專利名稱：離子交換劑介質(zhì)的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離領(lǐng)域，特別是使用混合型陽離子交換劑配體通過離子交換進行的分離。更具體地，本發(fā)明涉及產(chǎn)生混合型陽離子交換劑介質(zhì)的方法，還涉及試劑盒，該試劑盒包含產(chǎn)生該混介質(zhì)必需的原料。
背景技術(shù)：
術(shù)語色譜法包括一族密切相關(guān)的分離方法。將色譜法與大多數(shù)其它物理和化學(xué)分離方法區(qū)分的特征是使兩個相互不混溶的相接觸，其中一相是固定的，另一相是移動的。樣品混合物引入到移動相中，當(dāng)它被移動相攜帶通過該系統(tǒng)時，它在移動相和固定相前多次經(jīng)過一系列相互作用(分配)。該相互作用利用樣品中各組分的物理或化學(xué)性質(zhì)差異。這些差異決定在通過含有固定相的柱中移動的移動相的影響下各個組分的遷移速度。分離后的組分按照與固定相相互作用增大的順序排出。最小延遲的組分首先流出，最強保留物料最后流出。當(dāng)一個成分被充分延遲以防止樣品從柱中流出時與相鄰溶質(zhì)的區(qū)域重疊的時候，就獲得了分離。
所述柱是色譜的核心，其在可以通過單一儀器獲得的儀器種類中提供多樣性。特別是正在不斷努力設(shè)計用于每種具體用途的最佳固定相。這樣的固定相通常由支持體或基礎(chǔ)基質(zhì)構(gòu)成，該基礎(chǔ)基質(zhì)已經(jīng)附著了包含官能團(即結(jié)合基團)的配體。正如容易認識到的那樣，可能的配體的選擇是大量的，但是為了說明，以下將給出許多不同類型的配體。
在親合性吸附中，絲氨酸蛋白酶已經(jīng)吸附到基質(zhì)上或從基質(zhì)中脫附，其上已經(jīng)通過對位的氨基共價連接了對氨基苯甲瞇。
混合型陰離子交換劑已經(jīng)公開在例如WO 9729825(AmershamPharmacia Biotech AB)，其提供基于電荷和氫鍵的相互作用，該相互作用涉及離帶正電荷的胺氮在2-3個碳距離上的氧和氨基氮。該出版物基于以下發(fā)現(xiàn)這種配體可以給出陰離子交換劑，該交換劑要求較高的離子強度，用于洗脫被結(jié)合的物質(zhì)。
在WO 9965607(Amersham Pharmacia Biotech AB)中已經(jīng)提出其中存在混合型配體的陽離子交換劑，其要求較高的離子強度，用于洗脫被束縛物質(zhì)。此外，WO 9729825(US6,090,288)和WO 9965607描述了陰離子和陽離子交換配體，二者都要求較高的洗脫離子強度。
在WO 9808603(Upfront Chromatography)中公開了通式結(jié)構(gòu)M-SP1-L的分離介質(zhì)，其中M是支持體介質(zhì)，該支持體介質(zhì)可以是親水的，SP1是隔離物，L包含單環(huán)或雙環(huán)同芳族或雜芳族部分，其可以是被取代的(同芳族部分包含僅通過碳原子形成的芳環(huán))。取代基基本是酸性的。對于蛋白質(zhì)的吸附，特別是免疫球蛋白，提出通過疏水作用而不是離子交換的分離介質(zhì)。
WO 9600735、WO 9609116和US 5,652,348(Burton等人)還公開了基于疏水作用的分離介質(zhì)。吸附和脫附通過分別增大或減小液體的鹽濃度或改變配體上的電荷和/或通過改變pH值吸附/脫附的物質(zhì)來支持。配體通常包含可以包含芳族結(jié)構(gòu)的疏水部分。一些配體另外還含有可帶電的結(jié)構(gòu)，允許通過pH值的變化變換介質(zhì)的疏水/親水平衡?？蓭щ姾傻慕Y(jié)構(gòu)可以是胺基。
最后，US5,789,578(Burton等人)建議通過在附著到支持體基質(zhì)的碳碳雙鍵上加入硫醇基來固定含有硫醇基的配體，例如3一巰基丙酸、谷胱甘肽等。
但是，一旦已經(jīng)決定希望的配體結(jié)構(gòu)，進一步重要的問題將在于其合適制備方法的選擇。
例如，近來已經(jīng)公開了稱為高鹽配體的一類新型配體，參見例如WO0011605(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)。由于這些配體可以作為混合型的陽離子交換劑配體，它們已經(jīng)表現(xiàn)出在許多工業(yè)用途中具有重要意義，例如蛋白質(zhì)提純，因為它們可以承受高鹽濃度，因此不需要樣品的任何明顯稀釋。這樣，高鹽配體有利地用于分離，因為與以前描述的方法相比，它們減小所需的樣品總體積，因此降低了設(shè)備的總成本以及在這些用途中所需的工作。
但是，即使混合型陽離子交換劑配體在用于分離時降低了成本和減少了工作，但是到目前為止所描述的其制備方法存在一些缺點，使它們在實踐中不太有利。一般來說，為了獲得良好的多樣性，這樣的配體制備包括四個步驟，即
(i)反應(yīng)性基團在色譜載體上的引入及其任選的活化；(ii)使所得的修飾后載體與含有酸官能團的硫醇化合物反應(yīng)。
(iii)在有機溶劑中用合適的試劑(例如在DCC存在下的NHS)活化載體的酸性官能團。
(iv)加入包含合適殘基R的氨基酸衍生物，以產(chǎn)生附著到載體上的最終配體。
以上公開的步驟順序的一個問題是，它將產(chǎn)生實際上含有兩種不同配體的產(chǎn)物，即含有酸官能團的硫醇醚連接劑，這是由于在步驟(iii)和(iv)的不成功轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，以及希望的最終產(chǎn)物。由兩種這樣的不同配體構(gòu)成的色譜載體在用于分離過程中時可能引起嚴(yán)重的問題。例如，分析將變得困難，導(dǎo)致比一般需要的更不穩(wěn)定的制備和使用方法。由于相同的原因，如果以兩種配體混合物形式獲得該介質(zhì)，對于每種具體用途優(yōu)化這樣的色譜載體的制備和使用將更加困難。此外，這樣的混合物固有地將導(dǎo)致比更好限定的介質(zhì)更低的特定分離。
此外，在上述常規(guī)方法中所涉及的另一個問題是，大色譜載體分子將存在于步驟(i)的過程中。不同的是，整個過程將需要在大的體積內(nèi)進行，要求非常特別的大型設(shè)備，并涉及顯著的成本，這是這種類型設(shè)備運行所固有的。
以上公開的現(xiàn)有技術(shù)方法的仍然另一個缺點是，所有的步驟在固體載體上進行。上述大型特定設(shè)備的使用還包括與更費時和更復(fù)雜的洗滌過程相關(guān)的附加缺點。對于步驟(ii)-(iii)和(iii)-(iv)尤其如此，在這些過程中，需要從水相到有機溶劑和反過來進行。
由于目前對上述方法沒有有效的替代方法，因此在該領(lǐng)域內(nèi)需要改進的方法來制造用于分離過程的混合型陽離子交換劑配體。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種生產(chǎn)包含混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的方法，其中所獲得的配體的組成容易控制。通過使用新型支架(scaffold)或支架衍生物作為原料可以實現(xiàn)該目的，如所附權(quán)利要求中所述。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)包含混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的方法，該方法是簡化的并且比前述方法成本低。通過一種方法可以實現(xiàn)該目的，在該方法中，直到最后一步才引入包含試劑的固體載體或凝膠，從而可以避免以前要求的大體積試劑。這一目的還通過一種總體上比前面公開的方法更少步驟的方法來實現(xiàn)，如所附權(quán)利要求中所公開的。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種生產(chǎn)包含混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的方法，該方法比前述方法構(gòu)成了一種環(huán)境更能接受的替代方法。這一目的可以通過所附權(quán)利要求中所述的方法來實現(xiàn)，該方法比現(xiàn)有技術(shù)方法需要更少的溶劑。以上討論的總體上可以在更小體積內(nèi)進行的根據(jù)本發(fā)明方法的技術(shù)特征還構(gòu)成了對環(huán)境更有利的替代方案，因為更小的體積將需要更少的洗滌液并且能量消耗也更少。
由以下的詳細描述，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將是顯而易見的。
定義術(shù)語“帶負電荷”和“帶負電”是指該物質(zhì)攜帶一個或多個負電荷和/或具有負凈電荷。
術(shù)語“混合型陽離子交換劑配體”和“多重模態(tài)(multimodal)陽離子交換劑配體”在本發(fā)明范圍內(nèi)是指能夠提供至少兩個不同的但是共同作用的位點的配體，所述位點與被束縛物質(zhì)相互作用。這些位點之一在配體與所關(guān)注物質(zhì)之間給出吸引型的電荷-電荷相互作用。第二個位點通常給出電子受主-施主相互作用和/或疏水和/或親水相互作用。電子施主-受主相互作用包括諸如氫鍵、π -π、電荷傳遞、偶極子-偶極子、感應(yīng)偶極子等的相互作用。
