專利名稱：分離生物小分子的整體硅膠柱及其制備方法,和分離生物小分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離生物小分子的整體硅膠柱(monolithic silica column)及其制 備方法，和分離生物小分子的方法。
背景技術(shù)：
為了分析生物小分子如神經(jīng)遞質(zhì)和激素，廣泛采用利用反相柱作為分離柱的高效 液相色譜法(HPLC)。在生物樣品如血漿、血清、唾液或尿液中，生物小分子以與蛋白質(zhì)及大 量鹽的混合物的形式存在，蛋白質(zhì)的分子量比生物小分子高。對生物樣品中的生物小分子 進行HPLC分析時，進行預(yù)處理操作，從而將蛋白質(zhì)和鹽從該生物樣品中去除，之后將生物 樣品裝入分離柱。如果未進行預(yù)處理操作，將生物樣品直接裝入分離柱，則生物樣品中的蛋 白質(zhì)將吸附在分離柱的填料上，導(dǎo)致柱壓增加或柱性能劣化，由此生物小分子將不能有效 地被分離且分析靈敏度將會降低。對于HPLC分析中能夠獲得高分離能力的分離柱，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)整體硅膠柱 作為現(xiàn)有填充微粒的柱的替代的效用(參見日本專利特開2003-075420號公報(下文 稱為專利文獻1))。與現(xiàn)有填充硅膠微粒的柱不同的是，整體硅膠柱具有以下結(jié)構(gòu)三 維網(wǎng)絡(luò)形式的硅膠基體和其空隙集成在一起，該空隙也稱為“直通孔”，“大孔隙”，“通 孔(throughpore)”等。此外，在整體硅膠柱的硅膠基體中也存在細孔，稱為“間隙孔 (mesopore) ”。通孔的孔尺寸可以單獨控制在幾個微米到幾百個微米的范圍內(nèi)，而間隙孔的 孔尺寸可以單獨控制在幾個納米到幾十個納米的范圍內(nèi)。通過從這些存在的孔隙中可得到 的分子篩效應(yīng)，整體硅膠柱將生物小分子與蛋白質(zhì)和鹽分開。對于用于分離來源于活體等的特定組分的分離材料，最近已經(jīng)開發(fā)了在其表面具 有磷酸膽堿類似基團的分離材料(參見日本專利特開2002-98676號公報(下文稱為專利 文獻2))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含磷酸膽堿類似基團的聚合物由于源自生物膜的類似磷脂的結(jié)構(gòu)而具 有諸如血相容性、補體活性和對生物材料的非吸附性(non-adsorptivity)等性質(zhì)。對于含 磷酸膽堿類似基團的聚合物，近年來已經(jīng)積極開發(fā)了利用這些功能的生物學(xué)相關(guān)的材料。 使用專利文獻2中披露的分離材料，據(jù)稱可以通過控制分離材料表面上存在的磷酸膽堿類 似基團的百分比等從源自身體的組分中分離“細胞”、“蛋白質(zhì)”和“神經(jīng)遞質(zhì)”之一(參見專 利文獻2的權(quán)利要求5)。然而，注意到?jīng)]有關(guān)于用分離材料僅將特定物質(zhì)(生物小分子) 從例如“神經(jīng)遞質(zhì)”中分離的討論。

發(fā)明內(nèi)容
為了允許高精度分析生物樣品中的生物小分子如神經(jīng)遞質(zhì)或激素，非常需要可防 止在柱上吸附蛋白質(zhì)的分離柱能選擇性地分離目標生物小分子并且可以高產(chǎn)率地回收它們。期望提供可以在柱中有效保留生物小分子(尤其是要分析的生物小分子)，同時 防止在柱上吸附蛋白質(zhì)的分離柱。
在本發(fā)明的一種實施方式中，由此提供分離生物小分子的整體硅膠柱，其具有硅 膠基體(silica matrix)和在該硅膠基體上形成的孔隙，該硅膠基體和孔隙二者的表面已 經(jīng)用聚合物改性，使得表面改性的孔隙具有與要分離的生物小分子的分子大小相當?shù)目壮?寸，該聚合物通過聚合單體組合物而得到，該單體組合物包括下式(1)所示的含磷酸膽堿 類似基團的單體
