一種抗人甲狀旁腺激素的納米抗體及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人甲狀旁腺激素(PTH)的納米抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用定點(diǎn)固載抗原后用于篩選抗體的方法，即在人甲狀旁腺激素基因的碳末端加上一個(gè)半胱氨酸，進(jìn)行原核表達(dá)純化，并通過(guò)該半胱氨酸與馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)固定到ELISA板上，解決了傳統(tǒng)篩選過(guò)程中親水性抗原不易結(jié)合的問(wèn)題，也解決了小分子抗原結(jié)構(gòu)容易改變這一問(wèn)題，更有利于篩選到針對(duì)正確結(jié)構(gòu)的抗體，篩選出的抗體更具競(jìng)爭(zhēng)力。本發(fā)明的納米抗體對(duì)PTH具有很高的特異性親和活性，其親和常數(shù)在109M-1以上，可應(yīng)用于純化蛋白、制備吸附劑材料、制備血液凈化吸附材料、進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)等方面。
【專利說(shuō)明】一種抗人甲狀旁腺激素的納米抗體及其篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種抗人甲狀旁腺激素(PTH)的納米抗體及其應(yīng)用。還涉及利用定點(diǎn)固載的方法包被抗原，從羊駝納米抗體展示庫(kù)中篩選出具有高活性的抗人PTH納米抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)慢性腎臟病(CKD)患者逐年增加，至2014年初，發(fā)病率已增至11.5%左右，已成為影響人們生活質(zhì)量的主要病癥之一。當(dāng)各種腎臟疾病或其他疾病引起的腎臟損傷發(fā)展到晚期就會(huì)進(jìn)入慢性腎衰竭階段，最后發(fā)展為尿毒癥(Ong AC，et al.KidneyInternational, 1994，45:345-351.)。尿毒癥患者由于絕大部分腎實(shí)質(zhì)破壞，腎功能幾乎消失，導(dǎo)致多種代謝廢物難以排泄和某些內(nèi)分泌激素不能降解，在體內(nèi)蓄積進(jìn)而產(chǎn)生毒性，即尿毒癥毒素。這些毒素可進(jìn)一步導(dǎo)致代謝紊亂，多臟器損壞。甲狀旁腺激素(PTH)就是最主要的尿毒癥毒素之一。
[0003]PTH是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的含84個(gè)氨基酸的堿性單鏈多肽類激素，分子量942?a，等電點(diǎn)約為9.1，分子中不含半胱氨酸，親水性氨基酸居多，二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α-螺旋。PTH分子有較強(qiáng)的柔性，在不同溶劑中其結(jié)構(gòu)有很大差別(Strickland LA，et al..Biochemistry, 1993, 32:6050-6057.)。
[0004]在正常人體內(nèi)PTH的含量特別低，主要用于調(diào)節(jié)鈣磷代謝。在腎衰竭患者體內(nèi)，往往伴隨有較高水平的PTH產(chǎn)生，高水平的PTH對(duì)人體多器官有害，是一種毒素。首先表現(xiàn)在損壞腎臟，PTH過(guò)高會(huì)造成 腎臟及其他組織中的鈣降低、磷沉積增加，從而損壞腎單位，直至腎功能消失；同時(shí)表現(xiàn)為對(duì)骨的破壞，PTH增加必然會(huì)促進(jìn)溶骨作用以增加血鈣含量，會(huì)造成腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨痛骨折等；還會(huì)造成腎性貧血和心臟衰竭(Gruson D, et al.ClinicaChimica Acta, 2014，do1: 10.1016/j.cca.2014.03.029.)。據(jù)調(diào)查，維持性血液透析患者中很大一部分伴有繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，嚴(yán)重影響患者的治療和生活質(zhì)量，因此尋找有效治療甲狀旁腺功能亢進(jìn)去除過(guò)多的PTH的方法十分重要。
[0005]降低腎衰竭病人體內(nèi)過(guò)多的PTH可以緩解腎衰病人病情惡化。目前臨床上的治療方法主要包括:藥物治療、血液凈化治療以及手術(shù)治療。藥物治療用于初期或者輔助性治療，而切除甲狀旁腺的手術(shù)治療副作用很大，所以血液凈化治療被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的治療方法。目前研究的血液凈化方式主要包括血液透析、血液灌流等。由于血液中有很多與PTH分子性質(zhì)相似的蛋白，現(xiàn)有的非特異性配基的血液灌流對(duì)PTH去除能力差，還會(huì)存在大量非特異性吸附。因此開(kāi)發(fā)一種新的吸附材料對(duì)推動(dòng)血液凈化方法的發(fā)展十分必要。PTH在血液中含量相對(duì)較低，腎衰竭患者PTH濃度1200±600ng/L，這種吸附材料需要具備較高的親和性。
[0006]有些研究者將抗體技術(shù)引入臨床，其在診斷、治療方面表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。比如利用卵黃抗體吸附PTH，取得了很好的效果，但是由于卵黃抗體分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，只能從卵黃蛋白中提取，得到特異性卵黃抗體的量很低，不利于大規(guī)模應(yīng)用。[0007]1993年，Hamers-casteman等發(fā)現(xiàn)駱騎血清中存在一種天然缺失輕鏈卻具有完整功能的重鏈抗體(Hamers-Casterman C，et al.Nature, 1993, 363(3):446-448.)，說(shuō)明重鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VHH)能夠單獨(dú)形成完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)，克隆該部分便得到了納米抗體。納米抗體分子量低，免疫原性弱，穩(wěn)定性高，親和力高，而且易表達(dá)，基于這些優(yōu)勢(shì)，納米抗體成為去除PTH材料的最佳選擇之一。
[0008]目前獲得納米抗體的方法主要是從噬菌體庫(kù)中進(jìn)行篩選。篩選時(shí)首先包被抗原，封閉未反應(yīng)的位點(diǎn)，然后將噬菌體庫(kù)與抗原進(jìn)行結(jié)合，反復(fù)清洗去除未結(jié)合的噬菌體，最后洗脫結(jié)合的噬菌體，完成后進(jìn)行下一輪篩選，一般需要經(jīng)過(guò)三到四輪的連續(xù)篩選。在該過(guò)程中，抗原的包被是很重要的一環(huán)，傳統(tǒng)的抗原包被方法是利用疏水作用將蛋白吸附到96孔板等基質(zhì)上，是非共價(jià)鍵結(jié)合，但是這種包被方法對(duì)于親水性蛋白或者小分子蛋白并不適用。親水性蛋白疏水位點(diǎn)比較少，而且大都在蛋白的內(nèi)部或者活性部位，如果利用疏水作用其結(jié)合效果并不好，而且有可能破壞蛋白的活性。對(duì)于小分子蛋白，疏水固定會(huì)使小分子蛋白的結(jié)構(gòu)變化比較大，增加活性改變的可能(Reulen S W，et al.BMCBiotechnology, 2009,9:66.)，比如PTH，它會(huì)盡可能暴露出疏水位點(diǎn)以舒展?fàn)顟B(tài)吸附于材料表面，形態(tài)與在血液中的狀態(tài)完全不一樣，這樣篩選到的抗體并不能保證與血液中的PTH有良好的結(jié)合能力。基于以上情況，將定點(diǎn)固載技術(shù)引入抗體的篩選十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的之一是提供一種針對(duì)親水性小分子毒素甲狀旁腺激素(PTH)的高親和性納米抗體。
