專利名稱：：色譜介質(zhì)的制作方法色譜介質(zhì)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于分離和純化各種生物分子如肽類、蛋白質(zhì)類和抗體類的新的色譜介質(zhì)、優(yōu)選混合型聚合物色譜介質(zhì)的制備和用途。更具體地說(shuō)，本發(fā)明公開了新的色譜介質(zhì)，優(yōu)選是混合的陰離子交換劑、混合的陰離子-陽(yáng)離子交換劑及疏水的交換劑。所述色譜介質(zhì)通過(guò)將聚合物使用聚乙烯亞胺改性和將其官能化而制備。意外地發(fā)現(xiàn)，這些混合型聚合物介質(zhì)提供了增強(qiáng)了的分離能力和蛋白質(zhì)結(jié)合能力。發(fā)明背景文獻(xiàn)中詳細(xì)記載了通過(guò)離子交換色譜介質(zhì)分析蛋白質(zhì)混合物，例如PeteGagnon,"PurificationToolsforMonoclonalAntibodies",ValidatedBiosystems,Inc.,(1996)。最近，基于蛋白質(zhì)藥物和疫苗的發(fā)展，加大了對(duì)更大規(guī)模純化蛋白質(zhì)混合物的需要。非常期望離子交換色譜介質(zhì)能夠用于該領(lǐng)域。制備這類色譜介質(zhì)物質(zhì)、特別是含伯胺和仲胺官能團(tuán)的陰離子交換劑的一種方法是使用聚乙晞亞胺(PEI)覆蓋多孔硅物質(zhì)的內(nèi)表面。例如，使用聚乙烯亞胺覆蓋二氧化硅顆粒的內(nèi)表面，接著通過(guò)交聯(lián)固定，這已經(jīng)公開于Alpert和Regnier，J.Chromatogr.185，375-392(1979)中，而且以該方式制得的物質(zhì)在合成寡核苷酸的色譜分離中的應(yīng)用已經(jīng)描述在Lawson等人，Anal.Biochem.133,85-93(1983)中。類似地，由聚乙烯亞氨基丙基-三曱氧基硅烷的共價(jià)結(jié)合獲得的PEI覆蓋的多孔硅顆粒或可控多孔玻璃顆粒的制品，已經(jīng)公開于JTBakerChemicalCo.的US4,540,486中。該專利公開了通過(guò)PEI覆蓋的二氧化硅與環(huán)狀羧酸酐的反應(yīng)，形成具有混合的弱堿性/弱酸性官能團(tuán)的色譜樹脂。已經(jīng)表明，當(dāng)這些物質(zhì)在色譜柱中使用時(shí)，可以分離細(xì)胞色素C、al-酸糖蛋白、卵清蛋白和(3-乳球蛋白(弱堿性介質(zhì))的混合物或者卯清蛋白、細(xì)胞色素C、血紅蛋白和溶菌酶(混合的弱堿性/弱酸性介質(zhì))的混合物。在免疫球蛋白G的純化中，PEI衍生的多孔硅或其羧化型的效果已經(jīng)在JTBakerChemicalCo.的US4，606，825中得到證實(shí)。如JTBakerChemicalCo.在US4,721,573中所述，上述PEI覆蓋的二氧化硅的酰化形式通過(guò)^1入磺基，可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成混合的弱酸性/強(qiáng)酸性官能介質(zhì)。使用這種磺酸化介質(zhì)填充的柱子，可以分離細(xì)胞色素C、血紅蛋白、溶菌酶和卵清蛋白的混合物，還可以分離雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分。通過(guò)與單?；然蛑辨滛人狒磻?yīng)，PEI共價(jià)結(jié)合的二氧化硅顆粒還可以轉(zhuǎn)化成疏水的色譜介質(zhì)，其中?；梢允侵辨湡N鏈、苯基或取代的苯基。如JTBakerChemicalCo.在US4,551,245中所述，使用丁酰氯以該方式制得的二氧化硅基質(zhì)弱堿性/反相色譜介質(zhì)，可以分離細(xì)胞色素C、肌紅蛋白、溶菌酶、卵清蛋白和a-糜蛋白酶原。在聚乙烯醇(PVA)臂的末端具有離子交換基團(tuán)的瓊脂糖珠已經(jīng)在Amersham的WO98/58732中被公開。然而，與本發(fā)明不同的是，PVA間隔臂既不賦予產(chǎn)物任何離子交換能力，其自身也不提供混合型產(chǎn)物中的一種官能性。二氧化硅基質(zhì)色譜填料的一個(gè)主要缺點(diǎn)是其在高pH下缺乏穩(wěn)定性。對(duì)于涉及純化藥物的應(yīng)用而言尤其如此，這是因?yàn)槭褂肐N氫氧化鈉處理設(shè)備是常規(guī)的滅菌操作。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能夠在高pH下降低或避免上述缺乏穩(wěn)定性的色譜介質(zhì)。本發(fā)明還提供了混合型色譜介質(zhì)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，避免該不穩(wěn)定性問(wèn)題的一個(gè)可能方法是使用基于在聚合物表面上使用PEI衍生(即非交聯(lián))的聚合物載體的色譜填料，其表面衍生介質(zhì)可以進(jìn)一步通過(guò)官能化試劑與在聚合物樹脂表面上的聚乙烯亞胺的末端氨基的反應(yīng)官能化。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選可以提供混合型介質(zhì)，例如具有混合的伯胺、仲胺和叔胺交換位點(diǎn)的介質(zhì)、具有弱陰離子和弱陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的介質(zhì)、具有弱陰離子、弱陽(yáng)離子和強(qiáng)陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的介質(zhì)、具有弱陰離子和疏水(反相)交換位點(diǎn)的介質(zhì)、及具有弱陰離子和強(qiáng)陽(yáng)離子的介質(zhì)。此外，意外地發(fā)現(xiàn)，基于這種聚乙烯亞胺衍生的聚合且官能化的衍生物的色譜介質(zhì)提供了不同和獨(dú)特的分離特性。在本發(fā)明一方面，提供了用于生物分離的聚合物色譜介質(zhì)。