<formula>formula see original document page 4</formula>R1jR2和R3相同或相異且各自代表氫原子，Cp6烷基或CV6羥基烷基，R4代表C^6亞 烷基，R5代表氫原子或甲基，和η代表1 4的整數(shù)。采用該分離生物小分子的整體硅膠柱，可以因含磷酸膽堿類似基團的聚合物的高 親水性而防止蛋白質(zhì)吸附在柱上，使用該聚合物對硅膠基體和在該硅膠基體中形成的孔隙 在其表面進行改性。另外，該表面改性的孔隙的孔尺寸控制為與要分離的生物小分子的分 子大小相當，由此，可以選擇性地使目標生物小分子進入孔隙并且可以保留在那里。在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了分離生物小分子的方法，該方法包括使用所 述分離生物小分子的整體硅膠柱。在本發(fā)明的又一實施方式中，還提供了制備分離生物小分子的整體硅膠柱的方 法，該方法包括如下步驟提供整體硅膠柱，其具有硅膠基體和在該硅膠基體上形成的孔 隙，該孔隙的孔尺寸根據(jù)要分離的生物小分子預(yù)先確定；提供聚合物，該聚合物通過聚合單 體組合物而得到，該單體組合物包含下式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團的單體，從而根 據(jù)要分離的生物小分子的分子大小得到預(yù)先確定的分子量
<formula>formula see original document page 4</formula>R17R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，Cp6烷基或CV6羥基烷基，R4代表C^6亞 烷基，R5代表氫原子或甲基，和η代表1 4的整數(shù)，以及用該聚合物對所述整體硅膠柱的 硅膠基體和孔隙二者的表面進行改性。注意，本文使用的術(shù)語孔隙的“孔尺寸”指所述孔隙在已用含磷酸膽堿類似基團的 聚合物改性的狀態(tài)下的直徑。還要注意，孔隙在它們沒有用含磷酸膽堿類似基團的聚合物 改性的狀態(tài)下的直徑簡稱為“孔直徑”。本發(fā)明實施方式提供可以在柱中有效保留生物小分子，特別是要分析的生物小分 子，同時防止在柱上吸附蛋白質(zhì)的分離柱。


圖1顯示使用根據(jù)本發(fā)明實施方式的分離生物小分子的整體硅膠柱，從唾液溶液中分離和檢測氫化可的松(Cortisol)所獲得的HPLC色譜圖。
具體實施例方式參考附圖，下文描述實施本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。然而，要注意的是，下文描述的 實施方式說明本發(fā)明代表性實施方式的一些實例，不應(yīng)該認為本發(fā)明的范圍限于這些優(yōu)選 實施方式。以如下次序進行描述。1.分離生物小分子的整體硅膠柱及其制備方法
(1)整體硅膠柱(2)用MPC聚合物進行表面親水化處理(3)對要分析的生物小分子的優(yōu)化2.分離生物小分子的方法(1)要分離的生物小分子(2)要分離的溶液(3)分離步驟1.分離生物小分子的整體硅膠柱及其制備方法(1)整體硅膠柱為了分離生物小分子，本發(fā)明實施方式利用整體硅膠柱，該整體硅膠柱的結(jié)構(gòu)為， 在其中形成通孔的三維網(wǎng)絡(luò)硅膠基體中形成間隙孔。對于該整體硅膠柱，可以使用市售的 柱或者上述專利文獻1中披露的已知方法所獲得的柱等。通常，由有機硅烷形成HPLC的棒 型整體硅膠柱。例如，由于過渡態(tài)有序結(jié)構(gòu)(transitional ordered structure)的凍結(jié)形 成硅膠基體結(jié)構(gòu)，該過渡態(tài)有序結(jié)構(gòu)通過有機硅烷在烷氧基硅烷和聚乙二醇(PEG)的乙酸 水溶液中的水解_縮聚反應(yīng)，通過基于亞穩(wěn)相分離的相分離形成。水解_縮聚反應(yīng)伴隨著 溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變(sol-gel transition) 0另一方面，在形成硅膠基體之后通過氨水處理形 成間隙孔。整體硅膠中的通孔通過基于亞穩(wěn)相分離的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變形成。當通過進行氨水 處理形成間隙孔時，可以獨立地控制通孔和間隙孔的孔尺寸。