專(zhuān)利名稱(chēng)：生物活性濃縮物,其生產(chǎn)方法和某些還含有硫酸軟骨素的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性濃縮物，其生產(chǎn)方法和治療變性疾病、風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)病和其它相關(guān)疾病的藥物組合物。
背景技術(shù)：
一種抗透明質(zhì)酸酶物質(zhì)的配合物衍生于含有氨基酸、總糖、糖原、硫酸軟骨素、苯酚、降血壓物質(zhì)的天然產(chǎn)品如小魚(yú)，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為50I.U/ml。
生產(chǎn)此配合物的方法在于用0.5％苯酚溶液分兩階段處理海魚(yú)24小時(shí)，合并的提取物在最高40℃真空濃縮，再用等體積96c乙醇處理，除去沉淀物，所得的上清液用硅藻土處理、過(guò)濾，在最高40℃真空濃縮，然后用提取溶劑處理，除去溶劑后，用苯酚處理至4.5-5.5％的值。
含一種抗透明質(zhì)酸酶生物活性提取物、苯酚和偏亞硫酸氫鈉的藥物組合物也被開(kāi)發(fā)出來(lái)。
這些藥物有賴(lài)于一種物質(zhì)即天然活性成分的配合物，其比例與正常的起作用的比例接近，通過(guò)從動(dòng)物組織提取而生產(chǎn)或在細(xì)胞和微生物培養(yǎng)物中生物合成，這種配合物的作用是取代，代替在結(jié)締組織中由于各種原因引起失衡和導(dǎo)致疾病的天然配合物的功能，或甚至使其恢復(fù)正常。
已經(jīng)確立了提取和調(diào)節(jié)方法，以使活性物質(zhì)的損失和降解盡可能低，并且當(dāng)原料成分的比例與治療人類(lèi)疾病所需的不同時(shí)，可通過(guò)提取物的適當(dāng)復(fù)配或通過(guò)治療程序加以平衡。
現(xiàn)在，已知導(dǎo)致疾病的機(jī)理是由于關(guān)節(jié)正?；顒?dòng)所依賴(lài)的正常成分的生物合成和破壞失衡。
生物體組織中的細(xì)胞包埋于基礎(chǔ)物質(zhì)中并于其中演化。該基礎(chǔ)物質(zhì)-一種生物結(jié)構(gòu)的普通化合物-充滿(mǎn)所有間隙并把每一個(gè)固定的細(xì)胞與其相鄰者隔開(kāi)。細(xì)胞外環(huán)境組成的變化對(duì)細(xì)胞的行為有深刻的影響，而反過(guò)來(lái)，細(xì)胞具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)其中間環(huán)境的作用。
細(xì)胞間質(zhì)是一種配合物凝膠，含水、電解質(zhì)類(lèi)、代謝產(chǎn)物類(lèi)、溶解的氣體、酶類(lèi)、痕量元素、脂肪類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)。這種物質(zhì)由于富含某些長(zhǎng)鏈酸性粘多糖聚合物，尤其是葡萄糖胺聚糖和相關(guān)的蛋白聚糖而具有高粘性，在微觀水平上由膠原纖維的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而增強(qiáng)(Cameron，E.和Pauling，L.-The Encyclopaedia of Ignorance，p377-385，Pergamon Press，Oxford，1982)。
發(fā)現(xiàn)于所有關(guān)節(jié)處的滑液的作用不僅是用來(lái)潤(rùn)滑活動(dòng)結(jié)構(gòu)，而且用來(lái)消散能量。
這種功能是由滑液組合物實(shí)現(xiàn)的，其中葡萄糖胺聚糖(GAC)和蛋白聚糖(PG)如透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素由于其螺旋結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致高粘性，當(dāng)運(yùn)動(dòng)頻率低時(shí)表現(xiàn)為粘稠樣，當(dāng)運(yùn)動(dòng)頻率高時(shí)表現(xiàn)為彈性樣(Ogston，A.G.和Stanier，J.E.(1953)-生理學(xué)雜志(J.Physiol)，199，124)。
