專利名稱：多功能自由電泳技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一個(gè)總的發(fā)明構(gòu)思的三項(xiàng)發(fā)明，第一項(xiàng)是多功能自由電泳技術(shù)所需的裝置，第二項(xiàng)是完成這種自由電泳技術(shù)所需的方法，第三項(xiàng)是完成上述技術(shù)所需要的一種等量中和檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明適用于多種兩性物質(zhì)象氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒等物質(zhì)的分離、純化、分析、濃縮透析以及等電點(diǎn)的估計(jì)和測(cè)定，并可望在其他膠體化學(xué)中得到應(yīng)用。
本說(shuō)明書就以下幾個(gè)問(wèn)題對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述和說(shuō)明，它們是背景技術(shù)、裝置、原理方法功能、使用、優(yōu)缺點(diǎn)比較。(另附參考文獻(xiàn))背景技術(shù)電泳(Electrophoresis)電泳現(xiàn)象早在19世紀(jì)初期已被人們發(fā)現(xiàn)，但直到Tiselius在電泳儀器方響取得重大成就以后，電泳作為一種分離分析手段逐漸被廣泛地應(yīng)用。1948年Weiland等發(fā)展了以紙作為支持物的電泳方法，電泳技術(shù)又得到了進(jìn)一步地應(yīng)用和發(fā)展，到目前為止，電泳技術(shù)種類很多，但總括起來(lái)有兩大類，其中一類是無(wú)支持體電泳技術(shù)，另一類是支持體電泳技術(shù)，具體情況如下無(wú)支持體電泳(自由電泳)技術(shù)Tiselius電泳〔1〕等電點(diǎn)聚集電泳〔2.3.4.8.16.17〕
密度梯度等電點(diǎn)聚集電泳〔4〕等速電泳技術(shù)〔4.17〕有支持體電泳技術(shù)濾紙及其它纖維薄膜電泳紙上電泳〔4.17〕高壓紙上電泳〔4.17〕醋酸纖維薄膜電泳〔4〕玻璃纖維薄膜電泳〔4〕凝膠電泳技術(shù)淀粉凝膠電泳〔4.5〕瓊脂凝膠電泳〔4.7〕瓊脂糖凝膠電泳〔4〕對(duì)流免疫電泳〔16〕火箭電泳〔16〕聚丙烯烯胺凝膠電泳圓盤電泳〔8.16.17〕垂直板電泳〔8〕微型圓盤電泳〔9〕SDS-圓盤電泳〔8〕SDS-垂直板電泳〔8〕微型孔徑梯度電泳〔9〕凝膠等電點(diǎn)聚集電泳〔8.17〕微型SDS-孔徑梯度電泳〔9〕微型凝膠等電點(diǎn)聚焦電泳〔9〕
粉末電泳技術(shù)淀粉電泳〔11〕纖維素粉電泳〔12〕玻璃粉電泳〔4.8〕樹脂粉電泳〔4〕線絲電泳技術(shù)尼龍絲電泳〔10〕人造絲電泳〔10〕雙向電泳技術(shù)O′Farrell′s電泳〔13〕交叉電泳〔4〕混合凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖-聚丙烯酰胺凝膠電泳〔14.15〕2、凝膠過(guò)濾(Gel chromatography)〔16〕是60年代發(fā)展起來(lái)的一種分級(jí)分離技術(shù)。其分離的原理是凝膠物體本身有分子篩作用，用于分離時(shí)，象過(guò)篩一樣，把大分子和小分子物質(zhì)分開。適用于蛋白質(zhì)，多糖等大分子(或高分子)有機(jī)物質(zhì)的分離。
3、離子交換技術(shù)(Ion exchange chromatograpny)〔4.16.17〕離子交換技術(shù)是30年代漸漸發(fā)展起來(lái)的一種分離技術(shù)，其原理是
式中Exch-為帶有電荷的陽(yáng)離子交換劑。X+、YH+、Z+均為陽(yáng)離子。中性分子和陰離子完全不與交換劑結(jié)合。在交換劑與相反電荷的離子作靜電結(jié)合之后，將與交換劑帶相同電荷的離子和不帶電的分子從解質(zhì)中洗脫。洗脫的方式有兩種，一種是增加X(jué)+的濃度，使X+取代YH+和Z+，另一種是增大PH，從而使YH+和Z+轉(zhuǎn)變?yōu)閅H0和ZOH，從而使YH+和Z+得以洗脫。離子交換技術(shù)作為一種分離手段，在生物化學(xué)方面，用于分離，提純蛋白質(zhì)，多肽，核酸和酶等。
4、蛋白質(zhì)的鹽析技術(shù)(Solt fractional techniques of proeins)〔16〕其原理是在蛋白質(zhì)溶液中加入可溶性鹽，破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性，而使蛋白質(zhì)沉淀。不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)可以通過(guò)加入不同濃度的中性鹽而分別從蛋白質(zhì)膠體中沉淀出來(lái)，從而達(dá)到分離的目的。
5、親和層析技術(shù)(Affinity chromatography〔4.16.17〕其原理是依據(jù)抗原抗體等生物高分子所特有的生物活性不同進(jìn)行分離和提純。這種分離生物高分子物質(zhì)有很高的純度，而且一般只要一次性純化即可。
6、超速離心技術(shù)(The techniques of utracentrifugation)〔17〕是利用高速轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生500.000xg(75.000rpm.r＝8cm)的離心力來(lái)分離，分析亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的方法。