術(shù)語“介質(zhì)”(復(fù)數(shù)形式)包括配體，即結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上的結(jié)合基團，即用于色譜分析中的載體。本文所用的術(shù)語不包括任何液體。
術(shù)語“高鹽”配體是指在較高濃度鹽(例如0.3M NaCl)存在下能結(jié)合蛋白質(zhì)的配體，其相對于在相同條件下操作的對比離子交換劑而言。這可以使用前沿分析法(frontal analysis)確定，如以下在實驗部分中所述。
“電子施主-受主相互作用”是指具有自由電子對的電負性原子作為施主并結(jié)合到缺電子原子，該缺電子原子作為施主電子對的受主。(見例如Karger等人的“An Introduction into Separation Science，John Wiley & Sons(1973)第42頁)。
典型的受主原子/基團是缺電子原子或基團，例如金屬離子、氰基、硝基中的氮等，并且包括結(jié)合到電負性原子上的氫，如羥基和羧基中的HO-，在酰胺和胺中的-NH-、硫醇中的HS-等。
陽離子交換劑是指被除去的物質(zhì)攜帶正電荷且陽離子交換劑帶負電(＝陽離子交換劑條件)。對于含水液體中存在的兩性物質(zhì)，這意味著pH≤pI+0.5，優(yōu)選pH≤pI。


圖1表示多重模態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)的傳統(tǒng)分析的實例，如在以上“背景技術(shù)”中用一般術(shù)語所討論的。
圖2表示本發(fā)明的一個實施方案，其使用高半胱氨酸硫代內(nèi)酯(thiolactone)作為支架合成多重模態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)。
圖3表示借助于示例性支架高半胱氨酸硫代內(nèi)酯的多重組態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)文庫的潛在多樣性的實例。
圖4以示意方式表示用相同組的反應(yīng)溶液合成不同文庫介質(zhì)的一般過程。
具體實施例方式
本發(fā)明的一個方面是一種包含結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上的混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的產(chǎn)生方法，該方法包括以下步驟(a)提供至少一種支架，其每一種包含官能團F并具有環(huán)狀核心結(jié)構(gòu)；(b)通過使所述支架的基團F與所述試劑的反應(yīng)性基團反應(yīng)，用包含結(jié)合到殘基R的反應(yīng)性基團的試劑使支架衍生，并保持支架的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；(c)打開所得衍生物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和(d)使所獲得的開環(huán)產(chǎn)物與包含反應(yīng)性基團的基礎(chǔ)基質(zhì)反應(yīng)，所述反應(yīng)性基團任選通過間隔物結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上；其中所述支架存在至少兩個官能團，其中之一是含硫基團，用于結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)的活性基團，其另一個是可以轉(zhuǎn)變成離子基團的基團，所述官能團以相鄰位置存在于環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，并且其中在步驟(c)中，通過破壞在兩個官能團之間的鍵打開環(huán)。根據(jù)步驟(c)的水解可以例如通過加入堿或任何其他合適的方法進行。含硫基團的作用是提供到色譜載體的容易且穩(wěn)定的附著點。已知例如S-H基團的高親核性，通過親核取代或通過基團加成在結(jié)合中獲得了高效率。
在一個實施方案中，通過水解，例如加入氫氧化鈉，如在以下實驗部分A中舉例說明的，實現(xiàn)根據(jù)步驟(c)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的打開。在一個替代的實施方案中，通過加入親核試劑，例如通過加入氨基酸或胺，如在以下實驗部分B中舉例說明的，實現(xiàn)所述開環(huán)。但是，為了打開環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以加入產(chǎn)生親核取代反應(yīng)的任何化合物。唯一的要求是環(huán)的打開產(chǎn)生可以轉(zhuǎn)變成離子基團的一個基團和一個硫醇基團，該硫醇基團隨后可以用于結(jié)合到凝膠和/或間隔物。
更具體地，在本方法的一個實施方案中，所述支架由通式(I)定義 其中A、B和X相互獨立地是sp2或sp3雜化碳原子或任何雜原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅。在一個簡單的實施方案中，A、B和X都是碳原子。m是0-4之間的任何整數(shù)，例如1-3，優(yōu)選1或2，對于許多用途為1。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識的，數(shù)字m對最終分離介質(zhì)中配體的長度有影響。所以它根據(jù)例如在混合型陽離子交換劑配體上的選定活性基團、預(yù)計的分離、在基礎(chǔ)基質(zhì)與其上的反應(yīng)性基團之間是否存在間隔物等來決定。官能團F由一個X表示，即作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)的整體部分，或者結(jié)合到A、B和X的任一個上，可能通過連接劑。這樣的連接物取決于最終分離介質(zhì)的希望性質(zhì)可以由1-50構(gòu)成，所考慮的主要因素是它不應(yīng)當(dāng)在產(chǎn)生分離介質(zhì)的本方法中導(dǎo)致任何不希望的副作用。希望的連接劑性質(zhì)在很大程度上對應(yīng)于基質(zhì)與反應(yīng)性基團之間的間隔物的性質(zhì)。
更具體地，上述間隔物是傳統(tǒng)離子交換劑中常見的，并且因此可以包含直鏈、支鏈、環(huán)狀的飽和、不飽和的以及芳族的烴基(例如具有最多1-20個，例如1-10個碳原子)。所述基團可以攜帶羥基、鹵素、烷氧基和芳氧基以及相應(yīng)的硫代類似物和/或氨基。對于某些用途，碳鏈可以在一個或多個位置上被氨基的氮原子、醚的氧、硫醚的硫等打斷。還可以存在羰基，例如在酰胺和酮中的羰基，和對水解有類似穩(wěn)定性的其他基團。選自氧、硫和氮的最多一個原子優(yōu)選結(jié)合到一個或相同的sp3雜化碳原子。此外，間隔物可以提供一個或多個電子施主或受主原子或基團，增強物質(zhì)到陽離子交換劑的結(jié)合，如上所討論的，例如通過參與氫鍵、π-相互作用、疏水或親水相互作用等。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法比以前的方法包含更少的步驟，所以在運行時將節(jié)省時間，因此節(jié)約成本。此外，由于直到最后一步才引入基質(zhì)，基質(zhì)有利的是凝膠，通過限制以前需要的更長的洗滌過程，也產(chǎn)生了大量節(jié)約。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，在式(I)中，官能團F選自含有離去基團的基團，如親核取代中常用的，例如C-Y，其中Y表示例如Br、Cl、I、甲磺酸根或甲苯磺酸根基團；酸或活化的酸如WC＝O，其中W例如由N-氫琥珀酰亞胺、五氟苯酚、對硝基苯或氯代甲酸異丙酯形成的；親核基團例如-OH、-SH或-NH2；以及C＝C。
在該方法的有利的實施方案中，在式(I)中，A、B和X是碳原子，m是1且F是-NH2，在特別有利的實施方案中，所用的支架是高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，其是一種容易獲得的商品(例如得自Aldrich或任何其他公知的實驗化學(xué)品供應(yīng)商)。
