本發(fā)明涉及一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，具體講，涉及一種能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)與擴(kuò)增產(chǎn)物的pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置。

背景技術(shù)：

1、無(wú)論何時(shí)何地都能夠準(zhǔn)確、快速診斷患者疾病的poc(point?of?care，即時(shí)醫(yī)療)診斷技術(shù)是精密醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)基于證據(jù)的非常重要的技術(shù)，備受關(guān)注?；诎Y狀的現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)是一種以咳嗽、腹瀉、高燒、生殖器異常等疾病癥狀為標(biāo)準(zhǔn)，一次性快速檢測(cè)引發(fā)疾病癥狀的所有感染病原體并確認(rèn)致因病原體，然后開(kāi)具最佳抗生素和治療劑處方的技術(shù)，其作為未來(lái)精密醫(yī)學(xué)的核心新技術(shù)，目前有很多與其相關(guān)的研究正在進(jìn)一步發(fā)展。這種現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，就像現(xiàn)有用于確認(rèn)是否懷孕的驗(yàn)孕試紙，以及可以確認(rèn)血糖值的血糖儀一樣，即使不是專(zhuān)家也可以在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。目前，分子診斷技術(shù)作為未來(lái)醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)備受關(guān)注，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體的多重檢測(cè)法，利用這些技術(shù)，我們可以準(zhǔn)確掌握感染疾病的病因并開(kāi)具最佳處方，盡早對(duì)疾病進(jìn)行治療，大幅縮短患者的恢復(fù)時(shí)間，從而提高醫(yī)療質(zhì)量、節(jié)約醫(yī)療費(fèi)用。

2、但是，目前的分子診斷系統(tǒng)需要三個(gè)小時(shí)以上才能確認(rèn)結(jié)果，而且還需要技術(shù)熟練的專(zhuān)家操作，因此，為了進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)所需的poc分子診斷，需要開(kāi)發(fā)一種能夠以全自動(dòng)方式執(zhí)行復(fù)雜的核酸提取過(guò)程和實(shí)時(shí)基因擴(kuò)增檢測(cè)的自動(dòng)化小型裝置，并且應(yīng)當(dāng)確保非專(zhuān)業(yè)人員也能夠輕松操作。

3、具有代表性的分子診斷方法有利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr，polymerase?chainreaction，以下簡(jiǎn)稱(chēng)“pcr”)進(jìn)行診斷的方法。自從1985年被凱利·穆利斯發(fā)明以來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)因可以快速、輕松地對(duì)特定dna進(jìn)行擴(kuò)增而被廣泛用于分子生物學(xué)和分子診斷等方面。使用pcr/rt-pcr，可以確認(rèn)生物樣本內(nèi)是否存在特定的dna/rna，因此其多被用于診斷病毒等病原性微生物感染。隨著這種pcr/rt-pcr技術(shù)發(fā)展成為實(shí)時(shí)定量pcr(realtime?pcr、quantitative?pcr)技術(shù)，在pcr結(jié)束的同時(shí)就能知曉結(jié)果，這不僅簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，大幅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且還可以準(zhǔn)確地確定病原體數(shù)量，因此被用作監(jiān)測(cè)人類(lèi)免疫缺陷病毒(hiv)、丙型肝炎病毒(hcv)、乙型肝炎病毒(hbv)等治療效果的標(biāo)準(zhǔn)診斷方法。此外，其還可以檢測(cè)與特定疾病相關(guān)的基因表達(dá)模式或基因突變，因此被用作最重要的疾病診斷技術(shù)。

4、為了執(zhí)行這種pcr，需要核酸提取步驟，即從生物樣本內(nèi)除去阻礙pcr反應(yīng)的物質(zhì)，提取純凈的核酸。核酸提取過(guò)程由多個(gè)步驟組成，在生物樣本及核酸提取操作中需要具備熟練的技術(shù)。人工操作時(shí)，可能會(huì)因操作人員的失誤造成污染等問(wèn)題，因此大部分情況下都使用自動(dòng)化核酸提取設(shè)備進(jìn)行分子診斷。

5、pcr反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)作業(yè)需要配備實(shí)時(shí)定量pcr裝置，因此之前主要在大型醫(yī)院或?qū)I(yè)臨床檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行分子診斷。

