2級，定為耐性品種；綠色部分50%-74%定 為3級，定為耐性較差品種；綠色部分低于49%的定為4級，是耐性最差品種，大豆葉片的面 積按照下列方法計算卵園型和橢圓型葉片的面積是(葉片長X葉片寬)X2 + 3 .長橢圓 型和披針型葉片的面積是(葉片長X葉片寬)X4 + 7。
2.權(quán)利要求1所述大豆抗光氧化的快速篩選方法在大豆品種抗旱性篩選中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1所述大豆品種對光氧化的抗性 定為抗性品種的，則該大豆品種抗旱性也定為抗性品種；權(quán)利要求1所述大豆品種對光氧 化的抗性定為耐性品種的，則該大豆品種抗旱性也定為耐性品種；權(quán)利要求1所述大豆品 種對光氧化的抗性定為耐性較差品種的，則該大豆品種抗旱性也定為耐性較差品種；權(quán)利 要求1所述大豆品種對光氧化的抗性定為耐性最差品種的，則該大豆品種抗旱性也定為耐 性最差品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆品種抗光氧化的快速篩選方法，涉及作物生理學(xué)和育種學(xué)。其方法是在夏季高溫強光照季節(jié)，選取大豆頂端第四張葉片，置于規(guī)格一致的白色磁盤，葉面朝上，在葉片上蓋著透明普通玻璃片，磁盤加滿自來水，然后將裝有試驗材料的磁盤置于強光下曝曬，次日清晨，換上新鮮自來水，繼續(xù)放在高溫強光照下曝曬，連續(xù)四晝夜后，觀察已經(jīng)處理的大豆葉片的葉綠素氧化、褪淡情況，褪色越多說明供試材料對光氧化的抗性越差。連續(xù)四年的試驗表明該方法的鑒定結(jié)果有著很強的重演性，所選出的抗性材料有著很強的一致性。本方法操作簡單、快速高效、省工節(jié)本、沒有化學(xué)污染，結(jié)果可靠實用。
文檔編號G01N17/00GK102033038SQ201010522198
公開日2011年4月27日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者崔曉艷, 張紅梅, 袁星星, 陳華濤, 陳新, 顧和平 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院