專利名稱：相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠以及利用該凝膠的微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠以及利用該凝膠的微陣列。該微陣列可以在基因表達(dá)解析等中使用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，隨著人類基因組的破譯，各種各樣疾病和體質(zhì)與特定的基因序列的因果關(guān)系正在被闡明。人們認(rèn)為通過這樣的基因分析，可以進(jìn)行例如發(fā)病的預(yù)測、對藥劑的副作用的預(yù)測等。
作為基因的分析手段，很早就開始使用以凝膠為介質(zhì)的電泳法。近年來，開發(fā)了以在短時(shí)間內(nèi)對微量的生物樣品進(jìn)行分離分析為目的的毛細(xì)管凝膠電泳法。在毛細(xì)管凝膠電泳中，使用填充了丙烯酰胺等水凝膠的玻璃制毛細(xì)管。
另外，作為一并可以檢測多個(gè)基因的變異以及表達(dá)量的有用的工具，可以利用帶有多個(gè)DNA、蛋白質(zhì)等的捕捉探針(通過與檢測的目的DNA或蛋白質(zhì)雜交或結(jié)合，可以捕捉對方DNA或蛋白質(zhì)等的探針)的微陣列。而在上述微陣列中，已經(jīng)知道了許多利用凝膠的各種形態(tài)的微陣列。其中，作為在捕捉探針的固定中利用凝膠的微陣列，已知有在例如樹脂板等基板中形成多個(gè)溝或穴，在該溝或穴的內(nèi)部填充了含有DNA的凝膠的微陣列(參照特開2000-60554號(hào)公報(bào))，在平面基板上配置了含有DNA等的凝膠的點(diǎn)的微陣列(參照USP 5,770,721號(hào)公報(bào))。另外本發(fā)明人中的一部分還制作了在中空纖維的中空部保持含有捕捉探針的凝膠的中空纖維排列體，開發(fā)了通過在與該排列體的纖維軸交叉的方向進(jìn)行切斷得到的微陣列，并申請了專利(參照特開2000-270877號(hào)、特開2000-270878號(hào)、特開2000-270879號(hào)公報(bào))。
固定了捕捉探針的微陣列通過與檢體一起進(jìn)行雜交操作，可以用于特定堿基序列的檢測。在雜化體的檢測中，可以通過能夠特異識(shí)別雜化體的眾所周知的手段、例如通過熒光檢測進(jìn)行。
然而，存在著雜交后，當(dāng)對固定了捕捉探針的各區(qū)域的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定時(shí)，區(qū)域的外周部的熒光強(qiáng)度高，而區(qū)域的中央部的熒光強(qiáng)度低的問題。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的在于得到在微陣列的雜交反應(yīng)后的檢測中，可以獲得在區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度的分布均一，而且各個(gè)區(qū)域內(nèi)的總體的熒光強(qiáng)度的總和為更高的值，即高的雜交效率的凝膠組成。
本發(fā)明人為了解決上述問題，進(jìn)行了專心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在滿足以下性質(zhì)的凝膠中固定捕捉探針，可以獲得在區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度的分布均一，而且區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度升高，即高的雜交效率，直至完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明是一種在含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。另外，本發(fā)明是在含有以下組成的凝膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。
(a)N，N-二甲基丙烯酰胺2～7質(zhì)量％(b)交聯(lián)劑 0.1～1.5質(zhì)量％在上述相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠中，作為相關(guān)生物物質(zhì)可列舉例如，核酸。而作為交聯(lián)劑，可列舉帶有至少2個(gè)乙烯性不飽和鍵的多功能單體，例如，亞甲基雙丙烯酰胺。
另外，本發(fā)明是一種相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的制造方法，其特征是在含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺凝膠中固定相關(guān)生物物質(zhì)。在本發(fā)明中，凝膠最好是在0.1～1.5質(zhì)量％的交聯(lián)劑存在下，使含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺反應(yīng)后得到的凝膠。
