本發(fā)明涉及環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及利用微桿菌J-1修復(fù)DEHP污染土壤并降低種植蔬菜中DEHP含量的方法。

背景技術(shù)：

隨著社會經(jīng)濟(jì)和城市化的快速發(fā)展，大量“三廢”的不合理排放導(dǎo)致農(nóng)田土壤有機(jī)污染物污染日趨嚴(yán)重，對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全造成嚴(yán)重威脅。其中，農(nóng)田土壤的毒性有機(jī)物污染以鄰苯二甲酸酯(PAEs)污染程度較高，含量在μg/kg～mg/kg數(shù)量級，遠(yuǎn)高于多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等持久性有機(jī)污染物。PAEs主要被用作塑料工業(yè)的增塑劑，目前已成為全球最普遍的污染物之一，被美國環(huán)境保護(hù)局(EPA)和中國環(huán)境監(jiān)測總站列為優(yōu)先控制污染物。PAEs屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對人體具有較強(qiáng)的毒性，包括肝/腎毒性、神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性，甚至致癌效應(yīng)等。根據(jù)美國國家癌癥研究所的研究結(jié)果，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種鄰苯二甲酸酯被美國EPA列為優(yōu)先控制污染物。已有的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國農(nóng)業(yè)土壤中PAEs化合物有不同程度的超標(biāo)，部分土壤的個別PAEs化合物超標(biāo)嚴(yán)重。土壤中PAEs會被蔬菜等作物吸收并在體內(nèi)累積，居民食用含PAEs的農(nóng)產(chǎn)品導(dǎo)致長期低劑量暴露，嚴(yán)重危害人體健康，因此PAEs污染土壤中農(nóng)作物生產(chǎn)及食品安全問題亟待解決。

環(huán)境中的PAEs可通過水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途徑。近年來，PAEs的細(xì)菌降解已經(jīng)得到廣泛的研究，大量高效降解PAEs的菌株已經(jīng)從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等。然而，大多數(shù)已報(bào)道的PAEs降解菌僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行搖瓶降解研究，很少應(yīng)用到污染農(nóng)田土壤的安全生產(chǎn)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種修復(fù)DEHP污染土壤同時(shí)降低污染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種修復(fù)DEHP污染土壤同時(shí)降低污染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，具體為，在DEHP污染土壤中栽種菜心，在菜心根系周圍接種Microbacterium sp.J-1菌株。

Microbacterium sp.J-1菌株是發(fā)明人前期開發(fā)的一株DEHP高效降解菌，該該菌株于2015年1月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2015055。發(fā)明人對于該菌株的應(yīng)用研究僅僅局限在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行搖瓶降解研究，沒有應(yīng)用到污染農(nóng)田土壤的安全生產(chǎn)中。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，僅僅將Microbacterium sp.J-1菌株接種到DEHP污染土壤中，并不能實(shí)現(xiàn)持續(xù)性的修復(fù)作用，因?yàn)?，隨著接種時(shí)間的增加，Microbacterium sp.J-1菌株會死亡。但是如果在DEHP污染土壤中接種Microbacterium sp.J-1菌株，并同時(shí)種植菜心，蔬菜根系環(huán)境為Microbacterium sp.J-1菌株提供了可利用的有機(jī)質(zhì)，使接種的菌株可以長期存活于土壤中，對污染土壤實(shí)現(xiàn)持續(xù)性的修復(fù)作用，同時(shí)還可以種植質(zhì)量安全達(dá)標(biāo)的菜心，做到“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的模式。

為了方便應(yīng)用，作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述Microbacterium sp.J-1菌株做成凍干活性菌劑后再接種到污染土壤中，凍干活性菌劑的制備方法如下：

(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵的溫度為30～32℃，pH為8.0～8.3，接種量OD₆₀₀＝0.6～0.8；