本發(fā)明不同于現(xiàn)有的聚合物色譜介質(zhì)之處在于制備方法和介質(zhì)特性，這是因?yàn)檫@些現(xiàn)有的色譜介質(zhì)是簡(jiǎn)單的離子交換劑。另外，就制備方法、組成、用途和性能而言，本發(fā)明的介質(zhì)不同于現(xiàn)有的二氧化硅基質(zhì)介質(zhì)。出人意料地，根據(jù)本發(fā)明制得的聚合物混合型介質(zhì)具有提高了的分離和結(jié)合能力。附圖簡(jiǎn)述通過(guò)但不限于附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性說(shuō)明，其中圖1是使用根據(jù)實(shí)施例1制得的介質(zhì)和PEI二氧化硅介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例34的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV;險(xiǎn)測(cè)器記錄；圖2是使用根據(jù)實(shí)施例9制得的介質(zhì)和混合型二氧化硅介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例35的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV;險(xiǎn)測(cè)器記錄；圖3a和3b是使用根據(jù)實(shí)施例19制得的介質(zhì)和二氧化硅介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例37的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV檢測(cè)器記錄；圖4是使用根據(jù)實(shí)施例20制得的介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例38的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV;險(xiǎn)測(cè)器記錄；圖5是使用根據(jù)實(shí)施例22制得的介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例39的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV;險(xiǎn)測(cè)器記錄；圖6是使用根據(jù)實(shí)施例23制得的介質(zhì)，根據(jù)實(shí)施例40的方法分離蛋白質(zhì)的洗脫分布圖，通過(guò)UV檢測(cè)器記錄；圖7是根據(jù)實(shí)施例7制備的介質(zhì)的酸穩(wěn)定性圖，根據(jù)實(shí)施例41的方法測(cè)定；和圖8是根據(jù)實(shí)施例7制備的介質(zhì)的堿穩(wěn)定性圖，根據(jù)實(shí)施例42的方法測(cè)定。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的聚合物色譜介質(zhì)、優(yōu)選混合型聚合物色譜介質(zhì)的制備和優(yōu)選所述聚乙烯亞胺衍生的聚合物顆粒進(jìn)一步使用適宜的試劑官能化。用于色譜分離蛋白質(zhì)的聚合物優(yōu)選具有某些性質(zhì)，如1)孔徑大小足夠大，以使與蛋白質(zhì)一樣大的分子快速擴(kuò)散進(jìn)出樹脂顆粒;2)蛋白質(zhì)和非官能化聚合物之間的相互作用弱，以避免"非特異性相互作用"，從而可以高收率回收希望的蛋白質(zhì)；3)樹脂顆粒足夠堅(jiān)硬，以避免在色譜操作的遭遇的壓力下壓縮和損失流動(dòng)速率；和4)在分離過(guò)程中遭遇的各種條件下，樹脂應(yīng)當(dāng)是化學(xué)穩(wěn)定的。使用聚乙烯亞胺表面衍生的聚合物樹脂顆?？梢允侨魏芜m宜的能夠使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物樹脂顆粒，且所述聚乙烯亞胺衍生的聚合物或其進(jìn)一步官能化的衍生物可用作色譜分離介質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，適合使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物樹脂顆粒的實(shí)例包括但不限于纖維素、瓊脂糖、環(huán)氧化或卣化的聚苯乙烯、環(huán)氧化或卣化的聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯、及環(huán)氧化或卣化的聚二乙烯基苯。例如，多孔聚(甲基)丙烯酸酯，基于具有多個(gè)可聚合雙鍵的(甲基)丙烯酸單體的高度交聯(lián)樹脂，如在成孔劑存在下制得的二曱基丙烯酸乙二醇酯(ShowaDenko的US4,118,347)、三甲基丙烯酸季戊四醇酯(ToyoSoda的US4,256,842)、三曱基丙烯酸三羥曱基丙烷酯(Rohm和Haas的US4，582，860)或二曱基丙烯酸甘油酯(Mitsubishi的US2,254,634)，已經(jīng)表明可以提供具有所需性質(zhì)的物質(zhì)。此外，向聚合反應(yīng)混合物中加入官能單體，可以提供具有官能團(tuán)的最終產(chǎn)物，其他分子可以通過(guò)形成共價(jià)鍵與其結(jié)合。這種單體的實(shí)例是曱基丙烯酸甘油酯(-OH基團(tuán))(Mitsubishi的US2,254,634,1993)、曱基丙烯酸二曱基氨乙基S旨(叔胺)或曱基丙烯酸縮水甘油基酯(ShowaDenko的US4，118,347，ToyoSoda的US4,256,842,Rohm和Haas的US4,582,860)。