本發(fā)明涉及微流控芯片(micro-fluidicchip)及醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。特別是涉及一種基于泵閥控制的乙肝快檢微流控芯片及分析方法。

背景技術(shù)：

乙肝是全球性疾病，全世界目前大約有3億乙型肝炎病毒(hbv)攜帶者，我國(guó)更是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，擁有0.93億乙型肝炎攜帶者，其中乙肝患者大約有3000萬(wàn)。hbv標(biāo)志物檢測(cè)是臨床診斷乙肝感染的重要依據(jù)，在臨床上乙肝檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)的血液檢測(cè)方法，最常用的為酶聯(lián)免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay簡(jiǎn)寫(xiě)elisa)，即基于抗原-抗體特異性結(jié)合的一種分析方法，具有極高靈敏度和特異性，但常規(guī)免疫分析孵化時(shí)間較長(zhǎng)，儀器成本高，操作程序復(fù)雜，樣品消耗量大，并且往往需要配備實(shí)驗(yàn)室水平的操作環(huán)境和專業(yè)的技術(shù)操作人員，無(wú)法快速實(shí)時(shí)檢測(cè)，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)的要求，上述缺點(diǎn)則嚴(yán)重阻礙了乙肝病毒即時(shí)、快速檢測(cè)的應(yīng)用及推廣。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、便攜、成本低廉的血液檢測(cè)裝置具有重大的意義。

與傳統(tǒng)微孔板免疫分析相比，微流控芯片免疫分析具有以下優(yōu)勢(shì)：①操作簡(jiǎn)便，儀器微型化；②免疫反應(yīng)在微通道中進(jìn)行，比表面積大，擴(kuò)散距離顯著縮短，加快了抗原抗體反應(yīng)，縮短了反應(yīng)時(shí)間；③體積小，節(jié)約試劑和樣本；④可多樣本、多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)。因此，微泵閥式流控芯片免疫分析在血液安全分析檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用有著廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種快速、便攜、自動(dòng)、高集成度的基于泵閥驅(qū)動(dòng)的微流控芯片裝置，并實(shí)現(xiàn)采用elisa方法，對(duì)乙肝的檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種基于泵閥控制的乙肝快檢微流控芯片，所述微流控芯片上設(shè)有反應(yīng)池、廢液池、微流道、進(jìn)樣孔、排氣孔以及連接注射裝置的試劑入口，微流控芯片由底片、基片和蓋片組成。其中：微流控芯片的反應(yīng)池通過(guò)微流道與四個(gè)試劑入口連通，試劑入口分部在反應(yīng)池的四周，反應(yīng)池通過(guò)微流道與廢液池連接，連接洗滌液試劑瓶的微流道位于基片的下方。連接酶標(biāo)液試劑瓶、底物液瓶以及終止液瓶的微流道位于基片的上方。

四個(gè)試劑入口與外部的泵閥裝置進(jìn)行連接。分別連接對(duì)應(yīng)的試劑瓶：酶標(biāo)試劑瓶，洗滌液試劑瓶，ab底物液試劑瓶以及終止液試劑瓶，使對(duì)應(yīng)的試劑進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行反應(yīng)。

在較佳的實(shí)施例中，蓋片和底片采用ps材料，基片材料可以是石英、玻璃、pdms、pmma或pc等高分子聚合物材料。蓋片厚度為2mm，底片厚度為1mm，基片厚度為4mm。

在較佳的實(shí)施例中，反應(yīng)池的體積為150cm³。

在較佳的實(shí)施例中，微流道的寬度為400μm。

在較佳的實(shí)施例中，連接洗滌液試劑瓶的試劑入口2，位于反應(yīng)池的左方，進(jìn)樣孔位于反應(yīng)池的右上方，排氣孔位于廢液池的中央。

在較佳的實(shí)施例中，連接洗滌液試劑瓶的微流道位于基片的下方。連接酶標(biāo)液試劑瓶、底物液瓶以及終止液瓶的微流道位于基片的上方。

一種基于泵閥控制的乙肝快檢微流控芯片及分析方法，實(shí)施乙肝檢測(cè)包括如下步驟：

1)制作前述乙肝快速檢測(cè)的微流控芯片的底片、基片和蓋片，在底片包被區(qū)域?qū)贵w進(jìn)行包被，37℃溫育2～3小時(shí)。然后芯片三層進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)鍵合；

2)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使洗滌液進(jìn)入試劑入口2，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口2，是反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干。