6、最近，通過(guò)研究和開(kāi)發(fā)，核酸提取、pcr反應(yīng)及反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)的全過(guò)程已經(jīng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，開(kāi)發(fā)出了即使沒(méi)有專(zhuān)業(yè)技術(shù)也能輕松使用pcr的多種自動(dòng)化系統(tǒng)及利用這些系統(tǒng)的設(shè)備。

7、但是，現(xiàn)有裝置存在價(jià)格過(guò)于昂貴或處理時(shí)間長(zhǎng)，以及很難一次性同時(shí)進(jìn)行多種檢測(cè)的問(wèn)題。

8、下面介紹一下pcr的基本原理，在95℃的條件下加熱dna雙螺旋結(jié)構(gòu)，使之分離成單鏈，然后將反應(yīng)溶液冷卻至退火溫度，使互補(bǔ)引物在pcr反應(yīng)溶液中待擴(kuò)增部位的兩端選擇性地配對(duì)，反復(fù)進(jìn)行dna聚合酶在各個(gè)單鏈上依次連接互補(bǔ)的a、g、t、c四種核苷三磷酸形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的反應(yīng)。該反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)性地將pcr反應(yīng)溶液反復(fù)進(jìn)行30～45次加熱、冷卻循環(huán)(n)，使特定dna雙螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行2n幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。rt-pcr反應(yīng)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna后，可以通過(guò)pcr進(jìn)行擴(kuò)增，從而擴(kuò)展成一種rna檢測(cè)方法。

9、下面介紹一下為了將pcr正式應(yīng)用于分子診斷而新開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)定量pcr的原理，為了對(duì)利用pcr反應(yīng)而擴(kuò)增的dna進(jìn)行定量分析，將與dna量成正比產(chǎn)生熒光的物質(zhì)添加到pcr反應(yīng)液中后，測(cè)量每個(gè)循環(huán)的熒光，找到檢測(cè)出臨界熒光值的循環(huán)，由此定量測(cè)量初始目標(biāo)核酸濃度。

10、自從pcr被發(fā)明出以來(lái)，在各種應(yīng)用技術(shù)開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，有大量病原體和疾病相關(guān)基因堿基序列通過(guò)基因組計(jì)劃被發(fā)現(xiàn)，并且通過(guò)擴(kuò)增這些疾病相關(guān)dna/rna堿基序列進(jìn)行定性、定量診斷的分子診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展。由于現(xiàn)有pcr溫度循環(huán)需要兩個(gè)小時(shí)左右的時(shí)間，因此為了能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)診斷，可以更快速、準(zhǔn)確地執(zhí)行pcr的方法被不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)(lab?chip，2016，16，3866-3884)。

11、為了在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行pcr反應(yīng)，必須迅速改變反應(yīng)溶液的溫度。此外，為了通過(guò)精確的pcr反應(yīng)僅擴(kuò)增所需的目標(biāo)，必須將引物設(shè)計(jì)成能夠有針對(duì)性地與所需目標(biāo)結(jié)合，并應(yīng)在pcr溫度循環(huán)反應(yīng)中準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)退火溫度。

12、為此，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了與以往實(shí)驗(yàn)室常用的0.2ml和0.5ml反應(yīng)器相比熱容量盡可能小、熱傳遞性盡可能好的微pcr反應(yīng)容器。由于這種微反應(yīng)器使用反應(yīng)溶液少、表面積大，因此熱傳遞速度快，可以實(shí)現(xiàn)快速加熱和冷卻。向硅晶片上大小為17x15mm、厚度為40-80um的薄反應(yīng)槽中加入10ul的pcr溶液后用玻璃板覆蓋，保持較大的表面積(>100mm2/10ul)。但是，使用現(xiàn)有的珀?duì)柼麩釅K，不能顯示一個(gè)循環(huán)將時(shí)間縮短到約3分鐘(clin.chem.40/9，1815-1818(1994))。