彈性是由于在pH＝2.5時(shí)存在非常濃的透明質(zhì)酸，它在鹽溶液中形成一種粘彈性糊狀物(Balasz，E.A.，胞內(nèi)基質(zhì)的化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)(Chemistry and Molecular Biology of the Intercellular Matrix)，第II和III卷，Academic Press，New York，1970)。
就其粘性而論，滑液在不同年齡表現(xiàn)類(lèi)似，但在高運(yùn)動(dòng)頻率時(shí)吸收的能量是不同的，在年輕人中滑液吸收77％的能量，而在老年人中只能通過(guò)彈性貯藏吸收52％的能量。
在受疾病侵襲的關(guān)節(jié)中(骨關(guān)節(jié)病)，滑液是粘性而不是彈性的。這種滑液的稠度為健康老年人的七分之一。這些滑液中透明質(zhì)酸的濃度低，導(dǎo)致低粘度指數(shù)，而蛋白質(zhì)的濃度高。濃度變化的負(fù)面影響在某些病例中可能較低，粘度指數(shù)可達(dá)30倍。
而且，在關(guān)節(jié)、腱、眼玻璃體中-流質(zhì)區(qū)(滑液，玻璃體液)是與固體基質(zhì)(關(guān)節(jié)軟骨、腱、筋膜、玻璃體)相鄰的。
在流體基質(zhì)中的粘彈性大分子化合物-透明質(zhì)酸-穿透固體基質(zhì)的表面。從流變學(xué)上講，兩種基質(zhì)的主要區(qū)別是固體基質(zhì)中存在膠原纖維而在流體基質(zhì)中不存在。
1-2μ的表面層是由透明質(zhì)酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。
這一層可由在細(xì)胞間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的過(guò)量透明質(zhì)酸酶的作用而除去或破壞。
10-15μ厚的下層含典型的膠原纖維，而且原纖維間隙被大致等量的透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素充滿(mǎn)。
根據(jù)專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域已知的資料(Cameron，E.和Pauling，L.-TheEncyclopaedia of Ignorance，p377-385，Pergamon Press，Oxford，1982和Balasz，E.A.和Sweeney，D.B.-1968-視網(wǎng)膜脫落的新的且有爭(zhēng)論的方面(New and Controversial Aspects of Retinal Detachement)，p371，Ed.McPerson，Harpen和Row，New York)，本發(fā)明的目的在于生產(chǎn)一種各成分的配合物，其中粘多糖聚合物和蛋白聚糖以透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的形式參與其中，還有它們的片斷，肝素和抗壞血酸，它們都是被最近的研究證實(shí)，對(duì)恢復(fù)變性疾病中結(jié)締組織正常功能有貢獻(xiàn)的物質(zhì)。這些疾病改變了包埋細(xì)胞的基礎(chǔ)物質(zhì)，惡化了基礎(chǔ)物質(zhì)和這些細(xì)胞間的現(xiàn)存關(guān)系?！罢！逼胶獾臈l件是對(duì)每一部分-基礎(chǔ)物質(zhì)和細(xì)胞-保持其自身的功能，因?yàn)槿魏巫兓?，例如由?xì)胞過(guò)量分泌的透明質(zhì)酸酶的作用而引起的透明質(zhì)酸解聚導(dǎo)致的基礎(chǔ)物質(zhì)粘度降低，會(huì)伴隨著疾病的發(fā)生。