該實施方案目前是實施本發(fā)明的最佳方式。在本申請的實驗部分中，已經(jīng)使用了所述支架的外消旋混合物。但是，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的，對于某些用途，使用D或L形式或包含其特定比例的混合物可能是更有利的。最合適的形式可以用常規(guī)實驗容易地試驗。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，在步驟(b)中所用的衍生試劑由以下通式描述-Z-R- (II)其中Z構(gòu)成反應(yīng)性基團，其功能是與支架的官能團F反應(yīng)。因此，對于每個實施方案，選擇Z的性質(zhì)以便與如上討論的F反應(yīng)；R可以包含直鏈、支鏈、環(huán)狀的飽和、不飽和的以及芳族的烴基(例如具有最多1-20個，如1-10個碳原子)。這樣基團可以帶有羥基、鹵素、烷氧基和芳氧基以及相應(yīng)的硫代類似物和/或氨基基團。對于某些用途，碳鏈可以在一個或多個位置被氨基的氮、醚的氧、硫醚的硫等打斷。還可以存在羰基，例如在酰胺和酮中的，以及對水解具有類似穩(wěn)定性的其它基團。選自氧、硫和氮的最多一個原子優(yōu)選結(jié)合到一個碳原子和相同的sp3雜化碳原子。此外，R提供一個或多個電子施主或受主原子或基團，以便能將一種物質(zhì)結(jié)合到陽離子交換劑上，如上所討論的。R也可以含有帶電荷的基團，只要最終的配體給出完整的間隔范圍(fullinterval window)，這里它整體是帶負電的并且可以用作陽離子交換劑。
因此，由于最終的分離介質(zhì)用于離子交換模式，殘基R根據(jù)要求用來引入其多重模態(tài)特征。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，最終的介質(zhì)可以包含其中R由兩個或多個部分構(gòu)成的配體，所述兩個或多個部分在由以上討論的間隔物分開的結(jié)合中起作用。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)品，即混合型陽離子交換劑配體，如高鹽配體。根據(jù)本發(fā)明的配體可以比現(xiàn)有技術(shù)方法均勻得多的化合物形式生產(chǎn)。本發(fā)明所包括的具體實例如以下實驗部分中的表格所公開的。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，該方法還包括單獨的且在步驟(b)之前溴化基質(zhì)的反應(yīng)性基團的步驟，其中所述反應(yīng)性基團包含碳-碳雙鍵。這樣的溴化在本領(lǐng)域中是公知的。
在一個替代實施方案中，本發(fā)明方法改為包含單獨且在步驟(b)之前在有利于自由基反應(yīng)的條件下活化基質(zhì)的反應(yīng)性基團的步驟，其中所述反應(yīng)性基團包含碳-碳雙鍵。自由基反應(yīng)可以用任何公知的方法引發(fā)，例如通過加入稱為自由基引發(fā)劑的引發(fā)反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)，利用光如UV等。這類反應(yīng)及其條件是本領(lǐng)域公知的并且在文獻中已經(jīng)廣泛討論。
但是，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，限制基質(zhì)上存在的反應(yīng)性基團的唯一標(biāo)準(zhǔn)是它應(yīng)當(dāng)能夠在足夠的程度上與打開支架環(huán)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的端部之一反應(yīng)。此外，它還應(yīng)當(dāng)與開環(huán)的支架衍生物其余部分基本不反應(yīng)，以便不會破壞最終分離介質(zhì)上所需要的任何結(jié)構(gòu)。因此，應(yīng)當(dāng)進行支架官能團之一的選擇和基質(zhì)上存在的反應(yīng)性基團的選擇，使得它們相互反應(yīng)。并且即使它不是最簡單的實施方案，但是也應(yīng)當(dāng)理解，在基質(zhì)上的反應(yīng)性基團可以是相同的，也可以是不同的。
關(guān)于基礎(chǔ)基質(zhì)，其基于有機或無機物或其組合，例如Streamline型復(fù)合材料(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)?；A(chǔ)基質(zhì)優(yōu)選是親水的并且是聚合物形式的，其在水中是不溶性且或多或少是可溶脹的。已經(jīng)衍生變成親水的疏水聚合物包括在該定義中。合適的聚合物是多羥基聚合物，例如基于多糖如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、支鏈淀粉等和完全合成的聚合物如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羥基烷基乙烯基醚)、聚(羥基烷基丙烯酸酯)、和聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)、聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，以及其中包括對應(yīng)于上述聚合物的兩種或多種單體的共聚物。溶解于水的聚合物可以被衍生變成不溶性的，例如通過交聯(lián)和通過吸附或共價結(jié)合結(jié)合到不溶性主體上。通過具有可以轉(zhuǎn)變成OH的基團的單體聚合，或者通過最終聚合物的親水化例如通過合適化合物如親水聚合物的吸附，可以在疏水聚合物上(例如在單乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)引入親水基團。在基礎(chǔ)基質(zhì)中使用的合適的無機材料是二氧化硅、氧化鋯、石墨、氧化鉭等。所述基質(zhì)可以被陽離子交換劑配體均勻衍生或者僅以特別設(shè)計的方式部分衍生。
優(yōu)選的基質(zhì)沒有對水解不穩(wěn)定的基團，如硅烷(silan)、酯、酰胺基團和在二氧化硅上存在的基團等。這對于與所用液體直接接觸的基團是特別適用的?；|(zhì)可以是多孔或無孔的。這意味著對于要除去的物質(zhì)可以是完全透過的或部分透過的(多孔的)或者完全不透過的。基質(zhì)還可以是不規(guī)則或球形顆粒形式的，尺寸在1-1000微米范圍內(nèi)，對于高性能用途優(yōu)選為5-50微米，對于預(yù)備用途為50-300微米?；|(zhì)的一種有意義的形式具有比液體更高或更低的密度。對于流化床或膨脹床色譜法以及對于不同的批料過程如在攪拌罐中，這種基質(zhì)特別適用于大規(guī)模操作。流化床和膨脹床過程描述在WO9218237(Amersham Pharmacia Biotech AB)和WO9200799(Kem-En-Tek)中。術(shù)語親水基質(zhì)是指基質(zhì)的可接近表面是親水的，其意義是水性液體能夠滲入該基質(zhì)。親水基礎(chǔ)基質(zhì)上的可接近表面通常暴露許多極性基團，例如包含氧和/或氮原子的極性基團。這樣的極性基團的實例是羥基、氨基、羧基、酯、低級烷基的醚(例如(-CH2CH2O-)nH，其中n是整數(shù))。
本發(fā)明的第二方面是一種包含結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上的混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的產(chǎn)生方法，該方法包括以下步驟(a)提供具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的至少一種支架衍生物；(b)打開該衍生物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和(c)使所獲得的開環(huán)產(chǎn)物結(jié)合到包含反應(yīng)性基團的基礎(chǔ)基質(zhì)，所述反應(yīng)性基團任選通過間隔物結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上；其中所述支架可以由通式(III)定義 其中A、B和X獨立地是sp2或sp3雜化的碳原子或任何雜原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅，m是0-4之間的任何整數(shù)，例如1-3，優(yōu)選1或2，所述官能團以相鄰的位置存在于環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，并且其中在步驟(c)，通過破壞所述兩個相鄰位置之間的鍵提供環(huán)的打開，并且其中Z-R結(jié)合到A、B和X的任一個上，優(yōu)選結(jié)合到B。
步驟(b)可以按以上關(guān)于本發(fā)明第一方面所討論的進行。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，這一方面對應(yīng)于本發(fā)明的第一方面，但是一種起始產(chǎn)物是容易制備的支架衍生物。因此，第二方面是第一方面的一種簡化替代方案，在支架和衍生試劑的性質(zhì)可以產(chǎn)生容易儲存的產(chǎn)物時是特別有利的。預(yù)計在某些情況下，這樣的衍生物可能是可以購得的或者同時生產(chǎn)并儲存等到以后使用。關(guān)于這一方面中所用的支架衍生物的性質(zhì)和性能的進一步細節(jié)可以分別見以上關(guān)于支架和衍生試劑的討論。