除上述之外，其他分離、分析兩性物質(zhì)和高分子物質(zhì)的方法還很多。例如，吸附層析〔16.17〕·薄層層析〔17〕·逆流分溶〔17〕等。由于電子計(jì)算機(jī)與其他分離技術(shù)(如離子交換)結(jié)合產(chǎn)生了自動(dòng)化分離，純化和分析生物高分子等物質(zhì)的方法，但這些設(shè)備都非常貴重。
本發(fā)明的目的是提供一種自由電泳技術(shù)，它能夠方便地依據(jù)兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)不同，通過(guò)改變上下兩槽的緩沖液的PH值，將兩性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和分析，估計(jì)測(cè)定兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)，且能對(duì)較稀的兩性物質(zhì)溶液進(jìn)行濃縮，濃縮后透析。這種技術(shù)不僅適用于兩性物質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模分離和純化，而且也適用于少量或微量樣品的分離純化和分析。以下首先結(jié)合三種裝置對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述和說(shuō)明。
裝置本發(fā)明有三種發(fā)明裝置，第一種是多功能自由電泳裝置兼電泳濃縮透析裝置，第二種是帶冷卻系統(tǒng)的多功能自由電泳裝置。第三種是等量中和檢測(cè)裝置，以下按序予以詳細(xì)描述和說(shuō)明。
多功能自由電泳裝置兼電泳濃縮透析裝置。


圖1.是本裝置的立體剖面示意圖。
圖2a和圖2b分別是本裝置中的電泳管基的剖面圖及主視圖。
參照?qǐng)D1，可見(jiàn)上槽〔1〕為盛裝緩沖液的容器，在其最上面為蓋板〔a〕，在蓋板〔a〕上有電極孔〔b〕和惰性電極〔c〕，蓋板〔a〕可從上槽〔1〕上啟開。在上槽〔1〕底側(cè)壁上有排液孔道〔e〕，排液孔道〔e〕可接一橡皮軟管，電泳時(shí)將軟管夾閉，電泳完畢時(shí)可將軟管啟開，上槽〔1〕的緩沖液自排液孔道〔e〕排出。在上槽〔1〕的側(cè)壁還有一管夾〔g〕。在上槽的底部有分布規(guī)則的電泳孔道〔d〕。其主要與以下連接的電泳管基〔4〕和壓板〔2〕上的電泳孔道〔d〕的大小和分布一致。在上槽〔1〕下部外周有分布規(guī)則的4個(gè)標(biāo)刻〔f〕，標(biāo)刻〔f〕的圖形為“
”。在上槽〔1〕的底面有圓環(huán)狀的穩(wěn)滑凹〔i〕，正好能與其下連接的電泳管基〔4〕上面的環(huán)狀穩(wěn)滑凸〔h〕密切吻合。
結(jié)合圖1和圖2b，可見(jiàn)電泳管基〔4〕上分布規(guī)則的電泳孔道〔d〕和標(biāo)刻〔f〕，還有圓環(huán)狀穩(wěn)滑凸〔h〕和穩(wěn)滑凹〔i〕;其中標(biāo)刻〔f〕有兩種形式，這兩種形式相鄰并相隔45度排列，標(biāo)刻〔f〕的一種圖形同上槽〔l〕上的標(biāo)刻，另一種為“
”，當(dāng)上、下兩相鄰的電泳管基〔4〕上的標(biāo)刻〔f〕對(duì)應(yīng)相同時(shí)，表示上、下兩相鄰的電泳管基〔4〕上的電泳孔道〔d〕完全相通，當(dāng)相互旋轉(zhuǎn)45度，使得標(biāo)刻〔f〕對(duì)應(yīng)的相異的，表示上、下兩個(gè)電泳管基〔4〕上的電泳孔道〔d〕相互完全割斷，且是割斷的最好位置。完成上述的相通和斷隔是通過(guò)上、下兩個(gè)電泳管基〔4〕相互以共同軸心旋轉(zhuǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
參見(jiàn)圖1，在與上槽〔1〕緊相連的電泳管基〔4〕上，有圓盤狀的凹面〔j〕和栓卡〔k〕，這一凹面〔j〕正好容納通透膜〔3〕和通透膜壓板〔2〕。壓板〔2〕上也有電泳孔道〔d〕，還有栓母〔l〕，壓板〔2〕上的電泳孔道〔d〕與電泳管基〔4〕上的大小和分布一致;栓母〔l〕正好與栓卡〔k〕相配匹，設(shè)計(jì)這一機(jī)關(guān)的作用是阻斷壓板〔2〕在電泳管基〔4〕上的凹面〔j〕內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)。
在圖1中，所有的電泳管基〔4〕之間以及電泳管基〔4〕與上下槽之間，都可以以它們的共同軸而相互轉(zhuǎn)動(dòng)，且吻合足夠好，以致水溶液不能從這些吻合部位滲流。另外當(dāng)上下兩電泳管基〔4〕都處在完全相通的位置時(shí)，所有電泳管基〔4〕上的電泳孔道〔d〕組成電泳管道。
參見(jiàn)圖1，可見(jiàn)下槽〔5〕。在下槽〔5〕上有電極孔〔b〕，惰性電極〔c〕，電極〔c〕嚴(yán)密地固定電極孔〔b〕內(nèi)。在側(cè)壁上有排液孔道〔e〕，其作用同上槽〔l〕上的排液孔道〔e〕，在蓋板上有一排氣環(huán)槽〔m〕和排氣調(diào)壓孔〔n〕，排氣環(huán)槽〔m〕的作用是在電泳準(zhǔn)備時(shí)，將下槽〔5〕內(nèi)殘存氣體從排氣環(huán)槽〔m〕和電泳孔道〔d〕排出。在下槽〔5〕底面有支座〔o〕，在下槽〔5〕內(nèi)有聚氣器〔6〕，聚氣器〔6〕通過(guò)其腳固定在下底面上，并通過(guò)排氣調(diào)壓孔〔n〕，將其長(zhǎng)管伸出下槽〔1〕外，再接上一軟管〔7〕，軟管〔7〕可固定在上槽〔1〕上的管夾〔g〕上，這一機(jī)關(guān)的作用是排出電泳時(shí)電極產(chǎn)生的氣體，并平衡上、下槽液壓。在下槽〔5〕的蓋板上也有一凹面〔j〕，環(huán)形穩(wěn)滑凹〔h〕。通透膜〔3〕和壓板〔2〕與最上面的電泳管基〔4〕的結(jié)構(gòu)相同。