另一種恢復(fù)平衡的途徑與一種叫做抗透明質(zhì)酸酶的抗酶有關(guān)(透明質(zhì)酸酶終究是一種與結(jié)締結(jié)構(gòu)有同樣功能的酶類(lèi))，它與硫酸軟骨素、肝素和抗壞血酸一起阻止或限制透明質(zhì)酸的解聚。
已知有某些嘗試來(lái)制備基于從含有抗透明質(zhì)酸酶的原料，如牛的氣管、牛和羊的睪丸、臍帶、小海魚(yú)等提取得到的抗透明質(zhì)酸酶的藥物。
盡管當(dāng)時(shí)很重要(專(zhuān)利RO/82273-1982和由the Institute ofChemical and Pharmaceutical Research-Bucharest起草的“技術(shù)報(bào)告(Technological Reports)”，No.84740/1977和No.5160/1979)，這些嘗試代表了一種只部分地解決了生產(chǎn)方法和得到的藥物組成的問(wèn)題的基本可選途徑。
發(fā)明公開(kāi)根據(jù)本發(fā)明，生物活性濃縮物是一種活性物質(zhì)-10％水溶液，包含7-9％的抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物和加有1-3％的重組(restitutive)且抗透明質(zhì)酸酶的硫酸軟骨素，它具有pH＝4-6，抗透明質(zhì)酸酶活性為450-750I.U./ml，呈淡黃至淺棕色；凍干狀態(tài)下它含至少93％的活性物質(zhì)，活性物質(zhì)包含65-84％的粘多糖聚合物和9-28％的硫酸軟骨素，呈淡黃至淺棕色并含有通常的防腐劑(conservant)。生物活性濃縮物的生產(chǎn)方法在于用含0.5％苯酚，pH＝2-4的酸性水溶液分兩階段處理來(lái)自動(dòng)物的軟骨結(jié)締組織，如牛和羊的氣管、臍帶、未成年動(dòng)物的腱、腸、睪丸或海洋生物，第一階段用1∶3.5-4的比例，第二階段用1∶1.5的比例，兩階段的提取都需24小時(shí)，在0-4℃溫度下每3小時(shí)攪拌30分鐘，然后第一階段得到的提取物與第二階段得到的合并，并用Ca(OH)2溶液調(diào)節(jié)至pH＝4.5-5，讓其在0-4℃靜置8小時(shí)，然后過(guò)濾，得到的溶液在最高45℃溫度下真空蒸發(fā)濃縮至濃縮比值為7∶1，此后溶液通過(guò)弱離子(ion-weak)陰離子交換柱，隨后以1∶4的比例用提取溶劑脫脂6-10次，直至殘余的脂質(zhì)不超過(guò)1-5％。最后一次脫脂過(guò)程以同樣的比例用正己烷進(jìn)行，然后產(chǎn)生的水溶液真空濃縮至體積為原溶液體積的70％；經(jīng)過(guò)濾，所得上清液用96c乙醇處理以脫除蛋白質(zhì)，直至達(dá)到50％乙醇濃度，然后在0-5℃涼處放置12小時(shí)，再過(guò)濾，乙醇溶液濃縮以除去乙醇，直到與進(jìn)行脫蛋白質(zhì)的水溶液相比為70％的體積，蛋白質(zhì)沉淀物用硫酸銨梯度處理，低分子量蛋白質(zhì)級(jí)分與通過(guò)用磷酸三鈉連續(xù)處理最后溶液直至pH＝8.5而從中除去醇和組胺雜質(zhì)的水溶液合并，然后過(guò)濾，所得溶液通過(guò)弱離子陽(yáng)離子交換柱-pH值回復(fù)至4-6，然后加入硫酸軟骨素至1-3％的濃度。原料可以是新鮮、冷凍或保護(hù)狀態(tài)。溶液通過(guò)弱陽(yáng)離子交換劑是在每小時(shí)不超過(guò)原溶液體積的1/5的流速下進(jìn)行的。
藥物組合物含有此生物活性濃縮物-溶液或者是凍干狀態(tài)，還有增效物質(zhì)，如肝素、乙酰水楊酸鈉或溶素，抗壞血酸、維生素E，“I”樣構(gòu)造的水、芐醇、亞丙基甘氨酸(propylene glycocoll)、植物提取物(蓍屬，金盞花屬，母菊屬，車(chē)前草屬，金絲桃屬)和通常的賦形劑，調(diào)制成肌內(nèi)注射液、關(guān)節(jié)內(nèi)注射液、軟膏、凝膠和栓劑形式。
