專利名稱：微生物濃集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于捕集或濃集微生物使得它們保持活力以便檢測或測定的方法。在 其他方面，本發(fā)明還涉及用于實施所述濃集方法的診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
由微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病和醫(yī)院內(nèi)獲得性感染為世界各地許多地方所關(guān) 注。因此，測定多種診斷樣品、食品樣品、環(huán)境樣品或其他樣品中細(xì)菌或其他微生物的存在 以確定所存在的微生物的身份和/或量常常是合乎需要的或是必要的。例如，可測定細(xì)菌DNA或細(xì)菌RNA，以甚至在存在其他細(xì)菌種類的情況下評估特定 細(xì)菌種類的存在與否。然而，檢測特定細(xì)菌的存在的能力至少部分取決于所分析的樣品中 細(xì)菌的濃度?？蓪?xì)菌樣品進(jìn)行鋪板或培養(yǎng)，以增加樣品中細(xì)菌的數(shù)量，來確保足夠的檢測 水平，但培養(yǎng)步驟通常需要大量的時間且因此會顯著耽擱評估結(jié)果。使樣品中的細(xì)菌濃集可縮短培養(yǎng)時間或甚至消除對于培養(yǎng)步驟的需要。因此，已 經(jīng)開發(fā)了通過使用特定細(xì)菌株系的特異性抗體(例如，為抗體包被的磁性顆?；蚍谴判灶w 粒的形式)來分離(并由此濃集)該株系的方法。然而，這些方法往往昂貴，而且對于至少 一些診斷應(yīng)用來說速度仍比期望的稍慢。也已經(jīng)使用了非株系特異性的濃集方法(例如，以獲得對樣品中所存在的微生物 的較為一般性的評估)。在濃集了微生物混合群體之后，如果需要，通過使用株系特異性探 針來測定特定株系的存在。已經(jīng)通過基于碳水化合物和凝集素蛋白相互作用的方法實現(xiàn)了微生物的非特異 性濃集或捕集。涂覆殼聚糖的支持物已經(jīng)用作非特異性捕集裝置，并且用作微生物營養(yǎng)素 的物質(zhì)(例如，碳水化合物、維生素、鐵螯合的化合物以及鐵載體)也已經(jīng)被描述為可用作 配體以進(jìn)行微生物的非特異性捕集。多種無機材料(例如，羥基磷灰石和金屬氫氧化物)已經(jīng)用于非特異性結(jié)合和濃 集細(xì)菌。物理濃集方法(例如，過濾、色譜、離心和重力沉降)也已經(jīng)用于非特異性捕集，其 使用和/或不使用無機結(jié)合劑。這些非特異性濃集方法在速度、成本(至少一些需要昂貴 的設(shè)備、材料和/或受過訓(xùn)練的技術(shù)人員)、樣品要求(例如，樣品性質(zhì)和/或體積限制)、 空間要求、使用的方便性(至少一些需要復(fù)雜的多步驟方法)、現(xiàn)場使用的適合性和/或效 果方面不同。

發(fā)明內(nèi)容
因此，我們認(rèn)為迫切需要用于快速檢測病原微生物的方法。所述方法將優(yōu)選不僅 快速而且成本低、簡單(不涉及復(fù)雜的設(shè)備或程序)和/或在多種條件下(例如，不同類型樣品基質(zhì)、不同細(xì)菌負(fù)荷以及不同樣品體積)有效。簡而言之，在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于非特異性濃集樣品中存在的微生 物株系(例如，細(xì)菌、真菌、酵母菌、原生動物、病毒(包括無包膜病毒和有包膜病毒)和細(xì) 菌內(nèi)生孢子的株系)使得微生物保留活力以便檢測或測定一種或多種株系的方法。所述方 法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述濃集劑包含Y-FeO(OH)(也稱為纖鐵礦)；(b)提供包含 至少一種微生物株系的流體樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸(優(yōu)選通過混合 接觸)，使得至少一部分所述濃集劑分散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種微生 物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被所述濃集劑捕集。優(yōu)選地，所述方法還包括檢測所述至少 一種結(jié)合的微生物株系的存在(例如，通過基于培養(yǎng)的檢測方法、顯微鏡法/成像檢測方 法、基因檢測方法、基于生物發(fā)光的檢測方法或免疫檢測方法)和/或分離(優(yōu)選地，通過 重力沉降)所形成的結(jié)合微生物的濃集劑。所述方法還可任選包括將所形成的分離的濃集 劑與所述樣品分開。本發(fā)明的方法不靶向特定的微生物株系。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，某些較便宜的無機材 料可令人驚訝地有效捕集多種微生物。這類材料可以以非株系特異性方式濃集存在于樣 品(例如，食品樣品)中的微生物株系，使得可較容易且快速地測定一種或多種微生物株系 (優(yōu)選地，一種或多種細(xì)菌株系)。本發(fā)明的方法相對簡單且成本低(不需要復(fù)雜的設(shè)備或昂貴的株系特異性材 料)，并且相對快速(相對于無濃集劑的對照樣品，優(yōu)選的實施例在少于約30分鐘捕集存在 于樣品中的至少約70% (更優(yōu)選地，至少約80%;最優(yōu)選地，至少約90%)的微生物)。另 外，所述方法可對于多種微生物(包括諸如革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌之類的病原體) 和多種樣品(不同的樣品基質(zhì)，并且與至少一些現(xiàn)有技術(shù)的方法不同，即使具有低微生物 含量和/或大體積的樣品)有效。因此，本發(fā)明的方法的至少一些實施例可滿足上述對于 在多種條件下快速檢測病原微生物的低成本、簡單方法的迫切需要。在另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于實施本發(fā)明方法的診斷試劑盒，所述試劑 盒包括(a)粒狀濃集劑，所述濃集劑包含Y-FeO(OH) ； (b)檢測容器(優(yōu)選地，無菌檢測容 器)；和(c)關(guān)于使用所述濃集劑實施本發(fā)明方法的說明書。優(yōu)選地，所述診斷試劑盒還包 括一種或多種選自以下的組分微生物培養(yǎng)基、裂解試劑、緩沖劑、基因和生物發(fā)光檢測分 析組分。在又一方面，本發(fā)明提供了一種方法，所述方法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述 濃集劑包含氧化鐵或羥基氧化鐵中的至少一種，所述濃集劑包括微粒附聚物，所述附聚物 包含最大尺寸小于1微米的針狀微晶體；(b)提供包含至少一種微生物株系的流體樣品；以 及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸(優(yōu)選通過混合接觸)，使得至少一部分所述濃集劑分 散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種微生物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被所述 濃集劑捕集。在又一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括(a)粒狀濃集劑，所 述濃集劑包含氧化鐵或羥基氧化鐵中的至少一種，所述濃集劑包括微粒附聚物，所述附聚 物包含最大尺寸小于1微米的針狀微晶體；(b)檢測容器；和(c)關(guān)于使用所述濃集劑實施 權(quán)利要求1所述的方法的說明書。