參見(jiàn)圖1，當(dāng)很多電泳管基〔4〕熔合為一體時(shí)(大括號(hào)所括)，即電泳管基〔4〕制作很厚時(shí)，能很方便的用于濃縮。
帶冷卻系統(tǒng)的自由電泳裝置
圖3是本裝置的立體剖面示意圖。
圖4是本裝置中的平行于電泳管基〔4〕兩底的剖面圖。
參見(jiàn)圖3，可見(jiàn)除有一冷卻系統(tǒng)外，其他結(jié)構(gòu)與圖1中的結(jié)構(gòu)相同或相似，在此不以贅述。以下給圖3和圖4對(duì)本裝置冷卻系統(tǒng)作詳細(xì)描述和說(shuō)明。
參見(jiàn)圖3，可見(jiàn)整個(gè)冷卻系統(tǒng)由分水器〔8〕，若干導(dǎo)管〔9〕和電泳管基〔4〕組成。分水器有兩個(gè)，其組成為在一個(gè)有支座的容器上有一個(gè)較大的導(dǎo)水孔道(簡(jiǎn)稱大導(dǎo)孔〔p〕和若干較小的導(dǎo)水孔道(簡(jiǎn)稱小導(dǎo)孔〔q〕);兩個(gè)分水器的作用不同，一個(gè)是通過(guò)導(dǎo)管〔9〕將冷卻水送入各電泳管基〔4〕，另一個(gè)是將進(jìn)入各電泳管基〔4〕內(nèi)的冷卻水通過(guò)導(dǎo)管〔9〕導(dǎo)出，這從圖3標(biāo)記的箭頭指向可明顯看出。
結(jié)合圖3和圖4，可見(jiàn)電泳管基〔4〕除有在圖1中的結(jié)構(gòu)外，還有入水口〔r〕，冷卻腔〔s〕，導(dǎo)水板〔t〕和出水口〔x〕。設(shè)計(jì)導(dǎo)水板〔t〕的目的是引導(dǎo)冷卻水在冷卻腔〔S〕內(nèi)合理流動(dòng)，以達(dá)到均化冷卻效果的目的。另外出水口〔X〕要盡可能在高位，以排盡在冷卻腔〔S〕內(nèi)的氣體。
要指出的是在圖1、圖3中所用的材料要有足夠的機(jī)械強(qiáng)度和剛性，無(wú)色透明，能耐酸堿，要有相對(duì)的化學(xué)穩(wěn)定性以及要對(duì)兩性物質(zhì)無(wú)明顯的吸附作用，這類材料象某些品種的無(wú)機(jī)玻璃和有機(jī)玻璃等。自然對(duì)這種材料的要求不包括軟性導(dǎo)管，電極和通透膜。
另外，在對(duì)材料要求中，通透膜要求是對(duì)所要求分離的兩性物質(zhì)無(wú)通透性，而對(duì)很小的分子或離子象H2O、H+、OH-等能自由通過(guò)。這類材料象半透膜、透析膜、起過(guò)濾膜以及核微孔膜等。對(duì)電極材料的要求也自然是惰性的，這類材料象鉑金材料等。對(duì)于軟性導(dǎo)管，可采用橡膠材料，也可采用硅膠材料。
等量中和檢測(cè)裝置圖5是本裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
參見(jiàn)圖5，可見(jiàn)上槽〔1〕，為盛裝緩沖液的容器。在上槽〔1〕上有惰性電極〔2〕，以及上端的排氣平衡管〔3〕。上槽〔1〕下接有刻度觀察管〔4〕下部有一活塞〔5〕，活塞〔5〕內(nèi)管徑同觀察〔4〕內(nèi)管徑一樣粗細(xì)，觀察管下端接下槽〔6〕，在下槽〔6〕上有惰性電極〔2〕導(dǎo)氣平衡管〔3〕和支座〔7〕。兩導(dǎo)氣平衡管〔3〕既能導(dǎo)出電解時(shí)產(chǎn)生的氣體，又能平衡上下兩槽的壓力，兩個(gè)導(dǎo)氣平衡管〔3〕內(nèi)徑要求一樣粗細(xì)，以防止表面張力對(duì)觀察結(jié)果的影響。自然在觀察管〔4〕外圍可設(shè)計(jì)一冷卻裝置〔9〕，以避免電泳時(shí)產(chǎn)生過(guò)高的溫度對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。
整個(gè)裝置除惰性電極外，所用的材料要求無(wú)色透明耐酸堿，有一定的機(jī)械強(qiáng)度，并且有相對(duì)的化學(xué)惰性，這類材料象某些品種的無(wú)機(jī)玻璃和有機(jī)玻璃等。
原理、方法、功能圖6、圖7、圖8、圖9、圖10是本發(fā)明的原理示意圖。
在圖6中，顯示出上槽(也稱堿性槽)、電泳管和下槽(也稱酸性槽);上下槽都隔著通透膜與電泳管相連，上槽接陰極電極，下槽接陽(yáng)極電極。在未接通直流電源時(shí)，上槽和電泳管上部裝堿性的緩沖液(以O(shè)H-表示)，并設(shè)PH值為PH堿。電泳管中部裝兩性物質(zhì)溶液，象蝮蛇蛇毒;下槽和電泳管下部裝酸性溶液(以H+表示)，并設(shè)PH值為PH酸，以上的緩沖液較稀，且根據(jù)需要上槽的緩沖液的PH值不大于11，而酸性槽緩沖液的PH值不小于3。
在接通電源后，上下槽和電泳管內(nèi)緩沖液中的各陰陽(yáng)離子都向其相反的電極遷移，同樣OH-和H+也將在電場(chǎng)作用下產(chǎn)生遷移。如果在電泳管中部沒(méi)有兩性混合物質(zhì)，那么遷移的結(jié)果將使OH-和H+在電泳管中部附近相遇并相互中和，這樣在接通電源后，電泳管從上到下從PH值來(lái)分將出現(xiàn)3個(gè)區(qū)帶，即上部PH值為PH堿的堿性帶，PH值從上到下是PH值下降的中和帶和下部PH值為PH酸性帶。如圖7所示，很明顯，要使中和帶不向那一端漂移，必須在單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)上槽通透膜的OH-和通過(guò)下槽通透膜的H+的數(shù)目相等，也就是上部電泳管內(nèi)OH-所形成的電流IOH-和下部電泳管內(nèi)H+所形成的電流IH+相等。