對(duì)肌內(nèi)給藥，組合物在1ml水溶液中包含0.1ml10％生物活性濃縮物溶液或11mg凍干的生物活性濃縮物，最多5mg苯酚和2mg偏亞硫酸氫鈉，它具有pH＝4-6，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為45I.U./ml。對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)給藥，組合物在1ml水溶液中包含由10％的生物活性濃縮物溶液組成的15mg/ml干活性物質(zhì)或者16.5mg凍干的生物活性濃縮物，10mg乙酰水楊酸鈉或溶素，2mg抗壞血酸、0.2mg肝素、20mg芐醇、40mg亞丙基甘氨酸，它具有pH＝4-6，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為65I.U./ml，給藥劑量是2ml；其它類(lèi)型的防腐劑也可使用，如2mg偏亞硫酸氫鈉，5mg苯酚，只要不改變活性物的性質(zhì)或最終產(chǎn)品的質(zhì)量。對(duì)于軟膏、凝膠或栓劑形式的調(diào)制，100g組合物包含3-10g由10％的生物活性濃縮物溶液組成的干物質(zhì)或4-12g凍干的生物活性濃縮物，0.3-0.5g乙酰水楊酸鈉或溶素，0.2-0.4g維生素E，0.4-0.8g抗壞血酸(優(yōu)選0.5g)，0.2g肝素，2-5g植物總提取物，在含40-75g，優(yōu)選65g“I”樣構(gòu)造的水的乳油或凝膠基質(zhì)中乳化，以及通常的防腐劑和調(diào)味劑?？捎玫闹参锸嵌嗳~蓍、金盞花、母菊、車(chē)前草屬數(shù)種、貫葉金絲桃(Hypericum Perforatum)?！癐”樣構(gòu)造的水是一種具有增加的能勢(shì)(energetic potential)，高的跨膜穿透能力和顯著的抗炎和抗感染作用的水(羅馬尼亞專(zhuān)利號(hào)109835B.1/1995，作者M(jìn)anzatu Ioan和Ionita-Manzatu Vasile)。
本發(fā)明提出的溶液解決了引用著作中發(fā)現(xiàn)的某些缺點(diǎn)，因?yàn)檫@是一個(gè)關(guān)鍵的方法，以與現(xiàn)存于基礎(chǔ)物質(zhì)中，因而也現(xiàn)存于關(guān)節(jié)中相似的比例高效地完成抗透明質(zhì)酸酶與硫酸軟骨素的提取。如果進(jìn)行提取的原料缺少必需的硫酸軟骨素部分，最終產(chǎn)品通過(guò)充分利用的方法加入從其它原料中得到的這種配合物。
按照這一方法，得到了下列藥物用于肌內(nèi)給藥的注射液本身或凍干粉劑，用于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的注射液或凍干粉劑，外部、局部使用的軟膏和凝膠，以及用于肛門(mén)給藥的栓劑。
根據(jù)治療程序使用這些藥物以獲得某些協(xié)同作用，它們使每一種成份單獨(dú)的作用提高。
通過(guò)它的作用，生物活性濃縮物防止正常組成的大分子結(jié)構(gòu)的混亂，并在間質(zhì)和關(guān)節(jié)周?chē)揭约瓣P(guān)節(jié)軟骨水平上刺激炎性疾病中的組織和關(guān)節(jié)周?chē)闹亟ㄟ^(guò)程，積極地影響鈣離子在抗炎、再生、生物刺激、皮膚和組織重組作用中的動(dòng)力學(xué)，并刺激恢復(fù)期病人的新陳代謝。
所有五種藥物組合物對(duì)病因有吸引力，通過(guò)恢復(fù)細(xì)胞和細(xì)胞間機(jī)制，同時(shí)阻止透明質(zhì)酸酶過(guò)量并開(kāi)始組織的恢復(fù)過(guò)程。它們易于給藥且無(wú)任何副作用。
生產(chǎn)方法可用于工業(yè)規(guī)模，具有低能耗和所用物質(zhì)可回收利用。
提出的提取方法除了其非常有效這一事實(shí)外，在第一階段在pH＝2-4下排除了已發(fā)現(xiàn)的很多缺點(diǎn)，因?yàn)榘ㄟx擇性的純化過(guò)程，如組胺的除去，它是一個(gè)必需的操作，因?yàn)閺那吧a(chǎn)的一些產(chǎn)品具有不令人滿(mǎn)意的組胺試驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致因其降血壓作用而將其扔掉。還包括離子交換去離子作用，以降低在反復(fù)的濃縮操作后的高離子負(fù)荷。