與PEI表面衍生的聚合物樹脂顆粒反應(yīng)的適宜的官能化試劑的實(shí)例是例如酸酐如環(huán)狀羧酸酐如戊二酸肝和琥珀酸酐、不^:包和羧酸肝如馬來(lái)酸酐、^璜化試劑如亞好L酸氫鹽如偏亞碌^酸氫鈉、烷基氯或酸酐如丁酰氯和乙酸酐或丁酸酐、及含季銨官能團(tuán)的烷基氯如(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨、以及這些官能化試劑的混合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，具有混合的伯胺、仲胺和叔胺位點(diǎn)的陰離子交換劑通過(guò)將聚乙烯亞胺與具有環(huán)氧基團(tuán)或由化基團(tuán)如氯、溴、碘基團(tuán)的聚合物載體反應(yīng)而制得。這樣的聚合物載體可以是任何適宜的合成聚合物或天然聚合物樹脂，如聚(曱基)丙烯酸酯、纖維素、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(Polystyrene-divinylbenzene)及瓊脂糖。所述可商購(gòu)得到的樹脂實(shí)例是TosohBiosciencesToyopearlAF-epoxy650M、環(huán)氧基活4匕的Sepharose6B。這些物質(zhì)可以與不同分子量的聚乙烯亞胺的一個(gè)末端氨基，通過(guò)形成化學(xué)上穩(wěn)定的a-羥基氨基而發(fā)生反應(yīng)。按照這種方式根據(jù)下述實(shí)施例l-5制得的物質(zhì)的一些性質(zhì)匯總在表l中。在第二實(shí)施方案中，具有弱陰離子和弱陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的混合型介質(zhì)通過(guò)在下述實(shí)施例6-10中，將PEI官能化的聚合珠與環(huán)狀羧酸酐如戊二酸酐或琥珀酸酐反應(yīng)而制得。在第三實(shí)施方案中，具有弱陰離子、弱陽(yáng)離子和強(qiáng)陽(yáng)離子位點(diǎn)的混合型介質(zhì)通過(guò)將PEI衍生的聚合物與不飽和羧酸酐反應(yīng)，接著磺化而制得，如實(shí)施例11-13中所述。在第四實(shí)施方案中，具有弱陰離子和疏水(反相)位點(diǎn)的混合型介質(zhì)通過(guò)將PEI衍生的聚合物與烷基氯(實(shí)施例14-18)或一元酸酐(實(shí)施例19-24)反應(yīng)而制得。與丁酰氯的反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行2小時(shí)，使用曱苯或二p惡烷作為溶劑。三乙胺用于清除作為反應(yīng)副產(chǎn)物生成的鹽酸。在第五實(shí)施方案中，混合型介質(zhì)是通過(guò)PEI覆蓋的樹脂與丁酸酐反應(yīng)而獲得，PEI覆蓋的樹脂與丁酸酐的反應(yīng)是在60°C下、在l-曱氧基-2-丙醇中進(jìn)行3小時(shí)，如下述實(shí)施例20-22中所述。其中疏水部分是曱基或曱基和丁基的組合的混合型弱堿性/反相樹脂，可以通過(guò)4吏用乙酸酐或者先后加入丁酸酐和乙酸酐而制得，分別如實(shí)施例24(乙酸酐)或?qū)嵤├?0和23(混合的酸酐)所述。同樣地，通過(guò)一種試劑至多種試劑的組合可以改變和選擇適當(dāng)?shù)氖杷浴Ｔ诘诹鶎?shí)施方案中，具有弱陰離子和強(qiáng)陰離子(季銨)位點(diǎn)的混合型介質(zhì)通過(guò)將PEI衍生的聚合物與含末端季銨官能團(tuán)的烷基氯反應(yīng)而制得。更具體地說(shuō)，如下面實(shí)施例25-30所述，在70-80。C的氫氧化鈉水溶液中，將PEI衍生的聚合物與(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，意外地發(fā)現(xiàn)，這些聚合物的混合型色譜介質(zhì)提供了增強(qiáng)了的分離能力和高容量和穩(wěn)定性。例如，聚合物的混合型陰離子交換介質(zhì)可以分離溶菌酶、免疫球蛋白G、牛血清清蛋白、(3-乳球蛋白A及(3-乳球蛋白B,而如圖l所示，PEI-二氧化硅基質(zhì)介質(zhì)卻不能分離所有這些蛋白質(zhì)?；旌闲完?yáng)離子交換介質(zhì)可以有效地分離BSA、IgG、細(xì)胞色素-C和溶菌酶，如圖2所示，而混合型二氧化硅介質(zhì)卻不能分離所有這些蛋白質(zhì)。實(shí)施例實(shí)施例1將12g平均粒度為直徑35微米的含有環(huán)氧基的曱基丙烯酸酯聚合物及250ml二"惡烷置于裝備有漏斗、攪拌器、回流冷凝器和正氮?dú)鈮哼M(jìn)氣口的1L圓底燒瓶中，攪拌30分鐘使樹脂溶脹。加入20g聚乙烯亞胺(PEI，平均分子量600道爾頓)，用另外的150ml二p惡烷沖洗漏斗。攪拌的混合物回流過(guò)夜?；旌衔锢鋮s后，將混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干(drained),用二嚅烷洗滌一次，曱醇洗滌三次，在60。C下真空干燥。元素分^f斤57.8%C、7.4%H和5.6%N。實(shí)施例2將5g含有環(huán)氧基的曱基丙烯酸酯聚合物及150ml二p惡烷置于裝備有攪拌器和回流冷凝器的500ml圓底燒瓶中。加入30gPEI(平均分子量1200道爾頓)，混合物回流過(guò)夜。冷卻后，將混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用二-惡烷洗滌兩次，曱醇洗滌三次，干燥。元素分析55.7。/。C、7.8%H、5.5%N。實(shí)施例3將5g含有環(huán)氧基的曱基丙烯酸酯聚合物及150ml的二嚅烷與水50/50的混合物置于裝備有攪拌器和回流冷凝器的500ml圓底燒瓶中。加入30gPEI(平均分子量1200道爾頓)，混合物回流過(guò)夜(89。C)。冷卻后，將混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用二嚙烷洗滌兩次，曱醇洗滌三次，干燥。元素分析表明最終產(chǎn)物含有57.5%C、7.4%H、2.5%N。實(shí)施例4將5g含有環(huán)氧基的曱基丙烯酸酯聚合物及100ml30wt。/。