專利名稱：用于選擇和/或處理粒子、特別是細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于選擇和/或處理粒子，特別是由細(xì)胞組成的或包括細(xì)胞 或細(xì)胞物質(zhì)的粒子的方法，并獲得其主要在實(shí)現(xiàn)具有單細(xì)胞上的拆分的方 案中的應(yīng)用。通過細(xì)胞"處理"，在這里和下文中，應(yīng)該理解為意指可以 對單粒子或細(xì)胞、或它們的組進(jìn)行的任何類型的操作。
現(xiàn)有技術(shù)
授予G. Medoro的PCT/WO 00/69565專利描述了通過利用封閉介電泳 電位(dielectrophoreticpotential)柵格(cages)和集成傳感器，若有的話， 對粒子進(jìn)行操縱和檢測/識別的裝置和方法。所述方法教導(dǎo)在兩維空間中如 何控制獨(dú)立于所有其它粒子的每一粒子。用來捕獲流體介質(zhì)中的懸浮粒子 的力是負(fù)的介電泳。通過對與集成在相同襯底中的電極陣列和傳感器的每 一元件關(guān)聯(lián)的存儲元件和電路的編程，實(shí)現(xiàn)對操縱操作的單獨(dú)控制。該裝 置容許分離細(xì)胞，但需要使這些細(xì)胞向著第二微室移動，與第一個細(xì)胞流 動地分離。而且，沒有預(yù)見到用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。
Becker等的美國6,294,063專利描述了一種方法和裝置，其通過可編 程的力的分配來操縱固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)生物材料的包裝(packages)。該專 利也提及傳感器的使用。在該情形中，細(xì)胞的分離也僅通過物理地移動細(xì) 胞經(jīng)過整個裝置發(fā)生。
操縱粒子的又一種力是由電流體動力學(xué)(EHD)流產(chǎn)生的粘滯摩擦力， 例如電熱流(ETF)或AC電滲透。在NG. Green, A. Ramos和H. Morgan,物 理學(xué)雜志D:應(yīng)用物理學(xué)(J.Phys.D: Appl.Phys.) 33(2000)中，EHD用來 移動粒子。例如PCTWO 2004/071668 Al公開了一種通過利用所謂的電流 體動力學(xué)流將粒子濃縮在一些電極上的裝置。
在Medoro等的意大利專利申請BO2005A000481中，報告了一些用電
6極陣列操縱粒子的方法，以及一些檢測它們的方法和裝置。此外，在國際
專利申請?zhí)朠CT/IT02/00524中描述了一種方法，其中，通過使第一生物實(shí) 體與第二生物實(shí)體(例如，含有DNA的脂質(zhì)體、或微球體)相接觸，而 轉(zhuǎn)化第一生物實(shí)體，其中，將第一生物實(shí)體固定在第一電極陣列所限定的 表面上，所述電極是至少部分選擇地可激活的和可尋址的，朝向至少一個 第二電極安置，并且與借助于介電泳柵格移動的第二生物實(shí)體接觸。
相同申請人名下的PCT IB 2006000636專利申請涉及利用非均勻時變 力場和集成光學(xué)或阻抗計傳感器(impedance meter sensor)對粒子進(jìn)行表 征和/或計數(shù)的方法和裝置。力場可以是正的或負(fù)的介電泳、電泳或電流體 動力學(xué)運(yùn)動，其特征在于粒子(固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài))的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)； 通過利用己知為電介質(zhì)上的電潤濕的效應(yīng)，同樣的方法可適用于操縱小滴 (液態(tài)粒子)，其目的是對存在于樣本中的每一粒子的位置起控制作用， 以便以確定性和統(tǒng)計學(xué)方法使這些粒子移動，以集成光學(xué)或阻抗計傳感器 檢測它們的存在，和/或表征它們的類型，從而以有效的方法對它們進(jìn)行計 數(shù)和操縱。