3)通過(guò)進(jìn)樣孔，注入血清，血清進(jìn)入反應(yīng)池后，并行進(jìn)樣孔的密封，充分孵化10分鐘；

4)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使空氣進(jìn)入試劑入口2，使反應(yīng)池中的血清流入廢液池；

5)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使洗滌液進(jìn)入試劑入口2，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口2，是反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干；

6)通過(guò)外接的泵閥裝置，使酶標(biāo)液進(jìn)入試劑入口1，酶標(biāo)液進(jìn)入反應(yīng)池后，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)；

7)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使空氣進(jìn)入試劑入口2，使反應(yīng)池中的酶標(biāo)液流入廢液池；

8)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使洗滌液進(jìn)入試劑入口1，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口1，使反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干；重復(fù)此步驟5次；

9)通過(guò)外接的泵閥裝置，使ab底物液進(jìn)入試劑入口3，并進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行顯色反應(yīng)；

10)通過(guò)外接的泵閥裝置，使終止液進(jìn)入試劑入口4，并進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行終止反應(yīng)，肉眼可見(jiàn)初步檢測(cè)結(jié)果；

11)用酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)池中的試劑進(jìn)行吸光度檢測(cè)，得出最終結(jié)果。

在較佳的實(shí)施例中，具體的步驟如下：

1)制作前述乙肝快速檢測(cè)的微流控芯片的底片、基片和蓋片，在底片包被區(qū)域?qū)贵w進(jìn)行包被，37℃溫育2～3小時(shí)。然后芯片三層進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)鍵合；

2)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使160ml洗滌液進(jìn)入試劑入口2，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口2，是反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干。

3)通過(guò)進(jìn)樣孔，注入40ml血清，血清進(jìn)入反應(yīng)池后，并行進(jìn)樣孔的密封，充分孵化10分鐘；

4)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使空氣進(jìn)入試劑入口2，使反應(yīng)池中的血清流入廢液池；

5)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使160ml洗滌液進(jìn)入試劑入口2，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口2，是反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干；

6)通過(guò)外接的泵閥裝置，使40ml酶標(biāo)液進(jìn)入試劑入口1，酶標(biāo)液進(jìn)入反應(yīng)池后，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，37℃溫育；

7)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使空氣進(jìn)入試劑入口2，使反應(yīng)池中的酶標(biāo)液流入廢液池；

8)啟動(dòng)外接的泵閥裝置，使160ml洗滌液進(jìn)入試劑入口2，沖洗反應(yīng)池，再次啟動(dòng)泵閥裝置使空氣進(jìn)入試劑入口2，使反應(yīng)池中的洗滌液進(jìn)入廢液池，并對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行吹干；重復(fù)此步驟5次；

9)通過(guò)外接的泵閥裝置，使120mlab底物液進(jìn)入試劑入口3，并進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行顯色反應(yīng)；

10)通過(guò)外接的泵閥裝置，使40ml終止液進(jìn)入試劑入口4，并進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行終止反應(yīng)，肉眼可見(jiàn)初步檢測(cè)結(jié)果；

11)用酶標(biāo)儀對(duì)反應(yīng)池中的試劑進(jìn)行吸光度檢測(cè)，得出最終結(jié)果。

與現(xiàn)有方法和裝置相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1)本發(fā)明采用微型泵閥裝置作為驅(qū)動(dòng)力，可以準(zhǔn)確的控制液體的量，其芯片及其設(shè)計(jì)裝置較為簡(jiǎn)單，操作更為方便。并且能大大的提高洗滌過(guò)程的成功性，使elisa實(shí)驗(yàn)的最終檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

2)本發(fā)明的elisa反應(yīng)過(guò)程主要反應(yīng)在反應(yīng)池的下層，比較容易實(shí)現(xiàn)包被。

3)本發(fā)明所述的微流控芯片及其分析方法具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、試樣消耗量小、檢測(cè)成本低、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。

4)本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，除了要手動(dòng)加入樣品和密封進(jìn)樣孔外，其余只需要泵閥裝置自動(dòng)進(jìn)行即可，可以檢測(cè)乙肝的一次性實(shí)時(shí)、便攜檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1和圖2是根據(jù)本發(fā)明所述的用于血液乙肝快速檢測(cè)的泵閥式微流控芯片單元結(jié)構(gòu)圖