具體實施方式

定義如本專利申請中所使用的
“樣品”是指所采集的(例如，待分析的)的物質(zhì)或材料。
“樣品基質(zhì)”是指除了微生物以外的樣品組分?！皺z測”是指鑒定微生物的至少一種組分，由此確定微生物的存在。“基因檢測”是指對衍生自靶微生物的遺傳物質(zhì)組分如DNA或RNA的鑒定。“免疫檢測”是指對衍生自靶微生物的抗原物質(zhì)如蛋白質(zhì)或蛋白多糖的鑒定?！拔⑸铩笔侵妇哂羞m于分析或檢測的遺傳物質(zhì)的任何細(xì)胞，包括，例如細(xì)菌、酵 母、病毒和細(xì)菌內(nèi)生孢子?！拔⑸镏晗怠笔侵缚赏ㄟ^檢測方法區(qū)分的特定類型的微生物，例如，不同屬的微 生物，屬內(nèi)不同種的微生物或種內(nèi)不同分離物的微生物)?！鞍形⑸铩笔侵感枰獧z測的任何微生物。濃集劑適用于實施本發(fā)明方法的濃集劑包括包含Y-FeO(OH)(也稱為纖鐵礦)的那些粒 狀濃集劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述濃集劑令人驚訝地比其他含鐵濃集劑更有效地捕集革蘭氏陰性細(xì) 菌，它們是在食源性和水源性疾病以及人類細(xì)菌感染方面受到最大關(guān)注的微生物。所述濃 集劑還包括(除了 Y-FeO(OH))其他組分(例如，勃姆石(α-ΑΙΟ(ΟΗ))、粘土、氧化鐵以及 二氧化硅)，但優(yōu)選地，當(dāng)實施本發(fā)明方法時，這些其他組分不會顯著干擾樣品和所述濃集 劑的緊密接觸。因此，所述濃集劑優(yōu)選基本由Y-FeO(OH)組成。使用上述濃集劑進(jìn)行的濃集或捕集通常不特異性針對任何特定株系、種或類型的 微生物，因此提供了對樣品中微生物全體群落的濃集。然后，可使用任何已知的檢測方法用 特異性探針從捕集的微生物群落中檢測特定的微生物株系。因此，所述濃集劑可用于檢測 臨床樣品、食品樣品、環(huán)境樣品或其他樣品中的微生物污染物或病原體(特別是食源性病 原體，例如細(xì)菌)。Y-FeO(OH)是已知的，可通過已知方法化學(xué)合成(例如，通過在中性或弱酸性ρΗ 下對氫氧化亞鐵進(jìn)行氧化，如在美國專利號4，729，846 (Matsui等人)中為磁帶生產(chǎn)目的所 描述的，將其說明內(nèi)容以引用方式并入本文中)。Y-FeO(OH)還可商購獲得(例如，自Alfa Aesar, A JohnsonMatthey Company, Ward Hill, ΜΑ,禾口自 Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, M0)。在實施本發(fā)明方法中，所述濃集劑是以顆粒形式使用，更優(yōu)選包括微粒[優(yōu)選地， 顆粒尺寸(最大維度)范圍為約3微米(更優(yōu)選地，約5微米；最優(yōu)選地，約10微米)至約 100微米(更優(yōu)選地，約80微米；甚至更優(yōu)選地，約50微米；最優(yōu)選地，約35微米)；其中， 范圍的任何下限可與任何上限配對)的微粒]。優(yōu)選地，所述顆粒是較小顆粒的附聚物。所 述顆粒優(yōu)選包括尺寸小于約1微米(優(yōu)選，尺寸小于約0. 5微米)的微晶體。所述微晶體 可作為針狀微晶體存在，作為包含針狀微晶體的筏狀結(jié)構(gòu)存在，或作為針狀微晶體和筏狀 結(jié)構(gòu)的組合存在。如通過BET (Brunauer-Emmett-Teller)方法(通過氮氣分子的物理吸附 來計算固體的表面積)所測量的，所述濃集劑優(yōu)選其表面積大于每克約25平方米(m2/g)， 更優(yōu)選大于約50m2/g，以及最優(yōu)選大于約75m2/g。
所述顆粒的優(yōu)選附聚形式可提供微細(xì)顆粒系統(tǒng)的吸附能力，而又沒有通常與微細(xì) 顆粒相關(guān)的操作危害和其他危害。另外，所述附聚物顆?？扇菀自诹黧w中沉降，并因此可提 供微生物與流體相的快速分離(如果用于過濾應(yīng)用中的話還容許低反壓)?？稍趲в需F的氧化物或羥基氧化物顆粒中通過幾種涉及制備小微晶體組分的方 法誘導(dǎo)所述附聚物結(jié)構(gòu)。通常，可通過對氫氧化亞鐵或碳酸亞鐵進(jìn)行空氣氧化來產(chǎn)生針鐵 礦和纖鐵礦形式的微細(xì)羥基氧化鐵。纖鐵礦是更優(yōu)選的形式，可通過在維持較低的pH(例 如，約PH 3至約pH 5)的同時對氫氧化亞鐵或碳酸亞鐵進(jìn)行空氣氧化而產(chǎn)生。較高的pH 值可導(dǎo)致產(chǎn)生針鐵礦形式。如果氧化過程中的攪拌速率低(例如，磁力攪拌)，所形成的小 微晶體可自發(fā)地附聚成所需的附聚形式。如果在合成之后仍有不為附聚形式的小微晶體， 則可將顆粒分散體噴霧干燥以形成附聚物，所述附聚物在干燥(例如，在約90至150°C )之 后可保持附聚形式MM 本發(fā)明的方法可用于多種不同類型的樣品，包括但不限于醫(yī)學(xué)樣品、環(huán)境樣品、食 品樣品、飼料樣品、臨床樣品和實驗室樣品以及它們的組合。醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)樣品可包括(例 如)來自生物來源(例如，人或動物)的待測定以便進(jìn)行臨床診斷的細(xì)胞、組織或流體。環(huán) 境樣品可為(例如)來自醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)設(shè)施、工業(yè)設(shè)施、土壤、水源、食品制備區(qū)(食品接觸和 非接觸區(qū))、實驗室或已潛在遭受生物恐怖的區(qū)域。優(yōu)選的是食品加工、處理以及制備區(qū)樣 品，這是因為這些在細(xì)菌病原體導(dǎo)致的食品供應(yīng)污染方面常常受到特別的關(guān)注。所述樣品以流體形式(例如，液體、氣體，或者固體或液體于液體或氣體中的分散 體或懸浮體)用于本發(fā)明方法。以液體形式或以固體于液體中的分散液或懸浮液形式獲得 的樣品可直接使用，或可進(jìn)行濃縮(例如，通過離心)或稀釋(例如，通過添加緩沖液(控 制PH的溶液))。固體或半固體形式的樣品可通過例如用流體介質(zhì)(例如，緩沖液)洗滌或 漂洗或者懸浮或分散于流體介質(zhì)中的方法來萃取，以形成用于所述方法的流體樣品?？蓮?表面(例如，通過擦洗和/或漂洗)獲取樣品?？?