[0010]一種抗甲狀旁腺激素(PTH)的納米抗體，所述納米抗體包括框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述框架區(qū)由四個(gè)區(qū)域組成，分別為FR1、FR2、FR3、FR4，其中所述FRl的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.15、 19、23、27、30、33、36、41、46、48、51、55 中的一種，所述FR2 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.16、20、24、28、31、34、37、42、43、49、52、56 中的一種，所述FR3 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.17、21、25、29、32、35、38、39、44、47、50、53、57 中的一種，所述 FR4 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.18、22、26、40、45、54、58 中的一種；
[0011]所述互補(bǔ)決定區(qū)由三個(gè)區(qū)域組成，分別為⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中所述⑶Rl的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101 中的一種，所述CDR2 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102 中的一種，所述 CDR3 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103中的一種；
[0012]所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列選自SEQ ID N0.59、60、61中的一種。
[0013]進(jìn)一步地，所述的一種抗甲狀旁腺激素的納米抗體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13 或 SEQ ID N0.14 所示；
[0014]其中:
[0015]SEQ ID N0.1包括由SEQ ID N0.15~18組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.62~64組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；[0016]SEQ ID N0.2包括由SEQ ID N0.19~22組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.65~67組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0017]SEQ ID N0.3包括由SEQ ID N0.23~26組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.68~70組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0018]SEQ ID N0.4 包括由 SEQ ID N0.27 ~29 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.71~73組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0019]SEQ ID N0.5 包括由 SEQ ID N0.30 ~32 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.74~76組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0020]SEQ ID N0.6 包括由 SEQ ID N0.33 ~35 和和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQID N0.77~79組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0021]SEQ ID N0.7 包括由 SEQ ID N0.36 ~38 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.80~82組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0022]SEQ ID N0.8 包括由 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.39 和 SEQ ID N0.40 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.83~85組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0023]SEQ ID N0.9 包括由 SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.86~88組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0024]SEQ ID N0.10 包括由 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.89~91組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0025]SEQ ID N0.11 包括由 SEQ ID N0.46、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.47 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.92~94組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0026]SEQ ID N0.12 包括由 SEQ ID N0.48 ~50 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.95~97組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
[0027]SEQ ID N0.13 包括由 SEQ ID N0.51 ~54 組成的框架區(qū)、由 SEQ ID N0.98 ~100 組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.60所示的鉸鏈區(qū)；
[0028]SEQ ID N0.14 包括由 SEQ ID N0.55 ~58 組成的框架區(qū)、由 SEQ ID N0.101 ~103 組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.61所示的鉸鏈區(qū)。
[0029]本發(fā)明的目的之二是，提供一種上述所述的納米抗體的篩選方法，該方法包括，利用PCR技術(shù)在人甲狀旁腺激素目的基因片段的碳末端引入巰基標(biāo)簽，利用該巰基定點(diǎn)固載抗原進(jìn)行篩選的步驟。