最后，在提取流程中包含的最重要的過(guò)程是實(shí)現(xiàn)了與廢物回收的平行提取流程，因此可提供更高含量的氨基酸和硫酸軟骨素，這在前面引用的著作中是沒(méi)有出現(xiàn)的。
最終，肝素和抗壞血酸的加入也使得獲得一種要用于關(guān)節(jié)內(nèi)的注射液以及適當(dāng)?shù)能浉?，凝膠和栓劑成為可能。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式以下給出四個(gè)實(shí)施
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1為了獲得生物活性濃縮物，進(jìn)行提取過(guò)程的原料不但包含來(lái)自動(dòng)物的軟骨結(jié)締組織-牛和羊的氣管、臍帶、未成年動(dòng)物的腱-而且包括腸、睪丸或小海魚(yú)。所用的原料是小海魚(yú)(鳀)，用量20kg，為新鮮、冷凍或保護(hù)和脫鹽狀態(tài)，經(jīng)解凍或脫鹽后切成2-6mm大小的碎片，用75升含0.5％苯酚、pH＝2-4的水溶液在3-5℃的溫度下進(jìn)行提取。
在苯酚溶液中加入切碎的原料之前，用N(正常)HCl溶液調(diào)節(jié)其pH值。
第一次提取是用適當(dāng)?shù)牟ＡЩ蛱麓设T鐵罐，每3小時(shí)以90-120轉(zhuǎn)/分間歇攪拌30分鐘，共進(jìn)行24小時(shí)。所得溶液用大于100針/厘米2的織物作過(guò)濾材料離心分離，第二次提取用30升含0.5％苯酚，pH如上調(diào)節(jié)至2-4的溶液處理，操作需另一24小時(shí)，也間歇攪拌。
提取物I和II合并后用縐紙(工業(yè)過(guò)濾器)過(guò)濾，海洋糊狀物是廢渣。
按此方法提取和過(guò)濾的溶液用Ca(OH)2溶液調(diào)節(jié)至pH＝5，然后讓其在0-4℃溫度下靜置8小時(shí)。
用工業(yè)過(guò)濾器重復(fù)過(guò)濾以除去沉淀物和其中剩余的氯離子。
大約95升的濾液在最高45℃的內(nèi)部溫度下真空蒸發(fā)濃縮。濃縮比例是7∶1，因此得到13.5升棕黃色懸浮濃縮物。
濃縮后，控制pH值在4-6之間，一些離子經(jīng)弱離子陰離子交換柱而被除去。
溶液經(jīng)過(guò)離子交換柱的速度大約是2升/小時(shí)，以使其從柱里流出后的pH＝4-6。
所得溶液用提取溶劑重復(fù)脫脂，每次用3升溶劑，攪拌和靜置過(guò)程的持續(xù)時(shí)間是2小時(shí)。這一過(guò)程反復(fù)6-10次，控制其效率以使最后殘余脂質(zhì)不超過(guò)1-5％。
提取溶劑中的脂質(zhì)提取物通過(guò)在適當(dāng)容器中靜置分離，然后蒸餾以回收溶劑，回收比例為70-75％。也可用二氯乙烷、三氯乙烯或正己烷進(jìn)行脫脂。最后一次脫脂過(guò)程優(yōu)選用大約3kg的正己烷溶劑進(jìn)行。
脫脂水溶液真空濃縮至大約9升以除去痕量溶劑。
上清液用工業(yè)濾紙過(guò)濾以除去濃縮過(guò)程中形成的沉淀物，然后用乙醇處理脫蛋白質(zhì)。
過(guò)濾的上清液中加入96c乙醇，在攪拌下仔細(xì)噴入至醇濃度達(dá)到50％。然后在0-5℃的涼處放置12小時(shí)。形成的沉淀物以3000轉(zhuǎn)/分離心濾過(guò)最低100針/厘米2的織物。
離心過(guò)濾的殘?jiān)么蠹s3升50％醇溶液洗滌。按照此法得到的醇溶液合并，并真空濃縮回收醇。最終得到大約7升含抗透明質(zhì)酸酶活性成分的水溶液。