直接或者在經(jīng)處理以提供流體樣品后)用于實施本發(fā)明方法的樣品的例子 包括食品(例如，新鮮農(nóng)產(chǎn)品或即食型午餐食品或“deli”肉)、飲料(例如，果汁或碳酸鹽 飲料)、飲用水和生物流體(例如，全血或其組分，例如血漿，富含血小板的血液級分、血小 板濃縮物或濃縮紅細(xì)胞；細(xì)胞制劑(例如，分散的組織、骨髓抽吸物或椎體骨髓)；細(xì)胞懸 浮液；尿液、唾液以及其他體液；骨髓；肺流體；腦流體；傷口滲出物；傷口活檢樣品；眼睛 流體；脊髓液等)，以及可使用已知程序例如使用裂解緩沖液形成的裂解制劑，例如細(xì)胞裂 解物等。優(yōu)選的樣品包括食品、飲料、飲用水、生物流體以及它們的組合(更優(yōu)選為食品、飲 料、飲用水以及它們的組合)。樣品體積可根據(jù)具體應(yīng)用而不同。例如，當(dāng)本發(fā)明方法用于診斷或研究應(yīng)用時，所 述樣品的體積通常為微升范圍(例如，10微升或更大)。當(dāng)所述方法用于食品病原體檢測 分析或用于飲用水安全性檢測時，樣品的體積可通常為毫升至升的范圍(例如，100毫升至 3升)。在工業(yè)應(yīng)用中，例如生物工藝或制藥配方中，所述體積可為成千上萬升。本發(fā)明方法可從濃集狀態(tài)的樣品分離微生物，并且還可使得能從可對待使用的檢 測程序造成限制的樣品基質(zhì)組分分離微生物。在所有這些情況中，本發(fā)明的方法可伴隨或 替代微生物濃集的其他方法而使用。因此，任選地，如果需要另外的濃集，可在實施本發(fā)明方法之前或之后從樣品培養(yǎng)培養(yǎng)物。因此，任選地，如果需要另外的濃集，可在實施本發(fā)明 方法之前或之后從樣品培育培養(yǎng)物。SM可通過多種已知的或?qū)黹_發(fā)的提供兩種材料之間接觸以形成分散體的方法中 的任何方法來實施本發(fā)明方法。例如，可將粒狀濃集劑添加至樣品，或者可將樣品添加至粒 狀濃集劑。可將帶有粒狀濃集劑的壓片或浸漬片或其他物品浸于樣品溶液中，可將樣品溶 液傾至帶有粒狀濃集劑的薄膜上，或者，可將樣品溶液傾至含有粒狀濃集劑的管或微孔中， 等等。在所有情況中，至少一部分粒狀濃集劑變得分散于樣品中。然而，優(yōu)選地，在多種容器中的任何容器(任選地但也優(yōu)選地，帶蓋的容器、閉合 或密封容器，更優(yōu)選地，帶蓋的試管、瓶子或罐)中合并(使用任何添加次序)粒狀濃集劑 和樣品。用于實施本發(fā)明方法的合適的容器將由具體樣品決定，可在尺寸和性質(zhì)上大不相 同。例如，所述容器可為小容器，例如10微升容器(例如，試管)或較大的容器，例如100毫 升或3升容器(例如，三角燒瓶或聚丙烯大口瓶)。容器、濃集劑以及直接接觸樣品的任何 其他裝置或添加劑可在使用前進(jìn)行滅菌(例如，通過受控?zé)?、環(huán)氧乙烷氣或輻射來進(jìn)行)， 以減少或防止任何可導(dǎo)致檢測誤差的對樣品的污染。足以捕集或濃集特定樣品的微生物以 便成功檢測的濃集劑的量是可變動的(取決于例如，濃集劑的性質(zhì)和形式以及樣品體積)， 可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，對于一些應(yīng)用而言，每毫升樣品10毫克濃集劑是 實用的。 如果需要，可通過將粒狀濃集劑至少通過樣品一次來實現(xiàn)接觸(例如，通過依賴 重力沉降例如約10分鐘的一段時間)。可通過混合(例如，通過攪拌、搖動或使用振動臺) 使得濃集劑顆粒反復(fù)經(jīng)過或沉降穿過樣品的大部分，來增強接觸。對于微升級的小體積 (通常，小于0. 5毫升)來說，諸如通過渦旋或“章動”，混合可以是快速的，例如，如美國專 利號5，238，812(Coulter等人)所述，將其說明內(nèi)容以引用方式并入本文中。對于大于或 等于0. 5毫升(通常0. 5毫升至3升)的較大體積來說，可通過以“翻跟頭”的方式輕輕翻 轉(zhuǎn)粒狀濃集劑和樣品來實現(xiàn)混合，例如，如美國專利號5，576，185 (Coulter等人)所述，將 其說明內(nèi)容以引用方式并入本文中?？山柚诶绫辉O(shè)置成固定試管或其他類型反應(yīng)容器 并以“翻跟頭”方式緩慢旋轉(zhuǎn)試管或容器的裝置來實現(xiàn)所述翻轉(zhuǎn)?？蛇M(jìn)行接觸達(dá)所需的時 間(例如，對于等于或小于約100毫升體積的樣品，最多約60分鐘的接觸是有用的；優(yōu)選， 約15秒至約10分鐘或更長時間；更優(yōu)選，約15秒至5分鐘)。因此，在實施本發(fā)明方法中，混合(例如，攪動、振蕩或攪拌)和/或孵育(例如， 在室溫下)是任選的但也是優(yōu)選的，以便增加微生物與濃集劑的接觸。優(yōu)選的接觸方法包 括將含微生物的流體樣品與粒狀濃集劑一起混合[例如，約15秒至約5分鐘)和孵育(例 如，約3分鐘至約30分鐘)。如果需要，在濃集劑和樣品的組合中，可包括一種或多種添加 劑(例如，裂解試劑、生物發(fā)光檢測試劑、核酸捕集試劑(例如，磁珠)、微生物培養(yǎng)基、緩沖 劑(例如，用以分散或萃取固體樣品)、微生物染色試劑、洗滌緩沖液(例如，用以洗除未結(jié) 合材料)、洗脫劑(例如，血清白蛋白)、表面活性劑(例如，可從UnionCarbide Chemicals and Plastics (Houston, TX)獲得的Triton X-100非離子型表面活性劑)、機械磨蝕劑/ 洗脫劑(例如，玻璃珠)等)。分離和/或分離
任選地但也優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括分離所形成的結(jié)合微生物的濃集劑。優(yōu) 選可通過至少部分依賴于重力沉降(重力沉淀，例如，經(jīng)約5分鐘至約30分鐘的時間)實 現(xiàn)這樣的分離。然而，在一些情況下，可取的是加快分離(例如，通過離心或過濾)，或者采 用任何所述分離方法的組合。本發(fā)明的方法還可任選包括將所形成的結(jié)合微生物的濃集劑與樣品分開。這可涉 及去除或分離分離時產(chǎn)生的上清液。可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法(例如，通過傾析或虹 吸，以使得結(jié)合微生物的濃集劑留在用于實施本發(fā)明方法的容器或器皿的底部)實現(xiàn)上清 液的分離。本發(fā)明的方法可人工實施(例如，以分批方式實施)或者可為自動化的(例如，以 使得能夠連續(xù)或半連續(xù)處理)。腿可通過使用本發(fā)明方法來濃集并任選但也優(yōu)選地檢測多種微生物，包括例如細(xì) 菌、真菌、酵母菌、原生動物、病毒(包括無包膜病毒和有包膜病毒)、細(xì)菌內(nèi)生孢子等以及 它們的組合。所述方法可用于檢測病原體，這對于食品安全或?qū)τ卺t(yī)學(xué)、環(huán)境或反恐原因 來說是重要的。所述方法尤其可用于檢測病原性細(xì)菌(例如，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性 菌)，以及多種酵母、霉菌和支原體(以及這些中的任何的組合)。待檢測的靶微生物屬包括但不限于李斯特菌屬(Listeria)、埃希氏桿菌 屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、梭狀芽 ？