13、為了快速對(duì)pcr反應(yīng)器進(jìn)行熱循環(huán)，將pcr反應(yīng)器反復(fù)浸入高溫水槽和低溫水槽中的方式被開(kāi)發(fā)成了早期的pcr反應(yīng)裝置。(turbo?thermalcycler.bioneer?corp.daejeon)。這種讓反應(yīng)器在不同的溫度區(qū)域進(jìn)行循環(huán)的pcr設(shè)備采用的是空間移動(dòng)方式，其優(yōu)點(diǎn)是，可通過(guò)將反應(yīng)器浸入預(yù)先精確保持溫度的恒溫水槽中快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr反應(yīng)。但是，由于需要多個(gè)恒溫水槽，所以設(shè)備龐大，難以維護(hù)。同時(shí)，在固定塊中利用珀?duì)柼龋S著時(shí)間改變溫度的時(shí)差溫度循環(huán)式pcr設(shè)備目前占主導(dǎo)地位。

14、使用微流路的pcr方式還被開(kāi)發(fā)成了空間移動(dòng)溫度循環(huán)方式和時(shí)差溫度循環(huán)方式?？臻g移動(dòng)溫度循環(huán)方式大致可以分為以fifo(first-in-first-out，先進(jìn)先出)的方式連續(xù)流動(dòng)的開(kāi)放型方式，以及在不同的溫度區(qū)間進(jìn)行反復(fù)移動(dòng)的封閉型方式。作為開(kāi)放型方式，1994年nakano等人開(kāi)發(fā)出了將毛細(xì)管纏繞在具有不同溫度隔室的圓柱形塊上并讓pcr溶液連續(xù)流入其中的方式。(biosci.biotech.biochem.，58(2)，349-352，1994)。1998年，kopp等人確認(rèn)，以微流路形式反復(fù)流經(jīng)高溫和低溫區(qū)間的微流路式pcr設(shè)備使10ul溶液以4.5s的周期通過(guò)20個(gè)循環(huán)進(jìn)行pcr(science?2801046-1048，1998)。

15、本發(fā)明的背景技術(shù)在韓國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利公報(bào)第10-2016-0067872號(hào)(2016.06.14公開(kāi)，發(fā)明名稱(chēng)：一種用于執(zhí)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分析單元、分析裝置、所述分析單元的操作方法以及所述分析單元的制造方法)中公開(kāi)。

16、之前，在韓國(guó)注冊(cè)專(zhuān)利第10-2105558號(hào)中，公開(kāi)了高速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析板。但是，如果使用公開(kāi)的分析板，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中，反應(yīng)孔和反應(yīng)孔之間的擴(kuò)增產(chǎn)物可能會(huì)混合，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)精度降低。為了解決這些問(wèn)題，需要一種能夠快速定量、定性分析多個(gè)目標(biāo)的改進(jìn)pcr板。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、【發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題】

2、本發(fā)明就是為解決所述問(wèn)題而研發(fā)的，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，該裝置可以通過(guò)從生物樣本中提取核酸、進(jìn)行pcr反應(yīng)并掃描各種波段的激發(fā)光和相應(yīng)的熒光，以全自動(dòng)方式進(jìn)行目標(biāo)核酸檢測(cè)，并且一次操作就可以檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，使用簡(jiǎn)便，特別是可以在短時(shí)間內(nèi)獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

3、本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種pcr板、核酸提取盒及包含這些結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，該裝置能夠?qū)cr過(guò)程所需的溫度調(diào)節(jié)過(guò)程與熱變性過(guò)程所需的溫度進(jìn)行結(jié)合的過(guò)程中所要求的準(zhǔn)確溫度快速地反復(fù)施加到反應(yīng)目標(biāo)上，確保能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr，從而最大限度地提高反應(yīng)的可靠性。

4、【解決技術(shù)的方法】

5、本發(fā)明的pc板，包括：包括主體部，其配備有配備有一個(gè)以上反應(yīng)孔；插入部，其從所述主體部延長(zhǎng)，插入到核酸提取盒中，配備有配備有注入核酸溶液的注入口；流路流路部，其可以使所述核酸溶液從所述注入口流動(dòng)到所述反應(yīng)孔；阻斷部，其安裝于所述主體部上，阻斷所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