具體而言，通過改變相分離的 速率，縮聚的凍結(jié)速率，氨水處理的強度等，可以將通孔尺寸和間隙孔尺寸分別控制在幾個 微米至幾百個微米的范圍內(nèi)和幾個納米至幾十個納米的范圍內(nèi)。在本發(fā)明實施方式中，如 本文隨后所描述的，提供并使用了整體硅膠柱，其具有形成在硅膠基體中的間隙孔，孔尺寸 根據(jù)要分離的生物小分子的分子大小預(yù)先確定。(2)用MPC聚合物進行表面親水化處理為了防止樣品中的蛋白質(zhì)吸附在整體硅膠上，對整體硅膠柱在其三維網(wǎng)絡(luò)硅膠基 體的表面(基體中空隙形式的通孔的表面)和在該硅膠基體中形成的孔隙的表面(間隙孔 的表面)賦予親水性。親水性的賦予可以通過用含磷酸膽堿類似基團的聚合物化學(xué)改性整體硅膠的表 面而進行。該含磷酸膽堿類似基團的聚合物因歸因于其源自生物膜的類似磷脂的結(jié)構(gòu)的親 水性而顯示出高度防止蛋白質(zhì)吸附的作用。所述含磷酸膽堿類似基團的聚合物可以通過聚合包含下式(1)所示的含磷酸膽 堿類似基團的單體的單體組合物而獲得
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R1，R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，CV6烷基或CV6羥基烷基。C^6烷基的 實例包甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、環(huán)己基等。Cp6羥基烷基的實例包括羥基甲基、 2-羥基乙基、3-羥基丙基、4-羥基丁基、5-羥基戊基、6-羥基己基等。此外，R4代表Cp6亞 烷基，R5代表氫原子或甲基，和η代表1 4的整數(shù)。說明性的式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團的單體為2_((間)丙烯酰氧基)乙 基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽、3-((間)丙烯酰氧基)丙基-2'-(三甲基銨基)乙 基磷酸鹽、4-((間)丙烯酰氧基)丁基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽、5-((間)丙烯 酰氧基)戊基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽、6-((間)丙烯酰氧基)己基-2'-(三 甲基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)乙基-2'-(三乙基銨基)乙基磷酸鹽、 2_((間)丙烯酰氧基)乙基-2' _(三丙基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)乙 基-2' _(三丁基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)乙基-2' _(三環(huán)己基銨基) 乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)乙基-2'-(三苯基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯 酰氧基)丙基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)丁基-2'-(三 甲基銨基)乙基磷酸鹽、2-((間)丙烯酰氧基)戊基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽、 2_((間)丙烯酰氧基)己基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽等。這些當中，從易于獲得 的角度出發(fā)，優(yōu)選2-((間)丙烯酰氧基)乙基-2' _(三甲基銨基)乙基磷酸鹽(也稱 為"2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿"，下文簡稱"MPC”)。這些含磷酸膽堿類似基團的單體可以通過已知方法制備。