在脫脂階段得到的蛋白沉淀物用硫酸銨分級(jí)，由第一階段的脫蛋白質(zhì)產(chǎn)生的低分子量蛋白級(jí)分與第一階段脫蛋白質(zhì)得到的濃溶液合并。此溶液經(jīng)純化除去組胺雜質(zhì)，用350g磷酸三鈉、200g氯化鈣和大約300ml20％氫氧化鈉溶液處理。磷酸三鈉和氯化鈣以30％水溶液的形式加入。加入氫氧化鈉溶液以調(diào)節(jié)pH值到8.5，在0-5℃放置24小時(shí)，然后離心濾過(guò)100針/厘米2的織物，又得溶液。此法得到的大約9升溶液通過(guò)弱離子陽(yáng)離子交換柱，該柱用0.5％氫氧化鈉溶液再生。在溶液通過(guò)前，離子交換柱用0.5％酚鹽水(phenolate water)處理。重復(fù)此操作直到可容許的組胺試驗(yàn)程度。
所得溶液過(guò)濾。如果需要，加入硫酸軟骨素至1-3％的濃度。大約得到9升含大約10％活性物的濃溶液，pH＝4-6。
分析濃溶液，確定干物質(zhì)和透明質(zhì)酸酶的活性。
從這種濃溶液或凍干粉劑可以通過(guò)用蒸餾的不致熱水稀釋生產(chǎn)五種藥物，也就是說(shuō)，用于肌內(nèi)給藥的注射液，用于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的注射液，局部使用的軟膏或凝膠或栓劑。
實(shí)施例2用于肌內(nèi)給藥的藥物組合物是通過(guò)用不致熱水稀釋濃溶液或凍干粉劑得到的，含最多5mg/ml苯酚和最多2mg/ml偏亞硫酸氫鈉。確定稀釋比例以使在1ml的水溶液中注射液含0.1ml 10％的生物活性濃縮物溶液或11mg凍干的生物活性濃縮物，具有抗透明質(zhì)酸酶活性最低為45I.U./ml。
溶液首先經(jīng)孔隙度0.45μ的過(guò)濾器過(guò)濾純化，然后經(jīng)0.22μ的過(guò)濾器滅菌。
將其無(wú)菌地裝入1ml的棕色小瓶中。這些標(biāo)準(zhǔn)的1ml小瓶含10mg/ml活性物，由7-9ml抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物和加至1-3mg的普通重組硫酸軟骨素組成，通常的防腐劑，它具有pH＝4-6。
如果使用凍干的生物活性濃縮物，在10ml的小瓶中，含110mg凍干的生物活性濃縮物和25mg一種適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，在溶于蒸餾水之后，這種小瓶相當(dāng)于10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)小瓶。
實(shí)施例3用于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥的藥物組合物是通過(guò)用不致熱水稀釋濃溶液或凍干粉劑得到的，它含有20mg/ml芐醇和40mg/ml亞丙基甘氨酸(RoteListe-1993，Publishing House Cantor Aulendort/Wurttemberg，Germany)。加入10mg/ml的乙酰水楊酸鈉或溶素，2mg/ml的抗壞血酸和0.2mg/ml的肝素作為活性增效物。
確定濃溶液或凍干粉劑的稀釋比例以使注射液的活性物濃度為1.5％，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為65I.U./ml。
要裝入小瓶的溶液首先經(jīng)孔隙度0.45μ的過(guò)濾器過(guò)濾純化，然后經(jīng)0.22μ的過(guò)濾器滅菌，隨后無(wú)菌地裝入2ml棕色小瓶中。
這些小瓶含有15mg/ml的活性物質(zhì)，由10-13mg/ml的抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物，加至2-5mg/ml的重組硫酸軟骨素組成，2mg/ml的抗壞血酸和0.2mg/ml的肝素，它的pH＝4-6。
另一種調(diào)制可用0.5％苯酚水溶液和0.2％偏亞硫酸氫鈉完成。