(2)步驟(1)得到的發(fā)酵液在4500～5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心8～12min，收集菌體，菌體加入保護(hù)劑后進(jìn)行預(yù)凍，預(yù)凍好的菌體進(jìn)行真空冷凍干燥，獲得凍干菌劑，凍干菌劑復(fù)水后即可接種到DEHP污染土壤中。

更優(yōu)選地，步驟(1)中所述發(fā)酵的溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD₆₀₀＝0.8。在這樣的發(fā)酵條件下，菌株的發(fā)酵量和活力最大。

不同的離心條件會影響菌株的活性和收率，優(yōu)選地，步驟(2)中所述發(fā)酵液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min。

不同的保護(hù)劑對于Microbacterium sp.J-1菌株凍干過程中的保護(hù)力度不同，優(yōu)選地，步驟(2)中保護(hù)劑為葡萄糖、蔗糖、海藻糖或淀粉。

更優(yōu)選地，所述保護(hù)劑的添加量為4.8～9.6mg保護(hù)劑/g菌體。

作為優(yōu)選實(shí)施方案，制備的凍干活性菌劑按照2～3mg凍干菌劑/g污染土壤的量接種到DEHP污染土壤中。

更優(yōu)選地，制備的凍干活性菌劑按照2.5mg凍干菌劑/g污染土壤的量接種到DEHP污染土壤中。

更優(yōu)選地，所述Microbacterium sp.J-1菌株以滴管的方式接種到菜心根系周圍土壤中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明在DEHP污染土壤中接種Microbacterium sp.J-1菌株，并同時(shí)種植菜心，菜心根系環(huán)境為Microbacterium sp.J-1菌株提供了可利用的有機(jī)質(zhì)，使接種的菌株可以長期存活于土壤中，對污染土壤實(shí)現(xiàn)持續(xù)性的修復(fù)作用，同時(shí)還可以種植質(zhì)量安全達(dá)標(biāo)的菜心，做到“邊生產(chǎn)邊修復(fù)”的模式。

附圖說明

圖1為發(fā)酵條件(溫度、pH和接種量)對DEHP降解效果的模型方程響應(yīng)面3D分析。

圖2為不同轉(zhuǎn)速和時(shí)間對菌體存活率的影響。

圖3為加入不同種類濃度凍干保護(hù)劑后凍干菌體存活率。

圖4為不同處理下的土壤中DEHP殘留(a)和蔬菜中DEHP含量及其生物量(b)變化。

圖5為利用DGGE檢測不同處理下的土壤中接種菌株J-1在接種后7,21和35天的變化，圖中箭頭所指為菌株J-1的DNA條帶；條帶1-3，4-6,7-9和10-12分別為對照、接種菌株、種植菜心和種植菜心+接種菌株的土壤在接種后7,21和35天的微生物群落DNA條帶變化；條帶13為菌株J-1的DNA條帶。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：

計(jì)數(shù)和斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15.0g，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。

種子液培養(yǎng)基：即牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉10.0g，無機(jī)鹽溶液1.0mL(g/L，含K₂HPO₄：5.8；KH₂PO₄,4.5；(NH₄)₂SO₄,2.0；MgCl₂,0.16；CaCl₂,0.02；Na₂MoO₄·2H₂O：0.0024；FeCl₃,0.0018；MnCl₂·2H₂O：0.0015)，土壤浸液100mL，加超純水至1L，調(diào)節(jié)pH＝7.0。121℃滅菌20分鐘。

實(shí)施例1

Microbacterium sp.J-1降解菌的發(fā)酵條件優(yōu)化與凍干菌劑的制備，具體方法如下：

1、發(fā)酵條件優(yōu)化：取4℃下保存菌種用斜面培養(yǎng)基于30℃下活化24h。將活化菌種用10mL無菌水制成菌懸液，以O(shè)D₆₀₀＝1.0的接種量接于種子液培養(yǎng)基，于30℃、180rpm下恒溫震蕩培養(yǎng)24h；以O(shè)D₆₀₀＝1.0的接種量將種子液接入搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(含200mg/L DEHP)，于30℃、180rpm下培養(yǎng)，每隔24h取樣1次，對菌株活化條件初始pH(6～10)、溫度(20～40℃)、接種量(0.2～1.0)進(jìn)行響應(yīng)曲面(RSM)優(yōu)化。采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對上述三個因素采用高、中、低三個水平，見表1。采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以顯著因素為自變量，以DEHP降解菌為響應(yīng)值采用3因素3水平15組試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化(見表2)，以確定最佳降解發(fā)酵條件。