另外，本發(fā)明是一種凝膠填充中空管狀體，其中在中空管狀體的中空部填充了上述相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。作為中空管狀體，可列舉例如，中空纖維。
另外，本發(fā)明是一種相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列的制造方法，其特征是將數(shù)根上述凝膠填充中空管狀體集束，在與管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒃摷锴袛唷?br> 另外，本發(fā)明是一種包括以下工序的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列的制造方法。
(a)將數(shù)根中空管狀體集束的工序。
(b)向得到的集束物的各個(gè)管狀體的中空部填充上述相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的工序。
(c)在與管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒓锴袛嗟墓ば颉?br> 另外，本發(fā)明是一種在多個(gè)區(qū)域配置了上述相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列。其中各區(qū)域的表面積最好在10-6m2或其以下。而相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列可以使用區(qū)域由溝或貫通孔形成的微陣列。
另外，本發(fā)明是一種在與中空管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒓藬?shù)根上述凝膠填充中空管狀體(例如中空纖維)的集束物切斷后得到的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列。
另外，本發(fā)明是一種測定對象的檢測方法，其特征是使檢體與上述微陣列反應(yīng)，對檢體中的測定對象(例如DNA等核酸)進(jìn)行檢測。當(dāng)檢測的測定對象是DNA時(shí)，其長度優(yōu)選是在100個(gè)堿基或其以下。
以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明是對相關(guān)生物物質(zhì)進(jìn)行了固定化的凝膠(相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠)，而該凝膠是含有N，N-二甲基丙烯酰胺(2～7質(zhì)量％)組成的凝膠。
在本發(fā)明中，所謂「相關(guān)生物物質(zhì)」，指的是可以作為捕捉探針使用的生物學(xué)上的材料，例如脫氧核糖核酸(DNA)，或核糖核酸(RNA)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等。這些相關(guān)生物物質(zhì)可以從市售商品或活細(xì)胞中得到。
例如，從活細(xì)胞提取DNA可以通過Blin等人的方法[Nucleic.Acids.Res.3.2303(1976)]等實(shí)施，而RNA的提取可以通過Favaloro等人的方法[Methods.Enzymol.65.718(1980)]等實(shí)施。
另外，作為DNA，可以使用鏈狀或環(huán)狀的質(zhì)粒DNA或染色體DNA。而且也可以使用經(jīng)限制酶或化學(xué)方法切斷的DNA片段、在試管內(nèi)利用酶等合成的DNA或化學(xué)合成的寡核苷酸等。
利用上述方法等制備的相關(guān)生物物質(zhì)被固定在凝膠狀物(以下，稱為凝膠)。這里所謂「固定」指的是使相關(guān)生物物質(zhì)保持在凝膠中。
作為該凝膠的組成，雖然是含有相對于凝膠質(zhì)量2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的組成，但優(yōu)選以下組成。
(a)N，N-二甲基丙烯酰胺 2～7質(zhì)量％(b)交聯(lián)劑 0.1～1.5質(zhì)量％另外，N，N-二甲基丙烯酰胺優(yōu)選其下限值是2.5～5.0質(zhì)量％。
交聯(lián)劑優(yōu)選是帶有至少2個(gè)乙烯性不飽和鍵的多功能性單體，其量相對于凝膠質(zhì)量優(yōu)選0.1～1.5質(zhì)量％，更優(yōu)選0.3～0.7質(zhì)量％。交聯(lián)劑只要是上述多功能性單體，則沒有特別限制，可列舉例如，亞甲基雙丙烯酰胺、二乙烯基苯、聚二(甲基)丙烯酸乙二醇酯等。
凝膠的制作方法，可列舉例如，在水性溶劑中將N，N-二甲基丙烯酰胺和交聯(lián)劑混合，進(jìn)行共聚合的方法，或?qū)，N-二甲基丙烯酰胺進(jìn)行聚合，作為預(yù)聚合物后與交聯(lián)劑混合進(jìn)行共聚合的方法等。
作為在上述凝膠中固定相關(guān)生物物質(zhì)的方法，可列舉例如，在進(jìn)行聚合反應(yīng)時(shí)，加入在末端導(dǎo)入了乙烯基的相關(guān)生物物質(zhì)，使其與凝膠的構(gòu)成成分進(jìn)行共聚合的方法(參照WO02/62817號(hào)公報(bào))、準(zhǔn)備經(jīng)肼處理的凝膠，使其與含有氨基的相關(guān)生物物質(zhì)反應(yīng)的方法(參照特表平6-507486號(hào)公報(bào))等。