實(shí)施例4用于外部、局部給藥的藥物組合物-軟膏、凝膠或栓劑-是在一種軟膏、凝膠或栓劑的基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)的，在100g組合物中有3-10g由10％生物活性濃縮物溶液組成的干活性物質(zhì)或4-12g凍干的生物活性濃縮物，含7-9g抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物，加入1-3g硫酸軟骨素，0.4g維生素E，0.5g抗壞血酸，0.5g乙酰水楊酸鈉或溶素，0.2g肝素，2-5g植物總提取物(多葉蓍、金盞花、母菊、車(chē)前草屬數(shù)種，貫葉金絲桃)。值得一提的是，軟膏、凝膠或栓劑的基質(zhì)是用60-75％“I”樣構(gòu)造的水制備的。軟膏基質(zhì)還含通常的防腐劑和調(diào)味劑?！癐”樣構(gòu)造的水是羅馬尼亞專(zhuān)利號(hào)109835B的主題物，它是一種具有增加的能勢(shì)，高跨膜穿透能力和顯著的抗炎和抗感染作用的水。這種水是讓經(jīng)過(guò)濾的自來(lái)水通過(guò)活化電磁場(chǎng)得到的。
工業(yè)應(yīng)用性這五種藥物被用作治療程序的一部分，包括這五種藥物的給藥程序，或者在某些情況下，醫(yī)生根據(jù)不同病例只推薦使用兩種藥物。
權(quán)利要求
1.生物活性濃縮物，其特征在于它是一種含10％活性物質(zhì)的水溶液，包含7-9％的抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物和加有1-3％的重組且抗透明質(zhì)酸酶的硫酸軟骨素，其pH值在4-6之間，抗透明質(zhì)酸酶活性在450-750I.U./ml之間，并呈淡黃至淺棕色，在凍干狀態(tài)下它含最低93％的活性物質(zhì)，活性物質(zhì)包含65-84％的粘多糖聚合物和9-28％的硫酸軟骨素，呈淡黃至淺棕色，且含通常的防腐劑。
2.生產(chǎn)生物活性濃縮物的方法，通過(guò)在24小時(shí)內(nèi)用0.5％苯酚溶液分兩階段處理一種有機(jī)原料，合并的提取液真空濃縮，用96c乙醇脫蛋白質(zhì)，通過(guò)一種有機(jī)溶劑如提取溶劑脫脂，其特征在于來(lái)自動(dòng)物的軟骨結(jié)締組織-牛和羊的氣管、臍帶、未成年動(dòng)物的腱-以及腸、睪丸或海洋生物用含0.5％苯酚且pH＝2-4的酸性水溶液進(jìn)行兩階段處理，第一階段以1∶3.5-4的比例，第二階段以1∶1.5的比例，兩階段的提取都需24小時(shí)，在0-4℃溫度下每3小時(shí)攪拌30分鐘，然后第一階段得到的提取物與第二階段得到的合并，用Ca(OH)2溶液調(diào)節(jié)至pH＝4.5-5，然后讓其在0-4℃下靜置8小時(shí)，然后過(guò)濾，得到的溶液在內(nèi)部溫度最高45℃下真空蒸發(fā)濃縮至達(dá)到7∶1的濃縮比值，溶液通過(guò)弱離子陰離子交換柱，然后用提取溶劑以1∶4的比例脫脂6-10次，直到殘余脂質(zhì)不超過(guò)1-5％，最后一次脫脂過(guò)程用正己烷以同樣的比例完成，然后得到的水溶液真空濃縮直至體積為原溶液體積的70％；經(jīng)過(guò)濾后，所得上清液用96c乙醇處理以脫蛋白質(zhì)，直至醇濃度達(dá)到50％，然后在0-5℃放置12小時(shí)，再過(guò)濾，濃縮醇溶液以除去醇，直到達(dá)到與進(jìn)行脫蛋白質(zhì)的溶液相比為70％的體積，蛋白質(zhì)沉淀物用硫酸銨梯度處理，低分子量蛋白質(zhì)級(jí)分與除去醇的水溶液合并；組胺雜質(zhì)通過(guò)連續(xù)地用磷酸三鈉溶液、氯化鈣和氫氧化鈉處理最后的溶液直至pH＝8.5而除去，然后過(guò)濾，產(chǎn)生的溶液通過(guò)弱離子陽(yáng)離子交換柱，pH值調(diào)節(jié)回4-6，然后加入硫酸軟骨素至1-3％的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所用的原料可以是新鮮、冷凍或保護(hù)狀態(tài)，并在使用前切碎。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于溶液通過(guò)弱離子陽(yáng)離子交換柱的流速應(yīng)每小時(shí)不超過(guò)原溶液體積的1/5，以使pH值回到4-6的范圍。