方差分析結(jié)果見表3，回歸項(xiàng)模型P<0.001，說明回歸效果顯著。對各試驗(yàn)因子進(jìn)行，回歸方程擬合，擬合結(jié)果如下：

Y＝8811.1+248.65X₁+334.4788X₂+1283.826X₃-1903.369X₁²-2879.356X₂²-1103.506X²

回歸方程相關(guān)系數(shù)R²＝0.9936。進(jìn)一步說明回歸方程擬合度較好。綜合響應(yīng)曲面分析和回歸方程繪制相應(yīng)曲面圖形(見圖1)，獲得最佳發(fā)酵條件溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD₆₀₀＝0.8。

按此最佳發(fā)酵條件進(jìn)行菌體發(fā)酵，獲得大量菌體。

表1采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)水平

表2RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3各因素顯著性及效應(yīng)評價(jià)

2、凍干菌劑的制備

(1)菌體濃縮條件的確定：取上述發(fā)酵菌液50mL裝于滅菌的離心管中，以3500、5000、6500rpm轉(zhuǎn)速分別配以10、20min離心時(shí)間，考察不同離心參對菌體存活能力的影響，檢測在不同的離心條件下的離心損失率、離心存活率，從而選取最佳的離心條件，減少菌體的損傷。離心前稱取管體總質(zhì)量(m₂)及離心去上清液后管體總質(zhì)量(m₁)，計(jì)算每管獲得菌泥質(zhì)量。菌種計(jì)數(shù)采用平板稀釋涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算公式如下：

離心損失率(％)＝上清液活菌總數(shù)/發(fā)酵液活菌總數(shù)×100

離心存活率(％)＝菌泥活菌總數(shù)/(發(fā)酵液活菌總數(shù)-上清液活菌總數(shù))×100

如圖2所示，相同轉(zhuǎn)速下，隨著離心時(shí)間的增加，離心損失率下降，離心存活率也隨之下降，說明雖然增加離心時(shí)間可以減少菌體隨上清液的流失，但是對菌體活性的活性也造成了相應(yīng)的危害。相較離心損失率而言，不同離心時(shí)間對菌體存活率影響較大。從經(jīng)濟(jì)角度應(yīng)選擇較小離心力和較短離心時(shí)間，因此選取5000rpm，10min離心參數(shù)，來保證最佳的離心存活率，此時(shí)菌體存活率為80.7％。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個重復(fù)取平均值。同時(shí)經(jīng)測三次定取平均值后得知，離心每50mL發(fā)酵液獲菌泥的平均質(zhì)量為3.8g。

(2)真空冷凍干燥方法及不同保護(hù)劑對冷凍干燥保護(hù)效果的影響

將Microbacterium sp.J-1濃縮菌液放入到低溫冷凍冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，凍結(jié)完全和形成小冰晶后將預(yù)凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24h，收集凍干菌體。

選取蔗糖、葡萄糖、淀粉、海藻糖、甘油作為單一凍干保護(hù)劑，研究其在凍干過程中對菌株Microbacterium sp.J-1的保護(hù)效果。其中，蔗糖、葡萄糖、淀粉、海藻糖和甘油的添加濃度分別為0.9、4.8、9.6mg保護(hù)劑/g濕菌，以添加等量水為對照。結(jié)果如圖3所示，為加入不同種類和濃度的凍干保護(hù)劑后的菌株Microbacterium sp.J-1凍干存活率。結(jié)果顯示菌株的存活率在加入保護(hù)劑后均有不同程度的提高，保護(hù)劑均對菌株有一定的保護(hù)作用。在試驗(yàn)的保護(hù)劑中，葡萄糖保護(hù)效果最為顯著，凍干保護(hù)率達(dá)77.6％。另外，蔗糖、海藻糖和淀粉等也對Microbacterium sp.J-1具有良好的保護(hù)效果。