包桿菌屬(Clostridium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、分枝桿菌屬(Mycobacterium) > 葡萄球菌屬(Staphylococcus)、志賀氏菌屬(Shigella)、腸球菌屬(Enterococcus)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、志賀氏菌屬(Shigella)、鏈球 菌屬(Str印tococcus)、弧菌屬(Vibrio)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、博德特氏菌 屬(Bordetella)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、酵母菌 屬(Saccharomyces)、念珠菌屬(Candida)等以及它們的組合。樣品可含有多種微 生物株系，并且任何一種株系可獨立于任何其他株系而被檢測到。可作為檢測靶的 具體微生物株系包括大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 (Yersiniaenterocolitica)、假結(jié)核耳口爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌 (Vibrio vulnificus)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、酉良酒酵母 菌(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、葡萄球菌腸毒素亞禾中 (Staphylococcal enterotoxin ssp)、賭樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢桿菌 (Bacillus anthracis)(Bacillus atrophaeus)lif (Bacillus subtilis)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭狀芽孢桿菌 (Clostridiumbotulinum)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)、阪崎腸桿菌 (Enterobacter sakazakii)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等以及它們的組合 [優(yōu)選地，金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、白色念珠菌、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸 埃希氏桿菌、人類感染性無包膜腸道病毒(大腸埃希氏桿菌噬菌體為替代物)以及它們的 組合]。
由濃集劑捕集或結(jié)合(例如，通過吸附)的微生物可通過基本上任何目前已知或 將來開發(fā)的所需方法來檢測。該方法包括(例如)基于培養(yǎng)的方法(當(dāng)時間允許時可為優(yōu) 選)、顯微鏡法(例如，使用可用于觀察標(biāo)記熒光染料的微生物的透射光顯微鏡或落射熒光 顯微鏡)以及其他成像方法、免疫檢測方法和基因檢測方法。微生物捕集之后的檢測過程 可任選包括洗滌，以去除樣品基質(zhì)組分。免疫檢測是對衍生自靶生物體的抗原物質(zhì)的檢測，該抗原物質(zhì)通常是充當(dāng)細(xì)菌或 病毒顆粒的表面上的標(biāo)志的生物分子(例如，蛋白質(zhì)或蛋白多糖)?？乖镔|(zhì)的檢測通?？?通過抗體、選自諸如噬菌體展示之類的過程的多肽或來自篩選過程的適體來進(jìn)行。免疫檢測方法是熟知的，并且包括(例如)免疫沉淀和酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)?？梢远喾N方式(例如，通過用熒光染料、用量子點或用可產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶或有 色底物來標(biāo)記第一抗體或第二抗體，和使用讀板機或側(cè)流裝置)來檢測抗體結(jié)合。還可通過基因檢測(例如，通過核酸雜交或引物指導(dǎo)的擴增)來進(jìn)行檢測，基因檢 測常常是優(yōu)選的方法?？蓪⒉都蚪Y(jié)合的微生物裂解，以使它們的遺傳物質(zhì)可供檢測。裂 解方法是熟知的，包括例如下述處理聲裂法、滲透壓休克、高溫處理(例如，約50°C至約 IOO0C )以及與酶一起孵育，該酶例如為溶菌酶、葡萄糖酶、酵母裂解酶(zymolose) 、溶細(xì)胞 酶、蛋白酶K、蛋白酶E和病毒內(nèi)溶素。許多常用的基因檢測分析可檢測特定微生物的核酸，包括DNA和/或RNA?；驒z 測方法中使用的條件的嚴(yán)格性與所檢測的核酸序列的變異水平相關(guān)。高嚴(yán)格的鹽濃度和溫 度條件可使檢測限于靶標(biāo)的精確核酸序列。因此，使用高度嚴(yán)格的基因檢測可區(qū)分靶核酸 序列存在小變異的微生物株系。基因檢測可以基于核酸雜交，其中，單鏈核酸探針與微生物 的變性核酸雜交，使得產(chǎn)生包含探針鏈的雙鏈核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉用于在凝膠電 泳、毛細(xì)管電泳或其他分離方法之后檢測雜交物的探針標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記以 及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。特別有用的基因檢測方法是基于引物指導(dǎo)的核酸擴增。引物指導(dǎo)的核酸擴增方法 包括(例如)熱循環(huán)方法(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以 及連接酶鏈反應(yīng)(LCR))以及等溫法和鏈置換擴增(SDA)(以及它們的組合，優(yōu)選地，為PCR 或RT-PCR)。用于檢測擴增產(chǎn)物的方法包括(但不限于)例如凝膠電泳分離和溴化乙錠染 色，以及檢測產(chǎn)物中摻入的熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記。還可使用在檢測擴增產(chǎn)物之前不需要 分離步驟的方法(例如，實時PCR或均相檢測)。生物發(fā)光檢測方法是熟知的，并且包括(例如)腺苷酸三磷酸(ATP)檢測方法，包 括美國專利號7，422，868 (Fan等人)中所描述的那些，將其說明內(nèi)容以引用方式并入本文中。由于本發(fā)明方法是非株系特異性的，它提供了容許在同一樣品中靶向多種微生物 株系以便檢測的通用捕集系統(tǒng)。例如，在測定食品樣品的污染時，將同一樣品中的單核細(xì)胞 增多性李斯特菌、大腸埃希氏桿菌以及沙門氏菌一并檢測是合乎需要的。