即IOH-=IH+(1)若假定任意垂直于電泳管的內(nèi)截面積為S，上槽和電泳管上部的堿性緩沖液中的OH-在電場(chǎng)力作用下遷移速率為μOH-，其活度為aOH-，離子電價(jià)為ZOH-,單位電荷所帶的電量為e;同樣下槽和電泳管下部的H+遷移速率為μH+,活度為aH+,離子電價(jià)為ZH+，單位電荷所帶的電量為e。
則有 IOH-=S·μOH-·aOH-·ZOH-·e (2)IH+=S·μH+·aH+ZH+·e (3)由于ZOH-=ZH+，所以將(2)、(3)式代入(1)式，整理得(aOH-)/(aH+) = (μH+)/(μOH-) (4)又由于離子在電場(chǎng)中遷移速率μ±與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，即μ±=U±· (dV±)/(dl±) (5)U±為淌度，即在一定溫度和濃度下，電位梯度等于1時(shí)，帶電離子在溶液中的遷移速率， (dV±)/(dl±) 為帶電離子所在微小區(qū)域內(nèi)的電位梯度。
由(5)式得 μH+=UH+· (dVH+)/(dlh+) (6)μOH-=UOH-· (dVOH-)/(dlOH-) (7)將(6)、(7)式代入(4)式，則有 (aOH-)/(aH+) =(UH+· (dVH+)/(dlh+) )/(UOH-· (dVOH-)/(dlOH-) ) (8)若假設(shè)在電泳管上、下部?jī)?nèi)的電場(chǎng)強(qiáng)度相等，即 (dVH+)/(dlh+) = (dVOH-)/(dlOH-) (9)則(8)式為 (aH+)/(aOH-) = (UOH-)/(UH+) (10)我們知道在25℃時(shí)，在水溶液中〔OH-〕·〔H+〕＝10-14。
更確切的是 aOH-·aH+=10-14(11)由(10)、(11)式得aH+= (UOH-)/(UH+) · (10-14)/(a′H+) (12)在(12)式中，a′H+為上槽緩沖液中氫離子的活度。將(12)式兩邊取以10為底的負(fù)對(duì)數(shù)。
整理得(－lgaH+)=(14+lg (UH+)/(UOH-) )-(－lga′H+) (13)即 PH酸＝(14＋lg (UH+)/(UOH-) )－PH堿(14)在室溫變化不大(如25℃左右)的情況下，可以令常數(shù)K，使得K=14+lg (UH+)/(UOH-) (15)(如，在25℃時(shí)，在極稀的溶液中，UH+＝3.630×10-7米2·秒-1·伏-1，UOH-＝2.052×10-7米2·秒-1·伏-1〔1〕，則K＝14.255)則(14)式變成PH酸＝K-PH堿(16)(16)式說(shuō)明，在緩沖液的溫度和離子強(qiáng)度不大的情況下，一旦堿性槽中緩沖液的PH堿確定下來(lái)，那么酸性槽中的緩沖液PH酸也確定下來(lái)，反之也然。
在維持中和帶穩(wěn)定因素中，另一個(gè)重要的因素是緩沖液的緩沖能力，這是因?yàn)樵谒芤褐兴袔щ婋x子中。OH-和H+的淌度最大，這從表1可以明顯看出。
表1、在298.15K時(shí)，一些離子在無(wú)限稀釋的濃度(米3·秒-1·伏-1
我們知道，在推導(dǎo)(16)式時(shí)，忽略了OH-和H+的擴(kuò)散，要忽略擴(kuò)散的影響，就要求OH-和H+的濃度很低(因?yàn)殡x子擴(kuò)散率與其濃度差成正比)。的確如此，因?yàn)樵谂渲凭彌_液時(shí)，我們要求總的離子強(qiáng)度不是太高，且堿性緩沖液的PH值不大于11，酸性緩沖液的PH值不小于3，這說(shuō)明下槽內(nèi)的〔H+〕＜10-3M，上槽內(nèi)的〔OH-〕＜10-3M。如果我們考慮〔OH-〕和〔H+〕對(duì)中和帶的影響。那么只是隨〔OH-〕和〔H+〕增大，中和帶相應(yīng)變寬，隨〔OH-〕和〔H+〕下降，中和帶相應(yīng)變窄。
另外，所要分離的兩性物質(zhì)對(duì)中和帶也有影響。因?yàn)樗鼈円灿芯彌_能力，特別是所分離的兩性物質(zhì)濃度很高，加樣很大的情況下。
為了確保形成穩(wěn)定的中和帶，再設(shè)計(jì)等量中和檢測(cè)技術(shù)，其方法是在圖6中的兩性物質(zhì)不是待分離的物質(zhì)，而是很純的兩性染料，其等電點(diǎn)(PI)近中性，(如剛果紅PI 5.80〔16〕)，接通電源其電泳的結(jié)果剛果紅不產(chǎn)生漂移，說(shuō)明下槽H+和OH-等量中和。
剛果紅向下槽漂移，說(shuō)明下槽H+濃度不夠大，要提高下槽緩緩沖液中H+的濃度，或降低上槽緩沖中的OH-濃度。
剛果紅向上槽漂移，情況正好與上述相反。
應(yīng)該注意，在H+和OH-不能等數(shù)中和而需要更精確調(diào)整上、下槽緩沖液的濃度時(shí)，也要注要比電的調(diào)整。
在推導(dǎo)(16)式的過(guò)程中，假定電泳管下部和上部的電場(chǎng)強(qiáng)度相等。
即(dVH+)/(dlH+) = (dVOH-)/(dlOH-) (9)那么，如何使(9)式保持相等呢？眾所周知V＝1·R (17)即V＝1/L (18)那么，如果設(shè)電泳管內(nèi)總電泳為I總，電泳管上部的總電導(dǎo)為L(zhǎng)總OH-，電泳管下部的總電導(dǎo)為L(zhǎng)總H+。