[0030]進(jìn)一步，所述的巰基為半胱氨酸攜帶。
[0031]進(jìn)一步，所述的納米抗體的篩選方法，包括如下步驟:
[0032](I)在人甲狀旁腺激素目的基因片段的碳末端引入巰基標(biāo)簽，獲得融合蛋白PTH-C的基因；(2)利用酶切位點(diǎn)將PTH-C的基因構(gòu)建到載體pET-23a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-23a-PTH-C ； (3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中，陽(yáng)性菌落經(jīng)培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體，提取總蛋白；(4)總蛋白經(jīng)分離和純化，獲得帶有巰基的PTH-C融合蛋白；(5)以PTH-C融合蛋白為抗原，對(duì)羊駝噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行多輪富集篩選，獲得對(duì)PTH-C融合蛋白具有特異性結(jié)合能力的噬菌體。
[0033]在上述納米抗體的篩選方法中，步驟⑷中，總蛋白經(jīng)過(guò)0.12%的PEI沉淀、50%飽和硫酸銨沉淀、PH3.5的檸檬酸重懸、透析換液除鹽、陽(yáng)離子交換層析等分離純化步驟獲得純度在95%以上的帶有巰基的PTH-C融合蛋白。
[0034]在上述納米抗體的篩選方法中，步驟(5)中，首先將PTH-C融合蛋白利用定點(diǎn)固載方法固定到ELISA板上，經(jīng)封閉后用于羊駝噬菌體抗體庫(kù)的篩選。所述定點(diǎn)固載可以采用能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明技術(shù)方案的本領(lǐng)域常規(guī)的固載方法，本發(fā)明優(yōu)選利用PTH-C融合蛋白(抗原)上的巰基標(biāo)簽將抗原固定到修飾有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的ELISA板上。
[0035]目前，獲得納米抗體的方法主要是從噬菌體庫(kù)中進(jìn)行篩選。篩選時(shí)首先包被抗原，抗原的包被是很重要的一環(huán)，傳統(tǒng)的抗原包被方法是利用疏水作用將蛋白吸附到96孔板等基質(zhì)上，是非共價(jià)鍵結(jié)合，但是這種包被方法對(duì)于親水性蛋白或者小分子蛋白并不適用，不能得到高親和性的納米抗體，而本發(fā)明中利用巰基和馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)對(duì)蛋白進(jìn)行定點(diǎn)定向固載進(jìn)行篩選，該方法更有利于得到高親和性的抗體。
[0036]本發(fā)明的目的之三是，提供上述所述的納米抗體在檢測(cè)或去除甲狀旁腺激素試劑中的應(yīng)用。
[0037]進(jìn)一步，所述去除甲狀旁腺激素試劑為甲狀旁腺激素吸附劑、吸附血液中甲狀旁腺激素的吸附劑。
[0038]本發(fā)明所述納米抗體也可應(yīng)用于治療高表達(dá)甲狀旁腺激素的疾病藥物的制備。
[0039]進(jìn)一步，上述所述的甲狀旁腺激素為人甲狀旁腺激素。
[0040]本發(fā)明的有益效果:
[0041]首先，本發(fā)明提 供了一種特異性的抗PTH的納米抗體，可以將其對(duì)應(yīng)的基因克隆至質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞可以是原核的，也可以是真核的。然后在多表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)，獲得的抗體可以應(yīng)用在純化蛋白、制備吸附劑材料、制備血液凈化吸附材料、進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)等方面。再次，本發(fā)明中篩選納米抗體的方法將定點(diǎn)固載技術(shù)引入抗體的篩選過(guò)程，解決了傳統(tǒng)篩選過(guò)程中親水性抗原不易結(jié)合的問(wèn)題，也解決了小分子抗原容易形變的問(wèn)題，篩選出的抗體更具競(jìng)爭(zhēng)力，也為抗體篩選提供了一種新思路。通過(guò)這種新方法得到的展示有特異性抗體的噬菌體是多價(jià)抗體，也可以用來(lái)進(jìn)行蛋白純化以及高效檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1~14分別是SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.14所示的納米抗體氨基酸序列示意圖；
[0043]圖15為本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-23a-PTH_C的質(zhì)粒圖譜，利用酶切位點(diǎn)NdeI和Bam HI，將目的基因片段PTH-C連接到pET_23a載體上；
[0044]圖16 為質(zhì)粒 pET-23a-PTH-C 在 E.coli BL21 (DE3)中的表達(dá)情況 SDS-PAGE 電泳圖；其中，泳道M是低分子量蛋白marker，泳道I是菌株在IPTG誘導(dǎo)前的全菌蛋白，泳道2_5分別是隨機(jī)挑取的四株陽(yáng)性菌(依次命名為1-4號(hào)菌株)IPTG誘導(dǎo)后的全菌蛋白；
[0045]圖17為帶巰基標(biāo)簽的目的蛋白PTH-C經(jīng)粗分離以及精分離后的SDS-PAGE電泳圖；其中，泳道M是低分子量蛋白marker，泳道I是粗分離之后的目的蛋白；泳道2是陽(yáng)離子交換層析-精分離過(guò)程中出現(xiàn)第一個(gè)目標(biāo)峰(肩峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白；泳道3-5是出現(xiàn)第二個(gè)目標(biāo)峰(主峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白；泳道6是出現(xiàn)第三個(gè)目標(biāo)峰(肩峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白；
[0046]圖18噬菌斑圖；
[0047]圖19是鑒定單克隆噬菌體活性ELISA結(jié)果圖；其中，橫坐標(biāo)中SEQl~14分別是SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.14所示納米抗體的單克隆噬菌體；
[0048]圖20是投入不同量的T7噬菌體計(jì)算得到的親和常數(shù)值的比較，雙對(duì)數(shù)作圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0049]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，本申請(qǐng)公開(kāi)的DNA序列和氨基酸序列可以按照本領(lǐng)域常用的其他方法獲得。而且可以將本申請(qǐng)獲得的新的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因構(gòu)建到任何合適的載體，用任何合適的表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)。下述內(nèi)容僅僅是對(duì)本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍的示例性說(shuō)明，一些根據(jù)所公開(kāi)的內(nèi)容做出的改變和修飾，也應(yīng)當(dāng)屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。