在單個捕集步驟 之后接著可進(jìn)行例如PCR或RT-PCR測定，其使用特異性引物來擴增來自這些微生物株系中 每個株系的不同核酸序列。因此，可避免需要對每個株系分開進(jìn)行樣品處理和制備程序。診斷試劑盒用于實施本發(fā)明方法的診斷試劑盒包括(a)上述濃集劑；(b)檢測容器(優(yōu)選地，無菌檢測容器)；和(C)關(guān)于使用所述濃集劑實施本發(fā)明方法的說明書。優(yōu)選地，所述診 斷試劑盒還包括一種或多種選自以下的組分微生物培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基、裂解試劑、緩沖 齊 、生物發(fā)光檢測分析組分(例如，光度計、裂解試劑、螢光素酶、酶底物、反應(yīng)緩沖劑等)、 基因檢測分析組分以及它們的組合。優(yōu)選的裂解試劑是在緩沖劑中提供的水解酶，優(yōu)選的 基因檢測分析組分包括靶微生物的一種或多種特異性引物。例如，本發(fā)明的診斷試劑盒的優(yōu)選實施例包括粒狀濃集劑(例如，在諸如玻璃或 聚丙烯瓶的無菌一次性容器中)，連同關(guān)于使用所述濃集劑實施本發(fā)明方法的說明書(例 如，通過將濃集劑與待分析的流體樣品混合，通過重力使得濃集劑沉降，去除產(chǎn)生的上清 液，以及檢測至少一種被濃集劑結(jié)合的靶微生物株系的存在)。任選地，濃集劑可在含有防 腐劑的小量緩沖液中水合以提高儲存和運輸過程中的穩(wěn)定性，和/或可裝在/等分分配在 撕開式密封袋中以防止污染。濃集劑可以是液體中的分散液或懸浮液形式，或者可為粉末 形式。優(yōu)選地，診斷試劑盒包括預(yù)量出的等份的(例如，基于樣品體積)粒狀濃集劑(更優(yōu) 選地，裝在一個或多個撕開式密封袋內(nèi))。實施例通過以下的實例進(jìn)一步說明本發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點，但不應(yīng)當(dāng)將這些實例中例舉的 具體材料及其量以及其它的條件和細(xì)節(jié)理解成對本發(fā)明的不當(dāng)限制。材料Y-FeO(OH) (60目粉末，直徑小于250微米，目錄號17531)、Fe2O3(粉末，目錄號 10716)以及 Fe3O4(粉末)購自 Alfa Aesar(A JohnsonMatthey Company, Ward Hill, ΜΑ) ο Fe0(10 目粉末，直徑小于 2mm)購自 Sigma-Aldrich Corporation(目錄號 40，086-6， St. Louis,MO)。所有微生物原種培養(yǎng)物均購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas， VA)。使用掃描電子顯微鏡術(shù)(SEM)對各含鐵粉末的樣品進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)Fe3O4樣品主 要包含塊狀、針狀、蠕蟲狀晶體，最小的晶體尺寸小于約5微米，最大的晶體初始尺寸為約 44-45微米。蠕蟲狀晶體包含以小角度晶界連接的較小晶體，邊上有均勻的亞微米孔隙。Fe2O3顆粒的尺寸和形狀與Fe3O4顆粒非常相似，例外的是Fe2O3顆粒樣品含有較大 比例的塊狀、蠕蟲狀晶體的大附聚物(約50-70微米)。Y-FeO(OH)樣品包含較小顆粒的附聚物，所述附聚物尺寸范圍在略小于約10微 米至約60微米。附聚物中的較小顆粒通常包含甚至更小顆粒的簇，所述更小顆粒為針狀， 長度約0. 25-0. 75微米，其他兩種維度尺寸為約0. 05微米至約0. 25微米。在一些情況中， 針狀晶體附聚成更大的約0. 5微米至約1微米筏狀結(jié)構(gòu)。這些筏狀結(jié)構(gòu)相似地附聚成更大 的簇。FeO樣品包含大的顆粒(例如，尺寸大于約150微米)以及較小的顆粒(例如，尺 寸小于約10微米)。大部分樣品作為約30至70微米的顆粒存在。所述顆粒不顯示為多晶 態(tài)。BET (Brunauer-Emmett-Teller)表面積測量將約0. 1-1. Og 濃集劑轉(zhuǎn)移至可購自 Micromeritics，Inc. (Norcross, GA)的直徑 1. 3厘米(0. 5英寸)的樣品管，使用購自Micromeritics的商品名為VACPREP 061的系統(tǒng) 在110°C真空(低于10毫托或0.015毫巴)下至少過夜來除氣。在除氣之后，讓濃集劑在環(huán)境溫度(即20°C至25°C )下真空下冷卻10分鐘，然后裝入購自Micromeritics的商品 名為TRISTAR 3000的表面積和孔隙度分析儀。用在約0開始直到約0. 3的相對壓力(P/P。)，建立8點吸附等溫線(見下表的目 標(biāo)壓力和點)。未設(shè)定第一“壓力固定量”或最大體積增量。將“絕對壓力公差”設(shè)定為5mm Hg，并將“相對壓力公差”設(shè)定為5. 0%。未使用“快速抽真空”選項，進(jìn)行120秒的泄漏檢測。 隨著分析儀杜瓦瓶的液氮降低(即，濃集劑不在液氮中)，在自由空間測量之前應(yīng)用0. 1小 時的抽真空時間。在自由空間測量之后，進(jìn)行除氣測試180秒。升高杜瓦瓶以便分析(即， 將含有濃集劑的管置于液氮中)。在77. 350K (液氮的溫度)，初始測量P。，并在分析過程 中以120分鐘的間隔(如果需要的話)測量。使用氮氣的標(biāo)準(zhǔn)Pstat-溫度表，將氣體吸附 特性設(shè)定為如下數(shù)值非理想系數(shù)，0. 0000620 ；密度轉(zhuǎn)換系數(shù)，0. 0015468 ；分子橫斷面積， 0. 162nm2?；谠?點吸附等溫線過程中各相對壓力下吸附的N2量計算BET吸附表面積。下表顯示了用于分析的壓力和點。目標(biāo)壓力和點 所形成的Y -FeO (OH)的BET表面積為81. 43m2/g，所形成的Fe203的BET表面積為 1. 64m2/g，所形成的Fe304的BET表面積為1. 74m2/g。微牛物濃集試驗方法將分離的微生物菌落接種于5mL BBL Trypticase 大豆肉湯(Becton Dickinson, Sparks, MD)中并在37°C孵育18-20小時。將約 109個菌落形成單位/mL的 該過夜培養(yǎng)物在PH7. 2的吸附緩沖液(含5mM KClUmM CaCl2、0. lmMmgCl2，以及ImM K2HP04) 中稀釋，獲得103個微生物/mL的稀釋液。將1. lmL體積的微生物稀釋液添加至各經(jīng)標(biāo)記的 含 10mg濃集劑的無菌5mL聚丙烯管(BD Falcon ，BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes,NJ),給各管封蓋，并在 Thermolyne MaximixPlus 渦旋混合器(Barnstead International, Iowa)上混合。在室溫(25 °C)下于 Thermolyne Vari Mix 振蕩器平臺(Barnstead International, Iowa)上孵育各封蓋的管15分鐘。