專利名稱：用于處理生物質(zhì)的球孢梭菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使用球孢梭菌(Clostridium sporosphaeroides)微生物處 理生物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
生物燃料主要通過借助酵母菌、細(xì)菌或真菌發(fā)酵植物基質(zhì)而獲得。所產(chǎn)生的液體 能量源，特別是生物乙醇，可以隨后作為燃料用于合適的加熱裝置或作為汽車發(fā)動機(jī)或發(fā) 動機(jī)中的燃料或燃料添加劑以發(fā)電或產(chǎn)熱。因此，生物質(zhì)轉(zhuǎn)變成了液體的或移動性良好的 具有相對較高能量密度的能量源，可以極為普遍地投入使用。通?？梢允褂镁哂懈咛呛炕虻矸酆康漠?dāng)?shù)刂参镒鳛樾纬梢后w生物燃料的原 料。在歐洲主要是玉米粒和谷類以及甜菜，在北美洲是玉米，在拉丁美洲是甘蔗或糖蜜。還 可以考慮其他的能量植物，例如高粱、黑小麥或木薯。目前，在液化生物質(zhì)時，特別使用玉米 粒和谷類作為原料。植物不僅是人類和畜類的食物來源，還用于產(chǎn)生能量、改善二氧化碳平 衡以及保護(hù)資源，由于植物原料短缺日益嚴(yán)重，原料價格升高和競爭的產(chǎn)生，目前越來越多 地追求不僅使用玉米粒和谷類，還使用產(chǎn)生能量的全部植物，或者使用不需要密集農(nóng)業(yè)管 理的植物，例如柳枝稷或芒草。由所述原料制備的生物燃料為所謂的“第二代”燃料。此外， 也追求更多地使用合適的植物余料，例如來自木材業(yè)、園林和自然景觀維護(hù)的麥稈、植物廢 料。為了確保生物質(zhì)的有效發(fā)酵，作為原料使用的植物材料，特別是其中包含的有機(jī) 干物質(zhì)(oTS)必須針對隨后的應(yīng)用而分解。這通過有機(jī)干物質(zhì)的水解實(shí)現(xiàn)，其同樣對應(yīng)于 有機(jī)干物質(zhì)的液化。然后通過發(fā)酵由液體生物質(zhì)-基質(zhì)制備乙醇或其他生物燃料。然而， 通過現(xiàn)有技術(shù)無法達(dá)到高能效，其原因特別在于不充分的原料液化和應(yīng)用。在制備生物乙醇時，首先通過添加酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，所述酵母菌將葡萄糖轉(zhuǎn) 化為乙醇。根據(jù)基質(zhì)的情況，已經(jīng)含有相對較高糖含量的基質(zhì)(例如糖蜜)可直接使用，或 者必須首先酶法分解或化學(xué)分解高分子基質(zhì)，例如淀粉、纖維素或半纖維素(例如谷類、麥 稈、全植物使用)，由此可以進(jìn)行酒精發(fā)酵。首先由微生物特別是細(xì)菌負(fù)責(zé)該水解基質(zhì)的分 解(其也對應(yīng)于液化)。當(dāng)有機(jī)原料不僅轉(zhuǎn)化為液體生物燃料還轉(zhuǎn)化為氣態(tài)能量源時，使用沼氣裝置。在 沼氣裝置中，通過有機(jī)物質(zhì)的微生物分解過程形成甲烷。在此，在多級發(fā)酵或消化過程中， 通過厭氧或微氧(也就是說，排除空氣)微生物的活性產(chǎn)生沼氣。從化學(xué)層面講，作為發(fā)酵基質(zhì)使用的有機(jī)材料具有高分子量組成，所述高分子量 組成在沼氣裝置的每個方法步驟中通過微生物的代謝活動分解為低分子量組成。截至目 前，還未充分表征對有機(jī)發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵過程具有活性的微生物種群。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，存在四種不同的先后、并行以及相互交錯的生化代謝過程水解、 酸化、乙酸化和產(chǎn)甲烷，這些代謝過程使得有機(jī)發(fā)酵基質(zhì)可以分解為終產(chǎn)物甲烷和二氧化 碳。
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在水解過程中，通常單獨(dú)存在的高分子有機(jī)化合物通過發(fā)酵細(xì)菌的胞外酶(例如 纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶)轉(zhuǎn)化為可溶的分解產(chǎn)物。由此分解脂肪，例如脂肪酸， 碳水化合物，例如多糖、低聚糖和單糖，以及蛋白質(zhì)，寡肽或氨基酸。此外，產(chǎn)生的氣態(tài)產(chǎn)物
主要由二氧化碳組成。在酸化過程中，通常與水解細(xì)菌相同，兼性和專性厭氧細(xì)菌將水解產(chǎn)物(例如單 糖、二糖、二肽、寡肽、氨基酸、甘油、長鏈脂肪酸)在細(xì)胞內(nèi)代謝為短鏈脂肪酸或碳酸，例如 丁酸、丙酸和乙酸，代謝為短鏈醇，例如乙醇，代謝為氣態(tài)產(chǎn)物氫氣和二氧化碳。在隨后的乙酸化過程中，在酸化過程中形成的短鏈脂肪酸和碳酸以及短鏈醇被產(chǎn) 乙酸菌消化，并且在β-氧化之后作為乙酸再次排出。乙酸化的副產(chǎn)物為CO2和氫氣(H2) 分子。在專性厭氧的產(chǎn)甲烷過程中，乙酸化過程的產(chǎn)物例如乙酸以及其他基質(zhì)例如乙醇 和甲酸酯通過產(chǎn)甲烷的有機(jī)體轉(zhuǎn)化為甲烷和co2。此處產(chǎn)生的CO2以及其他工藝步驟(例 如水解)中形成的CO2也可以與積累的H2通過微生物再次轉(zhuǎn)化為甲烷。制備沼氣、液化生物質(zhì)與每個化學(xué)轉(zhuǎn)化過程一樣，提高定量原料形成的最終產(chǎn)物 產(chǎn)量是過程控制的主要目的。應(yīng)該由一定量的生物質(zhì)形成盡可能多的液體有機(jī)化合物或盡 可能多的甲烷。天然再生材質(zhì)專業(yè)協(xié)會于2005年公開了沼氣測量程序的結(jié)果(“Ergebnisse des Biogas-Messprogramms”，2005，Hrsgb.天然再生材質(zhì)專業(yè)協(xié)會 e. V.，GUlzow)，其中提及了 不同的沼氣裝置。由于沼氣裝置包括不同樣式、不同生產(chǎn)商并且具有不同的原料處理裝置， 該測量程序描述了各種裝置的典型外觀。所調(diào)查的沼氣裝置測得的總?cè)莘e負(fù)荷為0. 45kg oTS/m3d(多級裝置)至5. 7kg oTS/m3d (—級裝置)。通常的一級和多級裝置的容積負(fù)荷為 1 至 3kg oTS/m3d。發(fā)酵罐容積負(fù)荷指的是引入發(fā)酵罐中的基質(zhì)量，該量以千克有機(jī)干物質(zhì)每立方米 發(fā)酵罐容積每天計。產(chǎn)生的沼氣量極大地取決于發(fā)酵罐容積負(fù)荷，更高的容積負(fù)荷產(chǎn)生更 多的沼氣。高容積負(fù)荷使得沼氣形成過程更為經(jīng)濟(jì)可行，但是另一方面卻增加生物發(fā)酵過 程的不穩(wěn)定性。提升容積負(fù)荷是有效運(yùn)行沼氣裝置的一種可能性。因此，通過緩慢升高以oTS/d 計的進(jìn)料量來升高沼氣產(chǎn)量。在實(shí)踐中至今還未出現(xiàn)大于6kg oTS/m3d的高容積負(fù)荷。裝 置操作的目的是經(jīng)濟(jì)地操作裝置。在此，生物發(fā)酵過程的穩(wěn)定性處于首要地位，因?yàn)檠b置故 障導(dǎo)致非常高的成本。為了實(shí)現(xiàn)過程穩(wěn)定性，目前的裝置在低容積負(fù)荷下操作，但是在有效操作時有必 要處理相應(yīng)較大的發(fā)酵體積。因此，額外的建筑成本升高了初期投資。在高容積負(fù)荷下，由 于發(fā)酵罐中存在的生物群落與有機(jī)材料的強(qiáng)負(fù)荷，發(fā)酵罐內(nèi)容物首先由固體形式開始連續(xù) 稠化。其原因在于升高的干物質(zhì)含量以及生物質(zhì)不完全轉(zhuǎn)化為沼氣。用于沼氣制備的基質(zhì)具有5%至90%的干物質(zhì)含量。對于需要可泵送基質(zhì)的濕發(fā) 酵法，可以使用干物質(zhì)含量為達(dá)35% (至多40%)的基質(zhì)。由于具有較高干物質(zhì)含量，特 別是具有較高有機(jī)干物質(zhì)含量的基質(zhì)通常能提供較高的能量，因此優(yōu)選使用這些基質(zhì)。然 而，在這種情況下，泵和攪拌器增加了能量消耗，并且在高粘度和高干物質(zhì)含量情況下，泵、 攪拌器等的磨損和修理增加了額外費(fèi)用，從而產(chǎn)生了較高費(fèi)用。在由于干物質(zhì)含量高而需要稀釋基質(zhì)的情況下，產(chǎn)生了額外的水費(fèi)用和廢水費(fèi)用以及用于供水、回收水或廢水的技 術(shù)設(shè)備。在連續(xù)操作中，更高的干物質(zhì)含量給發(fā)酵罐內(nèi)容物的可攪拌性和可泵性造成更多 的問題。當(dāng)干物質(zhì)含量進(jìn)一步升高時，稠化使生物群落不穩(wěn)定并因此大范圍導(dǎo)致生物發(fā)酵 過程和氣體生成的完全停頓，這被稱作“發(fā)酵罐崩潰(Fermenterabstruz) ”。為了防止稠化， 可以通過添加液體物質(zhì)，例如水或廄液，以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵罐內(nèi)容物的液化。