本發(fā)明涉及二乙氨乙基化葡聚糖修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用，在提高蛋白質(zhì)吸附容量和傳質(zhì)速率中有明顯提高，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的蛋白質(zhì)色譜分離技術(shù)。

背景技術(shù)：
二乙氨乙基化葡聚糖(DEAEDextran)是葡聚糖上修飾有二乙氨乙基(DEAE)的一種長鏈陽離子聚電解質(zhì)。DEAEDextran帶正電荷，可以可逆性吸附帶負電荷的物質(zhì)。DEAEDextran具有較好的生物相容性，多應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染和蛋白的持續(xù)緩釋傳遞。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)DEAEDextran也可以應(yīng)用于生物傳感器中的細胞固定化。DEAEDextran分子量較大，具有較多的羥基，容易通過間隔臂與色譜基質(zhì)偶聯(lián)而獲得DEAEDextran接枝的色譜介質(zhì)。葡聚糖與蛋白質(zhì)之間基本沒有非特異性相互作用，并且在堿性溶液中具有很高的穩(wěn)定性。葡聚糖鏈具有較高的柔韌性和靈活性，其吸附位點和蛋白質(zhì)的結(jié)合也更加靈活。此外，DEAEDextran帶正電荷，不需要進行配基偶聯(lián)反應(yīng)，可以簡化接枝色譜介質(zhì)合成工藝。因此，DEAEDextran十分適用于色譜基質(zhì)的接枝修飾。然而，目前DEAEDextran多應(yīng)用于基因的轉(zhuǎn)染，鮮少有研究涉及在以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)上接枝DEAEDextran以改變蛋白質(zhì)在離子交換劑上的吸附容量和吸附速率。并且，在接枝型色譜介質(zhì)中，利用葡聚糖作為接枝鏈修飾色譜基質(zhì)的研究大多采用小分子量且不帶電荷的葡聚糖作為接枝鏈。采用這種小分子中性葡聚糖作為接枝鏈，通常是先將中性葡聚糖接枝到色譜基質(zhì)的表面，然后通過配基功能化，使葡聚糖接枝鏈與色譜基質(zhì)表面同時偶聯(lián)上離子交換配基，最終得到接枝型離子交換介質(zhì)。一方面，合成工藝較為復(fù)雜；另一方面，中性小分子量葡聚糖修飾的離子交換色譜介質(zhì)，雖然在一定程度上能夠提升蛋白的吸附容量和傳質(zhì)速率，但是提升程度非常有限。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，進而提供一種提高蛋白質(zhì)吸附性能的DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)。DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)同時具有高吸附容量和高傳質(zhì)速率的優(yōu)點。本發(fā)明即為將荷電DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的快速高效吸附中，DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)具有高吸附容量和高傳質(zhì)速率的優(yōu)點，相較于傳統(tǒng)非接枝型色譜介質(zhì)及小分子中性葡聚糖修飾的離子交換色譜介質(zhì)，能夠大幅度的提升吸附容量和傳質(zhì)速率，合成工藝簡單，成本低廉，生物相容性好，安全低毒。因此，DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)非常適用于蛋白質(zhì)的快速高效吸附中。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：一種用于提高蛋白質(zhì)吸附容量和傳質(zhì)速率的DEAEDextran修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)的制備方法，為在以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的顆粒表面通過引進環(huán)氧基間隔臂進而修飾DEAEDextran。制備DEAEDextran修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)的DEAEDextran(Mw300-500kDa)的結(jié)構(gòu)單元如下(不代表真實的配基比例與分布)：上述DEAEDextran修飾的以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)包括直接在瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran得到的介質(zhì)以及在偶聯(lián)DEAE的瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran得到的介質(zhì)。直接在瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran的介質(zhì)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)示意如下(不代表真實的配基比例與分布)：在偶聯(lián)DEAE的瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran的介質(zhì)結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)示意如下(不代表真實的配基比例與分布)：本發(fā)明DEAEDextran修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)中，直接在瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的介質(zhì)制備方法如下：利用環(huán)氧氯丙烷活化法在瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的顆粒表面引進環(huán)氧基間隔臂，然后在平均環(huán)氧基密度大于40mmol/L的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中加入等體積的DEAEDextran溶液，使DEAEDextran充分擴散到介質(zhì)孔道內(nèi)；然后向介質(zhì)懸浮液中加入氫氧化鈉溶液，置于恒溫水浴搖床中反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗至中性后，用硼氫化鈉溶液還原瓊脂糖凝膠介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基，還原后的瓊脂糖凝膠介質(zhì)再次用去離子水反復(fù)沖洗，得到結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的瓊脂糖表面修飾DEAEDextran介質(zhì)。