在孵育后，讓各管在試驗臺上靜放10分 鐘以使?jié)饧瘎┏两迪聛?。以相同方式處理含?. ImL微生物稀釋液但無濃集劑的對照樣品 管。然后將所形成的沉降的濃集劑和/或上清液(以及對照樣品)用于分析。根據(jù)制造商的說明書，將沉降的濃集劑重懸浮于ImL無菌巴特非爾德氏 (Butterfield' s)緩沖液(pH 7. 2士0. 2 ；磷酸二氫鉀緩沖液；VffR 目錄號 83008-093, VffR, West Chester, PA)中并鋪板于3M Petrifilm 好氧性微生物計數(shù)板培養(yǎng)基(干燥、可再 水合，3M 公司(St. Paul. ,MN)) ο 使用 3M Petrifilm 讀板機(3M 公司(St. Paul.，MN))對 好氧性微生物計數(shù)進(jìn)行定量。使用下式計算結(jié)果重懸浮的濃集劑中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL =(來自鋪板的重懸浮的濃集劑的菌落數(shù))/ (來自鋪板的未處理的對照樣品的菌落數(shù))X100(其中，CFU=菌落形成單位，其為活的或有活力的微生物的單位)。然后使用下式以微生物被濃集劑捕集的百分?jǐn)?shù)來報告結(jié)果捕集效率或捕集百分?jǐn)?shù)=重懸浮的濃集劑中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL濃集劑出于比較目的，在至少一些情況中，移取ImL上清液，未經(jīng)稀釋進(jìn)行鋪板或在巴特 非爾德氏緩沖液中1 10稀釋來鋪板，鋪板至3MTMPetrifilmTM好氧性微生物計數(shù)板培養(yǎng) 基。使用3M Petrifilm 讀板機(3M公司(St. Paul.，MN))對好氧性微生物計數(shù)進(jìn)行定 量。使用下式計算結(jié)果上清液中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL =(來自鋪板的上清液的菌落數(shù))/ (來自鋪板的未處 理的對照樣品的菌落數(shù))X100(其中，CFU=菌落形成單位，其為活的或有活力的微生物的單位)。當(dāng)微生物菌落和濃集劑的顏色相似時(給讀板機提供的對比度很小)，結(jié)果是基 于上清液，因而使用下式以微生物被濃集劑捕集的百分?jǐn)?shù)來報告結(jié)果捕集效率或捕集百分?jǐn)?shù)=100-上清液中的CFU百分?jǐn)?shù)/mL實例1和比較例1-3使用上述微生物濃集試驗方法，分別測定不同含鐵濃集劑各IOmg對靶微生物革 蘭氏陰性菌腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimuriu, ATCC 35987)的細(xì)菌濃集作用。結(jié)果示于下表1中表 1。 實例2-4使用上述微生物濃集試驗方法，分別測定每單位體積不同重量的Y-FeO(OH)對 靶微生物腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的細(xì)菌濃集作用。結(jié)果示于下表 2中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)差均小于10% )。表 2。 實例 5使用上述微生物濃集試驗方法，測定IOmgY-FeO(OH)對靶微生物革蘭氏陽性菌 金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)的細(xì)菌濃集作用。結(jié)果示于下表3中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)差均 小于10% )0表 3。 實例6-8使用上述微生物濃集試驗方法，測定IOmg γ -FeO (OH)在孵育5、10和15分鐘下對 靶微生物腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC35987)的細(xì)菌濃集作用。結(jié)果示于下表 4中(所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)差均小于10% )。表 4。 實例9使用上述微生物濃集試驗方法，測定IOmgY-FeO(OH)對靶微生物白色念珠菌 (102CFU/mL ；ATCC MYA-2876)的酵母菌濃集。根據(jù)制造商的說明書將所形成的材料鋪板于 3M Petrifilm 酵母菌和霉菌計數(shù)板培養(yǎng)基(干燥，可再水合；3M公司(St. Paul，MN))，并孵育5天。對分離的酵母菌落進(jìn)行手工計數(shù)，并如上所述計算出捕集百分?jǐn)?shù)。結(jié)果示于下 表5中(標(biāo)準(zhǔn)差小于10%)。表 5。 實例10 禾口 11測定IOmgY-FeO(OH)濃集劑樣品對靶細(xì)菌內(nèi)生孢子萎縮芽孢桿菌(ATCC 9372) 和枯草芽孢桿菌(ATCC 19659)的濃集作用。采用上述的微生物濃集試驗方法，但有以下修 改過夜培養(yǎng)物分別具有0. 9 X 102CFU/mL萎縮芽孢桿菌和4. 5X102CFU/mL枯草芽孢桿菌； 將所形成的上清液未經(jīng)稀釋進(jìn)行鋪板；將沉降的帶有結(jié)合的萎縮芽孢桿菌的濃集劑重懸浮 于2mL無菌巴特非爾德氏緩沖液中并以雙份進(jìn)行鋪板(各ImL)；將沉降的帶有結(jié)合的枯草 芽孢桿菌的濃集劑重懸浮于5mL無菌巴特非爾德氏緩沖液中并以雙份進(jìn)行鋪板(各ImL)。 基于得自鋪板的上清液的計數(shù)來計算捕集效率，測定出萎縮芽孢桿菌為99%和枯草芽孢桿 菌為96% (所有樣品的標(biāo)準(zhǔn)差均小于10%)。實例12檢測IOmgY-FeO(OH)濃集劑對無包膜的細(xì)菌感染性靶病毒大腸埃希氏桿菌噬菌 體MS2(ATCC 15597-B1 ；其常用作多種人類感染性無包膜腸道病毒的替代物)的濃集作用。 采用大腸埃希氏桿菌(ATCC15597)作為宿主，用雙層瓊脂方法(下文所述)測定對大腸埃 希氏桿菌噬菌體MS2 (ATCC 15597-B1)的捕集。在pH7. 2 的無菌 IX 吸附緩沖液(含有 5mM KClUmM CaCl2、0. ImM MgCl2，以及 ImMK2HPO4)中10倍系列稀釋大腸埃希氏桿菌噬菌體MS2原種，獲得每毫升IO3噬斑形成單 位(PFU/mL)。將1. OmL體積的所形成的噬菌體稀釋液添加至含有IOmg濃集劑的標(biāo)記的無 菌 5mL 聚丙烯管(BD Falcon , Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)，并在 Thermolyne Maximix Plus 渦旋混合器(Barnstead International, Iowa)上混合。在室溫(25°C )下 于 Thermolyne Vari Mix 振蕩器平臺(BarnsteadInternational，Iowa)上孵育封蓋的管 15分鐘。