此處的問題是，法律 體制(EEG，可再生能源法)不允許在獲得干發(fā)酵津貼(Trockenfermentations-Bonus)的 情況下添加干物質(zhì)含量平均為30%的基質(zhì)。因此，很少通過額外供應(yīng)液體來液化發(fā)酵罐材 料。除了上述考慮之外，人們也考慮到淡水資源的匱乏，因此排除了通過添加水來液 化發(fā)酵罐內(nèi)容物。廄液作為液化劑一方面費(fèi)用高昂，另一方面，并不能在各地都可使用，并 且質(zhì)量和性能也變化不定。此外，在某些國家使用廄液時，出于法定原因，需要在發(fā)酵過程 之后將發(fā)酵殘渣倒入土壤之前進(jìn)行衛(wèi)生處理的步驟。因此，進(jìn)一步需要一種處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)以制備生物燃料的 有效方法，以及用于生成沼氣的方法，所述方法與現(xiàn)有技術(shù)相比可以使沼氣產(chǎn)量升高。定義術(shù)語“生物燃料”在本發(fā)明中指由生物質(zhì)制備的液體或氣態(tài)燃料或能量源。生物 燃料可用于操作內(nèi)燃機(jī)以及用于動態(tài)應(yīng)用(例如汽車)和靜態(tài)應(yīng)用(例如在熱電聯(lián)產(chǎn)機(jī)組 中形成電能和熱能)。生物燃料的例子是生物柴油、生物乙醇、生物甲醇、生物煤油、生物氫 或沼氣。術(shù)語“生物乙醇”在本發(fā)明中指通過酒精發(fā)酵由作為可再生碳載體或可生物分解 廢料成分的生物質(zhì)制備的乙醇。其以不同的濃度作為礦物油燃料例如柴油或生物燃料的添 加劑。術(shù)語“沼氣”在本發(fā)明中指厭氧生物分解有機(jī)基質(zhì)所產(chǎn)生的氣態(tài)產(chǎn)物。理論上，其 包含約45-70%的甲烷，30-55%的二氧化碳，以及少量的氮?dú)狻⒘蚧瘹浜推渌麣怏w。術(shù)語“發(fā)酵”在本發(fā)明中包括厭氧和微氧代謝過程，其在工藝過程中供應(yīng)的基質(zhì)中 的微生物的作用下形成產(chǎn)物，例如沼氣。在此，“發(fā)酵”的定義僅限于厭氧過程。術(shù)語“發(fā)酵罐”在本發(fā)明中指在其中發(fā)生基質(zhì)的微生物分解并同時產(chǎn)生沼氣的容 器。術(shù)語“反應(yīng)器”、“發(fā)酵容器”和“腐化容器”也可互換使用。術(shù)語“發(fā)酵基質(zhì)”或“基質(zhì)”在本發(fā)明中指添加至發(fā)酵罐中以進(jìn)行發(fā)酵的有機(jī)或 生物可分解材料。基質(zhì)可以是可再生原料、農(nóng)業(yè)肥料、來自農(nóng)產(chǎn)品深加工行業(yè)的基質(zhì)、當(dāng)?shù)?的有機(jī)余料、屠宰殘渣(SchlachtrtickstSnde)或綠色廢料。所述基質(zhì)的例子為玉米青貯、 黑麥青貯、甜菜漿、糖蜜、牧草青貯、牛廄液或豬廄液、牛糞、豬糞、雞糞或馬糞、酒糟、蘋果殘 渣、水果殘渣或葡萄殘渣、谷類糊、土豆糊或水果糊。來自有機(jī)垃圾、廚余、市場廢棄物的有 機(jī)廢料，來自隔油池、內(nèi)臟、豬內(nèi)臟的油脂。術(shù)語“發(fā)酵基質(zhì)”和“基質(zhì)”可互換使用。術(shù)語“發(fā)酵殘渣(GSrriickstand/ Gargut)"指的是生產(chǎn)沼氣所形成的殘渣，其留 在發(fā)酵罐中并通常被儲入特定容器。術(shù)語“容積負(fù)荷”在本發(fā)明中指的是每天向每立方米(m3)發(fā)酵罐的工作容積中加 入的以Kg計的有機(jī)干物質(zhì)(oTS)量.
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術(shù)語“有機(jī)干物質(zhì)”(oTS)在本發(fā)明中指除去無機(jī)成分并在105°C下干燥之后不含 水的有機(jī)混合物的含量。理論上，基質(zhì)的干物質(zhì)含量以％計。術(shù)語“停留時間”在本發(fā)明中指基質(zhì)在發(fā)酵罐中的平均停留時間。術(shù)語“沼氣比產(chǎn)量”或“甲烷比產(chǎn)量”在本發(fā)明中指產(chǎn)生的沼氣或甲烷的量(以標(biāo) 準(zhǔn)立方米Nm3計的產(chǎn)生的氣體)除以使用的有機(jī)干物質(zhì)或基質(zhì)的量(理論上以每噸t計)。術(shù)語“時空產(chǎn)量”指的是的以標(biāo)準(zhǔn)升(Ni)(標(biāo)稱為一升發(fā)酵體積)計的產(chǎn)生的沼 氣量。該測量值用于更好地比較不同裝置的氣體產(chǎn)量。術(shù)語“核苷酸序列”包括DNA序列和相應(yīng)的RNA序列。本發(fā)明中，使用堿基A、U、 C、G情況下的RNA序列對應(yīng)于例如使用堿基A、T、C、G情況下的相應(yīng)DNA序列，反之亦然。借助于標(biāo)準(zhǔn)化過程確定微生物的核苷酸序列，通過該過程可以以高精確度證實(shí)微 生物的DNA或RNA的每個核苷酸。盡管該排序方法在每個位點(diǎn)都通常具有高精確度，但是 對于確定每個位點(diǎn)上的核苷酸來說，還未達(dá)到足夠的精度。在這種情況下，在本發(fā)明中，在 核苷酸序列中標(biāo)明符號“N”。當(dāng)下文在核苷酸序列中使用符號“N”時，其代表任意可能的核 苷酸縮寫，即，在核糖核酸的情況下為A、U、G或C，在脫氧核糖核酸的情況下為A、T、G或C。此處所使用的術(shù)語“核苷酸突變”指原始核苷酸序列的改變。在此，單個核苷酸或 多個直接相連的或由未改變的核苷酸隔斷的核苷酸序列可以缺失(刪除)、插入(加入或添 加)或由其他核苷酸取代(替換)。該術(shù)語還包括上述每種改變的可能組合。此處所使用的術(shù)語“缺失”指每個原始序列中缺失了 1、2或多個核苷酸。此處所使用的術(shù)語“加入”或“添加”指的是在每個原始序列中插入1、2或多個核 苷酸。此處所使用的術(shù)語“取代”指的是特定位點(diǎn)上的核苷酸被其他核苷酸取代。術(shù)語“微生物”指的是微小生物，其理論上為單細(xì)胞，但是也可以是多細(xì)胞。微生 物的例子為細(xì)菌、微藻類、真菌或原生動物。微生物的“屬”，微生物的“種，，和微生物的“株”在本發(fā)明中指生物分類學(xué)特別是 系統(tǒng)分類學(xué)的相應(yīng)基本分類。按照其RNA序列鑒定并區(qū)分微生物的屬、種和株。一定的屬、 一定的種或一定的株不僅包括具有完全確定的RNA序列的微生物，還包括其一定數(shù)量的遺 傳變型，其中該遺傳變型增加了株、種、屬的數(shù)量。細(xì)菌“種”的定義隨著科學(xué)變化且并不完全，不同的觀念也是無可非議的。在本 發(fā)明中，“種”的含義與染色體組和物種分析相關(guān)并且記載在Review von Staley (Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.，2006，361，1899-1909)。廣泛發(fā)現(xiàn)，具有大于 70 % DNA-DNA雜交或大于94%平均核苷酸同一性(ANI，平均核苷酸同一性)的兩種細(xì)菌屬于同 一種，具有小于97%的16S rRNA同一性的兩種細(xì)菌屬于不同的種。在本文中，術(shù)語“培養(yǎng)物”指在操作條件下的微生物自然增長物，該操作條件保證 微生物能夠生長或至少存活。對于細(xì)菌來說，為例如富集培養(yǎng)物或純培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物以 及在固體介質(zhì)例如瓊脂(Nmirb5den)上的培養(yǎng)物，還有長期培養(yǎng)物例如冷凍甘油培養(yǎng)物， 固定化培養(yǎng)物，例如凝膠培養(yǎng)物，或高濃度培養(yǎng)物例如細(xì)胞球(zellpellets)。微生物“純培養(yǎng)物”這一術(shù)語指單個細(xì)胞的子代。通過多級過程從不同微生物的 混合物中分離出該單個細(xì)胞。所述多級過程包括從細(xì)胞種群中分離出單個細(xì)胞，并且要求 通過生長和細(xì)胞分裂而從細(xì)胞中產(chǎn)生的菌落與其他單個細(xì)胞或菌落保持分離。通過小心分離菌落、重新懸浮至液體中以及反復(fù)篩選(Ausstreichen)可以獲得目標(biāo)微生物的純培養(yǎng) 物。如果原料中所需有機(jī)體數(shù)量占多數(shù)，也可以在液體營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。 通過在營養(yǎng)液中連續(xù)稀釋懸浮液，使得最終在最后的懸浮步驟中僅剩一個細(xì)胞。然后，該 細(xì)胞作為純培養(yǎng)物的基底。術(shù)語“純培養(yǎng)物”的含義以及用于形成純培養(yǎng)物的方法記載在 "Allgemeine Mikrobiologie” 中(Hans G Schlegel，第 7 版，1992，Georg Thieme 出版社 出版，第205頁)，在此以引用的方式并入本文。術(shù)語“混合培養(yǎng)物”指不同微生物的混合物。微生物的天然種群理論上為混合培 養(yǎng)物。