則有 VOH-=I總／L總OH-(19)VH+=I總／L總H+(20)又由于L＝L·S/1 (21)那么，如果設(shè)電泳管上部(或上槽)內(nèi)的總比電導(dǎo)為L(zhǎng)總OH-，高度為IOH-;電泳管下部(或下槽)總比電導(dǎo)為L(zhǎng)總H+·高度為IH+，則有 L總OH-=L總OH-·S/IOH-(22)L總H+=L總H+·S/IH+(23)由(9)、(19)、(20)、(22)、(23)式推導(dǎo)得L總OH-=L總H+(24)
如果在上槽(或電泳管上部)緩沖對(duì)試劑電離后形成的比電導(dǎo)為L(zhǎng)OH-，其他非緩沖對(duì)試劑電離后形成比電導(dǎo)為L(zhǎng)OH-。
則近似有L總OH-=LOH-+L′OH-(25)同樣在下槽(或電泳管下部)中也有L總H+=LH++L′H+(26)由(24)、(25)、(26)式，LOH-=LH++(L′H+-L′OH-) (27)令 △L=L′H+-L′OH-(28)則有LOH-=LH++△L(29)在(29)式中，當(dāng)LOH-=LH+時(shí)，必須是△L＝0，說(shuō)明不需要向任何一方緩沖液中加入一定量中性的電解質(zhì)(如KNO3等)當(dāng)LOH-＞LH+時(shí)，必須是△L＞0說(shuō)明需要向酸性緩沖液中加入一定量中性的電解質(zhì)，調(diào)整到L總OH-=L總H+。
當(dāng)LOH-＜LH+時(shí)，必須是△L＜0說(shuō)明需要向堿性緩沖液中加入一定量的中性電解質(zhì)，調(diào)整到L總OH-=L總H+。
應(yīng)該注意，同溶液的PH值一樣，溶液的比電導(dǎo)也受室溫和濃度的影響，這就要求在用電導(dǎo)儀測(cè)定緩沖液的電導(dǎo)時(shí)，就要保持電泳時(shí)電泳管的緩沖液的溫度同測(cè)定時(shí)的溫度大致相等。
從(16)和(29)式推導(dǎo)說(shuō)明，在配制緩沖液時(shí)，必須要滿足(16)和(19)式這兩個(gè)條件，而這在一般的實(shí)驗(yàn)室和生物制品工廠都很容易做到。
上述推導(dǎo)(16)和(29)式忽略了兩性物質(zhì)對(duì)中和帶的影響，但是實(shí)際電泳過(guò)程中，兩性物質(zhì)對(duì)中和帶是有影響的(已前述)。
對(duì)于處在圖6中的兩性混合物質(zhì)，在電泳時(shí)將怎樣移動(dòng)呢？在此不妨設(shè)所需分離的兩性物質(zhì)，按其等電點(diǎn)不同有堿性類(PIOH-＞7)PIOH-1·PIOH-2·……PIOH-n·PIOH-n+1n為自然數(shù)，且從左到右PIOH-是漸增的。
酸性類(PIH+＜7)PIH+1·PIH+2·……PIH+m·PIH+m+1m為自然數(shù)，且從左到右PIH+是漸減的。
在首次電泳時(shí)，電泳管下部?jī)?nèi)的PH值為PHH+i+1·電泳管上部的PH值為PHOH-i，且電泳管上、下部?jī)?nèi)的緩沖液滿足(16)和(29)兩式兩個(gè)條件，此時(shí)如果存在
那么電泳時(shí)，對(duì)堿性類的兩性物質(zhì)來(lái)說(shuō)，只有PIOH-n+1這組物質(zhì)才向陰極(即堿性槽)移動(dòng)，其他的物質(zhì)留在中和帶內(nèi)，當(dāng)PIOH-n+1這組物質(zhì)移至堿性槽(或上槽)的通透膜時(shí)，由于通透膜的作用，就被阻截而停留在這里，這樣這組物質(zhì)與其他兩性物質(zhì)分離。同樣在酸性類中只有PIH+m+1這組物質(zhì)與其他兩性物質(zhì)分離。電泳的結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)圖8所示的情況從PH值來(lái)分，仍有三個(gè)區(qū)帶，即堿性帶、中和帶和酸性帶;而從兩性物質(zhì)所在的區(qū)帶來(lái)分將有PIOH-n+1帶，堿性空白帶、混合帶、酸性空白帶和PIH+m+1帶。采用一定方式(如在圖1和圖3中采用45度旋轉(zhuǎn)方式)可將PIOH-n+1和PIH+m+1帶分離出來(lái)。
改變上、下槽的緩沖液。
使得
繼續(xù)電泳，結(jié)果PIH+m和PIOH-n同樣得到分離。
采用同樣的方法，可以將PIOH-n-1、PIH+m-1、……PIOH-2、PIH+2·PIOH-1·PIH+1進(jìn)行分離，這樣就將整個(gè)混合兩性物質(zhì)分離成2(n+1)+1＝2n+3個(gè)組份或2(m+1)+1＝2m+3個(gè)組份。
對(duì)于被分離的兩性物質(zhì)如蛋白質(zhì)，可以用751分光光度計(jì)或蛋白核酸檢測(cè)儀或凱氏定氮法來(lái)測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度，并根據(jù)需要測(cè)定其不同的生物活性。
需要指出的是PIH+m和PIOH-n應(yīng)該看成在一定PH值區(qū)間內(nèi)的兩性物質(zhì)在合組份;當(dāng)這個(gè)PH值區(qū)間從其兩邊向區(qū)間內(nèi)某一PH值不斷靠近時(shí)，就接近某一點(diǎn)PI的兩性混合組份;當(dāng)在這個(gè)定點(diǎn)PI的兩性物質(zhì)只有一種組份時(shí)，就成為純的兩性物質(zhì);當(dāng)這個(gè)PH值區(qū)間中沒(méi)有任何兩性物質(zhì)時(shí)，表示這一PH值區(qū)間組份內(nèi)無(wú)兩性物質(zhì)成份。