孵育后，讓管在試驗臺上靜放10分鐘以使?jié)饧瘎┏两迪聛怼Ｒ韵嗤绞教幚砗?1. OmL微生物稀釋液但無濃集劑的對照樣品管。然后將所形成的沉降的濃集劑和/或上清 液(以及對照樣品)用于分析。移取100微升上清液，使用下文所述的雙層瓊脂方法測定噬菌體。移取另外的800 微升上清液并棄除。也對100微升沉降的濃集劑測定噬菌體。雙層瓊脂方法將單菌落的大腸埃希氏桿菌(ATCC 15597)接種于25mL無菌的3重量百分?jǐn)?shù)的胰 蛋白酶大豆肉湯(Bacto 胰蛋白酶大豆肉湯，BectonDickinson and Company, Sparks, MD ； 根據(jù)制造商的說明書制備)中，并在設(shè)置為每分鐘250轉(zhuǎn)(rpm)的振蕩培養(yǎng)箱(Irmova 44, NewBrunswick Scientific Co.，Inc.，Edison, NJ)中在 37°C過夜培養(yǎng)。將 750 微升的 該過夜培養(yǎng)物用于接種75mL無菌的3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯。在設(shè)置為250rpm的振動培養(yǎng)箱中于37°C孵育所形成的培養(yǎng)物，獲得指數(shù)期的大腸埃希氏桿菌細(xì)胞，指數(shù)生 長期是通過用 SpectraMaxM5 分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)于 550nm 處 測得的吸光度(吸光度值0. 3-0. 6)來測定。將細(xì)胞在冰上孵育直至用于測定。將100微升的上述噬菌體檢測樣品與75微升冰孵育的大腸埃希氏桿菌(宿主細(xì) 胞)細(xì)胞一起混合，并在室溫(25°C)下孵育5分鐘。將所形成的樣品與5mL無菌的熔化頂 層瓊脂(3重量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯、1. 5重量百分?jǐn)?shù)的NaCl、0. 6重量百分?jǐn)?shù)的瓊 月旨，當(dāng)天制備，保持在48°C的水浴中)混合。然后將該混合物倒至培養(yǎng)皿中的底層瓊脂(3重 量百分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶大豆肉湯、1.5重量百分?jǐn)?shù)的NaCl、l. 2重量百分?jǐn)?shù)的瓊脂)之上。讓 混合物的熔化瓊脂組分固化5分鐘，倒置培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，在37°C下孵育。過夜孵育后，目 測檢查培養(yǎng)板，在三個獨立的試驗中，含有沉降的濃集劑的那些培養(yǎng)板(以及對照培養(yǎng)板) 顯示存在噬菌體噬斑?；趤碜凿伆宓纳锨逡旱挠嫈?shù)來計算捕集效率，測定出為93% (標(biāo) 準(zhǔn)差小于10% )0實例13蘋果汁購自本地雜貨店(Cub Foods，St. Paul)。在無菌玻璃皿中稱量蘋果汁(llg)，將其添加至99mL無菌巴特非爾德氏緩沖液中。將所形成的組合進(jìn)行漩渦混合1 分鐘，并使用腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 35987)和大腸埃希氏桿菌(ATCC 51813)的18-20小時過夜培養(yǎng)物(細(xì)菌原種)，各以lCFU/mL濃度將這兩種細(xì)菌培養(yǎng)物對 所述組合進(jìn)行接種。如上所述在IX吸附緩沖液中制備細(xì)菌原種的系列稀釋液。使用上述微生物濃集試驗方法，將IOmL體積的接了種的蘋果汁樣品添加至含 有IOOmgY-FeO(OH)濃集劑的無菌50mL錐形聚丙烯離心管(BD Falcon , Becton Die kinson,Franklin Lakes，NJ)，檢測對靶微生物沙門氏菌(在競爭性微生物大腸埃希氏桿菌 存在下)的細(xì)菌捕集/濃集。去除所形成的上清液，將沉降的濃集劑轉(zhuǎn)移至另一裝有2mL 3 重量百分?jǐn)?shù)的無菌胰蛋白酶大豆肉湯(Bacto Tryptic Soy Broth,BectonDickinson and Company, Sparks,MD ；根據(jù)制造商的說明書制備)的無菌50mL管。給管封蓋但不蓋牢，混合 其內(nèi)容物，并在37°C下孵育。在過夜孵育后，使用來自SDKStrategic Diagnostics, Inc.， Newark, DE)的RapidChek 沙門氏菌側(cè)流免疫測定測試條檢測所形成的肉湯混合物的沙門 氏菌的存在。目測檢查測試條顯示其為沙門氏菌陽性。還通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對含有微生物的肉湯混合物進(jìn)行核酸檢測。使用來 自 Applied Biosystems (Foster City, CA)的 TaqMan ABI 腸道沙門氏菌檢測試劑盒，測 定作為檢測樣品的ImL上述過夜孵育的含有濃集劑的肉湯的沙門氏菌的存在。也對作為對 照樣品的ImL的腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 35987)的18-20小時過夜培養(yǎng) 物(原種)進(jìn)行了測定。通過使用下列每個循環(huán)的循環(huán)條件(45個循環(huán))在Stratagene Mx3005P QPCR(定量 PCR)系統(tǒng)(StratageneCorporation，La Jolla, CA)中進(jìn)行 PCR 檢 測25°C 30秒，95°C 10分鐘，95°C 15秒，以及60°C 1分鐘。對照樣品獲得的平均(η = 2) 循環(huán)閾值(CT值)為17. 71。從檢測樣品獲得18. 04的平均(η = 2)CT值，表明為陽性PCR 反應(yīng)并證實了沙門氏菌的存在。將本文所引用的包含在專利、專利文獻(xiàn)以及出版物中的參考說明全文以引用方式 并入，就如同各自獨立地并入。在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，對本發(fā)明的多種無 法預(yù)料的修改和更改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非意圖受本文描述的示例性實施例和實例的不當(dāng)限制，所述實例和實施例僅通過舉例方式提 供，本發(fā)明的范圍旨在僅受本文中如下示出的權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