然而也可以人工方式混合培養(yǎng)物，例如多個純培養(yǎng)物的組合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種處理生物質(zhì)的方法，其與現(xiàn)有技術(shù)相比，可以提高可利 用生物燃料的產(chǎn)量。通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的處理生物質(zhì)的方法解決本發(fā)明的目的。從屬權(quán)利要 求、說明書和實(shí)施例描述了本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的細(xì)節(jié)、方面和具體實(shí)施方案。本發(fā)明提供了一種處理生物質(zhì)的方法。在生物質(zhì)中添加球孢梭菌微生物。所述處理生物質(zhì)的方法優(yōu)選為液化生物質(zhì)的方法。在處理生物質(zhì)或形成沼氣的 過程中，球孢梭菌微生物的用途或行為迄今為止仍未公知。然而，出人意料的，通過向生物 質(zhì)_基質(zhì)添加球孢梭菌微生物可以極大地降低基質(zhì)粘度。使用球孢梭菌微生物使生物質(zhì)高 度液化，并使得用于制備生物燃料的裝置的效率和生產(chǎn)率明顯改善。所述處理生物質(zhì)的方法還優(yōu)選為由生物質(zhì)形成沼氣的方法。出人意料的，通過向 發(fā)酵基質(zhì)添加球孢梭菌微生物不僅能夠升高發(fā)酵罐容積負(fù)荷，還可以顯著增加形成的沼氣 量。正如在實(shí)驗(yàn)中所表明的，添加球孢梭菌微生物使得發(fā)酵罐容積負(fù)荷升高超過50%，卻不 會影響發(fā)酵過程的穩(wěn)定性。在升高容積負(fù)荷的同時，形成的沼氣量也顯著增加。此外，由于 與不添加球孢梭菌微生物的情況相比，更多的有機(jī)干物質(zhì)被分解，因此沼氣比產(chǎn)量也升高。 在使用改良的基質(zhì)時，通過升高的分解度可以獲得顯著升高的氣體比產(chǎn)量。此外，在一定的 氣體產(chǎn)量下，通過添加球孢梭菌微生物可以顯著縮短發(fā)酵基質(zhì)在發(fā)酵罐中的停留時間，由 此可以升高容積負(fù)荷。因此，使用球孢梭菌微生物使得沼氣裝置的效率和生產(chǎn)率顯著改善。球孢梭菌微生物積極屬性的一種可能的解釋為，該微生物的代謝活性升高了水解 速率，因此該代謝活性使得一部分存在的難分解有機(jī)體質(zhì)(例如纖維素、半纖維素)轉(zhuǎn)化為 可溶的酸和co2。纖維素在水和水溶液中不溶，因此在發(fā)酵過程中纖維素的分解導(dǎo)致液化。 材料的可攪拌性和可泵送性保持不變，因?yàn)楦晌镔|(zhì)含量不繼續(xù)升高。因此，可以不斷混合所 述材料并且可以更好地將氣體從該過程中導(dǎo)出。在水解步驟中，通過球孢梭菌微生物升高的分解效率和代謝效率實(shí)現(xiàn)發(fā)酵罐材料 的液化，且不會觀察到所形成的沼氣的酸化以及甲烷含量的惡化。容積負(fù)荷顯著升高且過 程穩(wěn)定性得以改善。根據(jù)本發(fā)明，通過添加球孢梭菌微生物提供了一種方法，該方法能夠保證發(fā)酵過 程的升高的穩(wěn)定性并且能導(dǎo)致發(fā)酵基質(zhì)的液化。通過分解不溶的組成部分導(dǎo)致的基質(zhì)液化 可被用于由生物質(zhì)制備生物燃料。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案，以微生物培養(yǎng)物的形式添加球孢梭菌微生
9物，所述微生物培養(yǎng)物主要由球孢梭菌微生物組成。在沼氣裝置的發(fā)酵基質(zhì)中，球孢梭菌微 生物可以僅占存在的微生物總量的小于10_4%的痕量。對于添加微生物來說，由于通過其 天然形式(natilrlichen Vorkommen)分離的微生物的量理論上不夠，因此通常以培養(yǎng)物的 形式進(jìn)行增殖。實(shí)踐表明，以微生物培養(yǎng)物的形式向發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中添加微生物最為
簡單直接?？梢砸耘囵B(yǎng)物懸浮液的形式，以干燥、凍干或潮濕細(xì)胞球的形式或者以孢子懸浮 液、孢子制劑或干燥、凍干、潮濕的孢子球的形式添加球孢梭菌培養(yǎng)物。由于上述發(fā)酵過程的各種積極效果與球孢梭菌微生物相關(guān)，待添加的培養(yǎng)物中應(yīng) 該存在超過天然形式的量的該種微生物。當(dāng)然可以添加任意組成的混合培養(yǎng)物。唯一的要 求是，存在與天然形式相比更多量的球孢梭菌。優(yōu)選球孢梭菌微生物和煎盤梭菌(Clostridium sartagoformum)和/或浸麻類 芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)微生物組成的混合培養(yǎng)物。特別優(yōu)選球孢梭菌菌株 SBG3微生物和煎盤梭菌菌株SBGla和/或浸麻類芽孢桿菌菌株SBG2微生物組成的混合培 養(yǎng)物。對于生物質(zhì)的處理，煎盤梭菌和浸麻類芽孢桿菌微生物具有與球孢梭菌微生物相似 的性能，因此它們也適用于處理生物質(zhì)。因此，在本文所述的處理生物質(zhì)的方法和應(yīng)用中， 也可以使用煎盤梭菌和浸麻類芽孢桿菌微生物。優(yōu)選以微生物培養(yǎng)物的形式將球孢梭菌微生物添加至發(fā)酵基質(zhì)，其中微生物培養(yǎng) 物主要由球孢梭菌微生物組成。除了確定球孢梭菌微生物的數(shù)量之外，還確定微生物總量， 以便給出球孢梭菌微生物在培養(yǎng)物中的百分比含量。當(dāng)混合培養(yǎng)物中存在的不同微生物中 球孢梭菌微生物的百分比含量最高時，那么球孢梭菌微生物在混合培養(yǎng)物中是主要存在的 微生物。不同發(fā)酵基質(zhì)中的微生物種群組成以及發(fā)酵過程中有機(jī)體組成的變化通常不是 公知的，其極易變化并且受復(fù)雜動力學(xué)過程的控制，而該動力學(xué)過程又受各個工藝條件的 影響。為了確定微生物組成和發(fā)酵基質(zhì)中微生物總量以及確定發(fā)酵基質(zhì)中不同微生物的含 量，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉各種不同的方法，例如Amann等人的論文(Microbiol. Review. 59， 143-169,1995)中所描述的那些方法。為了確定與前述微生物培養(yǎng)無關(guān)的微生物組成，優(yōu)選的方法為例如在核酸提取 和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)之后創(chuàng)建rDNA克隆文庫(例如基于16S rRNA)，隨后可以進(jìn)行測 序。借助該克隆文庫，可以例如通過用特定熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交來確定 發(fā)酵基質(zhì)中微生物種群的組成。合適的基于rRNA的寡核苷酸探針通過上述文獻(xiàn)被人們公 知，或者可以通過 probeBase(Loy 等人，2003，Nucleic Acids Res. Μ，514-516. Loy 等人， 2007. Nucleic Acids Res.迪D800-D804)或 ARB 程序包(Ludwig 等人，Nucleic Acids Research. 2004，32，1363-1371)查到。可以以合適方式使用定量斑點(diǎn)雜交法、原位雜交法或 全細(xì)胞雜交法來定量地確定單種微生物在總種群中的含量。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案，球孢梭菌微生物占添加至發(fā)酵基質(zhì)的培養(yǎng)物中 存在的微生物總量的至少10_4%。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總 量的至少10_2%，特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少1%。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生 物總量的至少10%。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少50 %，特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少90 %。根據(jù)非常特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案，添加球孢梭菌微生物的純培養(yǎng)物。該純培養(yǎng) 物的生化特征在于特定的代謝過程和代謝活性，以及特定的生長條件。由于特定的代謝過 程和代謝活性，添加發(fā)酵微生物的純培養(yǎng)物特別有助于更好地控制整個沼氣形成過程。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，添加球孢梭菌微生物作為至少一種固定 化微生物培養(yǎng)物的組成部分。對于添加微生物來說，由于通過其天然形式(nattolichen Vorkommen)分離的微生物的量理論上不夠，因此通常以培養(yǎng)物的形式進(jìn)行增殖。