平均分子量10,000道爾頓PEI的二嘌烷溶液置于裝備有攪拌器、氮?dú)馊肟诤突亓骼淠鞯?50ml圓底燒瓶中，攪拌的混合物回流過(guò)夜。冷卻后，將混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用60。C的水洗滌三次，曱醇洗滌三次，再在60。C的真空烘箱中干燥過(guò)夜。元素分析表明最終產(chǎn)物含有56.5%C、7.8%H、6.4%N。實(shí)施例5將5g含有環(huán)氧基的曱基丙烯酸樹脂及100ml30wt%平均分子量10,000道爾頓PEI的水溶液置于裝備有攪拌器和回流冷凝器的250ml圓底燒瓶中，攪拌的混合物回流17.5小時(shí)。冷卻后，將混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用水洗滌三次，曱醇洗滌三次，再在60。C的真空烘箱中干燥過(guò)夜。元素分析表明最終產(chǎn)物含有56.9%C、7.5。/。H和3.2。/。N。如表l中的結(jié)果所示，系統(tǒng)中水的存在對(duì)于氮?dú)獾囊胗胁焕绊懀?dāng)不同分子量的PEI與樹脂在無(wú)水二哺烷中反應(yīng)時(shí)，獲得相近的氮?dú)夂?雖然在實(shí)施例1中具有較低的PEI與聚合物比例)。表1.溶劑和PEI分子量對(duì)于氮?dú)饧尤氲挠绊?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>根據(jù)表1中的結(jié)果進(jìn)一步表明，與二p惡烷/水混合物或純水相反，最終產(chǎn)品中的氮含量說(shuō)明在純二p惡烷中進(jìn)行的反應(yīng)獲得更高程度的官能化。當(dāng)純二嘈、烷用作溶劑(表1第1行)，隨著PEI的分子量由600增加至10,000道爾頓，并沒有明顯更高水平地引入氮?dú)?。?shí)施例6將實(shí)施例1中制得的30gPEI聚合物使用其體積100%的乙醇洗滌兩次，使用其自身體積的l-曱氧基-2-丙醇洗滌兩次，除去所有殘留水分。然后聚合物在450mll-甲氧基-2-丙醇中漿化，轉(zhuǎn)移至裝備有頂部攪拌器、回流冷凝器和正氮?dú)鈮哼M(jìn)氣口的燒瓶中，加熱至60。C。加入19.43g的95%戊二酸酐(1當(dāng)量，基于PEI樹脂的含氮量)的溶液后，在60+/-2°C下維持溫度2.5小時(shí)。反應(yīng)混合物然后轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，殘留固體用100ml1-曱氧基-2-丙醇洗滌1次，用100ml曱醇洗滌兩次，用100ml儲(chǔ)備液(乙醇水20:80v/v，或100mM乙酸鈉pH4.5含2。/。千醇)洗滌兩次。產(chǎn)物儲(chǔ)存在各自的儲(chǔ)備液中，用于表征和蛋白質(zhì)的色譜分離。元素分析表明最終產(chǎn)物含有%C=55.1，％N=4.6。實(shí)施例7將73.7g根據(jù)實(shí)施例1制得的PEI覆蓋的聚合物、225ml1-曱氧基-2-丙醇及14.4g琥珀酸酐加熱至60+/-2。C,在此溫度下保持2.5小時(shí)。反應(yīng)混合物然后轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，殘留固體用100mll-曱氧基-2-丙醇洗滌1次，用100ml曱醇洗滌兩次，用100ml的實(shí)施例5所述的儲(chǔ)備緩沖液洗滌兩次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.08%C、7.13。/。H和4.86。/。N。實(shí)施例8除了琥珀酸酐的進(jìn)料量是17.34g夕卜，才艮據(jù)實(shí)施例7進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.18%C、7.97。/。H和5.18%N。實(shí)施例9將根據(jù)實(shí)施例1制得的11gPEI覆蓋的聚合物使用其體積的100%乙醇洗滌兩次，使用其自身體積的二嗜烷洗滌兩次，除去所有殘留水分。然后樹脂在200ml二嘌烷中漿化，轉(zhuǎn)移至裝備有氮入口管的三頸燒瓶中，加熱至50-60。C。l小時(shí)后,加入7g戊二酸酐，在60+Z-2。C下維持溫度2.5小時(shí)。反應(yīng)混合物然后轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，殘留固體用二哺烷洗滌三次，甲醇洗滌三次，真空干燥。元素分析表明最終產(chǎn)物含有56.64%C、7.54%H和4.36%N。實(shí)施例10除了使用10g根據(jù)實(shí)施1制得的PEI聚合物及6.6g琥珀酸肝外，根據(jù)實(shí)施例9進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有54.46%C、7.96%H和4.6%N。表2.具有弱陰離子和弱陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的介質(zhì)的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例11將86.5g根據(jù)實(shí)施例1制得的PEI聚合物及865ml的曱氧基-2-丙醇置于裝備有攪拌器和回流冷凝器的2L圓底燒瓶中，攪拌30分鐘。加入23.7g馬來(lái)酸酐，混合物在60。C下攪拌2.5小時(shí)?；旌衔锢鋮s后，混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用曱氧基-2-丙醇洗滌一次，水洗滌三次，曱醇洗滌三次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有％C55.6、％N4.9、％H7.1、％S0。實(shí)施例12將86.5g根據(jù)實(shí)施例11馬來(lái)酸化的樹脂在80+/-2。C下、在190g偏亞石克酸氫鈉存在下、在卯Oml0.01N氫氧化鈉中加熱6小時(shí)。