在相同申請人名下的2006年3月27日的意大利申請?zhí)?TO2006A000226中，描述了用于處理(例如洗滌、培養(yǎng)、等)粒子的方法 和裝置，其中，在層流方案中，將第一流體中懸浮的粒子引入到至少一個 第一微室或該微室的第一區(qū)域中，其中通過不與第一流體相混合的方式， 在層流方案中，將第二流體引入到微室的至少一個第二區(qū)域或第二微室 中，并且其中在該微室中激活至少一個作用于粒子的力場(F)，從而引起 粒子僅在預(yù)定的方向上移動，并轉(zhuǎn)移第二流體中的懸浮中的該粒子；優(yōu)選 使用的裝置包括以沿著一個方向彼此順次排列的至少三個微室，并且每個 微室均通過兩個與微室序列方向垂直的方向彼此錯開的開口，與它前面和 后面緊挨著的微室相連。
近期，在文章"單細(xì)胞電穿孔芯片(A single cell electroporation chip)， 芯片上的實(shí)驗(yàn)室(Lab on a Chip), 2005， 5 (1), 38 — 43， Michelle Khine， Adrian Lau， Cristian Ionescu-Zanetti， Jeonggi Seo禾口 Luke P. Lee，，中，描述 了如何通過在單細(xì)胞上進(jìn)行的電穿孔增加細(xì)胞膜的滲透性；通過這種方 法，可以將以別的方式不能滲透過原生質(zhì)膜的極性物質(zhì)(諸如染料、藥物、DNA、蛋白質(zhì)、肽和氨基酸)引入到細(xì)胞中。
文章"用于高效的單細(xì)胞遺傳操縱流經(jīng)微-電穿孔芯片(Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation),傳感器和執(zhí)行器A:物理的(Sensors and Actuators A: Physical),巻104，刊3， 2003年5月15日，Yong Huang, Boris Rubinsky"
具體描述了單細(xì)胞的遺傳操縱，這在諸如生物學(xué)和生物工藝學(xué)中非常令人 感興趣，所述細(xì)胞是通過利用微-流體通道精確操縱單細(xì)胞的電穿孔芯片獲 得的；如已知地，電穿孔是使用強(qiáng)電場誘導(dǎo)細(xì)胞膜中結(jié)構(gòu)重排的工藝；由 于當(dāng)跨膜電位超過膜的電介質(zhì)穿孔電壓(0.2-1.5￥)時，穿膜形成孔，這容許
外部物質(zhì)滲入膜并到達(dá)其中包含的細(xì)胞質(zhì)。
單細(xì)胞的電穿孔是令人感興趣的技術(shù)，還因?yàn)樗菰S逐個細(xì)胞地研究 發(fā)生在細(xì)胞群中的變化，并還研究細(xì)胞內(nèi)化學(xué)，例如，通過為單細(xì)胞提供 特異性表型而激活或阻斷特異的和單一蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，利用基于使 用裝備在芯片上的陣列的工藝，可以實(shí)現(xiàn)HTS檢驗(yàn)(高通量篩選)的裝 置，其與DNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)以及指向特異性細(xì)胞靶標(biāo)(例如受體)的 化學(xué)化合物(例如藥物)均相關(guān)。
而且，單細(xì)胞電穿孔相對于通常使用的"大量"電穿孔方案而言，是 有利的技術(shù)，所述"大量"電穿孔方案需要非常高的電壓(>103 V)，并不 容許有效地控制單細(xì)胞滲透性，因此，例如，很難重新關(guān)閉預(yù)先張開的孔。
迄今為了獲得單細(xì)胞電穿孔而作出的努力包括使用由碳纖維制成的微 電極(Lundqvist等，1998)和其它技術(shù)諸如充滿電解質(zhì)的毛細(xì)管、微吸移 管和顯微加工芯片。
顯微加工的芯片對分離單細(xì)胞和集中電場均是理想的。
最后，文章"利用介電泳力控制細(xì)胞破裂"("Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces")， A. Menachery禾卩R. Pethig, IEE 學(xué)報-納米生物技術(shù)(IEE Proc.-Nanobiotechnol.)，巻152,第4期，2005年 8月，報告了對齒形或多項(xiàng)式電極中不同類型的細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞溶解研究， 并且提出了混合物中存在的不同類型細(xì)胞的溶解和區(qū)別性電穿孔(選擇這 樣的頻率和幅度，以使得進(jìn)行一種類型的溶解或電穿孔，但保存另一種)。