實(shí)踐表明， 以固定化微生物培養(yǎng)物的形式向發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中添加微生物最為簡單直接。由于上述發(fā)酵過程的各種積極效果與球孢梭菌微生物相關(guān)，待添加的固定化培養(yǎng) 物中應(yīng)該存在超過天然形式的量的微生物。當(dāng)然可以添加任意組成的固定化混合培養(yǎng)物。 唯一的要求是，存在與天然形式相比更多量的球孢梭菌微生物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案，球孢梭菌微生物占添加至發(fā)酵基質(zhì)的固定化培 養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少10_4%。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占固定化培養(yǎng)物中 存在的微生物總量的至少10_2 %，特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占固定化培養(yǎng)物中存在的微 生物總量的至少1%。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，球孢梭菌微生物占固定化培養(yǎng)物中存在的微生物 總量的至少10%。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占固定化培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至 少50%，特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占固定化培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少90%。根據(jù)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案，至少添加球孢梭菌微生物的固定化純培養(yǎng)物。作為球孢梭菌微生物固定其上的載體材料，可以使用天然或合成聚合物。優(yōu)選使 用形成凝膠的聚合物。其優(yōu)點(diǎn)在于，細(xì)菌可被容納或儲存在凝膠結(jié)構(gòu)中。優(yōu)選使用緩慢溶 于水或緩慢分解的材料，使得球孢梭菌微生物的釋放在較長時間段內(nèi)進(jìn)行。合適的聚合物的例子為聚苯胺(Polyanillin)、聚吡咯、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯乙 烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、環(huán)氧樹脂、聚乙烯亞胺、多糖例如瓊脂糖、藻酸鹽 或纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、羧甲基乙基纖維素、乙酸纖維素、堿性-纖維素硫酸 酯、聚苯乙烯和馬來酐的共聚物、苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚苯乙烯磺酸酯、聚 丙烯酸酯和聚丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚酯、硅氧烷、纖維素鄰苯二甲酸酯、蛋白質(zhì)例如明 膠、阿拉伯樹膠、白蛋白或纖維蛋白原、明膠和水玻璃的混合物、明膠和多聚磷酸酯的混合 物、明膠和馬來酐與甲基乙烯基醚的共聚物的混合物、醋酸丁酸纖維素、殼聚糖、聚二烷基 二甲基氯化銨(Polydialkyldimethylammonium-chlorid)、聚丙烯酸和聚二烷基二甲基氯 化銨的混合物，以及上述物質(zhì)的混合物。通常也可以使用交聯(lián)劑例如戊二醛、脲甲醛樹脂或 單寧酸化合物使所述聚合物材料交聯(lián)。藻酸鹽作為固定劑(Immobilisate)特別有利，因?yàn)橐环矫嫫鋵η蜴咚缶⑸?的活性僅產(chǎn)生很小的負(fù)面影響，另一方面其可被微生物緩慢分解。通過藻酸鹽固定劑的緩 慢分解可以逐漸地釋放被包覆的球孢梭菌微生物。對于固定化來說，將微生物與聚合物凝膠混合，然后在合適的硬化劑溶液中硬化。 為此，首先使其與凝膠溶液混合，然后以合適高度將其滴入硬化劑溶液中。用于固定化的確 切操作步驟對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在添加下述微生物的同時，在發(fā)酵反應(yīng)器中加入額外的生物質(zhì)。添加微生物之后，可以在1秒至3天的時間段內(nèi)同時添加額外的生物質(zhì)， 或者可以在添加微生物的同時添加額外的生物質(zhì)。在此，可以通過連續(xù)添加新的基質(zhì)來連 續(xù)升高發(fā)酵反應(yīng)器容積負(fù)荷，或使容積負(fù)荷基本保持恒定，其中可以在任何容積負(fù)荷下，優(yōu) 選在彡0. 5千克有機(jī)干物質(zhì)每立方米每天[kg oTS/m3d]的容積負(fù)荷下，更優(yōu)選在彡4. Okg oTS/m3d的容積負(fù)荷下，特別優(yōu)選在> 8. 0kgoTS/m3d的容積負(fù)荷下進(jìn)行發(fā)酵，其與現(xiàn)有技術(shù) 相比容積負(fù)荷升高至兩倍以上。所使用的發(fā)酵基質(zhì)也可以特別地具有高含量的固體組成部分。通過添加具有水解 活性的球孢梭菌發(fā)酵微生物至少部分地液化該固體組成部分。通過由于添加球孢梭菌微生 物而達(dá)到的發(fā)酵基質(zhì)液化可以防止并針對性地抵抗發(fā)酵罐材料的稠化?？梢员苊庠诎l(fā)酵過 程中以水或廄液的形式向發(fā)酵基質(zhì)中添加其他液體。因此，另一優(yōu)點(diǎn)是保護(hù)淡水資源。由 此獲得可攪拌和可泵送的基質(zhì)也是有利的。因此保護(hù)了攪拌器和泵，并且攪拌過程需要的 能量顯著減少。在酒精發(fā)酵過程中也可以使用球孢梭菌微生物液化生物質(zhì)，以制備生物燃料。根據(jù)另一具體實(shí)施方案，在不斷攪拌發(fā)酵基質(zhì)的情況下處理生物質(zhì)。通過不斷攪 拌發(fā)酵基質(zhì)可以使球孢梭菌培養(yǎng)物更好地分布在發(fā)酵基質(zhì)中。此外，在形成沼氣的情況下， 可以更好地將形成的沼氣從發(fā)酵過程中導(dǎo)出。此外，不斷攪拌發(fā)酵基質(zhì)使發(fā)酵反應(yīng)器中熱量均勻分布。發(fā)酵反應(yīng)器中的溫度測 量值(定期循環(huán)且連續(xù)進(jìn)行)表明，發(fā)酵基質(zhì)在20°C至80°C，優(yōu)選約35°C至60°C，特別優(yōu)選 40°C至50°C的溫度下有效發(fā)酵。因此，這些溫度范圍在本發(fā)明中是優(yōu)選的。除了水解之外， 發(fā)酵過程的最后步驟，即通過產(chǎn)甲烷微生物形成甲烷的步驟，在高溫下特別高效。對于多級 沼氣裝置，在不同的溫度下操作不同的反應(yīng)器是合理的，例如在中溫條件下進(jìn)行第一步驟， 并在恒溫條件下進(jìn)行后續(xù)步驟，特別是產(chǎn)甲烷步驟。對此，合適的條件在現(xiàn)有技術(shù)中是公知 的(例如 DE 10 2005 012367A1)。本發(fā)明所有的具體實(shí)施方案并不局限于制備沼氣的一級方法。使用球孢梭菌微生 物也可以以二級或多級方法進(jìn)行。同樣地，可以在形成液體生物燃料的方法中使用球孢梭 菌微生物。根據(jù)另一具體實(shí)施方案，連續(xù)添加發(fā)酵基質(zhì)和球孢梭菌微生物。在穩(wěn)定的微生物 群落的情況下，連續(xù)操作發(fā)酵反應(yīng)器可連續(xù)形成沼氣，由于會擾亂發(fā)酵過程，因此應(yīng)避免突 然停止添加用于發(fā)酵的基質(zhì)。同樣地，所述發(fā)酵方法和連續(xù)過程的具體實(shí)施方案也可以間歇進(jìn)行，例如“分批” 發(fā)酵。因此，根據(jù)另一具體實(shí)施方案，在發(fā)酵過程中，可以例如定期向發(fā)酵基質(zhì)中添加球孢 梭菌微生物。定期添加球孢梭菌微生物使活細(xì)胞數(shù)量增加，并且因此使發(fā)酵過程(例如水 解)更好地進(jìn)行，同時更好地利用了用于發(fā)酵的發(fā)酵基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案，將一定量的球孢梭菌微生物添加至發(fā)酵基質(zhì) 中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物的含量占發(fā)酵基質(zhì)中存在的微生物總量的10_8%至 50%。特別的，取決于發(fā)酵罐尺寸以及發(fā)酵基質(zhì)量，為了獲得所需的效果，可以添加量非常 不同的微生物。確定發(fā)酵基質(zhì)中微生物總量和確定發(fā)酵基質(zhì)中不同微生物的含量對于本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說不成問題。因此，可以例如借助熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針并根據(jù)上文所述方法