6、在本發(fā)明中，所述主體部，包括：主體框架部，其配備有配備有一個(gè)以上所述反應(yīng)孔；容納部阻斷容納部，其凹陷形成于所述主體框架部上，容納所述阻斷部；連接流路流路部，其將所述阻斷容納部與所述反應(yīng)孔連接起來(lái)；存儲(chǔ)部，其凹陷形成于所述主體部上，與所述流路流路部連通，用于供應(yīng)容納所述核酸溶液；流路流路引導(dǎo)部，其與所述存儲(chǔ)部連通，用于引導(dǎo)所述核酸溶液向所述阻斷部一側(cè)流動(dòng)。

7、在本發(fā)明中，所述連接流路流路部可以配備配備有從所述阻斷部向所述反應(yīng)孔側(cè)形成的狹窄的瓶頸部。

8、在本發(fā)明中，所述容納部阻斷容納部被沿著所述存儲(chǔ)部長(zhǎng)度方向形成的隔斷部分分割成多個(gè)，且所述阻斷部可以安裝在被分割的各個(gè)容納部阻斷容納部上。

9、在本發(fā)明中，所述阻斷部的組成包括彈性變形材料。

10、在本發(fā)明中，所述主體部包括：主體框架部，配備有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)孔；圓形容納部阻斷容納部，在所述主體框架部形成凹形并與各個(gè)反應(yīng)孔相對(duì)應(yīng)地布置，用于容納所述圓形阻斷部；以及連接流路流路部，用于連接所述容納部阻斷容納部和所述反應(yīng)孔。

11、在本發(fā)明中，所述阻斷部可以由包含能夠產(chǎn)生彈性變形材料在內(nèi)的材質(zhì)構(gòu)成。

12、在本發(fā)明中，所述反應(yīng)孔上可以通過(guò)熱熔方式安裝薄片部。

13、本發(fā)明所述的核酸提取盒，包括：盒蓋部，其配備有配備有盛放dna提取所需溶液的多個(gè)隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；盒本體部，其通過(guò)插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有配備有使從容納部引入的溶液與樣本發(fā)生反應(yīng)或進(jìn)行清洗的反應(yīng)容納部。

14、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

15、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包括彈性材料。

16、本發(fā)明所述核酸提取盒組件，包括：核酸提取盒；pcr板，其從所述核酸提取盒中容納核酸溶液并將其收儲(chǔ)在容納有pcr混合干燥物的反應(yīng)孔中。所述核酸提取盒包括：盒蓋部，其配備有配備有盛放dna提取所需溶液的多個(gè)隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；盒本體部，其通過(guò)插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有配備有使從所述容納部引入的溶液與樣本發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行清洗的反應(yīng)容納部。所述pcr板包括：主體部，其配備有配備有一個(gè)以上反應(yīng)孔；插入部，從主體部延伸，插入到核酸提取盒中，配備有配備有注入所述核酸溶液的注入口；流路流路部，可以使所述核酸溶液從所述注入口流動(dòng)到所述反應(yīng)孔；阻斷部，安裝于所述主體部，阻隔所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

17、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

18、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包括彈性材料。

19、本發(fā)明所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置，包括：核酸提取盒；pcr板，其從所述核酸提取盒容納核酸溶液并將其收儲(chǔ)在容納有pcr混合干燥物的反應(yīng)孔中。所述核酸提取盒包括：盒蓋部，其配備有盛放dna提取所需溶液的多個(gè)隔斷結(jié)構(gòu)的容納部；以及盒主體部，以插入結(jié)構(gòu)與所述盒蓋部結(jié)合，配備有用于與樣本發(fā)生反應(yīng)或清潔從容納部引入的溶液的反應(yīng)容納部，所述pcr板包括主體部，其配備有至少一個(gè)反應(yīng)孔；插入部，從主體部延伸，插入到核酸提取盒中，配備有注入核酸溶液的注入口；流路流路部，可以使所述核酸溶液從所述注入口流動(dòng)到所述反應(yīng)孔；以及阻斷部，安裝于所述主體部，阻隔所述核酸溶液從所述反應(yīng)孔向所述流路流路部逆流。

