一種核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法
【專利摘要】一種核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法。其步驟如下：首先以四甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷為前驅(qū)體，然后將巰基修飾的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽注入已預(yù)處理的毛細(xì)管中，通過巰基-烯的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，在溫和的條件下制備得到親和毛細(xì)管整體柱。本方法與傳統(tǒng)的非共價(jià)鍵結(jié)合親和配體方法相比，具有成本低、制備簡(jiǎn)單、親和配體固定化穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明所提供的核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱作為一種色譜固定相，可實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的分離、富集和純化。
【專利說明】一種核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法
[0001]【【技術(shù)領(lǐng)域】】:本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備，具體的說，是涉及一種對(duì)凝血酶具有特異性識(shí)別的親和毛細(xì)管整體柱的制備。
[0002]【【背景技術(shù)】】:整體柱(monolithiccolumn)具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的特性,使其作為一種新型的色譜固定相受到了越來越多的關(guān)注。整體柱可分為有機(jī)聚合物整體柱、硅膠整體柱和有機(jī)-硅膠雜化整體柱。前兩者在具有一系列優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也存在著不可避免的缺點(diǎn)，而有機(jī)-娃膠雜化整體柱(Organic-siIicaHybridMonolithic Column)結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)如制備簡(jiǎn)單、易于改性、機(jī)械強(qiáng)度高、適用的PH范圍寬以及耐溶劑性能好，已經(jīng)得到了越來越廣泛的應(yīng)用。
[0003]親和色譜是利用修飾在色譜固定相上具有特異性識(shí)別功能的配體，與被分析物存在高效且專一的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)樣品分離的過程。它具有較高選擇性，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于對(duì)復(fù)雜樣品的分離富集和定量分析中。樣品中待分析物的保留時(shí)間由待分析物與親和配體間的親和力大小決定。當(dāng)它們間的親和力較弱時(shí)，可以不改變流動(dòng)相就能將待分析物洗脫下來；而當(dāng)它們間的親和力很強(qiáng)時(shí)，則需改變流動(dòng)相的組成才得以將選擇性吸附的待分析物洗脫。核酸適配體親和色譜(Aptamer Affinity Chromatography)作為一種新型的色譜分離模式已經(jīng)得到了研究者的關(guān)注，成功應(yīng)用到分離小分子化合物、蛋白質(zhì)和細(xì)胞中。Zhao等人將基于細(xì)胞色素C的核酸適配體通過非共價(jià)鍵結(jié)合在了有機(jī)聚合物整體柱基質(zhì)上實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞色素C和凝血酶的分離與檢測(cè)(Zhao Q，Li X F，Le X C.Aptamer ModifiedMonolithic Capillary Chromatography for Protein Separat1n and Detect1nAnal.Chem.2008,80:3915-3920)。
[0004]點(diǎn)擊化學(xué)是一類具有高選擇性的反應(yīng),其擁有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，譬如起始反應(yīng)物易得、產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、對(duì)氧和水不敏感、且能得到單一的產(chǎn)物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)如一價(jià)銅催化的疊氮和炔的反應(yīng)、D-A環(huán)加成反應(yīng)和一系列基于硫醇的點(diǎn)擊反應(yīng)如硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-異氰酸鹽、硫醇-溴的反應(yīng)。這些反應(yīng)中，一價(jià)銅催化的疊氮和炔反應(yīng)的應(yīng)用最為廣泛，但因其重金屬催化劑的引入會(huì)污染反應(yīng)基質(zhì)且降低生物相容性，所以硫醇-烯加成反應(yīng)(Th1l-ene Chemistry)作為其替代受到了越來越多科研工作者的青睞。如Wang等人通過硫醇-烯的加成反應(yīng)制備了 C18修飾的有機(jī)-娃膠雜化整體柱,成功分離了苯及芳香化合物(Wang K Y, Chen Y Z, Yang H H, et al.Modificat1n of VTMS hybridmonolith via th1l-ene click chemistry for capillary electrochromatography.Talanta，2012，91:52-59)。Chen等人運(yùn)用硫醇-烯的點(diǎn)擊反應(yīng)制備了基于胰島素的酶反應(yīng)器(Chen Y Z, Wu M H，Wang K Y，et al.Vmyl funct1nalized silica hybridmonolith-based trypsin microreactor for on line digest1n and separat1nviath1l_ene“click，，strategy.JChromatogr A, 2011,1218:7982-7988)。這種快速合成化合物的新方法，已經(jīng)成功應(yīng)用到了新材料的合成和材料的后修飾過程中。目前，還沒有通過點(diǎn)擊化學(xué)的方式高效固定核酸適配體制備整體柱的相關(guān)報(bào)道。