12具體確定發(fā)酵基質(zhì)中不同微生物的含量。特別優(yōu)選地，將一定量的球孢梭菌微生物添加至發(fā)酵基質(zhì)中，使得在添加之后，球 孢梭菌微生物占發(fā)酵基質(zhì)中存在的微生物總量的10_6%至25%。特別優(yōu)選地，將一定量的 球孢梭菌微生物添加至發(fā)酵基質(zhì)中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物占發(fā)酵基質(zhì)中存在 的微生物總量的10_4%至10%。非常特別優(yōu)選地，將一定量的球孢梭菌微生物添加至發(fā) 酵基質(zhì)中，使得在添加之后，球孢梭菌微生物占發(fā)酵基質(zhì)中存在的微生物總量的10_3%至 1%。基本上可以在發(fā)酵過程的任何時間點(diǎn)添加球孢梭菌微生物，特別地，在發(fā)酵罐首 次運(yùn)轉(zhuǎn)或再次運(yùn)轉(zhuǎn)時，也可以使用球孢梭菌微生物接種發(fā)酵基質(zhì)?？梢砸耘囵B(yǎng)物的方式，定 期或不定期地(優(yōu)選每周或每年，特別優(yōu)選每天或每周兩次至五次)、單次或多次地以合適 的濃度和量添加球孢梭菌微生物。合適的微生物濃度和添加量已被提及并且記載于具體實(shí) 施方案中。在發(fā)酵過程波動時，也可以添加球孢梭菌微生物來穩(wěn)定發(fā)酵?？梢酝ㄟ^監(jiān)測發(fā)酵 過程的特定表征參數(shù)早期檢測到所述波動。特征參數(shù)提供了關(guān)于制備沼氣的發(fā)酵過程的質(zhì) 量信息。這些表征參數(shù)不僅有形成的沼氣量，還有形成的沼氣的甲烷含量，以及例如形成的 沼氣的氫氣含量，發(fā)酵基質(zhì)的PH值，發(fā)酵基質(zhì)的氧化還原電位，發(fā)酵基質(zhì)的碳酸含量，發(fā)酵 基質(zhì)中不同碳酸的含量，發(fā)酵基質(zhì)的氫氣含量，發(fā)酵基質(zhì)的干物質(zhì)含量，發(fā)酵基質(zhì)的有機(jī)干 物質(zhì)含量，發(fā)酵基質(zhì)的粘度以及發(fā)酵反應(yīng)器容積負(fù)荷。本發(fā)明還包括球孢梭菌微生物處理生物質(zhì)的用途。本發(fā)明還包括球孢梭菌微生物液化生物質(zhì)的用途。本發(fā)明還包括球孢梭菌微生物由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的用途。本發(fā)明還包括通過所述方法獲得的液化生物質(zhì)用于制備生物燃料的用途。優(yōu)選 的，使用通過所述方法獲得的液化生物質(zhì)制備生物乙醇。本發(fā)明還包括球孢梭菌微生物菌株SBG3，其保藏號為NO.DSM22577。根據(jù)布達(dá)佩 斯條約，所述球孢梭菌微生物SBG3以純培養(yǎng)物的形式保藏在不倫瑞克市的德國微生物菌 種保藏中心。其名稱為球孢梭菌SBG3，保藏號DSM 22577。本發(fā)明還包括煎盤梭菌微生物菌株SBGla，其保藏號為No. DSM22578。根據(jù)布達(dá)佩 斯條約，所述煎盤梭菌微生物SBGla以純培養(yǎng)物的形式保藏在不倫瑞克市的德國微生物菌 種保藏中心。其名稱為煎盤梭菌SBGla，保藏號DSM 22578。可以借助本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法從發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)或發(fā)酵殘渣中分離出 球孢梭菌細(xì)菌。為此，將來自發(fā)酵罐的合適基質(zhì)引入篩選培養(yǎng)基中，經(jīng)過長時間的培養(yǎng)并最 終從篩選培養(yǎng)基中分離出微生物的單個菌落。在借助PCR擴(kuò)增所獲得的微生物的DNA之后， 可以基于DNA篩選出球孢梭菌微生物。從第二發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中分離出球孢梭菌細(xì)菌SBG3。為此，使氮?dú)夂投趸?通過液體篩選培養(yǎng)基，然后向篩選培養(yǎng)基中添加Na2S并高壓滅菌(20分鐘，121°C )。然后 將從第二發(fā)酵罐獲得的生物質(zhì)引入篩選培養(yǎng)基中，并在至少30°C的溫度下培養(yǎng)至少一周。 將從液體篩選培養(yǎng)基獲得的樣本涂覆于固體篩選培養(yǎng)基上，然后篩選在固體篩選培養(yǎng)基上 生長的微生物群落。在借助PCR擴(kuò)增所獲得的微生物DNA之后，可以與已知的DNA序列進(jìn) 行比較。
從第二發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中成功分離出球孢梭菌細(xì)菌SBG3之后，對該微生物進(jìn) 行序列分析。確定了 16S rRNA的部分序列，其隨后轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的DNA序列。該DNA序 列SEQ ID No. 1包括1409個核苷酸。作為下一子代鑒定出梭菌屬(Clostridium sp.) 微生物克隆1099982248072，其來自嬰兒的糞便樣本并且與生物燃料的工藝形成有關(guān) (GenBank登錄號EF434352，序列長度為1340個核苷酸)。所述序列的對比表明，梭菌屬克 隆1099982248072的序列與SEQ ID No. 1相比總共有46個核苷酸的取代或空位。使用梭 菌屬克隆1099982248072的1340個核苷酸的序列長度計算出96. 57%的同一性。本發(fā)明還包括含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，該核苷酸序列包括 一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于96. 57%。特別優(yōu)選 地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大 于96. 58 %，或大于96. 59 %，或大于96. 60 %，或大于96. 65 %，或大于96. 70 %，或大于
96.75%，或大于96. 80%，或大于96. 90%，或大于97. 0%，或大于97. 1%，或大于97. 2%, 或大于97. 3 %，或大于97. 4 %，或大于97. 5 %，或大于97. 6 %，或大于97. 7 %，或大于
97.8%，或大于 97. 9%。特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1 的序列同一性大于98. 0%。特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與SEQ ID No. 1的序列同一性大于98. 1%，或大于98. 2%，或大于98. 3%，或大于98. 4%，或大于 98.5%,或大于98. 6%，或大于98. 7%，或大于98. 8%，或大于98. 9%，且特別優(yōu)選地，該核 苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQID No. 1的序列同一性大于99%。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，該微生物含有核苷酸序列，該核苷酸序列具有一 個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99.5%，且特別優(yōu)選地， 該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于 99. 8%。根據(jù)非常特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與 核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相同。在本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，針對原始核苷酸序列SEQ ID No. 1，可以在一 個位點(diǎn)，或兩個位點(diǎn)，或三個位點(diǎn)，或四個位點(diǎn)，或五個位點(diǎn)，或六個位點(diǎn)，或七個位點(diǎn)，或八 個位點(diǎn)，或九個位點(diǎn)，或十個位點(diǎn)，或十一個位點(diǎn)，或十二個位點(diǎn)，或十三個位點(diǎn)，或十四個 位點(diǎn)，或十五個位點(diǎn)，或十六個位點(diǎn)，或十七個位點(diǎn)，或十八個位點(diǎn)，或十九個位點(diǎn)，或二十 個位點(diǎn)，或二十一個位點(diǎn)，或二十二個位點(diǎn)，或二十三個位點(diǎn)，或二十四個位點(diǎn)，或二十五個 位點(diǎn)，或二十六個位點(diǎn)，或二十七個位點(diǎn)，或二十八個位點(diǎn)，或二十九個位點(diǎn)，或三十個位 點(diǎn)，或三十一個位點(diǎn)，或三十二個位點(diǎn)，或三十三個位點(diǎn)，或三十四個位點(diǎn)，或三十五個位 點(diǎn)，或三十六個位點(diǎn)，或三十七個位點(diǎn)，或三十八個位點(diǎn)，或三十九個位點(diǎn)，或四十個位點(diǎn)， 或四十一個位點(diǎn)，或四十二個位點(diǎn)，或四十三個位點(diǎn)，或四十四個位點(diǎn)，或四十五個位點(diǎn)，或 四十六個位點(diǎn)上發(fā)生核苷酸突變。術(shù)語“核苷酸突變”的含義記載于本文的“定義”章節(jié)。本發(fā)明還包括適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/或由生物 質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物培養(yǎng)物，其中在微生物培養(yǎng)物中存在微生物，該微生物含 有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列 同一性至少為96. 57%，其中該微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少10_4%。