從上述的情況可以看出，這種分離兩性物質(zhì)的方法很象將一根棍子從兩端不停地向中心附近以不同的距差分割，所以把這種分離多組兩性物質(zhì)的方法稱為兩端分割法(The mathod of cutting at twoends)。很明顯這一方法適用于對(duì)一組不知等電點(diǎn)的兩性混合物質(zhì)的分離、純化和分析。
對(duì)于一混合兩性物質(zhì)，如果在這組混合物中已知某一些組份物質(zhì)的等電點(diǎn)，則可以采用PH鉗制技術(shù)(The mathod of PH clamp)將這一物質(zhì)從這一混合物中分離出來(lái)。例如已知等電點(diǎn)為PIH+(為酸性類)的兩性物質(zhì)，則在配制酸性槽的緩沖液時(shí)，首先用PH值略小于PIH+的緩沖液，同時(shí)按照(16)或和(29)式配制堿性槽的緩沖液。電泳的結(jié)果PI＜PIH+的兩性物質(zhì)就能得到分離。然后再進(jìn)行第二次電泳，這時(shí)酸性槽的緩沖液的PH要略大于PIH+，電泳后PIH+就被分離出混合組份，不難看出，這一方法很象用一把鉗子將PIH+的這一組份從混合組份中鉗出。而這一鉗子正是PH，所以稱這一技術(shù)為PH鉗制技術(shù)(The mathod of PH clamp)。
以上說(shuō)明不同等電點(diǎn)兩性混合物分離的兩種方法，在兩端分割法中，如果某兩性物質(zhì)被分割在某一區(qū)間內(nèi)，就可以估計(jì)這種兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)，如果這個(gè)PH值區(qū)間足夠小，就可以測(cè)得其PI。
當(dāng)然，在兩端分割法和PH鉗制技術(shù)中，如果所分離的兩性物質(zhì)有可能是不純的，這時(shí)要使被分離的兩性物質(zhì)達(dá)到很純的程度，就要與其他分離技術(shù)結(jié)合，這類技術(shù)有離子交換、凝膠過(guò)濾、薄層層析等。
但是，用離子交換、凝膠過(guò)濾等技術(shù)分離的兩性高分子物質(zhì)，象蛋白質(zhì)，在洗脫以后，常出現(xiàn)洗脫蛋白峰的ODZBO值很低，也就是說(shuō)蛋白質(zhì)濃度低，另外還含有較濃的鹽成份，在對(duì)這些蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行檢測(cè)分析以前，常常需要濃縮透析。濃縮的方法很多，如采用透析袋的吹干法，透析袋聚乙二醇濃縮法，超過(guò)濾法，真空冷凍抽干法等。
在此利用電泳進(jìn)行濃縮，其原理是配制緩沖液的PH偏離待濃縮的兩性物質(zhì)的PH，這樣使待濃縮的兩性物質(zhì)所帶的凈電荷不為零。在電場(chǎng)的作用下，要么向陰極，要么向陽(yáng)極移動(dòng)，如圖9所示，但由于通透膜的阻通作用，而使待濃縮的物質(zhì)在通透膜處堆積，除出非兩性物質(zhì)堆積的溶液，既達(dá)到濃縮的目的，也達(dá)到部分透析的目的。
以下結(jié)合一個(gè)臨床檢驗(yàn)實(shí)例對(duì)這一方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
在臨床檢驗(yàn)中，常需要測(cè)定腦積液的蛋白質(zhì)，但由于腦積液的蛋白質(zhì)濃度很低(20～40mg/dl)〔18〕，所以測(cè)定時(shí)常需要濃縮〔19〕。在腦積液中的蛋白質(zhì)，蛋白電泳(濾紙法)〔18〕主要是白蛋白球蛋白(α1、α2、β、γ)，這些蛋白質(zhì)的PH都大于4，所以如果配制一PH值在4左右的緩沖液放置于上下槽、電泳管中放入待濃縮的腦積液(先要離心除去細(xì)胞成份)，進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果，所有的蛋白質(zhì)將在陰極端通透膜處聚集，從而達(dá)到濃縮的目的，采用這種方法一次可濃縮多個(gè)樣本。類似的應(yīng)用還有尿蛋白濃縮〔20〕等。
對(duì)于用上述方式或其他方式濃縮后的蛋白質(zhì)，在測(cè)定其生物活性前需要進(jìn)一步地將其蛋白溶液中電解質(zhì)成份去掉。去鹽的方法很多，如透析法、超過(guò)濾法、凝膠濾法。在此討論電透析法。
參見(jiàn)圖10，在上槽和下槽均是蒸餾水，在中間很短的電泳管內(nèi)是濃縮后含鹽的蛋白質(zhì)，接通電直流電源后，小分子的陰、陽(yáng)離子在電場(chǎng)的作用穿過(guò)通透膜，而大分子的蛋白質(zhì)仍留在電泳管內(nèi)。電泳一段時(shí)間后更換蒸餾水，繼續(xù)電泳、直至鹽成份全部去掉。應(yīng)該注意，開始電泳去鹽時(shí)，電壓不可太高，以免產(chǎn)生很大的電泳(因鹽份較高)，以后可不停地加大電壓。
使用多功能自由電泳技術(shù)的方法已在原理中給以詳細(xì)說(shuō)明，在此僅對(duì)這種電泳技術(shù)的裝置的使用和等電量中和檢測(cè)裝置的使用給以說(shuō)明。
多功能自由電泳技術(shù)裝置的使用。