然而，由于電極比細(xì)胞大得多，所以沒有提議使用該方法，且在獨(dú)立于其類型的條件下，可能不可以使用該方法選擇性破壞/電穿孔單細(xì)胞。事 實(shí)上，由于關(guān)于相對大的電極(和因此對它們起作用的場的強(qiáng)度)的位置 顯著變化，所以該方法不能以均勻方式作用于不同的細(xì)胞。
優(yōu)選地，利用處于跨越頻率(超過該頻率細(xì)胞從負(fù)的(nDEP)到達(dá)正 的(pDEP)介電泳)之間包括的頻率范圍中的，和低于這樣的頻率的場誘 導(dǎo)溶解，超過所述頻率，膜電位會由于超過膜松弛常數(shù)而削弱。
其它近期出版物文獻(xiàn)，諸如WO2005/075656和US2005/0070018A1涉 及基于微電極陣歹lj(array)或陣列(matrix)的使用而電穿孔單細(xì)胞的裝置，在 所述裝置上貼壁培養(yǎng)細(xì)胞(按照國際專利申請)或裝備用于連接待電穿孔 的細(xì)胞和電極的導(dǎo)電微絲和用于移動細(xì)胞的微流體通道。該裝置不提供以 確定的方式組織細(xì)胞的可能性，并且細(xì)胞相對于電極的位置引起偶然性。 因此，它們在電穿孔時受到的電場引起相當(dāng)?shù)母淖?，這樣施加的刺激有時 是統(tǒng)計學(xué)過量的(引起細(xì)胞死亡)，或不足量的，這引起細(xì)胞電穿孔的缺 乏。電穿孔過程中的成功百分比則導(dǎo)致次最優(yōu)的和較低的效率。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供用于對包含粒子典型地是細(xì)胞的流體樣品進(jìn)行操 作的方法，用于進(jìn)行一個或多個細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的方法，所述方法沒有關(guān)于現(xiàn) 有技術(shù)所述的局限性和/或缺陷。
具體地，本發(fā)明的目的是在樣品中存在的每個粒子的位置控制上起作
用，目的是以確定的方式移動所述粒子，從而以選擇性方式對每個細(xì)胞進(jìn) 行操作和/或以更有效的方式進(jìn)行操作，諸如電穿孔。
在此和以下，復(fù)數(shù)的"粒子"或單數(shù)的"粒子"術(shù)語意指天然的或人 造的微米或納米實(shí)體，如細(xì)胞、亞細(xì)胞組分、病毒、脂質(zhì)體、泡囊(niosomes)、 微球體。有時，將使用術(shù)語細(xì)胞，但除非另有說明，其應(yīng)該意指以上述最 廣義的方式用于檢測和表征粒子的非限制性示例。
因此本發(fā)明涉及權(quán)利要求1指定的方法。
具體地，利用非均勻、時變力場和集成光學(xué)傳感器。力場可以是正的 或負(fù)的介電泳、電泳或電流體動力學(xué)運(yùn)動，其特征在于關(guān)于粒子(固體、 液體或氣體的)的一組穩(wěn)定平衡點(diǎn)。這樣，現(xiàn)有技術(shù)的局限性可通過本發(fā)明予以克服。
按照本發(fā)明的方法的實(shí)現(xiàn)容許以有效和選擇性方式，例如通過引入外 源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此外，還容許也從以低百分比存在的污染物精確地 純化細(xì)胞樣品，所述細(xì)胞可能是轉(zhuǎn)化的。最后，容許從多相樣品中快速分 離一些目的細(xì)胞。通過采用單一技術(shù)的全部基于相同的微電極陣列，所述 微電極用于在結(jié)合電極陣列的微室內(nèi)移動細(xì)胞并引起其電穿孔。
本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將由本發(fā)明的一些非限制性實(shí)施方案的以 下描述表現(xiàn)為明顯的，這是參考附圖的圖進(jìn)行的。
附圖簡述


圖1圖解顯示了按照本發(fā)明的方法的步驟，本發(fā)明是在截面圖和正視
圖中所示的操縱裝置中進(jìn)行的；
圖2利用以關(guān)于圖1中裝置的俯視平面圖獲得的照片序列顯示了圖1
的方法的實(shí)際實(shí)施；
圖3利用照片序列顯示了電穿孔之前和之后的一些細(xì)胞；
圖4、 5a、 5b概略地顯示了按照本發(fā)明的方法的可能實(shí)施方案。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的是進(jìn)行用于操縱和/或轉(zhuǎn)化和/或研究最佳電穿孔條件和/ 或檢測粒子的方法。