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優(yōu)選地，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/或由生物質(zhì) 發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，該核苷 酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于96. 57%。 特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列 同一性大于96. 58 %，或大于96. 59 %，或大于96. 60 %，或大于96. 65 %，或大于96. 70 %， 或大于96. 75 %，或大于96. 80 %，或大于96. 90 %，或大于97. 0 %，或大于97. 1 %，或大于 97. 2%，或大于97. 3%，或大于97. 4%，或大于97. 5%，或大于97. 6%，或大于97. 7%，或大 于97.8%，或大于97.9%。特別優(yōu)選地，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/或由生 物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列，該 核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于98%。 特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列 同一性大于98. 1 %，或大于98. 2%，或大于98. 3%，或大于98. 4%，或大于98. 5%，或大于 98.6%,或大于98. 7 %，或大于98. 8 %，或大于98. 9 %，特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一 個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 0%。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì) 的方法和/或由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微生物含 有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列 同一性大于99. 5%。非常特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序 列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 8%。根據(jù)特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì) 的方法和/或由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微生物含 有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相 同。根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的 至少10_2%，優(yōu)選至少1%。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的 至少10 %，特別優(yōu)選至少25 %。特別優(yōu)選地，球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少50%，特別是 至少90%。特別優(yōu)選地，培養(yǎng)物是適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/ 或由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的微生物純培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物是上文中用其核苷酸序列 表征的球孢梭菌微生物SBG3的純培養(yǎng)物。特別優(yōu)選地，在上述情況下，培養(yǎng)物是固定化的微生物培養(yǎng)物。本發(fā)明還包括適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/或由生物 質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的固定化微生物培養(yǎng)物，其中在該固定化微生物培養(yǎng)物中存在微生 物，該微生物含有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性至少為96. 57%。優(yōu)選地，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì)的方法和/或由生物質(zhì) 發(fā)酵形成沼氣的方法的固定化微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微生物含有核苷酸序列， 該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于96.57%。特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ IDNo. 1 的序列同一性大于96. 58%，或大于96. 59%，或大于96. 60%，或大于96. 65%，或大于
96.70%，或大于96. 75%，或大于96. 80%，或大于96. 90%，或大于97. 0%，或大于97. 1%, 或大于97. 2 %，或大于97. 3 %，或大于97. 4 %，或大于97. 5 %，或大于97. 6 %，或大于
97.7%，或大于97. 8%，或大于97. 9%，或大于98. 0%，或大于98. 1%，或大于98. 2%，或大 于98. 3%，或大于98. 4%，或大于98. 5%，或大于98. 6%，或大于98. 7%，或大于98. 8%, 或大于98. 9%。特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 0%o根據(jù)另一優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生物質(zhì) 的方法和/或由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的固定化微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所述微 生物含有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1 的序列同一性大于99. 5%。特別優(yōu)選地，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸 序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 8%。根據(jù)非常特別優(yōu)選的具體實(shí)施方案，在適用于處理生物質(zhì)的方法，特別是液化生 物質(zhì)的方法和/或由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法的固定化微生物培養(yǎng)物中存在微生物，所 述微生物含有核苷酸序列，該核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相同。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在處理生物質(zhì)的方法中的 用途。優(yōu)選的，在上文詳述的處理生物質(zhì)的方法中使用該微生物。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在液化生物質(zhì)的方法中的 用途。優(yōu)選的，在上文詳述的液化生物質(zhì)的方法中使用該微生物。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物在由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣 的方法中的用途。優(yōu)選的，在上文詳述的由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法中使用該微生物。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培養(yǎng)物在處理生物質(zhì)的方 法中的用途。優(yōu)選的，在上文詳述的處理生物質(zhì)的方法中使用該微生物培養(yǎng)物。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培養(yǎng)物在液化生物質(zhì)的方 法中的用途。優(yōu)選的，在上文詳述的液化生物質(zhì)的方法中使用該微生物培養(yǎng)物。此外，本發(fā)明包括上文中用其核苷酸序列表征的微生物培養(yǎng)物在由生物質(zhì)發(fā)酵形 成沼氣的方法中的用途。優(yōu)選的，在上文詳述的由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法中使用該微 生物培養(yǎng)物。