(3)凍干菌劑的復(fù)水

復(fù)水是凍干細(xì)胞復(fù)蘇重要的一個步驟，復(fù)蘇所用的溶劑以及復(fù)蘇條件都會影響最后的菌體存活率。一般采用最適合該菌生長的培養(yǎng)液或生理鹽水作為復(fù)水介質(zhì)進(jìn)行復(fù)水。由于用于一般灌溉用水中存在Ca²⁺、Mg²⁺等金屬離子，可以滿足細(xì)胞復(fù)水需要。取等量的凍干菌劑分別加入自來水、灌溉河水、生理鹽水稀釋到凍干前原有體積后，放置1h，測定復(fù)蘇后菌體存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。結(jié)果顯示，經(jīng)復(fù)水后，在自來水、灌溉河水、生理鹽水中凍干菌劑的存活率分別為87.5％、89.4.53％、89.7％。可見，不同水質(zhì)用于凍干菌劑的復(fù)水，菌體存活率相差不大。

實(shí)施例2

Microbacterium sp.J-1菌劑對污染土壤中DEHP降解效果和種植菜心體內(nèi)DEHP含量影響的實(shí)驗(yàn)

1、供試土壤制備與種植蔬菜選擇：土壤為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場水稻土，風(fēng)干后過60目篩，pH為6.7，向其中添加DEHP達(dá)到50mg/kg，并加雙蒸水調(diào)至田間持水量(約30％)，避光老化15天。我們前期研究顯示菜心(Brassica parachinensis L.)品種華冠油青具有高累積DEHP的特性，給食品安全和人體健康帶來嚴(yán)重威脅。

2、實(shí)驗(yàn)處理：共設(shè)置四個處理：空白污染土壤(CK)、接菌的污染土壤(接種菌株)、種植菜心污染土壤(種植菜心)、同時(shí)接菌和種植菜心的污染土壤(種植菜心+接種菌株)。采用溫室盆栽方法，每個陶盆裝4kg污染土壤，添加6g的化肥。菜心經(jīng)育苗至3～4片真葉后，移栽到盆內(nèi)，每盆5棵。菌劑按每盆10mg/盆量經(jīng)復(fù)水后滴灌于污染土壤或菜心根際土壤中，每隔3天滴灌一次，共滴灌3次。每個處理設(shè)置三個重復(fù)，隨機(jī)排列。溫室溫度為25～32℃，澆灌自來水維持土壤自然濕度，共培育45天。分別于接菌后1、7、14、21、28和35收集四個處理的土樣，儲存于-80度冰箱待檢測DEHP含量；于接菌后35天收獲菜心，洗凈擦干后分別稱重地上部和根，然后凍干保存于-20度冰箱，待檢測DEHP含量。

3、土壤與菜心樣品抽提：稱取1g風(fēng)干磨碎的土壤或菜心樣品于35mL玻璃離心管中，加入20mL的二氯甲烷并超聲萃取10min，然后經(jīng)3500rpm離心收集上清液。土樣沉淀中再加入20mL的二氯甲烷相同方法超聲萃取3次，合并上清液。然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，用二氯甲烷超聲清洗后過柱子(1.0cm×35cm，填料自上而下為無水Na₂SO₄，硅膠和氧化鋁)，用雞心瓶收集濾液經(jīng)N₂吹干后，用色譜純二氯甲烷重新溶解并定容至1mL，待GC/MS測定。