在本發(fā)明中制作的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的透水率優(yōu)選在1.0×10- 5m3·m/m2/hr/Mpa或其以上。該凝膠的透水率由透過凝膠的水的透過量計(jì)算。透水實(shí)驗(yàn)定義為利用以下方法測定的值。
制作厚度1mm、直徑20mm的凝膠，摞在支撐濾膜(MilliporeSMWP04700)上，安裝在過濾用儲(chǔ)蓄器(ADVANTEC制UHP-43K)上，儲(chǔ)蓄器內(nèi)灌滿水。然后用氮壓對過濾用儲(chǔ)蓄器加壓，在濾液的出口連上直徑2mm的PE管，從濾液的前端移動(dòng)到管中的一定距離(40cm)時(shí)需要的時(shí)間估算透水量，算出透水率。
而該凝膠的形態(tài)保持率優(yōu)選在0.4或其以上。更優(yōu)選在0.6或其以上。所謂凝膠的形態(tài)保持率定義為用以下方法測定的值。
在直徑13mm、長4cm圓柱狀的容器中制作凝膠。從容器中取出凝膠，測定在25℃下，于密閉容器內(nèi)放置24小時(shí)后的凝膠的高度。然后通過以下式子算出形態(tài)保持率。
形態(tài)保持率＝24小時(shí)放置后的凝膠的高度mm/13mm(初期凝膠的直徑)通過上述方法制作的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠作為保持捕捉探針的凝膠，作為基因解析的工具使用。
例如，通過將上述凝膠填充到中空管狀體的中空部，做成凝膠填充中空管，可以作為基因等的解析工具使用該管狀體。而凝膠向中空部的導(dǎo)入可以利用與制作在毛細(xì)管凝膠電泳中使用的毛細(xì)管柱時(shí)同樣的方法填充。
另外，本發(fā)明的凝膠也可以作為微陣列的構(gòu)成構(gòu)件使用。例如，通過在平面基板上配置上述捕捉探針的凝膠(以下稱為固定化凝膠)，可以制作在平面基板上的多個(gè)區(qū)域配置了固定化凝膠的微陣列(參照特表平6-507486號(hào)，USP5,770,721號(hào)公報(bào))。作為平面基板，也可以使用具有多個(gè)溝或貫通孔的基板。此時(shí)，可以通過向由溝或貫通孔形成的區(qū)域添加含有聚合前或剛開始聚合的相關(guān)生物物質(zhì)的單體溶液，在區(qū)域內(nèi)實(shí)施聚合反應(yīng)，進(jìn)行交聯(lián)，由此制作在基板上配置了相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的微陣列(相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列)(參照特開2000-60554號(hào)公報(bào))。
保持在各區(qū)域內(nèi)的相關(guān)生物物質(zhì)的種類在每個(gè)區(qū)域也可以不同。另外，也可以將同一種類的固定化凝膠多個(gè)、形成組后配置在微陣列上。另外，可以通過在區(qū)域內(nèi)保持固定了代替相關(guān)生物物質(zhì)的例如色素的凝膠，決定區(qū)域的座標(biāo)。
各個(gè)區(qū)域的表面積通常在10-6m2或其以下。下限只要是可檢測相關(guān)生物物質(zhì)，則沒有特別限制。
在本發(fā)明中，中空管狀體可列舉例如，玻璃管、不銹鋼管、中空纖維等。如果考慮到加工性、處理容易，優(yōu)選使用中空纖維。作為在本發(fā)明中可以使用的纖維，可列舉合成纖維、半合成纖維、再生纖維、無機(jī)纖維那樣的化學(xué)纖維以及天然纖維等(特開2000-270878號(hào)公報(bào))。作為合成纖維的代表，可列舉例如使用尼龍6、尼龍66、芳香族聚酰胺等聚酰胺系的各種纖維、聚對苯二甲酸乙二(醇)酯、聚對苯二甲酸丁二(醇)酯、聚乳酸、聚二(元)醇酸等聚酯系的各種纖維、聚丙烯腈等丙烯酸系的各種纖維、聚乙烯或聚丙烯等聚烯烴系的各種纖維、聚乙烯醇系的各種纖維、聚偏氯乙烯系的各種纖維、聚氯乙烯系纖維、聚氨酯系的各種纖維、苯酚系纖維、由聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯等構(gòu)成的氟系纖維、聚亞烷基對羥基苯甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等(甲基)丙烯酸酯系樹脂的纖維等。
作為半合成纖維的代表例，可列舉，以二醋酸酯、三醋酸酯、甲殼質(zhì)、脫乙酰殼多糖等為原料的纖維素系衍生物系的各種纖維、稱為プロミツクス的蛋白質(zhì)系的各種纖維等。作為再生纖維的代表例，如通過粘膠法或銅-氨法、或有機(jī)溶劑法得到的纖維素系的各種再生纖維(人造纖維、銅氨纖維、高濕模量粘膠(纖維)等)等。
作為無機(jī)纖維的代表例，可列舉例如，玻璃纖維、碳纖維等。作為天然纖維的代表例，可列舉例如，棉、亞麻、苧麻、黃麻等植物纖維、羊毛、絲等動(dòng)物纖維、石棉等礦物纖維等。
天然纖維以外的中空纖維可以使用特殊的噴嘴通過眾所周知的方法制造。聚酰胺、聚酯、聚烯烴等優(yōu)選熔融紡絲法，作為噴嘴可以使用馬蹄型或C型噴嘴、2重管噴嘴等。