本發(fā)明的方法基于不均勻力場(F)的使用，通過該力場吸引單個粒 子或粒子組(BEADS)趨向穩(wěn)定平衡位置(CAGE)。該場可以是例如負(fù) 的(NDEP)或正的(PDEP)介電泳場(DEP)、電泳場(EF)或電流體 動力學(xué)(EHD)運(yùn)動場。
對細(xì)胞進(jìn)行的處理基于能夠?qū)е录?xì)胞膜暫時滲透的局部化電場的施加。
該方法，例如在需要檢查接近特定電極的粒子類型的全部那些步驟 中，還可以使用集成傳感器，優(yōu)選地，光學(xué)和/或阻抗計類型的。備選地， 通過與顯微鏡相連的非集成光學(xué)傳感器可以獲得類似的信息，所述顯微鏡 容許檢查微室的內(nèi)容物。力的產(chǎn)生
根據(jù)已知的技術(shù)，通過提供在襯底上的電極(EL)陣列，存在不同的 方法用于產(chǎn)生移動粒子的力。典型地，按照相同申請人以前的專利權(quán)(圖
1)，使用覆蓋物(LID)，它又可以是電極，它限定微室，在所述微室中粒 子(BEADS)典型地存在于液體懸浮液中。在介電泳(DED)的情況下，施 加的電壓以加號(+)標(biāo)示的是同相周期電壓(Vphip)，和以減號(-)標(biāo) 示的是反相周期電壓(Vphin)。術(shù)語"反相電壓"意指相位差180度的電 壓。這個場產(chǎn)生作用于空間區(qū)域(CAGE)中的粒子的力，吸引它們趨向 平衡點(diǎn)(PEQ)。在負(fù)的DEP (NDEP)的情況下，根據(jù)已有技術(shù)如果覆蓋物 (LID)是導(dǎo)電的電極，則可以產(chǎn)生封閉的力柵格；在這種情況下，將平 衡點(diǎn)(PEQ)建立為對應(yīng)于每一個與Vphin (-)相連的電極，其條件是如果 相鄰電極與反相的Vphip ( + )相連并且如果覆蓋物(LID)與相Vphin (-) 相連。這個平衡點(diǎn)(PEQ)通常在液體中與電極隔離，因此，粒子(BEADS) 以靜態(tài)懸浮。在正的DEP (PDEP)的情況下，平衡點(diǎn)(PEQ)通常處于與在 其上提供電極的表面相對應(yīng)，并且粒子(BEADS)以靜態(tài)與其接觸。關(guān)于 PDEP，在覆蓋物(帽蓋)中不必需具有其它電極，因?yàn)镻DEP的平衡點(diǎn) 對應(yīng)于電場的最大值。關(guān)于電流體動力學(xué)(EHD)運(yùn)動，電極的配置產(chǎn)生 某些流動，它們推動粒子趨向流動最小值的點(diǎn)。
以下，為了簡便起見，在本發(fā)明的方法描述中，使用封閉的負(fù)的介電 泳柵格作為粒子移動的執(zhí)行力僅被認(rèn)為是為了本發(fā)明的目的的本發(fā)明的 非限制性實(shí)施例(為此原因，需要使用起電極作用的蓋子)。對于本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，如何概括下述使用不同執(zhí)行力和不同類型粒子的方 法和裝置，是明顯的。
通過介電泳操縱協(xié)助的粒子電穿孔
借助于上述執(zhí)行力之一，例如通過對該電極自身通以第一振幅和頻率 的正弦電壓，將粒子定位在兩電極間間隙附近。該間隙優(yōu)選地小于10拜， 且典型地是1-2,的量級，因此，與集成電路的供給電壓(例如，2.5、 3.3或5 V)相當(dāng)?shù)牡碗妷捍碳ぷ銐虼_定能夠引起粒子不可逆破裂的跨膜電
ii位。
該刺激優(yōu)選地由第二振幅和第二頻率的正弦脈沖串組成。 圖1按照本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在截面圖中顯示了力場和對電極施 加的電壓"模式"(或電極(+ )或(_)狀態(tài)配置的復(fù)合體)的時間發(fā)展。
圖1 (a)中，細(xì)胞(CELL)處于nDEP中，以第一平衡點(diǎn)(MPEQ)以懸浮 狀態(tài)出于液體中。在圖1 (b)中，施加到電極(EL)的電壓模式，以及 施加的電壓的頻率和任選地，振幅發(fā)生改變，因此細(xì)胞受到的力也改變?yōu)?pDEP(FZAP)。然而，由于電壓模式的改變，只有待電穿孔的細(xì)胞(CELLZ) 受到顯著的力，因此，吸引它趨向新的穩(wěn)定平衡點(diǎn)(ZPEQ)。在該點(diǎn)附近， 電場最高，且頻率是這樣的，以致確定足以電穿孔細(xì)胞的跨膜電位。這樣， 以懸浮狀態(tài)存在的化合物(PL)能夠滲透在細(xì)胞內(nèi)。