反應(yīng)混合物冷卻后，混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用曱氧基-2-丙醇洗滌一次，水洗滌三次，曱醇洗滌三次，在儲(chǔ)備緩沖液中儲(chǔ)存供進(jìn)一步使用。元素分析表明最終產(chǎn)物含有％C49.8、％N4.6、％H6.8、％S2丄實(shí)施例13除了反應(yīng)在80+/-2。C下進(jìn)行20小時(shí)夕卜，根據(jù)實(shí)施例12進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有％C50.2、％N4.5、％H6.8、％S2.1。比4支反應(yīng)8小時(shí)(3.8%S，實(shí)施例12)和20小時(shí)(3.40%S,'實(shí)施例13)后得到的樣品的含硫量，表明在8小時(shí)后反應(yīng)完全。實(shí)施例14將30g根據(jù)實(shí)施例1制得的官能化的PEI使用120ml100%乙醇洗滌兩次，120ml曱苯洗滌兩次，除去殘留的水分。然后物質(zhì)在300ml的曱苯中漿化，加入9.29g丁酰氯(1當(dāng)量，基于樹脂的含氮量計(jì))和9.24g的三乙胺，反應(yīng)在25+/-2°C下進(jìn)行2小時(shí)。然后將樹脂轉(zhuǎn)移至吸濾^L中，用300ml曱苯、300ml曱醇洗滌，用300ml去離子水洗滌兩次，用300ml曱醇洗滌三次，用300mlpH5的4諸備緩沖液(10mM乙酸鈉，pH4.5)洗滌兩次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.7%C、7.5。/。H和5.6。/。N。實(shí)施例15除了溶劑是450ml二嗜、烷外，根據(jù)實(shí)施例14進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有54.7%C、S.0。/oH和5.5。/oN。實(shí)施例16除了使用13.3g丁酰氯和13.2g三乙胺外，根據(jù)實(shí)施例14進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.6%C、7.9。/。H和4.5。/。N。實(shí)施例17除了使用19g丁酰氯和18g三乙胺外，根據(jù)實(shí)施例14進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有55.4%C、7.8。/。H和4.2。/。N。實(shí)施例18除了使用25.3g丁酰氯和24g三乙胺外，根據(jù)實(shí)施例14進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有55.0%C、7.9。/oH和4.5。/oN。使用甲苯作為溶劑得到的結(jié)果匯總在表3中。表3.PEI覆蓋的樹脂與丁酰氯在曱苯中的反應(yīng)(室溫下2小時(shí))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3中的結(jié)果表明，試劑量增加導(dǎo)致官能化水平增加(通過(guò)產(chǎn)物的含氮量相應(yīng)增加表明)。實(shí)施例19將60g根據(jù)實(shí)施例1制得的、并在200ml1-甲氧基-2-丙醇中溶脹的PEI官能化的聚合物、600mll-曱氧基-2-丙醇、56.3g丁酸酐(1.5摩爾過(guò)量)和36g三乙胺在60+/-2。C下反應(yīng)3小時(shí)。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用500mll-曱氧基-2-丙醇洗滌一次，用500ml曱醇洗滌一次，用500ml去離子水洗滌兩次，用500ml儲(chǔ)備緩沖液洗滌兩次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有54.6%C、7.9。/。H和4.8。/。N。實(shí)施例20將60g根據(jù)實(shí)施例1制得的、并在200mll-曱氧基-2-丙醇中溶脹的PEI官能化的聚合物、600mll-曱氧基-2-丙醇、6.2g丁酸酐和4.0g三乙胺在60+A2。C下反應(yīng)3小時(shí)。此時(shí)加入24.2g乙酸酐，反應(yīng)在相同溫度下再進(jìn)行3小時(shí)。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用500ml1-曱氧基-2-丙醇洗滌一次，用500ml曱醇洗滌一次，用500ml去離子水洗滌兩次，用500ml儲(chǔ)備緩沖液洗滌兩次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.7%C、7.7%H和4.7%N。實(shí)施例21除了使用6.26g丁酸酐和4.0g三乙胺外，根據(jù)實(shí)施例19進(jìn)行反應(yīng)。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.7%C、7.9。/oH和4.8。/。N。實(shí)施例22除了使用1.52g丁酸酐和1.0g三乙胺外，根據(jù)實(shí)施例19進(jìn)行反應(yīng)。最終產(chǎn)物的元素分析是54.6%C、8.3%H和5.0%N。部分結(jié)果匯總在表4中。表4.PEI覆蓋的樹脂與丁酸肝在1-曱氧基-2-丙醇中反應(yīng)(60。C下3小時(shí))<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>比較表3和4中的結(jié)果表明，與采用丁酰氯所獲得的相當(dāng)?shù)娜〈娇梢越柚∷狒褂孟喈?dāng)?shù)突瘜W(xué)計(jì)量的試劑實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例23根據(jù)實(shí)施例20進(jìn)行反應(yīng)，除了使用1.52g丁酸酐和1.0g三乙胺及10.7g乙酸酐外。元素分析表明最終產(chǎn)物含有55.4%C、7.9。