參見(jiàn)圖1和圖3，使用時(shí)，首先關(guān)閉下槽的排液孔道〔e〕將配制好的酸性沖液從凹面〔J〕倒入下槽，使液面平凹面〔J〕，并注意要排盡下槽的氣體。挑選適當(dāng)?shù)耐ㄍ改ぁ?〕放入凹面〔J〕內(nèi)，注意排氣，蓋上壓板〔2〕，根據(jù)需要選擇適當(dāng)厚度的電泳管基，按導(dǎo)通的標(biāo)刻一一疊加，組成電泳管，在各電泳管下部加入下槽緩沖液，并在其中加入少量近中性的兩性指示劑。45度旋轉(zhuǎn)中上部的電泳管基，使中間電泳管基上的電泳孔道與下部錯(cuò)開，然后對(duì)中間一個(gè)電泳管基上的各電泳孔道加入待分離的兩性物質(zhì)(樣品)，再45度旋轉(zhuǎn)上部電泳管基，使上部電泳與中間電泳錯(cuò)開，在上部電泳孔道加滿配制好的堿性緩沖液至最上面一個(gè)電泳管基凹面〔J〕，接著挑選適當(dāng)?shù)耐ㄍ改し胖糜诎济妗睯〕內(nèi)，蓋上壓板(注意排氣)，再按裝上槽，在上槽內(nèi)倒入配制好的緩沖液，蓋上蓋，將上、下兩槽的電極導(dǎo)線接上電泳儀，將一軟管一端接上排氣調(diào)壓孔〔n〕，另一端夾在管上槽側(cè)壁的管夾〔g〕上，在軟管內(nèi)加入下槽緩沖液，使液面平上槽液面，最后旋轉(zhuǎn)中間和上部電泳管基，重新組成一完整的電泳管，打開電泳開關(guān)，進(jìn)行電泳。
對(duì)于圖3中的冷卻裝置的使用，前面已述。
電泳過(guò)程中，當(dāng)兩性指示劑在電泳管中央附近聚集，并穩(wěn)定不動(dòng)時(shí)，表明電泳已基本完成，停止電泳，45度旋轉(zhuǎn)各相鄰的電泳管基，使上下相鄰的電泳孔道相互錯(cuò)開，即可達(dá)到分離目的。
等量中和檢測(cè)裝置的使用將待檢的下槽緩沖液從下槽排氣平衡管上口倒入，打開活塞，使下槽緩沖液在觀察管內(nèi)停留在一定高度，關(guān)閉活塞，用帶有腰穿針的注射器吸取一定量的近中性的兩性指示劑，小心地將上槽排氣平衡管內(nèi)將兩性指示劑加到觀察管內(nèi)的緩沖液液面上(量不可多)，然后用同樣的方法加入上槽待檢緩沖液，最后用待檢的緩沖液分別調(diào)整上、下槽排氣平衡管內(nèi)的液面于同一水平面，打開活塞，接通直通電源，觀察兩性指示劑在觀察管中的移動(dòng)狀況，判斷是否等量中和(已前述)。在電泳觀察過(guò)程中，如果產(chǎn)熱較多可啟用冷卻系統(tǒng)。
優(yōu)缺點(diǎn)比較本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)1、既可用于大規(guī)模兩性物質(zhì)的制備，也可用于少量和微量?jī)尚晕镔|(zhì)的分離和分析。
2、所分離物質(zhì)不需要濃縮就可以達(dá)到很高的濃度。
3、本發(fā)明裝置的造價(jià)不高，且在電泳時(shí)一般不需要貴重的儀器和藥品;另外，儀器的使用簡(jiǎn)單。
4、分離的物質(zhì)廣，就是說(shuō)既適應(yīng)于分子量很高的象DNA、RNA，甚至病毒等，也適應(yīng)于分子量很低的多肽、甚至氨基酸等物質(zhì)的分離，這避免了很多電泳技術(shù)(象PAGE)的分離物質(zhì)的局限性。
5、電泳在無(wú)支持體溶液中進(jìn)行，并有較稀的緩沖液存在，所以電泳完成的時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng)。
6、PH鉗制技術(shù)用于分離兩性物質(zhì)有相對(duì)的特異性，很明顯這一技術(shù)特別適用于大規(guī)模制備。
7、分離物質(zhì)前，配制緩沖液等準(zhǔn)備工作時(shí)間一般不像離子交換和親和層析等需要很長(zhǎng)時(shí)間。
8、對(duì)流作用和電滲作用對(duì)待分離和濃縮的物質(zhì)結(jié)果影響小，因?yàn)椴恍枰塥M窄的區(qū)帶。
9、有很好的濃縮功能，這一功能不僅適用于兩性物質(zhì)的濃縮，而且能很方便地用于臨床檢驗(yàn)。
10、有估計(jì)和測(cè)定兩性物質(zhì)等電總的作用。
11、有很好的電透析作用。
12、這種多功能自由電泳技術(shù)的裝置可以根據(jù)不同的需要(如大規(guī)模制備分離或少量和微量的分離分析或濃縮透析)，制成不同的系列裝置。
不足之處是1、對(duì)溫度的變化反應(yīng)相對(duì)較大(這可通過(guò)冷卻系統(tǒng)克服)2、對(duì)在較強(qiáng)堿性或酸性的情況下易變性失活，而其PI又在較高的PH值或在較低PH值的蛋白質(zhì)，酶等不適用本技術(shù)。
3、不能像親和層析那樣有高度的特異性。
4、對(duì)不帶電的小分子不能進(jìn)行電透析。
附參考文獻(xiàn)1、傅獻(xiàn)彩等編物理化學(xué)(下冊(cè))，1980，高等教育出版社。
2、Vesterberg，O.svensson，H.Acta.chem，scand，20820，19663、Svensson.H.Acta.chem.Scclnd.15325.19614、中山大學(xué)生物系生化微生物教研室編生化技術(shù)導(dǎo)論，1979，人民教育出版社。
5、Bernfild.P.and Nisselbanm.J.S.J.Biol.chem.220851，19566、潘家秀等編蛋白質(zhì)化學(xué)研究技術(shù)，1973，科學(xué)出版社。
7、Depieds，Biffu.G.and orsini.A.compt.Rend.soc.Biol.1521549，1958。
8、莽克強(qiáng)等聚丙烯酰胺凝膠電泳，1975，科學(xué)出版社。
9、G.F.Bahr eteMicromethods in Molecular Biology.vol.14，1973，Springer-verlag Berlin.Heidelberg.New York。
10、張龍翔等生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，1982，人民教育出版社。