按照現(xiàn)有技術(shù)，所述化合物可以是在其中浸漬粒子的流體溶液中的化 學(xué)化合物(染料、藥物、肽)，或可以是例如質(zhì)粒，等，或者理想類型和 數(shù)量的第二 PL粒子可以以懸浮狀態(tài)存在于該流體中。
圖2顯示單細(xì)胞的電穿孔。將細(xì)胞，圖2 (a)捕獲在nDEP (頻率=50 kHz，電極的峰-峰電壓3.3 V，蓋子的峰-峰電壓6.6V)中。圖2 (b)顯示 熒光圖像。然后在pEDP(兩個500kHz脈沖，電極的峰-峰電壓的振幅2V， 蓋子的峰-峰電壓的振幅4V)中突變所述場，并且選擇的細(xì)胞經(jīng)歷孔張開， 這引起鈣熒光素(為了進(jìn)行試驗(yàn)，預(yù)先裝載在細(xì)胞中)的釋放和熒光降低 (圖2 (c))。
利用具有熒光檢測的光學(xué)-類型集成傳感器(參見相同申請人先前的專 利)，例如通過綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，可以檢查有效的轉(zhuǎn)化。
用于優(yōu)化電穿孔刺激的方法
在電極陣列上，可以安置細(xì)胞，并且可以對它們中的每一個或它們的 組試用具有不同振幅和/或頻率參數(shù)的刺激，以便迅速地確定更有效的刺 激。
例如，如上所述，可以用集成光學(xué)傳感器，或者利用監(jiān)測細(xì)胞中可能 引入的通常不能穿透膜的染料(染料或顏色物質(zhì))(例如，錐蟲藍(lán))來檢 査電穿孔。圖3顯示按照上述方案電穿孔之前圖3 (a)和之后圖3 (b)錐蟲藍(lán) 中的細(xì)胞。在圖3 (b)中，可以注意到錐蟲藍(lán)滲透到細(xì)胞內(nèi)。利用集成光 學(xué)傳感器，可以檢測到染料的入口以及電穿孔的發(fā)生。
備選地，可以控制在孔開口處向外的染料擴(kuò)散引起的細(xì)胞內(nèi)存在的染 料的消散。例如，如上所述，細(xì)胞內(nèi)的熒光鈣熒光素可以向外釋放，并且 決定細(xì)胞熒光的降低。
該方法預(yù)見到對單細(xì)胞反復(fù)施加增長強(qiáng)度的刺激，測量電穿孔的細(xì)胞
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用于調(diào)節(jié)對每個細(xì)胞電穿孔刺激的方法
可以將細(xì)胞定位在電極陣列上，并可以將增長強(qiáng)度的刺激在其上嘗 試，并且可以用集成光學(xué)傳感器控制通常不能穿透膜的染料的可能入口。
基于上述內(nèi)容，明顯的是，本發(fā)明容許進(jìn)行對外部剌激的施加是靈敏 的第一粒子的選擇或處理，并通過施加所述外部刺激提供引起至少一個所
述第一選擇的粒子滲透的步驟；具體地，本發(fā)明提供下列步驟
a) 使第一粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述 電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，對其可以施加第一配置
(PMAN)的電壓，從而通過由對所述電極(EL)選擇性通電引起的第一 力場(FMAN)組織所述第一粒子(CELL);
b) 對所述電極施加第二配置(PZAP)的電壓，從而產(chǎn)生第二力場 (FZAP)，所述第二力場基本接近至少一個第一選擇的待滲透粒子 (CELL)定位，并且由此引起對所述至少一個第一選擇的粒子施加刺激，
所述刺激適合于使所述至少一個第一選擇的粒子在滲透狀態(tài)中達(dá)所述刺 激長度的至少一部分。
按照本發(fā)明的方法還包括步驟
c) 使處于滲透狀態(tài)的所述至少一個第一選擇的粒子與至少一個第二 粒子接觸，其中進(jìn)行步驟b)和c)，從而引起所述至少一個第二粒子滲透 到處于滲透狀態(tài)的所述至少一個第一選擇的粒子內(nèi)部，如圖1中示意性顯 示。
將第一粒子浸漬于流體中，并且通過將第二粒子浸漬在該流體中并且延長步驟b) —段時間而進(jìn)行步驟C)，所述時間足以容許至少一個所述第 二粒子滲透到處于滲透狀態(tài)的所述至少一個第一選擇的粒子內(nèi)部。
備選地，將第二粒子浸漬在該流體中，并且然后優(yōu)選地，通過對至少
所述選擇的第二粒子施加力場(FMAN)，將至少一個選擇的所述第二粒 子對著保持在滲透狀態(tài)的所述至少一個第一選擇的粒子移動，所述力場是 通過對可選擇的電極陣列的電極(EL)進(jìn)行選擇性通電而獲得的，對所述 電極施加一系列適當(dāng)選擇的電壓配置。