例如，它們可以依照日 本專利特開昭54-63025號公報(下文稱為專利文獻3)(下文稱為專利文獻3)，日本專利特 開昭58-154591號公報等公開的已知方法制備。作為具體的方法，將環(huán)狀磷化物和(甲基) 丙烯酸2-羥基乙酯在脫氫鹵化劑(dehydrohalogenation agent)存在下相互反應(yīng)，然后和 三甲基胺反應(yīng)，導(dǎo)致開環(huán)，從而獲得目標單體。關(guān)于MPC，其制備方法描述在專利文獻3中。含磷酸膽堿類似基團的聚合物是通過聚合包含上述含磷酸膽堿類似基團的單體 和任選在需要時混合有另一種單體(例如，疏水單體或親水單體)的單體組合物獲得的?？?以例舉以下單體作為另一種單體。疏水單體的實例包括線性或者支化的烷基(甲基)丙烯酸酯如(甲基)丙烯酸 甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙 烯酸月桂基酯和(甲基)丙烯酸硬脂基酯；(甲基)丙烯酸環(huán)烷基酯如(甲基)丙烯酸環(huán) 己酯；芳族(甲基)丙烯酸酯如(甲基)丙烯酸芐基酯和苯氧基乙基(甲基)丙烯酸酯；疏 水聚亞烷基二醇(甲基)丙烯酸酯如聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯類單體如苯乙烯、 甲基苯乙烯和氯甲基苯乙烯；乙烯醚單體如甲基乙烯基醚和丁基乙烯基醚；乙烯基酯單體 如乙酸乙烯酯和丙酸乙烯酯；等等。它們可以單獨使用或組合使用。親水單體的實例包括其各自包含選自以下親水基團的單體等羥基、羧基、磺酸 基、酰氨基、氨基、二烷基氨基、三烷基胺鹽、三烷基鱗鹽和聚氧化乙烯基團。具體實例包括含羥基的(甲基)丙烯酸酯如(甲基)丙烯酸2-羥基乙酯、(甲基)丙烯酸2-羥基丁酯 和(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯；羧酸如丙烯酸和甲基丙烯酸；含離子基團的單體如苯乙烯 磺酸、(甲基)丙烯酰氧基乙基磷酸鹽和2-羥基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙基三甲基氯化 銨；含氮單體如(甲基)丙烯酰胺、氨基乙基甲基丙烯酸酯和二甲基氨基乙基(甲基)丙烯 酸酯；聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯。它們可以單獨使用或組合使用。含磷酸膽堿類似基團的聚合物可以根據(jù)常規(guī)自由基聚合方法通過聚合包含上述 含磷酸膽堿類似基團的單體和任選在需要時混合有另一種單體的單體組合物獲得。通常， 含磷酸膽堿類似基團的聚合物的分子量可以為，例如重均分子量5，000至5，000, 000。在本 發(fā)明實施方式中，如本文后面描述的，根據(jù)要分離的生物小分子的分子大小，將含磷酸膽堿 類似基團的聚合物聚合至預(yù)定的分子量。用含磷酸膽堿類似基團的聚合物改性通孔和間隙孔的表面可以通過將含磷酸膽 堿類似基團的聚合物與整體硅膠表面存在的硅烷醇基團化學(xué)結(jié)合而進行。通過用含磷酸膽 堿類似基團的聚合物改性，在硅膠基體中形成的各間隙孔的孔尺寸降到和含磷酸膽堿類似 基團的聚合物的表面改性膜的厚度差不多。用含磷酸膽堿類似基團的聚合物改性引起的間 隙孔尺寸的下降取決于該改性聚合物的分子量，分子量越大，間隙孔尺寸越小。(3)對要分析的生物小分子的優(yōu)化根據(jù)分子篩效應(yīng)僅僅允許生物小分子進入間隙孔并將其保留在那里，來進行整體 硅膠柱對生物小分子和生物樣品的分離，所述分子篩效應(yīng)依賴于通孔和間隙孔之間的孔尺 寸差異。此時為了有效地將生物小分子保留在間隙孔中，期望目標生物小分子的分子大小 和間隙孔的孔尺寸彼此一致，由此與要分離的生物小分子不同的生物小分子和較大分子大 小的蛋白質(zhì)均不能進入間隙孔。因此，在本發(fā)明實施方式中，具有根據(jù)要分離的生物小分子的分子量預(yù)先確定的 尺寸的間隙孔的表面用含磷酸膽堿類似基團的聚合物進行改性，該聚合物已經(jīng)聚合至基于 生物小分子分子量的預(yù)定的分子量。結(jié)果，用含磷酸膽堿類似基團的聚合物表面改性的間 隙孔的孔尺寸變得與要分離的生物小分子的分子大小相當。