/。H和4.9。/oN。實(shí)施例24將60g根據(jù)實(shí)施例1制得的、并在20mll-曱氧基-2-丙醇中溶脹的PEI官能化的聚合物、500mll-曱氧基-2-丙醇、14.07g乙酸酐在60+/-2。C下反應(yīng)6小時(shí)。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，抽干，用500mll-曱氧基-2-丙醇洗滌一次，用500ml0.1NNaOH洗滌兩次，用500ml去離子水洗滌兩次，用500ml儲(chǔ)備緩沖液洗滌兩次。元素分析表明最終產(chǎn)物含有53.8%C、7.50/oH和5.3%N。實(shí)施例25將80g根據(jù)實(shí)施例1制得的PEI官能化的聚合物在80°C下與59g60%(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨在500ml0.5N氫氧化鈉溶液中反應(yīng)8小時(shí)。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至吸濾瓶中，用0.1N氫氧化鈉洗滌兩次，用去離子水洗滌兩次，用儲(chǔ)備緩沖液洗滌一次。洗滌和干燥后，樹脂具有下述元素分析54.2%C、8.4%H和5.9%N。實(shí)施例26除了氫氧化鈉溶液是0.05N外，根據(jù)實(shí)施例25進(jìn)行反應(yīng)。洗滌和干燥后，樹脂具有下述元素分析51.9%C、7.6。/。H和5.3。/oN。實(shí)施例27除了反應(yīng)進(jìn)行16小時(shí)外，根據(jù)實(shí)施例25進(jìn)行反應(yīng)。洗滌和干燥后，樹脂具有下述元素分析53.4%C、8.4。/。H和5.7。/oN。實(shí)施例28除了反應(yīng)進(jìn)行16小時(shí)外，根據(jù)實(shí)施例26進(jìn)行反應(yīng)。洗滌和干燥后，樹脂具有下述元素分析52.8%C、8.1%H和5.7%N。實(shí)施例29除了60%(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨溶液與樹脂的比例是0.4而不是0.73夕卜，根據(jù)實(shí)施例25進(jìn)行反應(yīng)。洗滌和干燥后，樹脂具有下述元素分析53.72%C、7.32%H和6.04%N。實(shí)施例30除了60%(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨溶液與樹脂的比例是1.2而不是0.73外，根據(jù)實(shí)施例25進(jìn)行反應(yīng)，。洗滌和千燥后，樹脂具有下述元素分析53.72%C、7.32%H和6.04%N。表5.PEI覆蓋的樹脂與(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨的反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例31將160g根據(jù)實(shí)施例1制得的PEI官能化的聚合物在40°C下與111.8g曱醛、400ml乙腈及25.9g氰基硼氫化鈉反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)后，聚合物用480ml乙腈洗滌，用480ml去離子水洗滌，用480ml曱醇洗滌三次，然后在儲(chǔ)備緩沖液中儲(chǔ)存，供進(jìn)一步使用(元素分析％C=55.2、°/。N=5.8)。實(shí)施例32將25mg根據(jù)實(shí)施例31制得的聚合物和200ml乙腈加入高壓釜(裝備有具有Parr4840溫度控制器的壓力反應(yīng)器的Parrseries4500試驗(yàn)臺(tái))中。在120RPM下攪拌聚合物，同時(shí)加入曱基氯氣體，加壓至60PSI。反應(yīng)在80。C下保持5小時(shí)。反應(yīng)后，產(chǎn)物用60ml乙腈洗滌，用120ml0.1N氫氧化鈉洗滌，用120ml去離子水洗滌，用240ml儲(chǔ)備緩沖液洗滌，然后在儲(chǔ)備緩沖液中儲(chǔ)存。實(shí)施例33將71g根據(jù)實(shí)施例1制得的PEI改性的聚合物與500ml0.5N氫氧化鈉混合，然后與49g3-(二曱氨基)丙基氯反應(yīng)，同時(shí)在80。C、50-100RPM下攪拌8小時(shí)。反應(yīng)后，產(chǎn)物用500ml氫氧化鈉洗滌兩次，用500ml去離子水洗滌兩次，用500ml儲(chǔ)備緩沖液洗滌兩次，然后在儲(chǔ)備緩沖液中儲(chǔ)存，供進(jìn)一步使用。元素分析％C:55.4、％N:6.2。實(shí)施例34蛋白質(zhì)的色譜分離將根據(jù)實(shí)施例1制得的色譜介質(zhì)和來(lái)自JTBaker的PEI二氧化硅介質(zhì)(產(chǎn)品號(hào)7264,批號(hào)N16084)填充在4.6x100mm色譜柱中。將200微升1mg/ml溶菌酶、2mg/ml兔疫球蛋白G、2mg/ml牛血清清蛋白和各自為2mg/ml(3-乳球蛋白A和B在20mMpH6.2乙酸鈉緩沖液中的溶液注射入柱中，使用流速為1ml/min及由pH6.2的100%20mM乙酸鈉緩沖液至pH6.2的100%1.0M乙酸鈉緩沖液梯度洗脫30min。蛋白質(zhì)的洗脫液通過(guò)UV檢測(cè)器在280nm下記錄(圖1)。實(shí)施例35蛋白質(zhì)的色譜分離將根據(jù)實(shí)施例9制得的色語(yǔ)介質(zhì)填充在4.6x100mm色鐠柱中。將200微升4mg/mlBSA、2mg/ml兔IgG、2mg/ml細(xì)胞色素-c及2mg/ml溶菌酶在20mMpH6.2乙酸鈉緩沖液中的溶液注射入柱中，使用流速1ml/min及由pH6.2100%的20mM乙酸鈉緩沖液至pH6.2100%的相同洗脫液、但是含有l(wèi)mol/L乙酸鈉梯度洗脫40min。通過(guò)本實(shí)施例的介質(zhì)和用于對(duì)照的二氧化硅基質(zhì)混合型介質(zhì)(JTBaker產(chǎn)品號(hào)7269)的蛋白質(zhì)洗脫液，通過(guò)UV才企測(cè)器在280nm下記錄(圖2)。