本發(fā)明的第三方面是一種試劑盒，其包含由以上定義的通式(I)所限定的化合物或者由以上定義通式(III)所限定的衍生物。該試劑盒以固體形式包含這樣的化合物或衍生物及其在制造混合型陽離子交換劑配體中的使用說明書，所述混合型陽離子交換劑配體結(jié)合到基質(zhì)上，用作分離介質(zhì)。在一種替代的實施方案中，所述化合物或衍生物以溶解在適當(dāng)溶劑中的形式存在。
本發(fā)明的另一個方面是一種篩選方法，其中用于陽離子交換的分離介質(zhì)被鑒別。如上所述，可以在許多不同分子中進行R的選擇，這取決于最終分離介質(zhì)的希望性質(zhì)。在以下的實驗部分中，將提供試驗的R-基團的某些實例，但是它們的提供僅用于說明本發(fā)明的多樣性并用作想要在本發(fā)明范圍內(nèi)設(shè)計具體實施方案的本領(lǐng)域技術(shù)人員的一些指導(dǎo)。在實驗部分中，應(yīng)當(dāng)理解R’與R相當(dāng)。因此，本發(fā)明能設(shè)計許多種類的希望的混合型陽離子交換劑配體分離介質(zhì)。例如，為了試驗可能的混合型陽離子交換劑配體，可以產(chǎn)生R-基團的組合文庫，其中一個原始分子的特定部分系統(tǒng)地變化以找出對特定靶獲得最佳特性的組合。這樣的組合文庫當(dāng)今是公知的并在許多領(lǐng)域中利用，所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于任何有機化學(xué)工作者或生物化學(xué)工作者普通的一般知識范圍內(nèi)的考慮，可以設(shè)計其自己的文庫。
例如，文庫的試驗可以例如包括以下步驟(a)提供一種文庫，其包括(i)待測的一種或多種陽離子交換劑(測試陽離子交換劑，交換劑1、2、3、4……n；n＝整數(shù)＞0)，這些陽離子交換劑的每一種在配體種類方面都是不同的(配體1、2、3、4……n)，和(ii)具有參比配體的參考陽離子交換劑，載體基質(zhì)、反離子等在交換劑1、2、3、4…中與在參比陽離子交換劑中基本相同；(b)在預(yù)定條件下，對于該物質(zhì)在pH間隔2-12中確定交換劑1的最大臨界容量；(c)在與步驟(b)相同的條件下，對于該物質(zhì)在pH間隔2-12中確定參比陽離子交換劑的最大臨界容量；(d)借助在步驟(b)和(c)中所獲得的最大臨界容量之間的關(guān)系，總結(jié)陽離子交換劑(1)是否適合用于除去該物質(zhì)；和(e)如果必要，對交換劑2、3、4……n重復(fù)步驟(b)-(c)。
在參比陽離子交換劑與各種待測陽離子交換劑之間取代度變化的情況下，在進行步驟(d)時，這應(yīng)該是原因。如果取代度變化大，例如對于陽離子交換劑1、2……n的倍數(shù)大于3、5或10，這是特別適用的。
本發(fā)明的最后一個方面是一種方法，優(yōu)選是一種篩選方法，該方法優(yōu)化包含混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的結(jié)合性質(zhì)，其包括以下步驟(a)在水溶液中提供活化的支架衍生物；(b)使該溶液與由第一種性質(zhì)限定并能夠結(jié)合所述支架衍生物的基質(zhì)顆粒的懸浮液接觸；(c)將溶液與顆粒分離；(d)使分離后的溶液與由不同于所述第一種性質(zhì)的性質(zhì)限定并能夠結(jié)合所述支架衍生物的基質(zhì)顆粒的懸浮液接觸；(e)將溶液與顆粒分離；(f)任選重復(fù)步驟(d)和(e)一次或多次；和(g)通過常規(guī)離子交換實驗評價這樣獲得的分離介質(zhì)的容量。
在一個實施方案中，所述性質(zhì)是能夠結(jié)合活化的支架的基質(zhì)顆粒上存在的反應(yīng)性基團的密度。在一個替代實施方案中，所述性質(zhì)是在能夠結(jié)合活化的支架的基質(zhì)顆粒上存在的反應(yīng)性基團的性質(zhì)。然而，本方法實際上可以用于許多性質(zhì)如顆粒尺寸、孔隙率、剛性或結(jié)合條件，例如pH、時間、溫度等，一個必要特征是反應(yīng)性溶液通過一組不同的此類條件，以確定最佳值。在本發(fā)明的一個有利的實施方案中，已經(jīng)根據(jù)上述方法生產(chǎn)了在該方面中所用的支架衍生物。
本發(fā)明中所用的陽離子交換劑中陽離子交換配體的含量通常在0.001-4毫摩爾/毫升基質(zhì)范圍內(nèi)選擇，例如0.002-0.5毫摩爾/毫升基質(zhì)，參考值為0.005-0.3毫摩爾/毫升基質(zhì)。其中可能的和優(yōu)選的范圍由基質(zhì)種類、配體、待除去物質(zhì)等決定。因此，對于基于瓊脂糖的基質(zhì)，陽離子交換配體的含量通常在0.01-0.3范圍內(nèi)，參考值為0.06-0.2毫摩爾/毫升。對于基于葡聚糖的基質(zhì)，該范圍通常為0.01-0.6毫摩爾/毫升基質(zhì)，該范圍為0.01-0.2毫摩爾/毫升基質(zhì)。在某些變化中，例如當(dāng)R為芳族時，混合型配體的含量通常在這些范圍的下半部分。在本發(fā)明這些變化中，陽離子交換配體的含量因此小于0.150毫摩爾/毫升基質(zhì)和/或小于1毫摩爾/克干重的基質(zhì)。表述“毫摩爾/毫升基質(zhì)”是指用水飽和的完全沉降的基質(zhì)。容量范圍是指處于完全去質(zhì)子化形式的基質(zhì)滴定酸官能團的容量。它包括來自除了配體中的主離子基團以外的帶負電基團的可能貢獻，例如在間隔物或殘基R中的。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的分離介質(zhì)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法使用，如在陽離子交換中，特別是混合型陽離子交換中。目前，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分離介質(zhì)的最有利用途是作為高鹽配體。但是，本發(fā)明分離介質(zhì)在正常條件下在傳統(tǒng)陽離子交換過程中與以前已知的介質(zhì)一樣具有良好的容量，所述條件可以由在約10mS以下操作來確定。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分離介質(zhì)在上述正常條件與高鹽條件之間的范圍內(nèi)也能令人滿意地操作，如以下所討論的。
因此，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的分離介質(zhì)可以有利地用作陽離子交換劑，其在較高離子強度下吸附特定物質(zhì)，稱為高鹽配體。這樣的陽離子交換劑應(yīng)當(dāng)能夠(a)在離子強度相當(dāng)于0.25M NaCl的水性參考液體中結(jié)合所關(guān)注的物質(zhì)，和(b)對于所述物質(zhì)，允許在2-12的pH范圍內(nèi)某處的最大臨界容量≥200％，例如≥300％或≥500％或≥1000％的常規(guī)陽離子交換劑對該物質(zhì)的臨界容量。
術(shù)語“臨界容量”是本領(lǐng)域內(nèi)公知的術(shù)語，其計算方法是眾所周知的并且在以下本申請的實驗部分還將描述。這些百分?jǐn)?shù)主要應(yīng)用于在陽離子交換劑條件期間進行的測量。
更具體地，在吸附過程中，在導(dǎo)致所述物質(zhì)通過陽離子交換與配體結(jié)合的條件下，使含有帶正電物質(zhì)的樣品與陽離子交換劑接觸。選擇pH值使得所述物質(zhì)至少部分地帶正電并且至少一部分陽離子交換配體帶負電。在優(yōu)選的變化中，使用弱陽離子交換劑(例如陰離子基團是-COO-)，且液體的pH值緩沖到pKa±2，如±1個pH單位。陽離子交換劑的pKa值被取為該陽離子交換劑用NaOH滴定時的拐點。對于陽離子交換劑、待結(jié)合物質(zhì)、溫度和pH、溶劑組成等的特定組合，離子強度(按鹽濃度或電導(dǎo)率測定)通常低于洗脫離子強度。使用多重模態(tài)陰離子交換劑的優(yōu)點之一是與傳統(tǒng)陽離子交換劑相比，它然后可能也在較高離子強度下進行吸附/結(jié)合。通過使陽離子交換劑與要除去的物質(zhì)相匹配，可以在高于使用參比離子交換劑時的離子強度下進行吸附(在相同的pH且否則在相同條件下測量)。取決于陽離子交換劑，可以獲得用參比陽離子交換劑獲得的臨界容量的≥200％，例如≥300％或≥500％或≥1000％的臨界容量。
在結(jié)合過程中使用的準(zhǔn)確離子強度取決于所用的配體、其在基質(zhì)上的密度、待結(jié)合物質(zhì)及其濃度等。有用的離子強度通常對應(yīng)于NaCl濃度(純水)≥0.1M，例如≥0.3M或者甚至≥0.5M。
在脫附中，通常使用本領(lǐng)域熟知的過程，例如將鹽濃度(離子強度)提高到脫附所要求的最小洗脫離子強度以上；降低pH以降低配體的負電荷；提高pH以降低物質(zhì)上的正電荷；和/或通過包含降低所用水性液體極性的配體類似物或一種試劑(例如溶劑添加劑)。這些變化相對于含有所述物質(zhì)的水性液體而言。
在陽離子交換條件下脫附意味著用于脫附的液體提供使至少一部分要吸附的物質(zhì)帶正電的條件(例如pH值)，和離子強度設(shè)定到高于這些條件下的最小洗脫離子強度。對于兩性化合物，首先提到的選項是指pH≥pI，例如pH≥pI+0.5。
也可以在被吸附物質(zhì)具有0或更小的凈電荷和/或基本全部陽離子交換配體被去掉電荷的條件下進行脫附。