由所述場施加的刺激可以是這樣的，用于在去除了刺激本身后，還將 選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)保持預(yù)定的時間；因此通過將第二粒子浸漬在 浸漬第一粒子的流體中并通過對著施加相同力場(FMAN)的第二粒子移 動處于滲透狀態(tài)中的第一粒子而進(jìn)行步驟c)，所述力場(FMAN)是通過 對可選擇的電極陣列的電極(EL)進(jìn)行選擇性通電而獲得的，對所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。
參考圖4、 5a、 5b，可以將第一粒子浸漬于第一流體中，例如它們可 以已經(jīng)以懸浮狀態(tài)包含在所述第一流體中；并且可以通過將第二粒子浸漬 在接近第一流體的第二流體中(例如，在所述第二流體中可以已經(jīng)浸漬了 第二粒子)和通過對粒子施加合適的力場(FMAN)，將第一流體中存在 的處于滲透狀態(tài)(電穿孔的)粒子，從第一流體移動到第二流體而進(jìn)行步 驟c)，所述力場通過對電極施加一系列預(yù)定的電壓配置而對相同的電極通 電。隨后，為了在第一粒子內(nèi)接收第二粒子而轉(zhuǎn)化的第一粒子，可以被引 回到第一流體中，再次對電極施加合適的配置或電壓配置的序列。
當(dāng)將第一粒子浸漬在流體中時，所述方法可以備選地包括下列步驟
c) 向浸漬第一粒子的流體中引入至少一種溶液化合物；和
d) 容許所述化合物滲透到處于滲透狀態(tài)(預(yù)先通過電極電穿孔的) 的第一粒子內(nèi)部。
當(dāng)將第一粒子浸漬在裝備電極陣列的微室設(shè)備中包含的第一流體中 時，按照本發(fā)明(圖4)的方法包括步驟
c) 通過以層流運(yùn)動形式操作，將第二流體引入到微室內(nèi)部，從而使 第二流體不與第一流體混合(圖5a);
d) 向所述第二流體中引入至少一種溶解的化合物(在微室中第二流體的引入步驟之前還明顯可以進(jìn)行的操作，圖5a);
e) 通過對粒子施加力場(FMAN)，將處于滲透狀態(tài)的第一粒子從第 一流體移動到第二流體，所述力場是通過對所述可選擇的電極陣列的所述 電極進(jìn)行選擇性通電而獲得的，這是通過對所述電極施加一系列預(yù)定的電
壓配置而實(shí)現(xiàn)的(圖5b);
f) 容許所述化合物滲透在處于滲透狀態(tài)的選擇的第一粒子內(nèi)，進(jìn)行所 述選擇的第一粒子的電穿孔，所述電穿孔是當(dāng)所述第一粒子浸漬在第二液 體/流體時可以發(fā)生的操作，或者如果給予的刺激適合于在去除刺激后也維 持受其施加的第一粒子處于滲透狀態(tài)達(dá)預(yù)定的時間，而第一粒子仍然處于 第一流體中，則從而在它們?nèi)匀惶幱跐B透狀態(tài)下，將它們移動到第二流體 中。
一般而言，可以將第一粒子浸漬在裝備了所述電極陣列的微室中的多 種不同流體中，并且通過以層流運(yùn)動操作將第一粒子引入所述微室中，這 樣所述不同流體不混合在一起。
優(yōu)選地，如上所述，第一粒子是具有可滲透和可溶解膜的生物實(shí)體， 例如，細(xì)胞，且所述刺激由使選擇的粒子的跨膜電位達(dá)到引起膜滲透的數(shù) 值組成。按照本發(fā)明通常選擇浸漬待電穿孔粒子的流體具有相對低的電導(dǎo)
率，這樣可以傳到pEDP，從而在場的最大值中吸引細(xì)胞，足以引起產(chǎn)生 孔的跨膜電位。
最后，按照本發(fā)明方法的可能變化，提供了對多種所述選擇的第一粒 子施加增長強(qiáng)度的刺激，并且針對每種施加的刺激，通過在單芯片上與所 述電極陣列集成的傳感器，測量存在于滲透狀態(tài)中的粒子的數(shù)量。例如， 將第一粒子浸漬在流體中，且該流體含有這樣的化合物，所述化合物至少 在滲透到那些所述處于滲透狀態(tài)的第一粒子內(nèi)部時，適合于通過傳感器檢 測。
用于調(diào)節(jié)關(guān)于每個細(xì)胞的推定電穿孔刺激的方法
如果根據(jù)細(xì)胞特征能夠獲得關(guān)于刺激最佳值的信息(例如，遵循按照 上述方法的特征)，則可以"推定地"采用下列方法。
在電極陣列上，可以通過傳感器(優(yōu)選地，集成在芯片內(nèi)的光學(xué)和/或阻抗計傳感器)預(yù)先檢測每個待電穿孔的細(xì)胞的特征，諸如例如尺寸， 并對局部施加的刺激進(jìn)行編程，從而逐個位置地，或逐個電極地，局部最 優(yōu)化關(guān)于每個具體細(xì)胞的電穿孔成功百分比。
權(quán)利要求