實(shí)施例36容量比較測(cè)量和比較根據(jù)實(shí)施例9制得的色譜介質(zhì)及二氧化硅基質(zhì)產(chǎn)品的容量。將柱子(4.6mmx50mm)用上述介質(zhì)填充。IgG在pH5.6、6.2和6.9的20mM乙酸鈉溶液中的溶液(lmg/ml)以可變線速度(cm/hr)施加于柱子。通過(guò)在280nm下檢測(cè)UV測(cè)定漏出。柱子中介質(zhì)的漏出容量(breakthroughcapacity)在10%漏出下測(cè)定(表7)。表7:混合型介質(zhì)和二氧化硅介質(zhì)的漏出容量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例37將根據(jù)實(shí)施例19制得的色譜介質(zhì)及二氧化硅介質(zhì)(JTBaker產(chǎn)品號(hào)7285)填充在7.75mmx100mm柱子中。注射入200ul2mg/ml細(xì)胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶和卵清蛋白在25mM磷酸鈉(pH7.0)和1.7M硫酸銨中的溶液。通過(guò)由100%25mm磷酸鈉+1.7M硫酸銨至100%25mM磷酸鈉(pH7.0)的60分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)從柱子上洗脫出來(lái)。洗脫分布通過(guò)在280nm下的UV監(jiān)測(cè)(圖3A和3B)。實(shí)施例38將才艮據(jù)實(shí)施例20制得的色譜介質(zhì)填充在7.75mmx100mm柱子中。注射入200ul2mg/ml細(xì)胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶和卵清蛋白在25mM磷酸鈉(pH7.0)與1.7M硫酸銨中的溶液。通過(guò)由100%25mm磷酸鈉+1.7M硫酸銨至100%25mM磷酸鈉(pH7.0)的60分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)從柱子上洗脫出來(lái)。洗脫分布通過(guò)在280nm下的UV監(jiān)測(cè)(圖4)。實(shí)施例39將根據(jù)實(shí)施例22制得的色譜介質(zhì)填充在7.75mmx100mm柱子中。注射入200ul2mg/ml細(xì)胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶和卵清蛋白在25mM磷酸鈉(pH7.0)與1.7M硫酸銨中的溶液。通過(guò)由100%25mm磷酸鈉+1.7M硫酸銨至100%25mM磷酸鈉(pH7.0)的60分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)乂人柱子上洗脫出來(lái)。洗脫分布通過(guò)在280nm下的UV監(jiān)測(cè)(圖5)。實(shí)施例40將根據(jù)實(shí)施例23制得的色譜介質(zhì)填充進(jìn)7.75mmx100mm柱子中。注射入200ul2mg/ml細(xì)胞色素C、核糖核酸酶、溶菌酶和卵清蛋白在25mM磷酸鈉(pH7.0)與1.7M硫酸銨中的溶液。通過(guò)由100%25mm磷酸鈉+1.7M辟b酸銨至100%25mM磷酸鈉(pH7.0)的60分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)從柱子上洗脫出來(lái)。洗脫分布通過(guò)在280nm下的UV監(jiān)測(cè)(圖6)。實(shí)施例41將才艮據(jù)實(shí)施例7制得的聚合物介質(zhì)填充在1.0cmxl0cm柱子中。首先，柱子通過(guò)10個(gè)柱體積的緩沖液A(0.05MMES，pH5.6)平衡。平衡后，注射0.5ml含兔球蛋白(0.5mg/ml)和溶菌酶(0.25mg/ml)的蛋白質(zhì)溶液。通過(guò)由100%緩沖液A至100%緩沖液B(1M氯化鈉的緩沖液A溶液)的40分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)從柱子上洗脫出來(lái)。在第一次蛋白質(zhì)分離后，柱子用循環(huán)的500ml10mM磷酸以lml/min的流速洗滌48小時(shí)。沖洗后，再次進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，以測(cè)定柱子的酸穩(wěn)定性(圖7)。該數(shù)據(jù)表明聚合物的混合型介質(zhì)在酸性條件下具有極好的穩(wěn)定性，因?yàn)橹釉谟昧姿嵯礈熘昂椭笾?8小時(shí)，IgG和溶菌酶的保留時(shí)間沒有發(fā)生改變。實(shí)施例42將#4居實(shí)施例7制得的聚合物介質(zhì)填充在1.0cmxl0cm柱子中。首先，柱子通過(guò)IO個(gè)柱體積的緩沖液A(0.05MMES，pH5.6)平衡。平衡后，注射入0.5ml含兔球蛋白(0.5mg/ml)和溶菌酶(0.25mg/ml)的蛋白質(zhì)溶液。通過(guò)由100%緩沖液A至100%緩沖液B(1M氯化鈉的緩沖液A溶液)的40分鐘線性梯度洗脫，蛋白質(zhì)從柱子上洗脫出來(lái)。在第一次蛋白質(zhì)分離后，柱子用循環(huán)的500ml0.1M氫氧化鈉以lml/min的流速洗滌24和48小時(shí)。沖洗后，再次進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，以測(cè)定柱子的堿穩(wěn)定性(圖8)。該數(shù)據(jù)表明聚合物的混合型介質(zhì)在堿性條件下具有極好的穩(wěn)定性，柱子在用氬氧化鈉洗滌之前和之后至48小時(shí)，IgG和溶菌酶的保留時(shí)間沒有發(fā)生改變。