11、Bloemendal.H.J.Chromatography.2121，195812、Reevs.R.E.etcJ.Amer.Soc.724773，195013、P.H.O′FarrellJ.Biol.chem.2504007，197514、A.C.peacock etcRioohem.7688，196815、A.E.Bahlberg etcJ.Mol.Biol.41139，1969
16、第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征學(xué)院臨床免疫學(xué)技術(shù)，1980。
17、B.L.威廉斯等實(shí)用生物化學(xué)原理和技術(shù)，1979，科學(xué)出版社。
18、陳國(guó)楨主編內(nèi)科學(xué)，1985，人民衛(wèi)生出版社。
19、羅佩等中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，12303，1989。
20、王堯等中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，12130，1989。
權(quán)利要求
1.一種多功能自由電泳技術(shù)，其特征在于利用本發(fā)明的多功能自由電泳裝置能對(duì)多種兩性混合物進(jìn)行PH鉗制技術(shù)(或兩端分割技術(shù))的分離提純，并能對(duì)多種兩性物質(zhì)進(jìn)行濃縮和透析。
2.按權(quán)利要求1所述的多功能自由電泳裝置，其特征在于一段段規(guī)則地制作在電泳管基上的電泳孔道通過(guò)疊加形成電泳管，在電泳管兩端隔著通透膜與帶有惰性電極的上槽和下槽連接。
3.按權(quán)利要求2所述的多功能自由電泳裝置，其特征在于相疊加的電泳管基通過(guò)圓環(huán)狀的穩(wěn)滑凹和穩(wěn)滑凸既能精密吻合又能相互轉(zhuǎn)動(dòng)。
4.按權(quán)利要求2所述的多功能自由電泳裝置，其特征在于通透膜對(duì)所要分離提純或濃縮透析的兩性物質(zhì)無(wú)通透性，而能使小分子或小離子物質(zhì)自由通過(guò)。
5.按權(quán)利要求2所述的多功能自由電泳裝置，其特征在于整個(gè)電泳裝置可設(shè)計(jì)成帶有冷卻系統(tǒng)的電泳裝置。
6.按權(quán)利要求1所述的PH鉗制技術(shù)，其特征在于a、電泳分離兩性物質(zhì)所用的緩沖液按PH堿＝K-PH酸和LOH＝LH+△L兩式配制兩套緩沖液，b、在兩套緩沖液中兩個(gè)PH偏鹼性或PH偏酸性的緩沖液所形成的PH范圍包含所要分離出兩性物質(zhì)組份的等電點(diǎn)，c、在使用時(shí)，先啟用PH遠(yuǎn)離中性那套緩沖液，后啟用PH近中性的那套緩沖液。
7.按權(quán)利要求1所述的兩端分割技術(shù)，其特征在于a、電泳分離兩性物質(zhì)所用的多套緩沖液按PH堿＝K-PH酸和LOH＝LH+△L兩式配制。b、使用這些緩沖液時(shí)最先啟用PH最遠(yuǎn)中性的那套緩沖液，以后以次啟用PH漸近中性的各套緩沖液。
8.按權(quán)利要求1所述的多功能自由電泳技術(shù)，其特征在于需要一等量中和檢測(cè)裝置，對(duì)緩沖液按PH堿＝K-PH酸和LOH＝LH+△L兩式配制的作進(jìn)一步檢驗(yàn)。
9.按權(quán)利要求8所述的等量中和檢測(cè)裝置。其特征在于有刻度的觀察管兩端各連通一個(gè)帶有惰性電極的上槽和下槽，上槽和下槽又各連接一個(gè)內(nèi)徑相同的導(dǎo)氣平衡管，且在觀察下端附近有一活塞。
10.按權(quán)利要求8、9所述的等量中和檢測(cè)裝置，其特征在于在觀察管四周可帶有冷卻裝置。
11.按權(quán)利要求1所述的兩性物質(zhì)濃縮法，其特征在于電泳時(shí)所用的緩沖液的PH值，偏離待濃縮兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多功能自由電泳技術(shù)，包括三項(xiàng)，首項(xiàng)是多功能自由電泳技術(shù)所需的裝置。第二項(xiàng)是完成這種多功能自由電泳技術(shù)所需的方法。第三項(xiàng)是實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)所需要的一種等量中和檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明的特征是依據(jù)兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)(PI)不同。通過(guò)改變緩沖液的pH值將兩性物質(zhì)進(jìn)行分離、濃縮、透析、估計(jì)測(cè)定兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)。本發(fā)明不僅適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)大規(guī)模的分離、純化、濃縮、透析，也適用于上述物質(zhì)甚至病毒等少量或微量的分離純化，濃縮透析等電點(diǎn)的估計(jì)測(cè)定。
文檔編號(hào)B01D57/02GK1056261SQ9010255
公開日1991年11月20日 申請(qǐng)日期1990年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月28日
發(fā)明者曹成喜 申請(qǐng)人:曹成喜