20、在本發(fā)明中，所述盒蓋部包括橡膠部分，該橡膠部分與所述盒主體部的容納部一側(cè)接觸，其組成包括彈性變形材料。

21、在本發(fā)明中，所述核酸提取盒上可以安裝防止所述核酸溶液泄漏的防漏橡膠，其組成包含括彈性材料。

22、【發(fā)明效果】

23、根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)從生物樣本中提取核酸、進(jìn)行pcr反應(yīng)并掃描各種波段的激發(fā)光和相應(yīng)的熒光，實(shí)時(shí)自動(dòng)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，并且一次操作就可完成多項(xiàng)檢測(cè)，使用簡(jiǎn)便，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得準(zhǔn)確結(jié)果。

24、此外，可以防止pcr混合干燥物在pcr板上通過(guò)反應(yīng)孔逆流，從而防止pcr混合干燥物被混合到相鄰的反應(yīng)孔中而產(chǎn)生污染。

25、此外，根據(jù)本發(fā)明，可以將pcr過(guò)程所需的溫度調(diào)節(jié)過(guò)程中與熱變性步驟結(jié)合的過(guò)程中所要求的準(zhǔn)確溫度一次性快速、實(shí)時(shí)地施加到反應(yīng)目標(biāo)上，確保能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行pcr，從而最大限度地提高反應(yīng)的可靠性。

26、即，如果采用現(xiàn)有的移動(dòng)反應(yīng)液提高溫度的溫度控制方式，由于無(wú)法均勻地提高溫度，所以不利于pcr反應(yīng)。并且，通過(guò)移動(dòng)反應(yīng)液依次提高溫度的方式，不能使整個(gè)反應(yīng)物的溫度實(shí)現(xiàn)均勻化，因而很容易發(fā)生其他反應(yīng)。本發(fā)明可以解決上述問(wèn)題，通過(guò)使加熱塊上設(shè)定的溫度范圍保持在恒溫狀態(tài)，直接對(duì)整個(gè)反應(yīng)液進(jìn)行加壓以提高溫度，可以非常有效地提高pcr反應(yīng)所需的溫度。

27、此外，為了在使溫度從高溫向低溫變化的過(guò)程中最大限度地減少時(shí)間延遲，將塊狀加熱塊結(jié)構(gòu)并排間隔配置。為pcr板加壓時(shí)，通過(guò)改變加熱塊的位置，使具有不同溫度的加熱塊進(jìn)行實(shí)時(shí)加壓，從而可以顯著解決溫度變化過(guò)程中所需的時(shí)間延遲引起的問(wèn)題。

28、此外，pcr板以插入到核酸提取盒中的插入式結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，所以核酸提取盒可以通用，各種檢測(cè)試劑盒中使用的pcr板存儲(chǔ)在較小的空間內(nèi)，檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)需要插入合適的pcr板進(jìn)行使用。pcr板內(nèi)配備有的一個(gè)反應(yīng)孔最多可分析6個(gè)熒光值，并且可根據(jù)需要，將pcr板的反應(yīng)孔增加到8個(gè)，因此，可以擴(kuò)增并檢測(cè)與癥狀相關(guān)的患者生物樣本中可能包含的所有病原菌，提供基于癥狀的多重分子診斷檢測(cè)。

29、此外，根據(jù)本發(fā)明，恒溫板被分成具有第一溫度和第二溫度梯度的區(qū)域。當(dāng)通過(guò)驅(qū)動(dòng)模塊對(duì)加熱塊加壓時(shí)，相應(yīng)地移動(dòng)具有與加熱塊溫度相對(duì)應(yīng)的設(shè)置溫度(第一溫度或第二溫度)的區(qū)域，同時(shí)對(duì)pcr板的上下表面進(jìn)行接觸加壓，因此，與保持單一溫度的恒溫板方式相比，可以實(shí)現(xiàn)雙倍的效率。

30、此外，本發(fā)明采用移動(dòng)式恒溫板結(jié)構(gòu)，通過(guò)滑動(dòng)帶進(jìn)行驅(qū)動(dòng)操作，可以確保產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和移動(dòng)的可靠性。并且，將目標(biāo)內(nèi)板的加熱時(shí)間采用上下面同步的方式，可以縮短檢測(cè)時(shí)間。