在色譜法和/或間歇法中，具有被吸附物質(zhì)的基質(zhì)存在于柱中或其它合適的容器中，與吸附液體接觸。由該液體提供的條件然后被如上所述改變，直至希望的物質(zhì)被釋放并從基質(zhì)中洗出。對于在陽離子交換條件下進行的脫附過程，與吸附相比，離子強度通常增大，并常常相當(dāng)于至少0.6M NaCl。實際值取決于以上討論的各種因素。
以上討論的條件的變化可以用一個或多個步驟(階梯梯度)或連續(xù)(連續(xù)梯度)地實現(xiàn)。與基質(zhì)接觸的液體的各種變量可以逐一改變或組合改變。
用于改變離子強度的典型的鹽選自磷酸鹽、硫酸鹽的適當(dāng)銨鹽或金屬鹽等，特別是堿金屬和/或堿土金屬鹽。相同的鹽也可以用在吸附步驟中，但是其常常處于更低的濃度。
用于陽離子交換過程中的典型緩沖組分可以在酸/堿對中選擇，其中堿部分是陰離子的。典型的實例是羧酸/羧酸鹽(例如乙酸/乙酸鹽)、磷酸鹽等。在脫附步驟或更早步驟中pH的增大將減小從基質(zhì)中施放物質(zhì)所需的離子強度。取決于所用配體的pKa和物質(zhì)的pI，pH的降低可能導(dǎo)致物質(zhì)從陽離子交換基質(zhì)中施放或結(jié)合到陽離子交換基質(zhì)上。
與吸附液相比，通過調(diào)節(jié)脫附液的極性也有助于脫附。這可以通過在脫附液中包含水混溶性和/或親水性較小的有機溶劑來實現(xiàn)。這樣的溶劑的實例是丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、乙腈等。脫附液極性的降低可能有助于脫附，因此也降低從基質(zhì)中施放化合物所需的離子強度。通過在脫附液中包含陽離子交換配體的可溶性結(jié)構(gòu)類似物(配體類似物)也可以有助于脫附。這樣的類似物的足夠濃度至少大于其在吸附液中的濃度。
附圖詳述圖1表示在以上“背景技術(shù)”一節(jié)中用一般術(shù)語討論的多重模態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)的傳統(tǒng)合成的實例。從附圖中明顯看出，作為進行配體合成的固體載體的凝膠必須存在。
圖2表示使用高半胱氨酸硫代內(nèi)酯作為支架合成多重模態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)的本發(fā)明的一個實施方案。在原理上，根據(jù)本發(fā)明的方法由兩個步驟構(gòu)成，與現(xiàn)有技術(shù)的4步過程相比，配體的凝膠部分僅需要在最后一步中包含。
圖3說明借助于示例性支架高半胱氨酸硫代內(nèi)酯的多重模態(tài)陽離子交換劑介質(zhì)文庫的潛在多樣性?？赡艿腞殘基數(shù)量是巨大的并且在以上更詳細討論了，而具體實例將在以下實驗部分中討論。
圖4說明一種示意性方式，即從相同組的反應(yīng)性溶液中合成不同介質(zhì)文庫的一般過程。這樣的方法實際上可以用于許多性質(zhì)如顆粒尺寸、孔隙率、剛性或結(jié)合條件如pH、時間、溫度等。
以下利用實施例說明本發(fā)明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，提供本發(fā)明實施例僅用于說明的目的，并且不應(yīng)當(dāng)限制本發(fā)明，如所附權(quán)利要求所限定的。在本申請中以下及其它地方給出的全部對比文件并入本文作為參考。
實驗部分使用DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯產(chǎn)生新介質(zhì)的一般過程A.通過水解打開硫代內(nèi)酯
方案1一般合成方案一般過程步驟1步驟1a將DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia和二異丙基胺(DIPEA)在二氯甲烷(DCM)中的溶液A冷卻到0℃。將在DCM中含有?；然蚧酋Ｂ然蛩狒蚧罨乃岬娜芤築冷卻到0℃，并滴加到保持在0-5℃的溶液A中。該混合物在室溫整夜攪拌。
步驟1b將DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia和二異丙基胺(DIPEA)在二氯甲烷(DCM)中的溶液A冷卻到0℃。將碘代乙酰氯在DCM中的溶液滴加到保持在0-5℃的溶液A中。該混合物在室溫整夜攪拌。然后將在DCM中含有硫醇的溶液B滴加到該反應(yīng)混合物中并且再保持?jǐn)嚢?7小時。
步驟2在真空下從步驟1a或步驟1b得到的混合物中除去溶劑。在0℃緩慢加入氫氧化鈉溶液5N到該原料中，其在室溫進一步攪拌2小時。
步驟3將按公知過程獲得的溴化Sepharose6FF(Amershambiosciences AB，Uppsala，Sweden)與來自步驟2的堿溶液混合并整夜在最高50℃加熱。在反應(yīng)后，將凝膠(1份體積)過濾并用水(2×15份體積)、乙醇(2×15份體積)、乙酸0.2M(2×15份體積)和水(2×15份體積)洗滌。然后通過酸滴定測量凝膠的離子容量(Chauhan V.S.等人，Tetrahedron，44(8)，2359-2366，1988(酸活化))。這些凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在下表1A中。
實施例使用不同的R-Z-基團產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的分離介質(zhì)實施例1-4以下實施例使用作為支持物的D，L高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia以及所描述的化學(xué)物質(zhì)(參考以上方案1)。在通過使高半胱氨酸Ia與?；?、磺酰氯、酸酐或活化的酸反應(yīng)形成結(jié)合的酰胺或磺酰胺后，用堿水解實現(xiàn)硫代內(nèi)酯環(huán)的打開，所得的化合物進一步結(jié)合到活化的Sepharose6FF或Sepharose4FF(二者都得自AmershamBiosciences AB，Uppsala，Sweden)。
所有的溶液A都是新制備的，但是可以再利用來自結(jié)合反應(yīng)(步驟3中)后的過濾的溶液混合物并使其與另一種凝膠進一步反應(yīng)。在以下實施例中，來自第一個反應(yīng)(烯丙基含量為411微摩爾/毫升的凝膠)的濾液根據(jù)步驟1a、2和3進一步與烯丙基含量為250微摩爾/毫升的凝膠一起使用。在表1A中，得自烯丙基含量為411微摩爾/毫升的凝膠的結(jié)果用a)表示，而得自烯丙基含量為250微摩爾/毫升的凝膠的結(jié)果用b)表示，得自烯丙基含量為230微摩爾/毫升的結(jié)果用c)表示。
對于實施例1-4，溶液A根據(jù)步驟1a制備，使用1.58g的DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二異丙基-乙基胺(DIPEA)(20.6mmol)在6mL的DCM中。
實施例1?；?a.用2.37g(10.3mmol)的3，4，5-三甲氧基-苯甲酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)。凝膠1a的離子容量為232.6微摩爾/毫升。
1b.用1.80g(10.3mmol)的4-氯苯甲酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1b的離子容量為251.1微摩爾/毫升。
1c.用2.15g(10.3mmol)的2，4-二氯苯甲酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1c的離子容量為253.3微摩爾/毫升。
1d.用2.14g(10.3mmol)的3-(三氟甲基)苯甲酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1d的離子容量為239.9微摩爾/毫升。
1e.用2.14g(10.3mmol)的4-(三氟甲基)苯甲酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1e的離子容量為247.1微摩爾/毫升。
1f.用1.83g(10.3mmol)的煙酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1f的離子容量為253.3微摩爾/毫升。
1g.用1.65g(10.3mmol)的噻吩-2-乙酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1g的離子容量為261.5微摩爾/毫升。
1h.用1.10g(10.3mmol)的丁酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1h的離子容量為260.6微摩爾/毫升。
1i.用1.67g(10.3mmol)的辛酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1i的離子容量為233.6微摩爾/毫升。
1j.用1.24g(10.3mmol)的異戊酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1j的離子容量為232.4微摩爾/毫升。