換句話說，調(diào)節(jié)整體硅膠柱的 間隙孔尺寸和含磷酸膽堿類似基團的聚合物的分子量，從而使得通過間隙孔尺寸減去表面 改性的含磷酸膽堿類似基團的聚合物的膜厚度得到的孔尺寸與要分離的生物小分子的分 子大小一致。具體而言，當期望分離生物小分子氫化可的松時，可以將間隙孔尺寸設(shè)為12nm左 右，同時可以將含磷酸膽堿類似基團的聚合物的分子量設(shè)為例如30，OOODa左右。在這種 情況下，由于改性各間隙孔表面的含磷酸膽堿類似基團的聚合物的膜厚度變?yōu)閹讉€納米左 右，因此間隙孔尺寸可以通過間隙孔尺寸(12nm)減去膜厚(幾個納米)來確定，亦即，間隙 孔尺寸可以為IOnm左右。此間隙孔尺寸與分子大小相當(長12人,寬6人)。由此，可以 允許分子大小顯著小于該間隙孔尺寸的氫化可的松進入間隙孔，同時防止較大分子大小的 蛋白質(zhì)雜質(zhì)進入間隙孔。2.分離生物小分子的方法(1)要分離的生物小分子在本發(fā)明實施方式中，要分離的生物小分子為神經(jīng)遞質(zhì)、激素等。實例可以為兒 茶酚胺如腎上腺素和多巴胺，生理活性肽如催產(chǎn)素和內(nèi)啡肽，以及激素如卵泡激素、黃體激素、雄激素、胰島素、胰高血糖素、促性腺激素、促卵泡激素、黃體生成素、生長激素、腎上腺 皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、甲狀旁腺激素、催乳素、促甲狀腺激素和促皮質(zhì)素；以及它們的代謝 產(chǎn)物、衍生物、中間體等。此外，要分離的生物小分子也可以是促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲 腺原氨酸(T3)、二甲-4-羥色胺(T4)、絨毛膜促性腺激素(HCG)和人類胎盤促乳素(HPL)； 以及它們的代謝產(chǎn)物等。(2)要分離的溶液含有要分離的生物小分子的溶液可以是體液，其稀釋液等，但對此沒有特定限制。 本文中使用的術(shù)語“體液”應(yīng)包括充滿動物體脈管或組織間或細胞間的所有液體以及從身 體中釋放或分泌到體外的液體，說明性的有血液、血漿、血清、淋巴液、淚液、脊髓等。在根據(jù) 本發(fā)明實施方式的分離生物小分子的整體硅膠柱中，由于高親水性而防止蛋白質(zhì)吸附在柱 上，該親水性是改性硅膠基體的表面和在該硅膠基體中形成的孔隙的表面的含磷酸膽堿類 似基團的聚合物所具有的。因此，可以從甚至含有大量蛋白質(zhì)的溶液如體液中高產(chǎn)率地分 離和收集生物小分子。含有要分離的生物小分子的溶液例如也可以是水溶液、含有一種或多種有機溶劑 的溶液，通過將水溶液和一種或多種有機溶劑一起混合獲得的混合溶液等，而不是體液或 類似物。(3)分離步驟根據(jù)本發(fā)明實施方式分離生物小分子的方法，使用上述整體硅膠柱從溶液中分離 目標生物小分子。具體而言，將包含要分離的生物小分子的溶液(下文稱為“樣品溶液”) 裝載到整體硅膠柱上，從而使生物小分子保留在間隙孔中。在樣品溶液裝載之前，可以將緩 沖液或水(其稱為“流動緩沖液”)泵送通過柱。流動緩沖液的泵送一停止，就將樣品溶液 裝載到柱上，或者將樣品溶液和流動緩沖液一起裝載到柱上。由于相比現(xiàn)有填充微粒的柱，整體柱具有較大的通孔，此時樣品溶液可以在低壓 下裝載到柱上。另外，在根據(jù)本發(fā)明實施方式的整體柱中，通過用含磷酸膽堿類似基團的聚 合物化學(xué)改性來賦予通孔和間隙孔的表面以親水性，從而即使當使用其中含有大量蛋白質(zhì) 的樣品溶液如體液或其稀釋液時，蛋白質(zhì)也幾乎不吸附在整體硅膠上。因此，可以抑制柱壓 增加，從而在較低的壓力下裝載樣品溶液。低壓裝載的可行性使得在分離能力相同的條件下，可以通過使柱直徑小于現(xiàn)有柱 的直徑來減少柱體積。因此可以降低生物小分子的分散和損失。甚至從少量樣品溶液中分 離生物小分子也變得可能了。在根據(jù)本發(fā)明實施方式的整體硅膠柱中，用含磷酸膽堿類似基團的聚合物表面改 性的間隙孔的孔尺寸控制得與要分離的生物小分子的分子大小相當。由此，可以防止其他 生物小分子和較大分子量的蛋白質(zhì)進入間隙孔中。因此，可以僅僅選擇性地允許目標生物 小分子進入間隙孔并保留在那里。