1. 用于選擇或處理對施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通過施加所述外部刺激獲得至少一個選擇的第一粒子滲透的步驟，其特征在于所述方法包括下列步驟a)使所述第一粒子(CELL)接近可選擇的電極陣列的電極(EL)，所述電極具有與所述粒子的尺寸相似或更小的尺寸，可以對所述電極施加第一配置(PMAN)的電壓，用于通過將所述電極(EL)選擇性通電產(chǎn)生的第一力場(FMAN)組織所述粒子(CELL)；b)對所述電極施加第二配置(PZAP)的電壓，從而提供第二力場(FZAP)，所述第二力場基本定位于接近至少一個選擇的待滲透的第一粒子(CELL)處，并且由此對所述至少一個選擇的第一粒子產(chǎn)生刺激的施加，所述刺激適合于使所述至少一個第一選擇的粒子處于滲透狀態(tài)達(dá)所述刺激長度的至少一部分。
2. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法還包括下列步驟c) 使所述至少一個選擇的處于滲透狀態(tài)的第一粒子與至少一個第二粒 子接觸；進(jìn)行所述步驟b)和c)，從而引起所述至少一個第二粒子在所述至少 一個選擇的處于滲透狀態(tài)中的第一粒子內(nèi)部滲透。
3. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于將所述第一粒子浸漬在流體中； 對也浸漬在所述流體中的所述第二粒子進(jìn)行所述步驟c)并且將所述步驟 b)延長一段時間，所述時間足以容許至少一個所述第二粒子在所述至少 一個選擇的第一粒子內(nèi)部滲透，所述第一粒子處于滲透狀態(tài)。
4. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于將所述第一粒子浸漬在流體中； 對也浸漬在所述流體中的所述第二粒子進(jìn)行所述步驟c)，并通過對至少所 述選擇的第二粒子施加力場(FMAN)，對著保持在滲透狀態(tài)中的所述至 少一個選擇的第一粒子移動至少一個所述選擇的第二粒子，所述力場是通 過對所述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對所 述電極施加一系列預(yù)定的電壓配置。
5. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述刺激適合于在去除所述刺 激后，還將所述至少一個選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時間； 所述第一粒子浸漬在第一流體中；對也浸漬在所述第一流體中的所述第二 粒子進(jìn)行所述步驟c)，并對著所述第二粒子移動至少一個選擇的處于滲透 狀態(tài)的第一粒子，對所述粒子施加力場(FMAN)，所述力場是通過對所 述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。'
6. 按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在第一流體 中；且通過將所述第二粒子浸漬在接近所述第一流體的第二流體中而進(jìn)行 步驟c)，并且通過對所述粒子施加力場(FMAN)，將所述至少一個選擇 的第一粒子，從所述第一流體移動到所述第二流體，所述力場是通過對所 述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電獲得的，對所述電極 施加一系列預(yù)定的電壓配置。
7. 按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于當(dāng)所述至少一個選擇的第一粒 子浸漬在所述第二流體中時，在所述至少一個選擇的第一粒子上進(jìn)行步驟 b)和c);或備選地，當(dāng)所述至少一個選擇的第一粒子浸漬在所述第一流 體中時，進(jìn)行步驟b)和c)，只要所述刺激適合于在也去除所述刺激后將 所述至少一個選擇的第一粒子在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時間，足以容許將 所述粒子從第一流體移動到所述第二流體。
8. 按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在流體中； 所述方法還包括下列步驟c) 浸漬第一粒子的流體中具有至少一種溶液化合物；和d) 容許所述化合物滲透在處于滲透狀態(tài)中的所述至少一個選擇的第 一粒子內(nèi)部。