[0005]【
【發(fā)明內(nèi)容】
】:本發(fā)明的目的是拓展目前的核酸適配體的固定方法。傳統(tǒng)的固定方法是通過生物素與鏈霉親和素之間很強(qiáng)的特異性相互作用將核酸適配體通過非共價(jià)鍵的形式固定在整體柱基質(zhì)上，而本方法應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將核酸適配體通過共價(jià)鍵結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了低成本、高效率、高穩(wěn)定性的固定方法。得到的核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱可實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的分離、富集和純化。
[0006]本發(fā)明提供的核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，包括以下步驟:
[0007]第一、將四甲氧基硅烷和3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷尿素，聚乙二醇和乙酸混合，在0°C冰浴下攪拌4小時(shí)形成均一的預(yù)聚液；
[0008]第二、將上步形成的預(yù)聚液超聲脫氣，通氮?dú)獬?，注入已預(yù)處理的毛細(xì)管中，柱兩端用橡膠頭密封后放入45°C烘箱內(nèi)熱引發(fā)聚合反應(yīng)，沖洗除去致孔劑和未反應(yīng)物；
[0009]第三、取巰基修飾的核酸適配體(30yM，50ytL)，90°C加熱3分鐘以重新塑形，冷卻至室溫后加入3-巰基-1-丙烷磺酸鹽和2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽并超聲混合均勻，注入得到的毛細(xì)管整體柱中，保持25°C，5小時(shí)；
[0010]第四、沖洗除去未鍵合的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽，得到毛細(xì)管整體柱；
[0011]其中，
[0012]第一步所述的硅烷化試劑為四甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅燒；催化劑為乙酸；致孔劑為尿素和聚乙二醇；作用時(shí)間為4小時(shí)；
[0013]第二步所述的超聲脫氣時(shí)間為1min ;通氮除氧時(shí)間為1min ;作用時(shí)間為12小時(shí)；
[0014]第三步所述的功能單體為巰基修飾的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽；引發(fā)劑為2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽；所述的熱引發(fā)條件為25°C室溫反應(yīng)5小時(shí)。
[0015]所述的硅烷化試劑間的體積比為2: 1、3: 1、4:1或5:1 ;溫度為43°C、45°C或47°C ;聚乙二醇和尿素的質(zhì)量比分別為5: 6、5: 7、1: I或6: 7。
[0016]致孔劑總用量為0.3g，引發(fā)劑用量為0.05mg。
[0017]第二步中所述的石英毛細(xì)管柱，總長(zhǎng)為35cm，檢測(cè)窗口到整體柱末端的長(zhǎng)度為8.5cm，有效長(zhǎng)度為27cm。
[0018]第二步所述的清洗液分別為水和甲醇；第四步所述的清洗液為Tris-HCl緩沖液(50mM, ρΗ7.4)。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0020]本發(fā)明制備的共價(jià)鍵固定核酸適配體的親和整體柱與傳統(tǒng)非共價(jià)鍵固定核酸適配體的親和整體柱相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn):
[0021]1、制備過程簡(jiǎn)單易操作，成本低；
[0022]2、反應(yīng)產(chǎn)率高，條件溫和，無副產(chǎn)物；
[0023]3、親和配體固定化穩(wěn)定性高。
[0024]從應(yīng)用價(jià)值考慮，本發(fā)明所提供的核酸適配體的親和毛細(xì)管整體柱作為一種色譜固定相，可實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶高選擇性的分離、富集和純化。而且通過更換不同的核酸適配體，可以擴(kuò)展親和整體柱的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定生物蛋白質(zhì)的分離分析?！尽緦＠綀D】

【附圖說明】】:
[0025]圖1-2為不同硅烷化試劑的比例、不同溫度、不同致孔劑比例下的親和雜化整體柱的光學(xué)顯微鏡圖。圖3為核酸適配體親和整體柱以及雙鍵基質(zhì)整體柱的紅外光譜圖。
【【具體實(shí)施方式】】:
[0026]實(shí)例1.
[0027]首先將硅烷化試劑:四甲氧基硅烷0.45mL和3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷0.15mL(體積比3: I)，致孔劑:聚乙二醇(0.125g)和尿素(0.175g)，乙酸混合，在(TC冰浴下攪拌4小時(shí)形成均一的預(yù)聚液,超聲脫氣1min及通氮?dú)獬?min后將其注入已預(yù)處理的毛細(xì)管中，柱兩端用橡膠頭密封后放入45°C烘箱內(nèi)反應(yīng)12小時(shí)。然后沖洗掉致孔劑和未反應(yīng)物。取巰基修飾的核酸適配體(30μΜ，50μυ，90?加熱3分鐘以重新塑形，冷卻至室溫后加入3-巰基-1-丙烷磺酸鹽(50mM，50yL)和引發(fā)劑2，2 ^ -偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽并超聲混合均勻，用注射泵以20yL/h的速度注入得到的毛細(xì)管整體柱中，保持25°C，5小時(shí)。最后沖洗掉未鍵合的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽，得到親和毛細(xì)管整體柱I。
[0028]實(shí)例2.