在不能熔融紡絲的合成高分子、半合成纖維或再生纖維中使用的高分子紡絲優(yōu)選使用溶劑紡絲。此時(shí)與熔融紡絲一樣可以使用2重管噴嘴，作為芯材將合適的液體填充到中空部的同時(shí)，進(jìn)行紡絲，由此可以得到具有連續(xù)的中空部的中空纖維。
象上述那樣制備的中空管狀體可以作為保持本發(fā)明的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的基本單位。使用中空管狀體時(shí)，例如通過將數(shù)根上述中空管狀體集束，在該集束物的各個(gè)中空管狀體的中空部內(nèi)填充相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠，在與相對于管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒓锴袛?，切的要領(lǐng)是切成圓片，可以制作微陣列(相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列)(參照WO 00/53736號(hào)公報(bào))。而在本發(fā)明中，也可以使凝膠填充到各個(gè)中空管后進(jìn)行集束。
此時(shí)，通過使中空管狀體有規(guī)則地排列后，用粘接劑進(jìn)行固定，可以得到例如，縱橫方向中空管狀體有規(guī)則地排列的排列體。所謂「有規(guī)則」指的是使集束物有序排列，使得在一定大小的框中含有的中空管狀體的根數(shù)一定。
排列體的制作例如可以象以下那樣進(jìn)行。即，準(zhǔn)備2塊形成有規(guī)則孔的多孔板，使中空管狀體穿過兩塊板的孔，要使一塊多孔板的孔的位置與另一塊多孔板的孔的位置對應(yīng)。然后調(diào)整該多孔板之間的間隔。也可以將中空管狀體穿過孔的作業(yè)和調(diào)整多孔板之間的間隔的作業(yè)的順序反過來進(jìn)行。然后賦予中空管狀體張力，在賦予張力的狀態(tài)下，將樹脂填充到中空管狀體間(管狀體集束物的間隙)，對集束的管狀體進(jìn)行固定，得到排列體(特開2001-239594號(hào)公報(bào))。
排列體的斷面形狀沒有特別限定，例如通過使中空管狀體有規(guī)則地排列使斷面形成正方形或長方形都可以，也可以使中空管排列成同心圓狀，使斷面形成圓形。
在本發(fā)明中，通過在與縱向方向(中空管狀體的軸方向)交叉的方向、優(yōu)選是垂直于縱向方向切斷上述排列體，得到薄片。作為切斷方法，可列舉例如，使用切片機(jī)從排列體切薄片的方法等。薄片的厚度可以任意調(diào)整，但通常為1～5,000μm，優(yōu)選是10～2,000μm。
得到的薄片可以作為保持固定化了相關(guān)生物物質(zhì)的凝膠的微陣列使用。
固定在微陣列中的凝膠上的相關(guān)生物物質(zhì)可以起到作為與該相關(guān)生物物質(zhì)雜交或結(jié)合的核酸或蛋白質(zhì)等(這些物質(zhì)稱為測定對象)的捕捉探針的功能。因此，本發(fā)明的微陣列可以作為用于檢測測定對象(核酸或蛋白質(zhì)等)的試劑盒使用。
制備含有作為檢測目的的相關(guān)生物物質(zhì)(例如DNA等的核酸)的檢體，將檢體添加到微陣列中，使其與固定于微陣列的凝膠中的相關(guān)生物物質(zhì)反應(yīng)。例如，對成為測定對象的DNA預(yù)先進(jìn)行熒光標(biāo)識(shí)，使其與微陣列中的DNA雜交。然后進(jìn)行清洗，除去未反應(yīng)的DNA，對熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。熒光強(qiáng)度可以使用任意裝置(例如市售的DNA檢測器)進(jìn)行檢測。本發(fā)明的「含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠」反應(yīng)性良好，微陣列的每一區(qū)域的熒光強(qiáng)度均一。其結(jié)果可以獲得高靈敏度的檢測結(jié)果。
附圖的簡單說明

圖1是表示使用本發(fā)明的微陣列對DNA進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。
圖2是表示使用本發(fā)明的微陣列對DNA進(jìn)行檢測的結(jié)果的照片。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式通過以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明。但是本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
<實(shí)施例1>
(1)聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制中空纖維的制作將由單體組成比為甲基丙烯酸甲酯(MMA)/丙烯酸甲酯(MA)＝82/18構(gòu)成的質(zhì)量分子量約為9萬的丙烯樹脂作為原料，使用擠出機(jī)由具有環(huán)狀吐出口的紡絲噴嘴進(jìn)行熔融擠出。其結(jié)果可以得到外徑為0.3mm、內(nèi)徑為0.2mm、長為600mm的中空纖維。