[0050]本文實(shí)施例中所使用的藥品及試劑若無(wú)特殊說(shuō)明均按常規(guī)途徑獲得，帶巰基標(biāo)簽的PTH簡(jiǎn)寫(xiě)PTH-C。
[0051]實(shí)施例1重組質(zhì)粒pET-23a-PTH_C的構(gòu)建及鑒定
[0052](I)目的基因的獲得
[0053]通過(guò)PCR的方法獲得帶巰基標(biāo)簽的目的蛋白。以質(zhì)粒pET-23a_PTH(大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物材料課題組保存)為模板，在此基礎(chǔ)上合理設(shè)計(jì)引物，在PTH基因的末端引入半胱氨酸的密碼子，酶切位點(diǎn)為Nde I和Bam HI。
[0054]上游引物(UP):
[0055]5’ -CTACACGG AAATTCCATATGTCTGTTTCTGAAATCCAGC-3’
[0056]下游引物(DOWN):
[0057]5’ -GACTATGTCCGGGATCCTTAGCACTGAGATTTAGCTTTGGTCAGAACG-3’
[0058](2) PCR產(chǎn)物的純化
[0059]反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠(I %)電泳，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增基因片段在270bp附近呈現(xiàn)亮帶。用TaKaRa公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒(TaKaRa Code: 9762)回收目的基因條帶，得目的基因片段。試劑盒回收基因條帶的具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0060](3)質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物的雙酶切
[0061]用Nde I和Bam HI兩種限制性內(nèi)切酶分別消化質(zhì)粒pET23a及PCR產(chǎn)物(步驟(2)得到的目的基因片段)，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端。
[0062](4)酶切產(chǎn)物的鏈接
[0063]將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段及載體片段，使用T4連接酶將二者進(jìn)行連接。
[0064](5)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及其鑒定
[0065]用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，_80°C保存。
[0066]采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a中，并將得到的轉(zhuǎn)化菌株在培養(yǎng)皿上進(jìn)行涂布。待培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出菌落之后，挑取一株單菌落，接種到20mL Amp-LB液體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素濃度為0.lmg/mL)，170r/min、37°C培養(yǎng)過(guò)夜，使用TaKaRa公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒(TaKaRa Code:9760)提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行Nde I和Bam HI的雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖電泳顯示在略高于250bp的位置存在目的條帶。再將該種質(zhì)粒送交旭冠生物科技有限公司測(cè)序，用clustal X2.0軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明PTH-C基因(核苷酸序列如SEQ ID N0.104)成功構(gòu)建到pET-23a載體上，將該重組質(zhì)粒命名為pET-23a-PTH-C，其質(zhì)粒圖譜如圖15所/Jn ο
[0067]實(shí)施例2融合蛋白PTH-C的搖瓶培養(yǎng)及表達(dá)
[0068]按照實(shí)施例1的方法將構(gòu)建的質(zhì)粒pET-23a-PTH_C轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3)中，過(guò)夜培養(yǎng)后，培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出陽(yáng)性菌落。挑取4株單菌落分別接種到20mLAmp-LB液體培養(yǎng)基中，170r/min、37°C活化過(guò)夜。
[0069]將活化的菌種I %接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3_4h后，加入終濃度為0.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，4h后停止誘導(dǎo)，離心收集菌體。對(duì)全菌進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖16所示，其中泳道M為蛋白低分量marker，泳道I是IPTG誘導(dǎo)前的全菌蛋白，泳道2_5分別是隨機(jī)挑取的菌株四株陽(yáng)性菌(依次命名為1-4號(hào)菌株)IPTG誘導(dǎo)后的全菌蛋白，可見(jiàn)四株菌在9600Da處均有目的蛋白PTH-C的表達(dá)，通過(guò)灰度掃描，表達(dá)量占總蛋白25 % -30 %，4號(hào)菌株的表達(dá)量最高，保存該株菌的菌保方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
[0070]實(shí)施例3融合蛋白PTH-C的分離純化及巰基檢測(cè)
[0071](I)重組蛋白可溶性考察
[0072]首先將培養(yǎng)的4號(hào)菌體利用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎，在4°C、10，OOOrpm下離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，大部分表達(dá)的目的蛋白(9600Da)分布在上清液中，呈現(xiàn)可溶性表達(dá)。 [0073](2)蛋白預(yù)處理-粗分離
[0074]在破碎離心得到的上清中加入終濃度為0.12% (w/v)的PEI，去除溶液中的核酸。4°C靜置30min，10000r/min，4°C離心15min。取出上清，等體積加入飽和硫酸銨，4°C靜置30min，離心。保留沉淀并用pH3.5的檸檬酸緩沖液溶解，攪拌均勻，離心。取上清液放入透析袋(截留分子量3000Da)中，用20mM、pH8.0的PBS作為透析緩沖液，過(guò)夜透析，中間換液兩次。將透析好的溶液離心，收集上清，過(guò)0.22 μ m濾膜，進(jìn)入下一步精分離。
[0075](3) SP強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析-精分離