實(shí)施例43測(cè)量和比較根據(jù)實(shí)施例1、25、26、27、28、29、30和32制得的色譜介質(zhì)的容量。將柱子(4.6mmx50mm)用介質(zhì)填充。20mMCAPS(3-[環(huán)己基氨基]-l-丙磺酸)中的BSA溶液(lmg/ml)(pHll)以lml/min的速率施加于柱子上。通過(guò)監(jiān)測(cè)280nm下的UV監(jiān)測(cè)測(cè)定漏出。柱子中介質(zhì)的漏出容量在10%漏出下測(cè)定。在柱子上負(fù)載BSA后，柱子用CAPS緩沖液洗滌，然后吸附的BSA使用1M氯化鈉洗脫以計(jì)算飽和量(表8)。表8容量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本文根據(jù)本發(fā)明具體的實(shí)施方案對(duì)其進(jìn)行了描述。應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本文所公開的本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以進(jìn)行各種改變、改進(jìn)和變型。因此，這意味著本發(fā)明包括落入附錄權(quán)利要求書精神和范圍之內(nèi)的所有上述改變、改進(jìn)和變型。權(quán)利要求l、色譜介質(zhì)，其中含有在聚合物表面上使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物樹脂顆粒。2、根據(jù)權(quán)利要求1的色語(yǔ)介質(zhì)，其中所述聚合物顆粒含有選自纖維素、瓊脂糖、環(huán)氧化或卣化的聚苯乙烯、環(huán)氧化或卣化的聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯、及環(huán)氧化或卣化的聚二乙烯基苯中的聚合物。3、根據(jù)權(quán)利要求2的色譜介質(zhì)，其中所述聚合物顆粒含有選自環(huán)氧化或卣化的聚苯乙烯、環(huán)氧化或卣化的聚丙烯酸酯或聚曱基丙烯酸酯、及環(huán)氧化或囟化的聚二乙烯基苯中的聚合物。4、根據(jù)權(quán)利要求1的色譜介質(zhì)，其中在聚合物表面上使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物樹脂顆粒通過(guò)官能化試劑與聚合物樹脂表面上的聚乙烯亞胺的末端氨基的反應(yīng)進(jìn)行官能化。5、根據(jù)權(quán)利要求3的色譜介質(zhì)，其中在聚合物表面上使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物樹脂顆粒通過(guò)官能化試劑與聚合物樹脂表面上的聚乙烯亞胺的末端氨基的反應(yīng)進(jìn)行官能化。6、根據(jù)權(quán)利要求4的色譜介質(zhì)，其中所述官能化試劑選自酸酐、磺化劑、烷基氯和含季銨官能團(tuán)的烷基氯及其混合物。7、根據(jù)權(quán)利要求6的色譜介質(zhì)，其中所述官能化試劑選自環(huán)狀羧酸酐、不飽和羧酸酐、亞硫酸氫鹽、烷基氯、烷基酸酐、含季銨官能團(tuán)的烷基氯及其混合物。8、根據(jù)權(quán)利要求7的色譜介質(zhì)，其中所述官能化試劑選自戊二酸酐、琥珀酸酐、馬來(lái)酸酐、偏亞碌^酸氫鈉、丁酰氯、乙酸酐、丁酸酐、(3-氯-2-羥丙基)三曱基氯化銨及其混合物。9、根據(jù)權(quán)利要求1的色譜介質(zhì)，其中所述介質(zhì)是混合型。10、根據(jù)權(quán)利要求4的色譜介質(zhì)，其中所述介質(zhì)是混合型。11、根據(jù)權(quán)利要求10的色譜介質(zhì)，其中所述混合型介質(zhì)選自具有混合的伯胺、仲胺和叔胺交換位點(diǎn)的介質(zhì)，具有弱陰離子和弱陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的介質(zhì)、具有弱陰離子、弱陽(yáng)離子和強(qiáng)陽(yáng)離子交換位點(diǎn)的介質(zhì)、具有弱陰離子和疏水(反相)交換位點(diǎn)的介質(zhì)、及具有弱陰離子和強(qiáng)陰離子的介質(zhì)。12、色譜柱，其使用權(quán)利要求1的色譜介質(zhì)填充。13、色鐠柱，其使用權(quán)利要求3的色i普介質(zhì)填充。14、色譜柱，其使用權(quán)利要求5的色譜介質(zhì)填充。15、色譜柱，其使用權(quán)利要求8的色語(yǔ)介質(zhì)填充。16、分離溶液中各種組分的方法，包括將所述溶液通過(guò)權(quán)利要求12的色鐠柱，然后洗脫溶液中各種組分。17、分離溶液中各種組分的方法，包括將所述溶液通過(guò)權(quán)利要求13的色譜柱，然后洗脫溶液中各種組分。18、分離溶液中各種組分的方法，包括將所述溶液通過(guò)權(quán)利要求14的色譜柱，然后洗脫溶液中各種組分。19、分離溶液中各種組分的方法，包括將所述溶液通過(guò)權(quán)利要求15的色譜柱，然后洗脫溶液中各種組分。20、根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述溶液是含有蛋白質(zhì)的溶液。全文摘要本發(fā)明涉及新的聚合物色譜介質(zhì)和優(yōu)選混合型聚合物色譜介質(zhì)的制備和用途。根據(jù)本發(fā)明，聚合物介質(zhì)采用使用聚乙烯亞胺衍生的聚合物顆粒制備，優(yōu)選這類聚乙烯亞胺衍生的聚合物顆粒進(jìn)一步使用適宜的反應(yīng)試劑官能化。這種聚合物色譜介質(zhì)對(duì)生物分離特別有用。文檔編號(hào)B01J20/22GK101146609SQ200580049255公開日2008年3月19日申請(qǐng)日期2005年12月16日優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日發(fā)明者保羅·A·布伊斯,南都·德奧卡,約瑟夫·M·姆拉多?？?羅伯特·C·巴斯申請(qǐng)人:馬林克羅特貝克公司