圖1為示出芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)的平面圖。

其中，1、2、3和4為試劑入口，分別通過(guò)軟管連接泵閥結(jié)構(gòu)的酶標(biāo)液瓶、洗滌液瓶、ab底物液瓶以及終止液瓶。5為進(jìn)樣孔。1'、2'、3'、4'、5'和6為微流道，7為反應(yīng)池，8為廢液池。1'、3'、4'、5'和6微流道位于基片的上方，2'微流道位于基片的下方。

圖2為示出芯片三層結(jié)構(gòu)的立體圖。

其中底片c的陰影部分為抗原或抗體包被區(qū)。

圖3為本發(fā)明所述外接泵閥裝置的進(jìn)樣過(guò)程示意圖。

其中，a是加入血液樣品，b是進(jìn)行洗滌并吹干，c是加入酶標(biāo)液，d是進(jìn)行洗滌并吹干，e是加入底物液，f是加入終止液。

圖4為示出本微流控芯片的整體結(jié)構(gòu)圖。

圖5為示出運(yùn)用本發(fā)明微流控芯片所進(jìn)行的乙肝抗原標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

參見(jiàn)圖1至圖3，本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)如下：

主體為長(zhǎng)方體。其中微流控模塊為三層結(jié)構(gòu)，包括一蓋片a、基片b以及底片c，三層之間通過(guò)膠封實(shí)現(xiàn)對(duì)準(zhǔn)鍵合。

通道結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1，微流控芯片的模塊包括：反應(yīng)池7，廢液池8，四個(gè)試劑入口，進(jìn)樣孔5和微流道。

其中：試劑入口1、2、3及4，分別通過(guò)軟管連接泵閥結(jié)構(gòu)的酶標(biāo)液瓶、洗滌液瓶、ab底物液瓶以及終止液瓶。每個(gè)微流道都設(shè)有微型的緩沖區(qū)，微流道的寬度為0.4mm，1'、3'、4'、5'和6微流道位于基片的上方，2'微流道位于基片的下方。廢液池上方設(shè)有通氣孔。

蓋片和底片采用ps材料，基片材料可以是石英、玻璃，也可以是pdms、pmma或pc等高分子聚合物材料。芯片的厚度為7mm。微流控通道單元可通過(guò)現(xiàn)有成型微芯片加工技術(shù)而成。

芯片要提前包被，即在圖2所示的底片c的陰影區(qū)進(jìn)行包被，37℃溫育2小時(shí)。之后進(jìn)行芯片的對(duì)準(zhǔn)鍵合。

反應(yīng)池的體積為150ul，保證反應(yīng)液可以在反應(yīng)池充分反應(yīng)。廢液池的體積遠(yuǎn)大于反應(yīng)池，容量為1200ul以上。

實(shí)施例2

設(shè)計(jì)并制作用于血液乙肝快速檢測(cè)的泵閥式微流控芯片，為了進(jìn)行包被以及透明度，蓋片和底片采用ps材料，對(duì)基片材料沒(méi)有特殊要求，則基片材料可以是石英、玻璃、pdms、pmma或pc等高分子聚合物材料。用激光打標(biāo)機(jī)加工通道結(jié)構(gòu)，最后進(jìn)行對(duì)準(zhǔn)校核。

對(duì)底片包被區(qū)域進(jìn)行包被，37℃溫育2小時(shí)，之后進(jìn)行芯片的對(duì)準(zhǔn)鍵合。用微量注射器向進(jìn)液口注入40ul的1:5000乙肝抗原標(biāo)準(zhǔn)品，密封芯片進(jìn)樣口。液體進(jìn)入反應(yīng)池，孵化10分鐘。通過(guò)泵閥裝置，試劑入口2注入空氣進(jìn)行將乙肝抗原樣品推進(jìn)廢液池，之后試劑入口2注入洗滌液，沖洗通道以及反應(yīng)池，然后試劑入口2注入空氣，洗滌液流進(jìn)廢液池。試劑入口1注入酶標(biāo)液，酶標(biāo)液進(jìn)入反應(yīng)池反應(yīng)。反應(yīng)5分鐘之后，試劑入口2注入空氣，將酶標(biāo)液推進(jìn)廢液池。并重復(fù)下面過(guò)程5次，通過(guò)泵閥裝置，試劑入口2注入洗滌液，沖洗通道以及反應(yīng)池，之后向試劑入口2注入空氣，洗滌液流進(jìn)廢液池。試劑入口3注入ab底物液，進(jìn)入反應(yīng)池進(jìn)行反應(yīng)顯色；最終試劑入口4注入終止液，進(jìn)行終止反應(yīng)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程所需的時(shí)間大約為45分鐘，所得結(jié)果如圖5所示。