[0076]實(shí)驗(yàn)中層析系統(tǒng)選用AKTA purifierlOO。由于PTH理論等電點(diǎn)為9.1，引入半胱氨酸后Pl值變化不會(huì)太大，用PH8.0的緩沖體系、SP陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)對(duì)蛋白進(jìn)行精分離，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)選擇214nm。采用線性洗脫方式，洗脫液(20mM PBS，IM NaCl，pH8.0)線性范圍0-30 %，210min,出峰時(shí)收集洗脫液，直到出峰完全。
[0077]將洗脫得到的蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE，圖17所示為不同峰時(shí)蛋白的電泳情況，泳道M為蛋白低分量marker，泳道I是粗分離之后的目的蛋白；泳道2是陽(yáng)離子交換層析過(guò)程中出現(xiàn)第一個(gè)目標(biāo)峰(肩峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白；泳道3-5是出現(xiàn)第二個(gè)目標(biāo)峰(主峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白；泳道6是出現(xiàn)第三個(gè)目標(biāo)峰(肩峰)時(shí)對(duì)應(yīng)的蛋白?？梢?jiàn)主峰和第三個(gè)峰對(duì)應(yīng)的蛋白純度已經(jīng)很高，基本看不到雜質(zhì)條帶。用BandScan軟件進(jìn)行灰度掃描，純度在95%以上，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,最高可達(dá)到0.16mg/mL。
[0078](4)自由巰基的定性檢測(cè)
[0079]取100 μ L洗脫蛋白的濃縮液，加入IOOyL Ellman試劑，室溫反應(yīng)15min，溶液變?yōu)辄S色，證明純化的PTH-C中存在自由巰基。
[0080]實(shí)施例4納米抗體庫(kù)的建立
[0081]本發(fā)明使用的噬菌體展示庫(kù)是以T7噬菌體為載體的非免疫庫(kù)，建立步驟如下:
[0082](I)采取2歲雄性羊駝?lì)i靜脈血，提取外周血淋巴細(xì)胞，并提取其中的總RNA ( ambion!< PuerLinkTM RNA Mini Kit, Life Technologies:12183018A)；
[0083](2)以UP primer I為引物將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用采用兩輪巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增VHH基因；
[0084]其中第一輪PCR為以轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，以UP primerl和DOWN primerl為上游和下游引物，PCR擴(kuò)增，回收得到大小為650~750bp的條帶作為模版，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，上游和下游引物分別為UP primer2, DOWN primer2,回收得到450~500bp的PCR產(chǎn)物；
[0085]UP pr imer 1:5 ’ -GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3，
[0086]DOWN pr imer 1:5，-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3，
[0087]UP primer2:5，-AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3，
[0088]DOWN primer2:5，-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3’
[0089](3)用EcoRI和HindIII雙酶切VHH基因，并進(jìn)行瓊脂糖電泳，回收其中350-500bp的基因條帶，即為VHH基因片段；
[0090](4)用 T4 連接酶連接 T7 載體(T7Sclect? IO-3Cloning Kit, MerckMillipore Novagcnl1: 70550-3)和 VHH 基因片段；
[0091](5)將連接產(chǎn)物進(jìn)行包裝，然后進(jìn)行擴(kuò)增(方法見(jiàn)實(shí)施例5)，得噬菌體原始文庫(kù)；
[0092](6)該原始庫(kù)滴 度為1.5 X 1010pfu/mL (方法見(jiàn)實(shí)施例6)，多樣性為2.0 X IO70
[0093]實(shí)施例5 T7噬菌體的液體擴(kuò)增
[0094](I)活化宿主菌:在50ml Carb-LB培養(yǎng)基(羧芐青霉素含量0.lmg/mL)中，接種大腸桿菌BLT5403單菌落或菌保，37°C 170r/min搖床過(guò)夜。此菌液簡(jiǎn)稱一代宿主菌；
[0095](2)在Carb-LB液體培養(yǎng)基中接種I %的一代菌，搖床培養(yǎng)，到OD6tltl為0.5-1.0 ；
[0096](3)用T7噬菌體感染二代宿主菌，37°C 200r/min搖床培養(yǎng)2_3h，觀察溶菌情況，溶菌完全立即停止培養(yǎng)。將溶菌產(chǎn)物立即離心:8000g，10min。回收上清，上清即為擴(kuò)增的噬菌體。測(cè)定滴度。
[0097]實(shí)施例6 T7噬菌體滴度的測(cè)定
[0098](I)倒平板:在培養(yǎng)皿中倒入Carb-LB底層培養(yǎng)基，冷卻、凝固；
[0099](2)溶解頂層培養(yǎng)基，冷卻，加入Carb后45°C保溫；
[0100](3)用無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基梯度稀釋擴(kuò)增的噬菌體；
[0101](4)在一系列5mL無(wú)菌離心管中加入300 μ L 二代宿主菌、50 μ L不同梯度稀釋的曬菌體，混勻,加入4mL Carb-頂層培養(yǎng)基,迅速倒入已預(yù)熱的倒有底層培養(yǎng)基的平皿中，晃動(dòng)平皿使之分布均勻；
[0102](5)37°C倒置培養(yǎng)3_4h，直到看到大小適中的噬菌斑(如圖18所示)；
[0103](6)挑選噬菌斑數(shù)量為50-500間的平板進(jìn)行噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算噬菌體滴度。
[0104]實(shí)施例7納米抗體的篩選
[0105]首先在巰基結(jié)合板(Sulfhydryl-BIND? surface plate,美國(guó)康寧公司)上包被抗原，將實(shí)施例3得到的PTH-C蛋白用TBS稀釋成10 μ g/mL,調(diào)pH至7.0，100 μ L/孔進(jìn)行包被，室溫?fù)u床反應(yīng)2h ;用TBS洗板3次，拍干；用ImM的巰基乙醇封閉2h ;再用TBS清洗3次，拍干；用足量的I %無(wú)蛋白封閉液(購(gòu)自生工生物工程有限公司)進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床
1.5h (篩選時(shí)不同輪之間I %無(wú)蛋白封閉液和I % BSA交叉使用)；用TBST洗板6次，拍干；加入擴(kuò)增的噬菌體，100 μ L/孔，室溫?fù)u床孵育30min ;用TBST洗板10次，充分去除未結(jié)合的噬菌體；最后加入T7洗脫緩沖液(1% SDS)洗脫噬菌體，室溫?fù)u床30min，并將洗脫液擴(kuò)增，得下一輪篩選用噬菌體，進(jìn)入下一輪篩選。經(jīng)過(guò)四輪篩選之后，特異性的噬菌體得到富集。