然后將緩沖液(洗脫緩沖液)泵送通過其上已經(jīng)裝載樣品溶液的整體硅膠柱，從 而洗脫出生物小分子。也可以使用上述流動緩沖液作為該洗脫緩沖液。當一停止流動緩沖 液的泵送之后就將樣品溶液裝載到柱上時，由于分子篩效應(yīng)，恢復(fù)流動緩沖液的泵送首先 導(dǎo)致蛋白質(zhì)洗脫，接著是目標生物小分子的洗脫。另一方面，當樣品溶液和流動緩沖液一起 裝載在柱上時，首先洗脫出蛋白質(zhì)，接著洗脫目標生物小分子。收集后面洗脫出的和包含所述生物小分子的緩沖液級分，由此可以高產(chǎn)率地收集已經(jīng)選擇性允許進入間隙孔并保留在 那里的生物小分子。使用現(xiàn)有的柱，此時為了洗脫蛋白質(zhì)和生物小分子需要使用含有有機溶劑的流動 緩沖液。因此，在收集的生物小分子溶液中含有有機溶劑，在一些情形中，在隨后的分析中 產(chǎn)生問題。當使收集的生物小分子溶液進行親和性分析如ELISA時，例如，和生物小分子如 抗體或適配體的親和性根據(jù)生物小分子溶液中有機溶劑的濃度而變化，從而產(chǎn)生潛在的影 響分析結(jié)果精確性和/或再現(xiàn)性的問題。使用本發(fā)明實施方式的整體硅膠柱，蛋白質(zhì)和生 物小分子的吸附幾乎不會發(fā)生，因此可以使用不含有機溶劑的緩沖液(或者含有低濃度有 機溶劑的緩沖液)。結(jié)果，后續(xù)的分析將不會到受包含在收集的生物小分子溶液中的有機溶 劑的影響。實施例1.使用分離生物小分子的整體硅膠柱分離氫化可的松(1)整體硅膠柱的制備用MPC聚合物(分子量約30，OOODa)表面改性市售的整體硅膠柱(通孔尺寸 2iim，間隙孔尺寸12nm，柱尺寸0. 53mm直徑(外徑0. 66mm) X60mm)。在將含有90% MPC 單元和10% 3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的MPC溶液(0. 03%乙醇溶液)作為表 面處理溶液泵送至所述柱120分鐘或更長，從而將其鋪展到通孔和間隙孔的表面之后，使 反應(yīng)在60°C進行30分鐘以進行表面處理。在冷卻至室溫之后，將乙腈泵送通過該柱幾分 鐘，從而沖洗去未反應(yīng)的表面處理劑。(2) HPLC 分析將如此制備的分離生物小分子的整體硅膠柱與UV檢測器連接以組裝HPLC體系 ("SHISEIDO NAN0SPACE”)，分離并檢測加入至5%唾液水溶液的氫化可的松。使用超純水 作為流動緩沖液，將在5%唾液水溶液中的5 u M氫化可的松水溶液的等分試樣(aliquot) (luL)以50i!L/min的流速進行HPLC分析。通過測量242nm波長下的吸光度來檢測氫化 可的松。為了比較，使用市售的預(yù)處理分離柱("CAPCELL PAK MF Ph_l，” Shiseido Co.， Ltd.的產(chǎn)品；2. 0mm I. D. X35mm)由另一在5%唾液水溶液中的5 y M氫化可的松水溶液的 等分試樣(1PL)同樣進行氫化可的松的分離和檢測。注意，該市售的柱的分析在200 yL/ min流速下進行。圖1顯示分離生物小分子的整體硅膠柱和市售的預(yù)處理分離柱獲得的色譜圖。使 用分離生物小分子的整體硅膠柱，在大約6分鐘的洗脫時間時觀察到氫化可的松的峰(見 色譜圖中的字母A)。另一方面，使用市售的預(yù)處理分離柱，在大約4分鐘的洗脫時間時觀察 到峰(見字母B)。如色譜圖中所示，顯然使用分離生物小分子的整體硅膠柱觀察到較高的 氫化可的松峰，與使用市售的預(yù)處理分離柱相比，以較高產(chǎn)率成功地分離出氫化可的松。根據(jù)本發(fā)明實施方式的分離生物小分子的整體硅膠柱，低壓裝載是可行的，而且， 甚至可以使用較小體積的柱從少量樣品溶液中以較高濃度分離生物小分子。因此，本發(fā)明 實施方式可以在P "TAS領(lǐng)域如利用微芯片的醫(yī)學(xué)診斷生物芯片中用于高靈敏度檢測少量 樣品溶液中的生物小分子，并且可以有助于該裝置的小型化。根據(jù)本發(fā)明實施方式的分離生物小分子的整體硅膠柱，可以在不含任何有機溶劑的溶液中回收生物小分子。