(2)中空纖維排列體的制作將作為具有直徑為0.32mm的孔，孔的中心距離為0.42mm的多孔板，縱橫各3列合計(jì)9個(gè)排列的厚度為0.1mm的多孔板重疊，使上述中空纖維9根通過這兩個(gè)多孔板的各個(gè)孔。2塊多孔板的的間隔做成50mm，在使絲拉直的狀態(tài)下，對離中空纖維的一端的50mm的位置和100mm的位置的兩個(gè)地方進(jìn)行固定。
然后，使樹脂原料流入2塊多孔板之間。作為樹脂，使用聚氨酯樹脂粘合劑(日本聚氨酯工業(yè)(株)ニツポラン4276、コロネ-ト4403)。而相對于該粘合劑的總重量，使用添加了2.5質(zhì)量％的炭黑的粘合劑。于室溫下，靜置1周，使樹脂固化。然后除去多孔板，得到中空纖維排列。
(3)末端含有乙烯基的寡核苷酸(末端乙烯基化寡核苷酸)的制備寡核苷酸的合成使用自動(dòng)合成儀DNA/RNA合成儀(PEBiosystems公司生產(chǎn)model 394)進(jìn)行。在合成的最終步驟，向5’末端導(dǎo)入氨基[HN2(CH2)6-]，合成以下所示的寡核苷酸A(序列編號(hào)1)。同樣合成寡核苷酸B(序列編號(hào)2)(但，5’末端不導(dǎo)入氨基)。5’末端氨基的導(dǎo)入使用氨基接頭IITM(Applied Biosystem公司生產(chǎn))。
這些寡核苷酸通過一般的手法進(jìn)行脫保護(hù)和純化后使用。
caaccaacca caactacata cacatac寡核苷酸B(序列編號(hào)2)]gtactttaga caactctca agcgt然后，將5μl的寡核苷酸A(500nmol/ml)和0.5μl甲基丙烯酸縮水甘油基酯混合，于70℃下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加水將總量調(diào)到25μl，得到100nmol/ml的末端帶有甲基丙烯酸酯基的寡核苷酸(GMA改性寡核苷酸A)。
(4)末端導(dǎo)入乙烯基的寡核苷酸的PCR反應(yīng)在100mlYPD培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、酵母提取液10g/L、多胨20g/LpH6.0)于30℃下對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)JCM7255培養(yǎng)1天后，收集菌。收集的菌體利用常規(guī)方法制備染色體DNA，用作PCR的模板。
GMA改性寡核苷酸A和寡核苷酸B用滅菌水分別稀釋到50μM和5μM。使用上述寡核苷酸作為引物，使用上述制備的模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下稱為PCR)。
PCR的條件按照Ex-Taq(寶酒造)的說明書，使用TaKaRa PCR熱循環(huán)儀PERSONAL進(jìn)行。反應(yīng)于100μl中進(jìn)行，溫度條件為93℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘，共進(jìn)行30循環(huán)。通過PCR，末端乙烯化核酸(捕捉探針A序列編號(hào)3)被擴(kuò)增。
(5)單體液以及聚合引發(fā)劑液的制備制備由表1所示組成構(gòu)成的聚合液1和聚合液2。單體液A和聚合引發(fā)劑液象下述那樣制備。
將二甲基丙烯酰胺0.45g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.05g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。
將2，2-偶氮雙(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二鹽酸鹽1g溶解于純水中，將總量調(diào)到10ml。
表1

(6)薄片的制造將聚合液1填充到(2)中得到的中空纖維排列體的中央列的3根中空纖維的中空部，其余的中空纖維的中空部填充聚合液2。填充了聚合液1和聚合液2。移至內(nèi)部被水蒸氣飽和的密閉玻璃容器中，通過于55℃下放置1小時(shí)，進(jìn)行聚合反應(yīng)。
聚合后，用切片機(jī)在與中空纖維的縱向方向垂直交叉的方向反復(fù)切中空纖維排列體。結(jié)果得到厚度約為500μm的薄片。
(7)雜交制備含有與捕捉探針A的堿基序列的一部分(序列編號(hào)3的241～339位)互補(bǔ)的200fmol/ml的寡核苷酸C(序列編號(hào)4)的雜交溶液。
寡核苷酸C通過與(3)所述同樣方法，使用DNA自動(dòng)合成儀合成，在5’末端導(dǎo)入了Cy5。合成結(jié)束后，使用通過一般手法進(jìn)行脫保護(hù)和純化后的寡核苷酸。
gccaacaatg gaatgttgat tgggcccaaa ccaccttcct ttcttgggat attggtccatgccaaaaggg atattcgga gtcagtggag gcgaaaaga<雜交溶液組成>
5×SSC(0.75mol/L氯化鈉、0.075mol/L檸檬酸鈉、pH7.0)0.02％SDS(十二烷基硫酸鈉)將(6)中得到的薄片和上述雜交溶液1ml注入雜交盒中，將盒的上端進(jìn)行熱密封。雜交于65℃下進(jìn)行20小時(shí)。
(8)清洗從雜交盒中取出薄片，按照表2所示條件依次進(jìn)行清洗。清洗溶液的容量為10ml。
表2