1k.用1.57g(10.3mmol)的2-(2-甲氧基-乙氧基)乙酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1k的離子容量為234.0微摩爾/毫升。
實施例2磺酰氯2a.用1.96g(10.3mmol)的甲苯-4-磺酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠2a的離子容量為199.0微摩爾/毫升。
2b.用2.43g(10.3mmol)的2，5-二甲氧基苯磺酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠2b的離子容量為182.6微摩爾/毫升。
2c.用2.40g(10.3mmol)的4-乙酰胺基苯磺酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠2c的離子容量為159.7微摩爾/毫升。
2d.用2.25g(10.3mmol)的2，4，6-三甲基苯磺酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠2d的離子容量為176.5微摩爾/毫升。
2e.用1.18g(10.3mmol)的甲磺酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠2e的離子容量為163.2微摩爾/毫升。
實施例3酸酐3a.用2.33g(10.3mmol)的苯甲酸酐在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠3a的離子容量為255.1微摩爾/毫升。
3b.用1.34g(10.3mmol)的丙酸酐在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠3b的離子容量為238.3微摩爾/毫升。
實施例4活化的酸4a.活化的酸用羧酸新制備如下把1.84g(10.3mmol)馬尿酸和1.13mL的N-甲基嗎啉在20mL四氫呋喃(THF)中的溶液冷卻到-8℃，然后緩慢加入1.33mL氯甲酸異丁酯在5mL的THF中的溶液。該混合物在0℃攪拌2h，在室溫攪拌整夜，然后蒸發(fā)溶劑。將該原料溶解在4mL的DCM中制備溶液B，并根據(jù)步驟1a加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠4a的離子容量為182.4微摩爾/毫升。
實施例5碘代乙酰氯和硫醇以下實施例使用作為支架的D，L高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia以及所述化學(xué)物質(zhì)(參見上述方案1)。通過使高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia與碘代乙酰氯反應(yīng)形成酰胺。通過殘余鹵素的親核取代在所得的配體上引入硫醇。用堿水解實現(xiàn)硫代內(nèi)酯環(huán)的打開，所得的化合物進一步結(jié)合到活化的Sepharose6FF或Sepharose4FF上。
對于全部的實施例5，用0.35g的DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、HCl(2.3mmol)和0.841μL的二異丙基-乙基胺(DIPEA)(4.8mmol)在4mL的DCM中根據(jù)步驟1b制備溶液A。向冷卻后的反應(yīng)混合物中加入0.52g的碘代乙酰氯(2.5mmol)在2mL的DCM中的溶液。
5a.用284μL(2.3mmol)的芐硫醇在1mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1b，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入5mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入4mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠5a的離子容量為118.2微摩爾/毫升。
5b.用243μL(2.3mmol)的糠基硫醇在1mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1b，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入5mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入4mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠5b的離子容量為114.1微摩爾/毫升。
5c.用373mg(2.3mmol)的4-巰基-苯甲酸在1mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1b，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入5mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入4mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠5c的離子容量為184.8微摩爾/毫升。
5d.用251μL(2.3mmol)的2-甲基-1-丙硫醇在1mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1b，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入5mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入4mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠5d的離子容量為155.0微摩爾/毫升。
5e.用205μL(2.3mmol)的2，2，2-三氟乙硫醇在1mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1b，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入5mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入4mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠5e的離子容量為125.4微摩爾/毫升。
表1A表1A V＝CO，SO2，CO-CH2-S
表1A(續(xù)) a用烯丙基含量為411微摩爾/毫升的凝膠Sepharose6FF獲得的離子容量。
b用烯丙基含量為250微摩爾/毫升的凝膠Sepharose6FF獲得的離子容量。
c用烯丙基含量為230微摩爾/毫升的凝膠Sepharose6FF獲得的離子容量。
Nd未測定。
B.通過親核試劑打開硫代內(nèi)酯1.氨基酸 方案2用氨基酸打開硫代內(nèi)酯實施例6苯甲酰氯和苯基絲氨酸以下實施例使用作為支架的D，L高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia以及所述化學(xué)物質(zhì)(參見上述方案2)。通過使高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia與酰基氯反應(yīng)形成結(jié)合的酰胺后，用氨基酸衍生物實現(xiàn)硫代內(nèi)酯環(huán)的打開，并且所得的化合物進一步結(jié)合到活化的Sepharose。
在下表1B中，得自烯丙基含量為230微摩爾/毫升的凝膠的結(jié)果用c)表示。
制備1.58g的DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二異丙基-乙胺(DIPEA)(20.6mmol)在6mL的DCM中的溶液A并將其冷卻到0℃。用1.45g(10.3mmol)苯甲酰氯在4mL的DCM中制備另一種溶液，并滴加到溶液A中。在室溫攪拌17小時后，去除溶劑。向該原始混合物中加入50ml的THF和1.8mL(10.3mmol)的DIPEA和3.52g(20.6mmol)的DL-苯基絲氨酸水合物。把反應(yīng)物在50℃整夜加熱。在真空中除去溶劑，加入50mL碳酸鉀的10％水溶液。用乙酸乙酯(EtOAc)(3×15mL)洗滌水相，用檸檬酸酸化，用EtOAc(3×15mL)萃取。用硫酸鈉干燥有機相并在真空下濃縮。
向該原料中加入6mL氫氧化鈉的5N溶液。向該堿性混合物中加入5mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF，整夜在最高50℃加熱。在反應(yīng)后，將凝膠(1份體積)過濾并用水(2×15份體積)、乙醇(2×15份體積)、乙酸0.2M(2×15份體積)和水(2×15份體積)洗滌。然后通過酸滴定測量凝膠的離子容量。這些凝膠的色譜評價表示在下表1B中。