所述的DEAEDextran溶液濃度為200-600mg/mL；置于20-35℃的恒溫水浴搖床中，120-200rpm攪拌混合1-12h，使DEAEDextran充分擴散到介質(zhì)孔道內(nèi)。所述的氫氧化鈉溶液濃度為0.1-2mol/L的，氫氧化鈉溶液體積用量為活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)體積量的0.1-2倍，置于20-35℃恒溫水浴搖床中，120-200rpm下反應(yīng)12-60h。所述的硼氫化鈉溶液濃度為0.3g/L-1g/L。本發(fā)明中二乙氨乙基化葡聚糖修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)的色譜介質(zhì)的制備方法，只是將瓊脂糖凝膠先處理，方法為：在瓊脂糖凝膠表面偶聯(lián)二乙氨乙基(DEAE)，利用環(huán)氧氯丙烷活化法在以表面偶聯(lián)DEAE的瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的顆粒表面引進環(huán)氧基間隔臂；然后與在瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的介質(zhì)制備方法相同，得到結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)的在瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的表面修飾DEAEDextran介質(zhì)。偶聯(lián)DEAE的瓊脂糖凝膠介質(zhì)的DEAE密度為30-103mmol/L。本發(fā)明的二乙氨乙基化葡聚糖修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)應(yīng)用于蛋白質(zhì)高效分離純化中，提升蛋白質(zhì)的吸附容量和吸附速率。本發(fā)明首先是接枝用DEAEDextran分子量的選擇，分子量較高的DEAEDextran有利于獲得吸附性能較好的接枝介質(zhì)；其次，DEAEDextran水溶液濃度的控制，高濃度的DEAEDextran水溶液有利于獲得高接枝密度的DEAEDextran修飾介質(zhì)；再次，偶聯(lián)DEAEDextan前擴散時間的確定，合適的擴散時間有利于DEAEDextran大分子充分進入介質(zhì)孔道，進而有助于偶聯(lián)反應(yīng)。最后，偶聯(lián)DEAEDextran的反應(yīng)時間和氫氧化鈉濃度、體積的確定，充足的偶聯(lián)時間及偶聯(lián)時合適的氫氧化鈉濃度與體積有助于獲得高接枝密度的DEAEDextran修飾介質(zhì)。經(jīng)實驗證明，DEAEDextran修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)在不同的修飾密度時對蛋白質(zhì)均具有很強的吸附特性，表現(xiàn)出了很高的吸附容量和吸附速率，提高了分離效率。介質(zhì)清洗、除菌方便，易于再生，生物相容性好，制備方法簡單、低毒，在蛋白質(zhì)高效快速分離純化中將有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1：牛血清白蛋白的吸附等溫線；圖2：牛血清白蛋白溶液濃度隨時間的變化曲線。具體實施方式下面的實例將對本發(fā)明提供的方法予以進一步的說明。本發(fā)明DEAEDextran修飾以瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的色譜介質(zhì)中，直接在瓊脂糖凝膠表面修飾DEAEDextran結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的介質(zhì)制備方法如下：利用環(huán)氧氯丙烷活化法在瓊脂糖凝膠表面引進環(huán)氧基間隔臂，然后在平均環(huán)氧基密度大于40mmol/L的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中加入等體積的DEAEDextran溶液，DEAEDextran溶液濃度為200-600mg/mL；置于20-35℃的恒溫水浴搖床中，120-200rpm攪拌混合1-12h，使DEAEDextran充分擴散到介質(zhì)孔道內(nèi)；然后向介質(zhì)懸浮液中加入濃度為0.1-2mol/L的氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉溶液體積用量為活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)體積量的0.1-2倍，置于20-35℃恒溫水浴搖床中，120-200rpm下反應(yīng)12-60h；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗至中性后，用0.3g/L-1g/L的硼氫化鈉溶液還原瓊脂糖凝膠介質(zhì)表面殘留的環(huán)氧基，還原后的瓊脂糖凝膠介質(zhì)再次用去離子水反復(fù)沖洗，得到結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的瓊脂糖表面修飾DEAEDextran介質(zhì)。其中，利用環(huán)氧氯丙烷活化法在瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)的顆粒表面引進環(huán)氧基間隔臂進而得到...