9. 按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在裝備有所 述電極陣列的微室中包含的第一流體中；所述方法還包括下列步驟c) 通過處于層流運(yùn)動形式的操作，在所述微室中引入第二流體，從 而使所述第二流體不與所述第一流體混合，所述第二流體含有至少一種溶 解的化合物；d) 通過對所述至少一個第一粒子施加力場(FMAN)，將所述粒子從所述第一流體移動到所述第二流體，所述力場是通過對所述可選擇的電極陣列的所述電極(EL)的選擇性通電而獲得的，對所述電極施加一系列預(yù) 定的電壓配置；e)容許所述化合物滲透在所述至少一個處于滲透狀態(tài)中的第一粒子 內(nèi)部；當(dāng)所述至少一個第一粒子在所述第二流體中時，進(jìn)行所述步驟a) 和b)，或備選地，只要所述刺激適合于在去除所述刺激后還將所述至少一 個選擇的第一粒子在在滲透狀態(tài)中保持預(yù)定的時間，足以容許從所述第一 流體到所述第二流體的移動，當(dāng)所述至少一個第一粒子在所述第一流體內(nèi) 時，進(jìn)行所述步驟a)和b)。
10. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一粒子浸 漬在裝備有所述電極陣列的微室中包含的多種不同的流體中，并且通過層 流運(yùn)動形式的操作將其引入到所述微室中，以致所述不同的流體不混合在 一起。
11. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一粒子是 具有可滲透和可溶解膜的生物實(shí)體，例如，細(xì)胞，其中所述刺激由使所述 至少一個選擇的粒子的跨膜電位在引起膜滲透的這樣一種數(shù)值組成。
12. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法包括檢 查所述至少一個選擇的粒子是否發(fā)生滲透的步驟，優(yōu)選地，通過在單芯片 中與所述電極陣列集成的傳感器進(jìn)行。
13. 按照權(quán)利要求2或8的方法，其特征在于所述方法包括檢査所述 至少一個所述第二粒子或所述至少一個選擇的第一粒子中的所述化合物 是否發(fā)生滲透的步驟，優(yōu)選地，通過在單芯片中與所述電極陣列集成的傳 感器進(jìn)行。
14. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述粒子懸浮在流體中， 其特征在于以這樣一種方式選擇所述流體，即提供相對低的電導(dǎo)率。
15. 按照以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述方法提供將 具有增長強(qiáng)度的刺激施加到多種所述選擇的第一粒子，并且對于每種施加 的刺激，通過在單芯片中與所述電極陣列集成的傳感器，測量滲透狀態(tài)中 存在的粒子的數(shù)量。
16. 按照權(quán)利要求15的方法，其特征在于所述第一粒子浸漬在流體中，且所述流體含有這樣的化合物，所述化合物至少在處于滲透狀態(tài)的那 些所述第一粒子內(nèi)部滲透時，適合于從所述傳感器檢測。
17.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其特征在于提供下列步驟 -根據(jù)所述第一粒子的已知特征，收集關(guān)于通過所述電極施加的刺激的最佳數(shù)值的信息；-通過優(yōu)選地集成在芯片上的傳感器，預(yù)先檢測所述已知的特征，用于確定選擇的第一粒子；和-編程待局部施加的刺激，以便優(yōu)化每個特異性選擇的第一粒子滲透的 成功百分比。
全文摘要
用于選擇或處理對施加外部刺激敏感的第一粒子的方法，所述方法包括通過施加外部刺激引起至少一個選擇的第一粒子滲透的步驟，其存在于通過第一力場(FMAN)組織第一粒子(CELL)，從而產(chǎn)生第二力場(FZAP)，所述第二力場基本位于接近至少一個選擇的待滲透第一粒子。
文檔編號B03C5/00GK101479044SQ200780021606
公開日2009年7月8日 申請日期2007年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者尼科洛·馬納雷西, 梅拉尼·阿博南, 詹內(nèi)伊·梅多羅 申請人:硅生物系統(tǒng)股份公司