(9)檢測將洗凈后的薄片放到無熒光的載玻片上，向薄片上滴數(shù)滴滅菌水，蓋上蓋片。將載玻片放到DNA芯片檢測器(GeneTac VGenomic Solutions公司生產(chǎn))，使用Cy5用激光進(jìn)行檢測。圖像設(shè)定為1小網(wǎng)格10μm大小。
(10)熒光強(qiáng)度的測定將區(qū)域中央部周邊分為80個(gè)小網(wǎng)格的熒光強(qiáng)度的總和作為區(qū)域的強(qiáng)度算出。圖1給出了熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像。區(qū)域中央部任意決定。結(jié)果表明進(jìn)行雜交的區(qū)域的熒光強(qiáng)度的分布是均一的。
<比較例1>
除了將單體液A變更為單體液B以外，其他與實(shí)施例1同樣操作。
將丙烯酰胺0.475g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.025g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。
熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像如圖1所示。
進(jìn)行雜交的中空部的熒光強(qiáng)度的分布是均一的，但熒光強(qiáng)度比實(shí)施例1低。
<比較例2>
除了將單體液A變更為單體液C以外，其他與實(shí)施例1同樣操作。
將丙烯酰胺0.76g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.04g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像如圖1所示。
熒光強(qiáng)度比實(shí)施例1低，中空部的熒光強(qiáng)度在周邊部高，在中心部低。
<實(shí)施例2>
除了將單體液A變更為單體液D，捕捉探針A變更為捕捉探針B(序列編號(hào)5)以外，其他與實(shí)施例1同樣操作，制備薄片。而捕捉探針B在5’末端導(dǎo)入氨基，然后與甲基丙烯酸縮水甘油基酯反應(yīng)，做成末端帶有甲基丙烯酸酯的構(gòu)造。
將二甲基丙烯酰胺0.27g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.03g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。
aaatacgcct gcaggcggag atcttccagg cccgcctcaa gggctggttc gagccaatag
tggaagcat雜交以及清洗用以下方法進(jìn)行。
(1)雜交制備含有在一部分(序列編號(hào)6的16～85位)含有與捕捉探針B的堿基序列互補(bǔ)的互補(bǔ)序列的1pmol/ml的寡核苷酸E(序列編號(hào)6)的雜交溶液。
寡核苷酸E用DNA自動(dòng)合成裝置合成，在5’末端導(dǎo)入Cy5。合成結(jié)束后，使用通過一般的手法脫保護(hù)和純化后的寡核苷酸E。
gcccactggc gatgcatgtc ttccactatt ggctcgaacc agcccttgag gcgggcctggaagatctccg cctgcaggcg tatttgctgg gtctgttcc[雜交溶液組成]6×SSC(0.75mol/L氯化鈉、0.075mol/L檸檬酸鈉、pH7.0)0.02％SDS(十二烷基硫酸鈉)將得到的薄片和上述雜交溶液1ml注入雜交盒中，將盒的上端進(jìn)行熱密封。雜交于37℃下進(jìn)行16小時(shí)。
(2)清洗從雜交盒中取出薄片，按照表3所示條件依次進(jìn)行清洗。清洗的溫度為45℃。清洗溶液的容量為10ml。
表3

(3)檢測將洗凈后的薄片放到無熒光的載玻片上，向薄片上滴數(shù)滴滅菌水，蓋上蓋片。將載玻片放到DNA芯片檢測器(GeneTac VGenomic Solutions公司生產(chǎn))，使用Cy5用激光進(jìn)行檢測。圖像設(shè)定為1個(gè)小網(wǎng)格10μm大小。
(4)熒光強(qiáng)度的測定將區(qū)域中央部周邊分為200小網(wǎng)格的熒光強(qiáng)度的平均值作為區(qū)域強(qiáng)度算出。
圖2給出了熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像。區(qū)域中央部任意決定。結(jié)果表明進(jìn)行雜交的區(qū)域的熒光強(qiáng)度的分布是均一的。
<實(shí)施例3>
除了將單體液D變更為單體液A以外，其他與實(shí)施例2同樣操作。熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像如圖2所示。區(qū)域中央部任意決定。結(jié)果表明進(jìn)行雜交的區(qū)域的熒光強(qiáng)度的分布是均一的。
<比較例3>
除了將單體液A變更為單體液E以外，其他與實(shí)施例2同樣操作。
將N，N-二甲基丙烯酰胺0.72g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.08g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。