凝膠6的離子容量為148.3微摩爾/毫升。
2.胺 方案用胺打開硫代內(nèi)酯實施例7琥珀酸酐和苯胺以下實施例使用作為支架的D，L高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia以及所述化學(xué)物質(zhì)(參見上述方案3)。通過使高半胱氨酸硫代內(nèi)酯Ia與酸酐反應(yīng)形成結(jié)合的酰胺后，用胺實現(xiàn)硫代內(nèi)酯環(huán)的打開，并且所得的化合物進一步結(jié)合到活化的Sepharose。
在下表1B中，得自烯丙基含量為230微摩爾/毫升的凝膠的結(jié)果用c)表示。
制備1.58g的DL-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、HCl(10.3mmol)和3.58mL的二異丙基-乙胺(DIPEA)(20.6mmol)在50mL的甲醇中的溶液并將其冷卻到0℃。分小份向該硫代內(nèi)酯中加入0.93g(9.3mmol)的琥珀酸酐。在室溫攪拌17小時后，去除溶劑。向原始混合物中加入20ml的THF和1.3mL(15.3mmol)的。把反應(yīng)物整夜回流。在真空中除去溶劑，加入50mL碳酸鉀的10％水溶液。用乙酸乙酯(EtOAc)(3×15mL)洗滌水相，用檸檬酸酸化，用EtOAc(3×15mL)萃取。用硫酸鈉干燥有機相并在真空下濃縮。
向該原料中加入6mL氫氧化鈉的5N溶液。向該堿混合物中加入5mL烯丙基含量為230微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF，整夜在最高50℃加熱。在反應(yīng)后，將凝膠(1份體積)過濾并用水(2×15份體積)、乙醇(2×15份體積)、乙酸0.2M(2×15份體積)和水(2×15份體積)洗滌。然后通過酸滴定測量凝膠的離子容量。這些凝膠的色譜評價表示在下表1B中。
凝膠7的離子容量為155.1微摩爾/毫升。
表1B c用烯丙基含量為230微摩爾/毫升的凝膠Sepharose6FF獲得的離子容量。
實施例8-11基質(zhì)的優(yōu)化反應(yīng)混合物可以使用若干次，以便與不同的基質(zhì)反應(yīng)，和/或用于不同級別烯丙基含量的相同基質(zhì)。
實施例8第1級凝膠1j的制備如上所述。用1.24g(10.3mmol)異戊酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠1j的離子容量為232.4微摩爾/毫升。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第2級
由直接在結(jié)合到411微摩爾/毫升(第1級)的基質(zhì)后過濾得到的溶液，與烯丙基含量為250微摩爾/毫升的活化Sepharose6FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠1j-2給出162.8微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第3級由直接在結(jié)合到250微摩爾/毫升(第2級)的基質(zhì)后過濾得到的溶液，與烯丙基含量為138微摩爾/毫升的活化Sepharose6FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠1j-3給出104.2微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
實施例9第1級凝膠3a的制備如部分A中所述。用2.33g(10.3mmol)苯甲酸酐在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為411微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose6FF。凝膠3a的離子容量為255.1微摩爾/毫升。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第2級由直接在結(jié)合到411微摩爾/毫升的基質(zhì)后過濾獲得的溶液，與烯丙基含量為250微摩爾/毫升的活化Sepharose6FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠3a-2給出196.0微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第3級由直接在結(jié)合到250微摩爾/毫升的基質(zhì)后過濾獲得的溶液，與烯丙基含量為138微摩爾/毫升的活化Sepharose6FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠3a-3給出117.4微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
實施例10第1級用1.24g(10.3mmol)異戊酰氯在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a(一般過程)，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為580微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose4FF。凝膠1j-4的離子容量為108.4微摩爾/毫升。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第2級直接在結(jié)合到580微摩爾/毫升(第1級)的基質(zhì)后過濾所得的溶液，與烯丙基含量為240微摩爾/毫升的活化Sepharose4FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠1j-5給出128.1微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
實施例11第1級用2.33g(10.3mmol)苯甲酸酐在4mL的DCM中制備溶液B并根據(jù)步驟1a，加入到溶液A中。在步驟2后，去除溶劑，向該原料中加入6mL氫氧化鈉5N的溶液。根據(jù)步驟3，向該混合物中加入5mL烯丙基含量為580微摩爾/毫升凝膠的溴化Sepharose4FF。凝膠3a-4的離子容量為148.1微摩爾/毫升。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
第2級直接在結(jié)合到580微摩爾/毫升的基質(zhì)后過濾所得的溶液，與烯丙基含量為240微摩爾/毫升的活化Sepharose4FF反應(yīng)。根據(jù)步驟3進行結(jié)合。所產(chǎn)生的凝膠3a-5給出144.7微摩爾/毫升的離子容量。該凝膠的色譜評價(保持率和容量)表示在表2中。
表2 V＝CO，SO2 實施例12-14離子交換劑的實驗參比過程材料緩沖溶液緩沖溶液120mM磷酸鈉、0.3M NaCl、pH＝6.8緩沖溶液220mM乙酸鈉、0.25M NaCl、pH＝4.0緩沖溶液320mM乙酸鈉、0.25M NaCl、pH＝4.5緩沖溶液420mM磷酸鈉、2M NaCl、pH＝6.8緩沖溶液5100mM磷酸鈉、pH＝7.0(用于BSA和IgG的洗脫)蛋白質(zhì)溶液
1.BSA4mg/mL在緩沖溶液2中2.IgG4mg/mL在緩沖溶液3中在使用前，所有的緩沖溶液和蛋白質(zhì)溶液通過0.45微米Millipore Millex HA過濾器過濾。
色譜系統(tǒng)所有的實驗使用裝備Unicorn 3.1軟件的AKTA Explorer 100色譜系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biothech AB)在室溫下進行。將樣品通過150mL的長毛圈織物(superloop)施加到柱。整個過程使用1mL/min(約300cm/h)的流量。通過使用10mm貫流分析池在280nm的吸收率測量連續(xù)監(jiān)測洗出物。
實施例12前沿分析，“高鹽”配體將每種樣品陽離子交換劑堆積在HR5/5柱(堆積床體積＝1mL)并用合適的pH值和鹽濃度的緩沖液平衡。通過在非結(jié)合條件下向柱中施加合適蛋白質(zhì)的溶液，確定系統(tǒng)的空隙體積。流出物的A280達到所施加蛋白質(zhì)的A280的10％所消耗的時間被定義為系統(tǒng)的空隙體積(用分鐘表示)。
向用合適的緩沖溶液(緩沖溶液1、2或3)平衡的柱中，連續(xù)送入(例如通過150mL的長毛圈織物)溶解在合適的平衡緩沖液(見以上)中的樣品蛋白質(zhì)，流量為1mL/min(即約300cm/h)。繼續(xù)樣品的施加直至流出物的A280達到施加到該柱的樣品A280的10％?；谌绱双@得的數(shù)據(jù)[即堆積凝膠床的體積(Vc)，其空隙體積、流量和送入該柱的蛋白質(zhì)濃度]，可以計算出在施加到堆積凝膠的蛋白質(zhì)濃度的10％水平下該堆積凝膠的臨界容量。
實施例13臨界值和評價在吸附最大值的10％(Qb10％)水平下的臨界值使用以下關(guān)系式進行計算Qb10％＝(TR10％-TRD)×C/Vc這里TR10％＝在吸附最大值的10％時的保持時間(min)，TRD＝系統(tǒng)的空隙體積(用min表示)，C＝原料蛋白質(zhì)的濃度(4mg/mL)和VC＝柱的堆積床體積(mL)。