4、樣品檢測：采用島津公司QP2010Plus型GC/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱為安捷倫HP-5柱子(0.25μm×0.25mm×30m)，進(jìn)樣溫度為250℃，離子源(EI)溫度為220℃，采用不分流進(jìn)樣1μL，載氣為高純氦氣。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?00℃，保持2min，15℃/min梯度上升至129℃，然后以40℃/min升溫至280℃，保持5min。

質(zhì)量控制：采用外標(biāo)法和六點(diǎn)校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。土壤樣品中DEHP回收率為92.0％～96.5％，菜心樣品中DEHP回收率為87.4％～107.2％。

5、結(jié)果與分析：如圖4a所示，在接種后35天，對照處理(CK)土壤中僅有12％的DEHP去除率，而接種菌株、種植菜心和以上兩種同時(shí)處理(種植菜心+接種菌株)的土壤中DEHP含量去除率分別為88％、62％和97％，這表明接種菌株和種植菜心均能顯著促進(jìn)土壤中DEHP的消除，而且菌株和菜心同時(shí)處理去除DEHP效率更高。

另外，如圖4b所示，與未接菌的菜心相比，接種菌株J-1能夠顯著降低(p<0.05)菜心體內(nèi)DEHP的累積，其中地上部下降了74％，根部下降了83％。接種菌株對菜心生物量未產(chǎn)生顯著(p>0.05)影響。在接種后最初的第7天，接種菌株的土壤(59～69％降解率)中DEHP去除率遠(yuǎn)高于僅種植菜心土壤(僅4％降解率)，這說明接種菜心體內(nèi)DEHP低含量可能是由于菌株J-1對土壤中DEHP較高的降解效率。

為了檢測接種菌株J-1在土壤中的存活能力，利用PCR-DGGE方法檢測菌株DNA條帶變化。如圖4所示，在接種菌株J-1的土壤中，第7天和21天條帶較清晰，但是在第35天條帶最終消失(條帶4～6)，說明菌株J-1在土壤中無法長期存活，可能由于土壤中DEHP等碳源耗盡導(dǎo)致菌群數(shù)量減少。然而，當(dāng)菌株接種于菜心根際，其DNA條帶在第35天仍然存在(條帶10～12)，說明菜心種植有利于菌株J-1的存活，可能是由于菜心根系環(huán)境為菌株J-1提供了可利用的有機(jī)質(zhì)，使接種的菌株可以長期存活于菜心根際土壤中。

實(shí)施例3

一種修復(fù)DEHP污染土壤同時(shí)降低污染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，包括如下步驟：

(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵的溫度為30℃，pH為8.0，接種量OD₆₀₀＝0.7；

(2)步驟(1)得到的發(fā)酵液在5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，收集菌體，按照6mg葡萄糖/g菌體的加入量，向菌體中加入葡萄糖后放入低溫冷凍冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，凍結(jié)完全和形成小冰晶后將預(yù)凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24h，收集凍干菌體。

(3)DEHP污染土壤中栽種菜心后，在菜心根系周圍接種凍干菌劑。凍干菌劑的加入量為按照2.5mg凍干菌劑/g污染土壤的量。凍干菌劑接種之前先用生理鹽水復(fù)水1h。

實(shí)施例4

一種修復(fù)DEHP污染土壤同時(shí)降低污染土壤種植蔬菜中DEHP含量的方法，包括如下步驟：

(1)將Microbacterium sp.J-1菌株活化后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵的溫度為32℃，pH為8.3，接種量OD₆₀₀＝0.8；

(2)步驟(1)得到的發(fā)酵液在4500rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，收集菌體，按照9mg蔗糖/g菌體的加入量，向菌體中加入蔗糖后放入低溫冷凍冰箱中進(jìn)行預(yù)凍，凍結(jié)完全和形成小冰晶后將預(yù)凍好的菌液放入冷阱溫度為-30℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干24h，收集凍干菌體。

(3)DEHP污染土壤中栽種菜心后，在菜心根系周圍接種凍干菌劑。凍干菌劑的加入量為按照2mg凍干菌劑/g污染土壤的量。凍干菌劑接種之前先用自來水復(fù)水1h。