熒光強(qiáng)度以及洗凈后的中空纖維周邊的圖像如圖2所示。熒光強(qiáng)度比實(shí)施例2低，中空部的熒光強(qiáng)度在周邊部高，在中心部低。
<比較例4>
除了將單體液A變更為單體液F以外，其他與實(shí)施例2同樣操作。
將N，N-二甲基丙烯酰胺0.18g以及亞甲基雙丙烯酰胺0.02g溶解于甘油/純水＝50/50(質(zhì)量比)混合溶劑，將總量調(diào)到10ml。
薄片化的芯片凝膠脫落，沒有填充到中空部(圖2)。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性本發(fā)明提供固定了相關(guān)生物物質(zhì)的凝膠。通過使用本發(fā)明的凝膠，由于可以得到區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度均一，更高的雜交效率，所以在DNA等基因檢測中是有用的。
序列表簡述序列編號(hào)1合成DNA序列編號(hào)2合成DNA序列編號(hào)3合成DNA序列編號(hào)4合成DNA序列編號(hào)5合成DNA序列編號(hào)6合成DNA
序列表<110>三菱麗陽株式會(huì)社<120>相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠以及利用該凝膠的微陣列<130>P03-0047PCT<150>JP2002-101675<151>2002-04-03<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>1caaccaacca caactacata cacatac 27
<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>人工序列的描述合成DNA<223>Description of Artificial SequenceSYNTHETIC DNA<400>2gtcatttaga caactctgca agcgt 25<210>3<211>651<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>3caaccaacca caactacata cacatacata cacaatggtc gctcaagttc aaaagcaagc 60tccaactttt aagaaaactg ccgtcgtcga cggtgtcttt gacgaagtct ccttggacaa 120atacaagggt aagtacgttg tcctagcctt tattccattg gccttcactt tcgtctgtcc 180aaccgaaatc attgctttct cagaagctgc taagaaattc gaagaacaag gcgctcaagt 240tcttttcgcc tccactgact ccgaatactc ccttttggca tggaccaata tcccaagaaa 300ggaaggtggt ttgggcccaa tcaacattcc attgttggct gacaccaacc actctttgtc 360cagagactat ggtgtcttga tcgaagaaga aggtgtcgcc ttgagaggtt tgttcatcat 420
cgacccaaag ggtgtcatta gacacatcac cattaacgat ttgccagtcg gtagaaacgt 480tgacgaagcc ttgagattgg ttgaagcctt ccaatggacc gacaagaacg gtactgtctt 540gccatgtaac tggactccag gtgctgctac catcaagcca accgttgaag actccaagga 600atacttcgaa gctgccaaca aataagacgc ttgcagagtt gtctaaatga c 651<210>4<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>4gccaacaatg gaatgttgat tgggcccaaa ccaccttcct ttcttgggat attggtccat 60gccaaaaggg agtattcgga gtcagtggag gcgaaaaga 99<210>5<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>人工序列的描述合成DNA<223>Description of Artificial SequenceSYNTHETIC DNA<400>5
aaatacgcct gcaggcggag atcttccagg cccgcctcaa gggctggttc gagccaatag 60tggaagacat 70<210>6<211>99<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>6gcccactggc gatgcatgtc ttccactatt ggctcgaacc agcccttgag gcgggcctgg 60aagatctccg cctgcaggcg tatttgctgg gtctgttcc 99
權(quán)利要求