為了解釋本發(fā)明以及說明其益處，下文中提供具體實(shí)施方案。通過圖1至4詳細(xì) 解釋該具體實(shí)施方案。應(yīng)理解，本發(fā)明不應(yīng)局限于具體實(shí)施方案所提供的信息。附圖表示圖1 用于研究發(fā)酵基質(zhì)液化程度的基質(zhì)流動試驗(yàn)；圖2 發(fā)酵過程的測量結(jié)果以時空產(chǎn)量(N1/1)作為氣體產(chǎn)量和發(fā)酵罐容積負(fù)荷 相對于時間繪圖；圖3 另一發(fā)酵過程的測量結(jié)果以時空產(chǎn)量(N1/1)作為氣體產(chǎn)量和發(fā)酵罐容積 負(fù)荷相對于時間繪圖4 另一發(fā)酵過程的測量結(jié)果以時空產(chǎn)量(N1/1)作為氣體產(chǎn)量和發(fā)酵罐容積 負(fù)荷相對于時間繪圖。
具體實(shí)施例方式從第二發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中成功分離出球孢梭菌細(xì)菌SBG3。根據(jù)布達(dá)佩斯條約， 在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)以純培養(yǎng)物的形式保藏該有機(jī)體(球孢梭菌SBG3，保藏 號 DSM 22577)。同樣地，從第二發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中成功分離出煎盤梭菌細(xì)菌SBGla。根據(jù)布達(dá) 佩斯條約，在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)以純培養(yǎng)物的形式保藏該有機(jī)體(煎盤梭菌 SBGla，保藏號 DSM 22578)。正如下文的具體實(shí)施方案所示，煎盤梭菌菌株細(xì)菌SBGla不僅在混合培養(yǎng)物中而 且在純培養(yǎng)物中均具有與球孢梭菌菌株細(xì)菌SBG3相似的如本發(fā)明所述的性能，例如，升高 容積負(fù)荷，提高氣體產(chǎn)量，穩(wěn)定沼氣工藝，以及液化生物質(zhì)。在下文中，如果沒有特殊說明，則使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法，例如Sambrook等人 所描述的方法(1989年，Molecular cloning =ALaboratory Manual，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室 出版社，冷泉港，紐約)。微牛物分離和增殖從第二發(fā)酵罐的發(fā)酵基質(zhì)中成功分離出球孢梭菌菌株細(xì)菌SBG3。借助篩選培養(yǎng)基 進(jìn)行微生物分離，該篩選培養(yǎng)基以羧甲基纖維素(CMC)作為唯一的碳源。羧甲基纖維素與 在沼氣裝置的發(fā)酵基質(zhì)中獲得的纖維素非常相似，并且通過羥基和羧甲基(-CH2-COOH-)的 連接在水介質(zhì)中具有改善的溶解性。為篩選球孢梭菌SBG3而使用的介質(zhì)(德國微生物菌 種保藏中心，介質(zhì)250加1 % CMC和0. 2%酵母抽提物)用N2充氣，以此在厭氧條件下進(jìn)行 篩選。借助0. 5克/升的Na2S還原所包含的剩余氧氣。然后，用來自第二發(fā)酵罐的材料的上清液(以1 2000稀釋)接種篩選培養(yǎng)基。 在40°C下培養(yǎng)一周之后，通過顯微鏡分析顯示出單個的桿菌(StSbchen)。通過在厭氧羧甲 基纖維素板上涂片從而進(jìn)一步篩選液體培養(yǎng)物并分離至純培養(yǎng)物。對于大量的球孢梭菌菌株細(xì)菌SBG3(例如，對于向3型發(fā)酵罐中的添加物)，在接 種了 100毫升預(yù)培養(yǎng)物的Im3發(fā)酵罐中所提供的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由于所述生長以約2小 時的倍增時間相當(dāng)快速地進(jìn)行，球孢梭菌SBG3非常適用于生物技術(shù)應(yīng)用。少量的細(xì)菌(例 如，對于向1、2和4型發(fā)酵罐中的添加物)在500毫升至1升的規(guī)模下培養(yǎng)。在1至2天 的時間段內(nèi)培養(yǎng)發(fā)酵過程中的添加物。達(dá)到IO8至IOltl細(xì)胞每毫升培養(yǎng)基的細(xì)胞濃度。通 過離心分離獲得細(xì)菌細(xì)胞，并且在將其應(yīng)用于發(fā)酵過程之前，將其引入盡可能小的體積的 新鮮培養(yǎng)基中。冷凍所述細(xì)胞以便進(jìn)行中間儲存?？梢栽谙嗤臈l件下培養(yǎng)煎盤梭菌和浸麻類芽孢桿菌微生物，例如，用于具有大 約相同含量的所述三種微生物的混合培養(yǎng)物。DNA分離和核苷酸序列確定利用菌落PCR方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，使用培養(yǎng)的分離菌落的細(xì)胞材料來擴(kuò)增微生 物 DNA。為了確定16S rRNA序列，利用PCR從細(xì)胞DNA擴(kuò)增16S rRNA基因。為此，使用具有序列 GRGTTTGATCCTGGCTCAG 和 ACGGHTACCTTGTTACGACTT 的引物(5，一 3，方向，H 的含義 為C、T或A)。然后，作為PCR產(chǎn)物獲得的DNA片段被克隆至克隆載體中(通過使用p-Drive 載體和德國希爾登/QIAGEN公司的QIAGEN PCR克隆試劑盒進(jìn)行連接)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(根 據(jù)QIAGEN PCR克隆手冊)并使用菌落PCR進(jìn)行研究。對獲得的菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性 片段長度多態(tài)性分析(RFLP)，以篩選合適的克隆。從每個克隆中分離出相應(yīng)的質(zhì)粒DNA并 按照鏈終止法(Sanger等人，1977)測序。序列分析在菌落的序列分析之后，可以使用程序包ARB(Ludwig等人，Nucleic Acids Research，2004，32，1363-1371)系統(tǒng)分析16S rDNA或其相應(yīng)的16S rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并將 其分類為球孢梭菌微生物。使用數(shù)據(jù)庫www, ncbi. nlm. nih. rov的BLAST程序(基本局部 比對搜索工具)分析16S rDNA或相應(yīng)的16S rRNA序列鑒定出作為下一子代的梭菌屬克隆 1099982248072。句,含纖維素的培養(yǎng)某的液化使用具有水解活性的發(fā)酵微生物球孢梭菌SBG3的純培養(yǎng)物的研究表明，將其添 加至包含羧甲基纖維素的極粘稠的粘性篩選培養(yǎng)基導(dǎo)致介質(zhì)的逐步液化，直至達(dá)到細(xì)菌生 長過程中的水樣一致性，這可以通過搖晃培養(yǎng)瓶和肉眼觀察清楚地看到。發(fā)酵基質(zhì)的液化_基質(zhì)流動試騎在濕法發(fā)酵方法中，液化具有高干物質(zhì)含量的發(fā)酵基質(zhì)或保持液-漿一致性是必 要的，以保證工藝過程平穩(wěn)和經(jīng)濟(jì)地運(yùn)行。有時候，在連續(xù)操作中這也導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)容物的 “黏液”增多，其同樣對沼氣形成過程產(chǎn)生負(fù)面作用。通過一個試驗(yàn)確定添加微生物對發(fā)酵 基質(zhì)一致性所造成的影響，其中在斜面上測量基質(zhì)樣本的流動性能(基質(zhì)流動試驗(yàn))。用于流動試驗(yàn)的原料為來自沼氣裝置的含約8%至12%干物質(zhì)的材料。將來自發(fā) 酵罐的500毫升材料裝入1升肖特瓶中并在40°C下培養(yǎng)1天。