[0106]實(shí)施例8單克隆噬菌體的序列分析
[0107]經(jīng)第四輪篩選后，按照實(shí)施例6的方法得到單克隆噬菌斑。采用PCR法擴(kuò)增后進(jìn)行序列分析，方法如下:
[0108](I) PCR 擴(kuò)增
[0109]①用滅菌牙簽挑取100個(gè)噬菌斑，同一噬菌斑一部分放入EDTA溶膠緩沖液中用于PCR，另一部分進(jìn)行擴(kuò)增，用于后續(xù)ELISA ；
[0110]②放入EDTA溶膠緩沖液中的部分65°C處理IOmin ；
[0111]③冷卻至室溫，14000g離心5min,取上清98°C熱擊處理5min ；
[0112]④取2 μ L作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0113]UP pr imer 3:5’ -GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3 ’
[0114]DOWN primer3:5’ -AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3’
[0115]反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后，98°C變性10s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min;
[0116](2)將PCR產(chǎn)物送交生工生物工程有限公司測(cè)序；
[0117](3)利用MEGA4.0軟件將得到的核酸序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，CDR區(qū)不同的視為不同的克隆株，最后得到14株結(jié)構(gòu)類似的抗體，其氨基酸為SEQ ID N0.1~14，均由4個(gè)框架區(qū)(FR)、3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以及I個(gè)鉸鏈區(qū)組成，它們的FR區(qū)以及鉸鏈區(qū)高度同源。所述納米抗體的氨基酸序列以及其組成序列為如下。
[0118]序列1:氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.15~18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.62~64所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.1中位置關(guān)系如圖1所示。
[0119]序列2:氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.19~22所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.65~67所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.2中位置關(guān)系如圖2所示。
[0120]序列3:氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.23~26所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.68~70所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.3中位置關(guān)系如圖3所示。
[0121]序列4:氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.27~29和SEQ ID N0.18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.71~73所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所不。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和絞鏈區(qū)在SEQ ID N0.4中位直關(guān)系如圖4所不。
[0122]序列5:氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.30~32和SEQ ID N0.18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.74~76所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所不。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和絞鏈區(qū)在SEQ ID N0.5中位直關(guān)系如圖5所不。
[0123]序列6:氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.33~35和SEQ ID N0.18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.77~79所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所不。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和絞鏈區(qū)在SEQ ID N0.6中位直關(guān)系如圖6所不
[0124]序列7:氨基酸序列如SEQ IDN0.7所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.36~38和SEQ ID N0.18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.80~82所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所不。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和絞鏈區(qū)在SEQ ID N0.7中位直關(guān)系如圖7所不。
[0125]序列8:氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.39 和 SEQ ID N0.40 所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.83~85所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.8中位置關(guān)系如圖8所不。
[0126]序列9:氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，其中4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為 SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.18 所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.86~88所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.9中位置關(guān)系如圖9所不。