一種方法，所述方法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述濃集劑包含γ-FeO(OH)；(b)提供包含至少一種微生物株系的流體樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸，使得至少一部分所述濃集劑分散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種微生物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被所述濃集劑捕集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括檢測至少一種結(jié)合的微生物株系 的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述濃集劑包括微粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述濃集劑基本由Y-FeO(OH)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物株系選自如下物質(zhì)的株系細(xì)菌、真 菌、酵母菌、原生動物、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述微生物株系選自如下物質(zhì)的株系細(xì)菌、酵母 菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述微生物株系選自革蘭氏陰性細(xì)菌的株系以及 它們的組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接觸是通過將所述濃集劑與所述樣品混合來 進(jìn)行的。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測是通過選自以下的方法進(jìn)行的基于培 養(yǎng)的方法、顯微鏡法和其他成像方法、基因檢測方法、免疫檢測方法、基于生物發(fā)光的檢測 方法以及它們的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括分離所形成的結(jié)合了微生物的 濃集劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述分離通過選自重力沉降、離心、過濾以及它 們的組合的方法來實現(xiàn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述分離至少部分通過重力沉降來實現(xiàn)。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述方法還包括將所述形成的分離的濃集劑與 所述樣品分開。
14.一種方法，所述方法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述濃集劑包含Y-FeO(OH) ； (b) 提供包含至少一種微生物株系的流體樣品，所述微生物選自細(xì)菌、酵母菌、病毒、細(xì)菌內(nèi)生 孢子以及它們的組合；以及(c)將所述濃集劑與所述樣品混合，使得至少一部分所述濃集 劑分散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種微生物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被 所述濃集劑捕集。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述方法還包括檢測至少一種結(jié)合的微生物株 系的存在。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述濃集劑基本由Y-FeO(OH)組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述方法還包括至少部分通過重力沉降來分離 所形成的結(jié)合了微生物的濃集劑，并將所形成的分離的濃集劑與所述樣品分開。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述微生物株系選自如下物質(zhì)的株系細(xì)菌、病 毒、細(xì)菌內(nèi)生孢子以及它們的組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述微生物株系選自革蘭氏陰性細(xì)菌的株系以及它們的組合。
20.一種試劑盒，所述試劑盒包括(a)粒狀濃集劑，所述濃集劑包含Y-FeO(OH) ； (b) 檢測容器；和(c)關(guān)于使用所述濃集劑實施權(quán)利要求1所述的方法的說明書。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括至少一種選自以下的組 分微生物培養(yǎng)基、裂解試劑、緩沖劑、基因檢測分析組分、生物發(fā)光檢測分析組分以及它們 的組合。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述濃集劑包括微粒，所述檢測容器是無菌 且一次性的，并且所述檢測容器容納有所述濃集劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括處于至少一個撕開式密封袋 中的至少一個預(yù)量出的所述濃集劑的等份。
24.一種方法，所述方法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述濃集劑包含氧化鐵或羥基氧 化鐵中的至少一種，所述濃集劑包括微粒附聚物，所述附聚物包含最大尺寸小于1微米的 針狀微晶體；(b)提供包含至少一種微生物株系的流體樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述 樣品接觸，使得至少一部分所述濃集劑分散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種 微生物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被所述濃集劑捕集。
25.—種試劑盒，所述試劑盒包括(a)粒狀濃集劑，所述濃集劑包含氧化鐵或羥基氧 化鐵中的至少一種，所述濃集劑包括微粒附聚物，所述附聚物包含最大尺寸小于1微米的 針狀微晶體；(b)檢測容器；和(c)關(guān)于使用所述濃集劑實施權(quán)利要求1所述的方法的說明 書。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于捕集或濃集微生物以便檢測或測定的方法，所述方法包括(a)提供粒狀濃集劑，所述濃集劑包含γ-FeO(OH)；(b)提供包含至少一種微生物株系的流體樣品；以及(c)使所述濃集劑與所述樣品接觸，使得至少一部分所述濃集劑分散于所述樣品中，并且至少一部分所述至少一種微生物株系被結(jié)合于所述濃集劑或被所述濃集劑捕集。
文檔編號B01J20/14GK101878294SQ200880118360
公開日2010年11月3日 申請日期2008年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月3日
發(fā)明者圖沙爾·A·克希爾薩加爾, 托馬斯·E·伍德, 曼基里·T·克希爾薩加爾 申請人:3M創(chuàng)新有限公司