1.一種在含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺凝膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。
2.在含有以下組成的膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。(a)N，N-二甲基丙烯酰胺 2～7質(zhì)量％(b)交聯(lián)劑 0.1～1.5質(zhì)量％
3.如權(quán)利要求1或2所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠，其中相關(guān)生物物質(zhì)是核酸。
4.如權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠，其中交聯(lián)劑是帶有至少2個(gè)乙烯性不飽和鍵的多功能單體。
5.如權(quán)利要求4所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠，其中交聯(lián)劑是亞甲基雙丙烯酰胺。
6.一種相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的制造方法，其特征是在含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺的凝膠中固定相關(guān)生物物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，凝膠是在0.1～1.5質(zhì)量％的交聯(lián)劑存在下，使含有2～7質(zhì)量％的N，N-二甲基丙烯酰胺反應(yīng)后得到的凝膠。
8.一種在中空管狀體的中空部填充了權(quán)利1～5中任一項(xiàng)中所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的凝膠填充中空管狀體。
9.如權(quán)利要求8所述的凝膠填充中空管狀體，其中中空管狀體是中空纖維。
10.一種相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列的制造方法，其特征是將數(shù)根權(quán)利要求8或9所述的凝膠填充中空管狀體集束，在與管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒌玫降募锴袛唷?br> 11.一種包括以下工序的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列的制造方法，(1)將數(shù)根中空管狀體集束的工序，(2)向得到的集束物的各個(gè)管狀體的中空部填充權(quán)利1～5中任一項(xiàng)中所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的工序，(3)在與管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒓锴袛嗟墓ば颉?br> 12.一種在多個(gè)區(qū)域配置了權(quán)利1～5中任一項(xiàng)中所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列。
13.如權(quán)利要求12所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列，其中各區(qū)域的表面積在10-6m2或其以下。
14.如權(quán)利要求12或13所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列，區(qū)域由溝或貫通孔形成。
15.一種在與中空管狀體的縱向方向交叉的方向?qū)⒓藬?shù)根權(quán)利要求8或9所述的凝膠填充中空管狀體的集束物切斷后得到的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列。
16.如權(quán)利要求15所述的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠微陣列，其中中空管狀體是中空纖維。
17.一種測定對象的檢測方法，其特征是使檢體與權(quán)利要求12～16任一項(xiàng)所述的微陣列反應(yīng)，對檢體中的測定對象進(jìn)行檢測。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中測定對象是核酸。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中核酸是具有100個(gè)堿基或其以下長度的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供在含有2～7質(zhì)量的N，N－二甲基丙烯酰胺的凝膠中固定了相關(guān)生物物質(zhì)的相關(guān)生物物質(zhì)固定化凝膠。
文檔編號(hào)B01J19/00GK1650164SQ03810119
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月3日
發(fā)明者長濱千秋, 伊藤千穗 申請人:三菱麗陽株式會(huì)社