[0127]序列10:氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，其中4個(gè)框架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.43~45所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDRl、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.89~91所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.10中位置關(guān)系如圖10所示。
[0128]序列11:氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，其中4個(gè)框架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為 SEQ ID N0.46,SEQ ID N0.20,SEQ ID N0.47 和 SEQ ID N0.18 所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.92~94所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.11中位置關(guān)系如圖11所示。
[0129]序列12:氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示，其中4個(gè)框架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.48~50和SEQ ID N0.18所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.95~97所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ IDN0.59所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.12中位置關(guān)系如圖12所示。
[0130]序列13:氨基酸序列如SEQ ID N0.13所示，其中4個(gè)框架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.51~54所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.98~100所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.60所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)在SEQ ID N0.13中位置關(guān)系如圖13所示。
[0131]序列14:氨基酸序列如SEQ ID N0.14所示，其中4個(gè)框架區(qū)FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.55~58所示；3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3氨基酸序列依次分別為SEQ ID N0.101~103所示；鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.61所示。所述框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和絞鏈區(qū)在SEQ ID N0.14中似直關(guān)系如圖14所不。
[0132]實(shí)施例9 ELISA鑒定單克隆噬菌體活性
[0133]將由實(shí)施例8確定的納米抗體(SEQ ID N0.1~14)對(duì)應(yīng)的單克隆噬菌體分別進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用ELISA鑒定其和抗原的結(jié)合活性。
[0134]用巰基結(jié)合板作為基質(zhì)，固載抗原PTH-C，0.01 μ g/mL, 100 μ L/孔，室溫慢搖2h，TBS洗板3次，拍干；依次用ImM的巰基乙醇和1%無(wú)蛋白封閉液封閉；分別加入等量的待測(cè)單克隆噬菌體(實(shí)施例8中擴(kuò)增的噬菌體)，用干凈的LB培養(yǎng)基作陰性對(duì)照，37°C慢搖孵育lh，用TBST清洗；加入稀釋10000倍的一抗(抗T7尾絲的鼠源抗體，購(gòu)自MerckMillipore
Novagcnk )，100 μ L/孔，37°C孵育lh，用TBST清洗；加入稀釋1000倍的帶有辣根過(guò)氧化物
酶的二抗(羊抗鼠抗體，購(gòu)自ThermoFisher)，100yL/孔，37°C孵育2h，用TBST清洗；加入100 μ L/孔TMB工作液，暗處?kù)o置20min后，加入50 μ L/孔2Μ的硫酸終止反應(yīng)，450nm檢測(cè)吸光值。圖19是不同單克隆噬菌體的ELISA結(jié)果，SEQ ID N0.1~14所示抗體對(duì)抗原PTH都具有較好的結(jié)合活性，其中SEQ ID N0.1、3、4、5、7、9、10、11、12、13、14這11種具有較高的
結(jié)合活性。
[0135]實(shí)施例10親和常數(shù)的估算 [0136]T7噬菌體表面展示的納米抗體數(shù)量并不一致，不是單分子層吸附，不符合朗繆爾吸附，因此納米抗體以噬菌體狀態(tài)存在時(shí)測(cè)其親和常數(shù)難度相當(dāng)大，本實(shí)施例用ELISA的方法結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)的思路進(jìn)行估算，得到親和常數(shù)的數(shù)量級(jí)。
[0137](I)提出模型假設(shè):
[0138]①由于空間位阻以及盡可能使模型簡(jiǎn)單化，可以假設(shè)抗原及噬菌體1:1反應(yīng)。②抗原全部被固載至巰基結(jié)合板上。因?yàn)榘豢乖瓭舛群艿?，已?jīng)超出了一般試劑盒的檢測(cè)范圍，試圖用差量法或者直接檢測(cè)包被抗原量很難，因此只能是盡量降低抗原濃度，認(rèn)為其全部被固載至板上。本小節(jié)包被抗原分子個(gè)數(shù)6.4X IO9個(gè)/孔，巰基結(jié)合板上馬來(lái)酰亞胺亞胺活性位點(diǎn)3.2 X IO13個(gè)/孔，而且半胱氨酸和馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)極易進(jìn)行，因此該假設(shè)可以成立。③假設(shè)固載的抗原表現(xiàn)出自由抗原一樣的活性，親和常數(shù)公式同樣適用于固載的抗原。④假設(shè)反應(yīng)達(dá)到平衡之后，結(jié)合上的T7噬菌體不因后續(xù)清洗而脫落。
[0139](2)實(shí)施步驟:
[0140]與實(shí)施例9中ELISA加入一抗之前的步驟一樣，只是抗原包被濃度為0.001 μ g/mL。封閉完成后加入噬菌體的濃度依次為6.5Χ1010、3.25Χ IO10U.3Χ1010、6.5X IO9,
3.25Χ109、1.3Χ109、8.71 X 108、6.5 X ΙΟ8、1.3 X ΙΟ8、1.3 X ΙΟ6、1.3 X IO4 個(gè) /mL, 100 μ L/孔。噬菌體結(jié)合完成后，要收集殘留液測(cè)滴度，利用差量法計(jì)算噬菌體的結(jié)合量。
[0141](3)計(jì)算方法:
[0142]
PTH + Τ7 P ΡΤΗ-Τ7
[0143]
【權(quán)利要求】