5.藥物組合物，其特征在于它們含權(quán)利要求1所述的生物活性濃縮物，還有增效物質(zhì)，如肝素、抗壞血酸、乙酰水楊酸鈉或溶素、維生素E、芐醇、亞丙基甘氨酸，“I”樣構(gòu)造的水和植物提取物，和將它們調(diào)制成肌內(nèi)注射液、關(guān)節(jié)內(nèi)注射液、軟膏、凝膠和栓劑形式的通常物質(zhì)。
6.含一種抗透明質(zhì)酸酶的生物活性配合物、苯酚和偏亞硫酸氫鈉的藥物組合物，其特征在于對(duì)肌內(nèi)給藥，1ml水溶液含0.1ml權(quán)利要求1中所述的10％生物活性濃縮物溶液或11mg凍干的生物活性濃縮物，最多5mg苯酚和2mg偏亞硫酸氫鈉，其pH＝4-6，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為45I.U./ml。
7.藥物組合物，其特征在于對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)給藥，1ml水溶液含由權(quán)利要求1所述的10％生物活性濃縮物溶液組成的15mg/ml干活性物質(zhì)或16.5mg凍干的生物活性濃縮物，10mg乙酰水楊酸鈉或溶素、2mg抗壞血酸、0.2mg肝素、20mg芐醇、40mg亞丙基甘氨酸，其pH＝4-6，抗透明質(zhì)酸酶活性最低為65I.U./ml，也可與其它類(lèi)型的防腐劑合用，如最多2mg偏亞硫酸氫鈉和最多5mg苯酚。
8.藥物組合物，其特征在于對(duì)于軟膏、凝膠和栓劑的調(diào)制，100g組合物含3-10g由如權(quán)利要求1所述的10％生物活性濃縮物溶液組成的干活性物質(zhì)或4-12g凍干的生物活性濃縮物，0.3-0.5g乙酰水楊酸鈉或溶素、0.4-0.8g抗壞血酸，優(yōu)選0.5g，0.2-0.4g維生素E，0.2g肝素，2-5g植物總提取物，在含40-75％，優(yōu)選65％“I”樣構(gòu)造水的乳油或凝膠基質(zhì)中乳化，以及通常的防腐劑和調(diào)味劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其特征在于所用植物可以是多葉蓍、金盞花、母菊、車(chē)前草屬數(shù)種、貫葉金絲桃。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其特征在于“I”樣構(gòu)造的水是一種具有增加的能勢(shì)和高跨膜穿透能力及顯著的抗炎和抗感染作用的水。
全文摘要
這種生物活性濃縮物是一種活性物質(zhì)——水溶液或凍干粉劑——包含抗透明質(zhì)酸酶且抗炎的粘多糖聚合物并添有重組且抗透明質(zhì)酸酶的硫酸軟骨素,它具有pH=4—6和抗透明質(zhì)酸酶活性。本生物活性濃縮物的生產(chǎn)方法在于用苯酚溶液分兩階段處理來(lái)自動(dòng)物的結(jié)締軟骨組織,如牛和羊的氣管、臍帶、未成年動(dòng)物的腱、腸、睪丸或海洋生物,所得溶液真空蒸發(fā)濃縮,然后脫脂;經(jīng)過(guò)濾,所得上清液進(jìn)行脫蛋白質(zhì)處理,過(guò)量的離子通過(guò)離子交換柱除去,醇溶液濃縮除去醇直至與進(jìn)行脫蛋白質(zhì)的水溶液相比為70%的體積。藥物組合物含有此生物活性濃縮物——溶液或凍干狀態(tài)——還有增效物質(zhì)如:肝素、乙酰水楊酸鈉或溶素、抗壞血酸、維生素E、“I”樣構(gòu)造的水、芐醇、亞丙基甘氨酸、植物提取物(蓍屬、金盞花屬、母菊屬、車(chē)前草屬、金絲桃屬)和通常的賦形劑,調(diào)制成肌內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)注射液、軟膏、凝膠和栓劑形式。最后,除去組胺并加入硫酸軟骨素至要求的濃度。
文檔編號(hào)C02F1/00GK1181017SQ96193190
公開(kāi)日1998年5月6日 申請(qǐng)日期1996年3月14日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月11日
發(fā)明者I·曼薩圖, D·E·阿里贊, V·伊奧尼塔曼薩圖, M·卡拉薩瓦, M·帕納特, I·G·斯卡拉特 申請(qǐng)人:S·C·泰曼公司