實施例14結(jié)合到“高鹽”陽離子交換配體的蛋白質(zhì)的回收“高鹽”陽離子交換配體優(yōu)選還相對于在其上結(jié)合的蛋白質(zhì)的回收進行篩選。這是選擇正確種類配體的附加且重要的標(biāo)準(zhǔn)，所述配體將較高吸附容量與施加到其上的蛋白質(zhì)高比例或定量回收結(jié)合在一起。
權(quán)利要求
1.一種包含結(jié)合到基質(zhì)上的混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的產(chǎn)生方法，該方法包括以下步驟(a)提供至少一種支架，其每一種包含官能團F并具有環(huán)狀核心結(jié)構(gòu)；(b)用包含結(jié)合到殘基R的反應(yīng)性基團的試劑使支架衍生，其通過使所述支架的基團F與所述試劑的反應(yīng)性基團反應(yīng)而進行，同時保持支架的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；(c)打開所得衍生物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和(d)使所獲得的開環(huán)產(chǎn)物與包含反應(yīng)性基團的基礎(chǔ)基質(zhì)反應(yīng)，所述反應(yīng)性基團任選通過間隔物結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上；其中所述支架存在至少兩個官能團，其中之一是含硫基團，用于結(jié)合到基質(zhì)的活性基團上，其另一個是可以轉(zhuǎn)變成離子基團的基團，所述官能團以相鄰位置存在于環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，并且其中在步驟(c)中，通過破壞在兩個官能團之間的鍵提供開環(huán)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述支架可以由通式(I)限定 其中A、B和X相互獨立地是碳原子或任何雜原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅，m是0-4之間的任何整數(shù)，例如1-3，優(yōu)選1或2，官能團F由一個X表示，或者結(jié)合到A、B和X的任一個上，任選通過連接劑，所述連接劑由1-50個原子構(gòu)成。
3.前述權(quán)利要求任一項的的方法，其中在式(I)中，官能團F選自含有離去基團的基團，如親核取代中常用的，例如C-Y，其中Y表示例如Br、Cl、I、甲磺酸根或甲苯磺酸根基團；酸或活化的酸如WC＝O，其中W例如由N-氫琥珀酰亞胺、五氟苯酚、對硝基苯或氯甲酸異丙酯形成的；親核基團例如-OH、-SH或-NH2；以及C＝C。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中在式(I)中，A、B和X是碳原子，m為1，F(xiàn)是-NH2。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中在式(I)中，支架是高半胱氨酸硫代內(nèi)酯
6.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中在步驟(b)中所用的衍生試劑可以由以下通式描述-Z-R (II)其中Z是能夠與支架的官能團F反應(yīng)的基團；和R是直鏈、支鏈、環(huán)狀的飽和、不飽和的和芳族的烴基，其優(yōu)選包含約1-20個，如1-10個碳原子。
7.一種包含結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上的混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的產(chǎn)生方法，該方法包括以下步驟(a)提供具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的至少一種支架衍生物；(b)打開該衍生物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和(c)使所獲得的開環(huán)產(chǎn)物與包含反應(yīng)性基團的基礎(chǔ)基質(zhì)反應(yīng)，所述反應(yīng)性基團任選通過間隔物結(jié)合到基礎(chǔ)基質(zhì)上；其中所述支架可以由通式(III)定義 其中A、B和X相互獨立地是碳原子或任何雜原子，如氧、硫、氮和/或二氧化硅，m是0-4之間的任何整數(shù)，例如1-3，優(yōu)選1或2，所述官能團以相鄰的位置存在于環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，并且其中在步驟(c)，通過破壞所述兩個相鄰位置之間的鍵提供環(huán)的打開，并且其中Z-R結(jié)合到A、B和X的任一個上。
8.權(quán)利要求7的方法，其中R是直鏈、支鏈、環(huán)狀的飽和、不飽和的和芳族的烴基，其優(yōu)選包含約1-20個，如1-10個碳原子。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中支架衍生物是高半胱氨酸硫代內(nèi)酯衍生物。
10.權(quán)利要求1-9的任一項方法，其還包含單獨的并且在步驟(b)之前溴化基礎(chǔ)基質(zhì)的反應(yīng)性基團的步驟，其中所述反應(yīng)性基團是碳-碳雙鍵。
11.權(quán)利要求1-9的任一項的方法，其還包含單獨的并且在步驟(b)之前在有利于自由基反應(yīng)的條件下活化基礎(chǔ)基質(zhì)的反應(yīng)性基團的步驟，其中所述反應(yīng)性基團是碳-碳雙鍵。
12.一種試劑盒，其包含如權(quán)利要求2-5的任一項限定的由以上定義的通式(I)所定義的化合物或者如權(quán)利要求9-11的任一項限定的由以上通式(III)所定義的衍生物，該試劑盒以固體形式包含這樣的化合物或衍生物及其在制造混合型陽離子交換劑配體中的使用說明書，所述混合型陽離子交換劑配體結(jié)合到基質(zhì)上，用作分離介質(zhì)。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其是一種用于產(chǎn)生高鹽配體的試劑盒。
14.一種優(yōu)化包含混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的結(jié)合性質(zhì)的方法，其包括以下步驟(a)在水溶液中提供活化的支架衍生物；(b)使該溶液與由第一種性質(zhì)限定并能夠結(jié)合所述支架衍生物的基礎(chǔ)基質(zhì)顆粒的懸浮液接觸；(c)將溶液與顆粒分離；(d)使分離后的溶液與由不同于所述第一種性質(zhì)的性質(zhì)限定并能夠結(jié)合所述支架衍生物的基礎(chǔ)基質(zhì)顆粒的懸浮液接觸；(e)將溶液與顆粒分離；(f)任選重復(fù)步驟(d)和(e)一次或多次；和(g)通過常規(guī)離子交換實驗評價這樣獲得的分離介質(zhì)的容量。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述性質(zhì)是在能夠結(jié)合活化的支架的基礎(chǔ)基質(zhì)顆粒上存在的反應(yīng)性基團的密度。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述性質(zhì)是在能夠結(jié)合活化的支架的基礎(chǔ)基質(zhì)顆粒上存在的反應(yīng)性基團的特性。
17.權(quán)利要求14-16的任一項的方法，其中支架衍生物如權(quán)利要求1-8的任一項所述進行生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含結(jié)合到基質(zhì)上的混合型陽離子交換劑配體的分離介質(zhì)的產(chǎn)生方法，該方法包括提供包含官能團并具有環(huán)狀核心結(jié)構(gòu)的支架；用包含結(jié)合到殘基R的反應(yīng)性基團的試劑使支架衍生，其通過使所述支架的官能團與所述反應(yīng)性基團反應(yīng)而進行；打開所得衍生物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；和使該產(chǎn)物與包含反應(yīng)性基團的基質(zhì)反應(yīng)。所述支架存在至少兩個官能團，一個用于結(jié)合到基質(zhì)上的含硫基團和一個可以轉(zhuǎn)變成離子基團的基團。
文檔編號B01J39/18GK1553828SQ02817837
公開日2004年12月8日 申請日期2002年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者J·L·馬盧瓦塞爾, N·泰弗南, J L 馬盧瓦塞爾, つ 申請人:阿默森生物科學(xué)有限公司