1.一種抗甲狀旁腺激素的納米抗體，所述納米抗體包括框架區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)和鉸鏈區(qū)，所述框架區(qū)由四個(gè)區(qū)域組成，分別為FR1、FR2、FR3、FR4，其中所述FRl的氨基酸序列選自SEQ ID N0.15、19、23、27、30、33、36、41、46、48、51、55 中的一種，所述 FR2 的氨基酸序列選自SEQ ID N0.16、20、24、28、31、34、37、42、43、49、52、56 中的一種，所述 FR3 的氨基酸序列選自SEQ ID N0.17、21、25、29、32、35、38、39、44、47、50、53、57 中的一種，所述 FR4 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.18、22、26、40、45、54、58 中的一種； 所述互補(bǔ)決定區(qū)由三個(gè)區(qū)域組成，分別為⑶R1XDR2、⑶R3，其中所述⑶Rl的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101 中的一種，所述CDR2 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102 中的一種，所述CDR3 的氨基酸序列選自 SEQ ID N0.64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103 中的一種； 所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列選自SEQ ID N0.59、60、61中的一種。
2.一種抗甲狀旁腺激素的納米抗體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.13 或 SEQ ID N0.14 所示； 其中: SEQ ID N0.1包括由SEQ ID N0.15~18組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.62~64組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.2包括由SEQ ID N0.19~22組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.65~67組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.3包括由SEQ ID N0.23~26組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.68~70組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.4 包括由 SEQ ID N0.27 ~29 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.71~73組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.5 包括由 SEQ ID N0.30 ~32 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.74~76組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.6包括由SEQ ID N0.33~35和和SEQ ID N0.18組成的框架區(qū)、由SEQ IDN0.77~79組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.7 包括由 SEQ ID N0.36 ~38 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.80~82組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
SEQ ID N0.8 包括由 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.39 和 SEQ ID N0.40 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.83~85組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
SEQ ID N0.9 包括由 SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42、SEQ ID N0.29 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.86~88組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
SEQ ID N0.10 包括由 SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.89~91組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
SEQ ID N0.11 包括由 SEQ ID N0.46、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.47 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.92~94組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)；
SEQ ID N0.12 包括由 SEQ ID N0.48 ~50 和 SEQ ID N0.18 組成的框架區(qū)、由 SEQ IDN0.95~97組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.59所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.13包括由SEQ ID N0.51~54組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.98~100組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.60所示的鉸鏈區(qū)； SEQ ID N0.14包括由SEQ ID N0.55~58組成的框架區(qū)、由SEQ ID N0.101~103組成的互補(bǔ)決定區(qū)和SEQ ID N0.61所示的鉸鏈區(qū)。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的納米抗體的篩選方法，其特征在于，該方法包括，在人甲狀旁腺激素目的基因片段的碳末端引入巰基，利用該巰基定點(diǎn)固載的甲狀旁腺激素融合蛋白為抗原，對(duì)羊駝噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行多輪富集篩選的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述巰基為半胱氨酸攜帶。
5.權(quán)利要求1或2所述的納米抗體在檢測(cè)或去除甲狀旁腺激素試劑中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述去除甲狀旁腺激素試劑為甲狀旁腺激素吸附劑、吸附血液中甲狀旁腺激素的吸附劑。
7.權(quán)利要求1或2所述的納米抗體在制備治療高表達(dá)甲狀旁腺激素的疾病藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要 求5或7所述的應(yīng)用，其特征在于，甲狀旁腺激素為人甲狀旁腺激素。
【文檔編號(hào)】B01D15/38GK104004093SQ201410243295
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】賈凌云, 王玉鳳, 徐麗, 黃春東, 張明星 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)