當在P-TAS領(lǐng)域通過生物傳感器等進行高靈敏度檢測時，本發(fā) 明實施方式可由此避免需要從生物小分子溶液中除去有機溶劑的工作，從而有助于促進分 析體系的自動化。本申請包括2009年2月16日提交日本專利局的日本優(yōu)先權(quán)專利申請JP 2009-032548的公開內(nèi)容有關(guān)的主題，其全部內(nèi)容引入本文作為參考。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，依據(jù)設(shè)計需要和其它因素，可以作出各種修改、組 合、次組合和變換，這些均在權(quán)利要求書或其等價物的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
分離生物小分子的整體硅膠柱，其具有硅膠基體和在該硅膠基體上形成的孔隙，該硅膠基體和孔隙二者的表面已經(jīng)用聚合物改性，使得表面改性的孔隙具有與要分離的生物小分子的分子大小相當?shù)目壮叽?，該聚合物通過聚合單體組合物而得到，該單體組合物包括下式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團的單體其中R1，R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，C1-6烷基或C1-6羥基烷基，R4代表C1-6亞烷基，R5代表氫原子或甲基，和n代表1～4的整數(shù)。FSA00000021966100011.tif
2.分離生物小分子的方法，其包括使用分離生物小分子的整體硅膠柱，所述整體硅膠 柱具有硅膠基體和在該硅膠基體上形成的孔隙，該硅膠基體和孔隙二者的表面已經(jīng)用聚合 物改性，使得表面改性的孔隙具有與要分離的生物小分子的分子大小相當?shù)目壮叽纾摼?合物通過聚合單體組合物而得到，該單體組合物包括下式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團 的單體<formula>formula see original document page 2</formula> …(1)其中R1，R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，C^e烷基或羥基烷基，R4代表(V6 亞烷基，R5代表氫原子或甲基，和n代表1 4的整數(shù)。
3.制備分離生物小分子的整體硅膠柱的方法，所述方法包括以下步驟提供整體硅膠柱，其具有硅膠基體和在該硅膠基體上形成的孔隙，所述孔隙的孔尺寸 根據(jù)要分離的生物小分子預(yù)先確定，提供聚合物，該聚合物通過聚合包含下式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團的單體的單 體組合物而得到，從而根據(jù)要分離的生物小分子的分子大小得到預(yù)先確定的分子量<formula>formula see original document page 2</formula>…⑴其中R1，R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，C^e烷基或羥基烷基，R4代表(V6 亞烷基，R5代表氫原子或甲基，和n代表1 4的整數(shù)，以及用所述聚合物對該整體硅膠柱的硅膠基體和孔隙二者的表面上進行改性。
全文摘要
本發(fā)明公開了分離生物小分子的整體硅膠柱，其具有硅膠基體和在該硅膠基體上形成的孔隙，該硅膠基體和孔隙在其表面已經(jīng)用聚合物改性，使得表面改性的孔隙具有與要分離的生物小分子的分子大小相當?shù)目壮叽?，該聚合物通過聚合單體組合物而得到，該單體混合物包括下式(1)所示的含磷酸膽堿類似基團的單體其中R1，R2和R3相同或相異且各自代表氫原子，C1-6烷基或C1-6羥基烷基，R4代表C1-6亞烷基，R5代表氫原子或甲基，和n代表1～4的整數(shù)。
文檔編號B01J20/283GK101804336SQ201010114749
公開日2010年8月18日 申請日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月16日
發(fā)明者松本真寬, 石原一彥, 勝原智子 申請人:索尼公司