[0029]四甲氧基硅烷0.4mL和3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷0.2mL(體積比2: I)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱2。
[0030]實(shí)例3.
[0031]四甲氧基硅烷0.48mL和3_(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷0.12mL(體積比
4: I)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱3。
[0032]實(shí)例4.
[0033]四甲氧基硅烷0.5mL和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷0.1mL (體積比
5: I)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱4。
[0034]實(shí)例5.
[0035]聚合反應(yīng)溫度為43°C，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱5。
[0036]實(shí)例6.
[0037]聚合反應(yīng)溫度為47°C，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱6。
[0038]實(shí)例7.
[0039]加入致孔劑:聚乙二醇(0.125g)，尿素(0.15g)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱7。
[0040]實(shí)例8.
[0041]加入致孔劑:聚乙二醇(0.15g)，尿素(0.15g)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱8。
[0042]實(shí)例9.
[0043]加入致孔劑:聚乙二醇(0.15g)，尿素(0.175g)，其他同實(shí)例1，可得親和毛細(xì)管整體柱9。
[0044]通過圖1可以看出，45°C下硅烷化試劑的比例為3:1和4:1的比例可以得到飽滿且均一的骨架，且通過圖2可以看出，3: I較4: I更能得到均一飽滿的骨架，且當(dāng)PEG用量為0.125g，Urea用量為0.175g時(shí)得到的整體柱形貌特征以及通透性最好。通過圖3可以看出，修飾核酸適配體的整體柱的C = C的伸縮振動(dòng)峰明顯縮小，說明骨架中的碳碳雙鍵絕大部分都參與了點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。689.92CHT1和652.2Icm^1為C-S鍵的振動(dòng)峰，這些峰都證明了巰基修飾的核酸適配體通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)成功接枝到了雜化整體柱的骨架中。
【權(quán)利要求】
1.一種核酸適配體親和有機(jī)-硅膠雜化毛細(xì)管整體柱的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 第一、將四甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷，尿素，聚乙二醇和乙酸混合，在0°C冰浴下攪拌4小時(shí)形成均一的預(yù)聚液； 第二、將上步形成的預(yù)聚液超聲脫氣，通氮?dú)獬?，注入已預(yù)處理的毛細(xì)管中，柱兩端用橡膠頭密封后放入45°C烘箱內(nèi)熱引發(fā)聚合反應(yīng)，沖洗除去致孔劑和未反應(yīng)物； 第三、取巰基修飾的核酸適配體(30μΜ，50μ L)，90°C加熱3分鐘以重新塑形，冷卻至室溫后加入3-巰基1-丙烷磺酸鹽(50mM，50 μ L)和2，2 ^ -偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽并超聲混合均勻，注入得到的毛細(xì)管整體柱中，保持25°C，5小時(shí)； 第四、沖洗除去未鍵合的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽，得到毛細(xì)管整體柱； 其中， 第一步所述的硅烷化試劑為四甲氧基硅烷和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷；催化劑為乙酸；致孔劑為尿素和聚乙二醇；作用時(shí)間為4小時(shí)； 第二步所述的超聲脫氣時(shí)間為1min ;通氮除氧時(shí)間為1min ;作用時(shí)間為12小時(shí)； 第三步所述的功能單體為巰基修飾的核酸適配體和3-巰基-1-丙烷磺酸鹽；引發(fā)劑為2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽；所述的熱引發(fā)條件為25°C室溫反應(yīng)5小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于硅烷化試劑間的體積比為2: 1、3: 1、4: I或5: I ;溫度為43°C、45°C或47°C;聚乙二醇和尿素的質(zhì)量比分別為5: 6、5: 7、1:1 或 6: 7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于致孔劑總用量為0.3g，引發(fā)劑用量為0.05mgo
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于第二步所述的清洗液分別為水和甲醇；第四步所述的清洗液為Tris-HCl緩沖液(50mM，pH7.4)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于第二步中所述的石英毛細(xì)管柱，總長(zhǎng)為35cm，檢測(cè)窗口到整體柱末端的長(zhǎng)度為8.5cm，有效長(zhǎng)度為27cm。
【文檔編號(hào)】B01J20/281GK104248863SQ201410305228
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】陳朗星, 毛劼, 何錫文, 張玉奎 申請(qǐng)人:南開大學(xué)