然后將來自球孢梭菌SBG3、 煎盤梭菌SBGla、浸麻類芽孢桿菌SBG2的500毫升預(yù)培養(yǎng)物或來自由所述三種細(xì)菌以相同 比例構(gòu)成的混合物的500毫升預(yù)培養(yǎng)物(對應(yīng)于大約4x IO11個細(xì)胞)的細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)再懸 浮并添加至1毫升的培養(yǎng)基中，并在40°C下?lián)u動培養(yǎng)5天。對于對照樣本，僅添加1毫升培 養(yǎng)基。將1.3克樣本放置在金屬斜面的起點(diǎn)，并通過厘米刻度尺讀取每個樣本的流速(每 10分鐘運(yùn)行的距離)，該流速是發(fā)酵基質(zhì)的液化或粘度的度量標(biāo)準(zhǔn)。流動試驗(yàn)的結(jié)果描述 于圖1中。圖1中顯示了如下曲線曲線1 未添加微生物的對照樣本(對比例)；曲線2 煎 盤梭菌SBGla(對比例)；曲線3:球孢梭菌SBG3;曲線4:浸麻類芽孢桿菌SBG2(對比例)； 曲線5 由煎盤梭菌SBGla、球孢梭菌SBG3和浸麻類芽孢桿菌SBG2以相同比例構(gòu)成的混合 物。圖IA顯示了涂覆樣品之后直接測量的曲線，圖IB顯示了涂覆樣品2分鐘之后的曲線， 圖IC顯示了涂覆樣品18分鐘之后的曲線。人們發(fā)現(xiàn)，通過添加活球孢梭菌菌株細(xì)菌SBG3使得發(fā)酵罐內(nèi)容物的粘度急劇下 降，然而添加有機(jī)體煎盤梭菌SBGla和浸麻類芽孢桿菌SBG2也表現(xiàn)出顯著但并不那么明顯 的效果。通過添加所述3種微生物的混合物也可以實(shí)現(xiàn)基質(zhì)的明顯液化。另一試驗(yàn)表明， 添加死亡細(xì)胞(高壓滅菌殺死)實(shí)際上不產(chǎn)生效果。肉眼觀察該樣本，發(fā)現(xiàn)在添加活球孢 梭菌菌株SBG3的細(xì)胞時，黏液物質(zhì)的含量降低。出人意料的，對于已經(jīng)經(jīng)歷了發(fā)酵罐和由微生物引起的發(fā)酵過程的基質(zhì)來說，添加細(xì)菌也能導(dǎo)致進(jìn)一步的液化。這意味著，在沒有添 加外部微生物的發(fā)酵過程中，基質(zhì)不能完全分解并含有額外的能量，該能量可以通過添加 本發(fā)明的微生物得以利用。細(xì)胞濃度的確定為了確定活細(xì)菌的細(xì)胞濃度，將10微升細(xì)菌樣本(例如，預(yù)培養(yǎng)物，細(xì)菌培養(yǎng)物 (Bakterienzuchtansatz)，發(fā)酵罐樣本的上清液)與 2 微升 BacLight 染料(Invitrogen) 混合并使用顯微鏡放大1000倍進(jìn)行觀察(ΑΧΙ0 ImagerAl,Zeiss, Jena) 0在使用紫外線下 以及兩種不同濾鏡的情況下，可以通過BacLight 系統(tǒng)確定樣本中活細(xì)胞的含量。在阿-蔡 二氏計數(shù)池(ThomazShlkammer)中計算總細(xì)胞數(shù)量。來自預(yù)培養(yǎng)物的活細(xì)胞含量理論 上大于90%。樣本中球 包檢菌SBG3 ^Mmmmmm SBG2或前盤檢菌SBGia Mm^mmm ^ - “釣倉(Fishing)法”根據(jù)Amann等人描述的方法(1995，Microbiol. Rev. 59,143-169)，通過“全細(xì)胞雜 交”確定球孢梭菌SBG3或浸麻類芽孢桿菌SBG2或煎盤梭菌SBGla的細(xì)菌含量。對于球孢梭 菌SBG3，使用具有序列Cy3-CCACAGCTCTCACGCCCG (5 ’ 一 3 ’方向)的標(biāo)記的寡核苷酸作為“釣 魚”的探針，對于浸麻類芽孢桿菌SBG2，使用具有序列Cy3-GCAACCCGAACTGAGACC(5’ 一 3’ 方向)的標(biāo)記的寡核苷酸作為“釣魚”的探針，對于煎盤梭菌SBGla，使用具有序列 Cy3-CTTCATGCGAAAATGTAA(5‘ — 3’方向)的標(biāo)記的寡核苷酸作為“釣魚”的探針。標(biāo)記的 寡核苷酸均在5’ -端攜帶吲哚菁染料(Cy3)。發(fā)酵罐類型在不同類型的發(fā)酵罐中進(jìn)行中試規(guī)模的試驗(yàn)。在約40°C的操作溫度下操作發(fā)酵 罐。主要使用有機(jī)干物質(zhì)(oTS)含量為30%至35%的玉米青貯作為基質(zhì)。為了保證對參 與發(fā)酵過程的具有代謝活性的微生物供應(yīng)微量元素，通常添加商業(yè)可獲得的微量元素混合 物(例如Novodyn )。1型發(fā)酵罐水平式長方體活塞流發(fā)酵罐，容積150升，在結(jié)構(gòu)上通過附加的具有 用于基質(zhì)流的小孔的壁分割發(fā)酵罐空間，將發(fā)酵罐空間分割為基質(zhì)進(jìn)料管后有1/4空間和 孔板后有3/4空間，二級裝置。2型發(fā)酵罐容積為150升的水平式長方體活塞流發(fā)酵罐作為第一級，容積為200 升的總球形攪拌發(fā)酵罐作為第二級；總?cè)莘e為350升。具有球形發(fā)酵罐和活塞流發(fā)酵罐之 間的再循環(huán)系統(tǒng)的二級裝置。3型發(fā)酵罐水平式圓柱體活塞流發(fā)酵罐，容積30立方米，一級裝置。4型發(fā)酵罐水平式長方體活塞流發(fā)酵罐，容積150升，發(fā)酵罐空間中沒有結(jié)構(gòu)分 割，一級裝置。任選再循環(huán)。微生物在發(fā)酵罐內(nèi)的分布-“示蹤試驗(yàn)”由于黏性基質(zhì)的攪拌以及向發(fā)酵罐中添加其他物質(zhì)持續(xù)一段時間，并且該時間還 取決于所使用的攪拌工藝，因此建立一種試驗(yàn)，通過該試驗(yàn)可以確定發(fā)酵罐中添加的微生 物達(dá)到均勻分布所需要的時間段。在該“示蹤試驗(yàn)”中，在添加基質(zhì)的位置以10毫克鋰/千 克起始基質(zhì)的濃度(當(dāng)使用2型發(fā)酵罐時該量加倍)添加粉末狀LiCl以代替微生物。然 后，不同的時間段之后(在第一天進(jìn)行添加)，在發(fā)酵罐的不同位置(從基質(zhì)入口之后的發(fā)酵罐起點(diǎn)至基質(zhì)出口之前的終點(diǎn))取得基質(zhì)樣本，并根據(jù)方法DIN EN ISO 13346 (S7a)和 DIN EN ISO 11885 (E22)借助誘導(dǎo)結(jié)合等離子體原子發(fā)射光譜法分析其鋰含量。完全攪拌 發(fā)酵罐內(nèi)容物之后，在發(fā)酵罐前端和發(fā)酵罐后端測得的鋰含量相同并且為約10毫克/千克 起始基質(zhì)(對于2型發(fā)酵罐來說為約20毫克/千克起始基質(zhì))。對于三種不同類型發(fā)酵罐 的“示蹤試驗(yàn)”的結(jié)果列于表1中。
表1: 人們發(fā)現(xiàn)，對于2型和3型發(fā)酵罐，添加“示蹤物”5天之后達(dá)到發(fā)酵罐內(nèi)容物的完 全攪拌以及“示蹤物”的均勻分布，對于1型發(fā)酵罐，添加“示蹤物” 8天之后才達(dá)到發(fā)酵罐 內(nèi)容物的完全攪拌以及“示蹤物”的均勻分布。由此可以預(yù)計，添加的微生物達(dá)到均勻分布 的時間段也為更多的天數(shù)。添力D或不添力口本發(fā)日月的微勿的長其月發(fā)酵IU泡丨備沼氣,在中試工藝規(guī)模中可以穩(wěn)定達(dá)到實(shí)踐中已知的平均容積負(fù)荷至少兩倍的容積負(fù) 荷。在8kg oTS/m3d的容積負(fù)荷下，通過每立方米每周添加2xl013個細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定的操作。 在此，不改變實(shí)踐中通常使用的工藝參數(shù)，例如溫度(40°C )和pH值(6-9)或緩沖能力。在容積為150升至30000升的不同試驗(yàn)發(fā)酵罐和實(shí)際裝置條件下(T 40°C，pH 6-8，連續(xù)供料，不斷攪拌)的發(fā)酵過程中，在數(shù)月的時間段中確定發(fā)酵罐的以千克有機(jī)干 物質(zhì)每立方米每天(kgoTS/m3d)計的容積負(fù)荷的時間曲線和產(chǎn)生的沼氣的時間曲線。為了 更好地比較不同試驗(yàn)裝置，對于氣體產(chǎn)量來說，需要標(biāo)明時空產(chǎn)量(每升發(fā)酵體積產(chǎn)生的 沼氣的標(biāo)準(zhǔn)升[N1/1])而不是沼氣比產(chǎn)量，其中產(chǎn)生的沼氣量通過發(fā)酵體積得以標(biāo)準(zhǔn)化。 此外，計算預(yù)期的理論氣體產(chǎn)量的時間曲線。農(nóng)業(yè)技術(shù)與建筑委員會(KTBL)和聯(lián)邦農(nóng)業(yè)研究中心以及天然再生材質(zhì)專業(yè)協(xié)會 公布了參考數(shù)據(jù)，該標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)代表在穩(wěn)定的發(fā)酵過程中，根據(jù)所使用的基質(zhì)而預(yù)計的沼氣量。因此，該理論參考數(shù)據(jù)可以反映理論產(chǎn)生的沼氣量?；蛘撸部梢允褂闷渌麌业钠渌?研究所公布的參考數(shù)據(jù)。對于玉米青貯來說，其oTS含量為22%至40%，預(yù)計有533Nl/kg oTS M 650Nl/kg oTS 白勺氣體產(chǎn)量(“Handreichung Biogasgewinnung und-nutzung", 2006, Hrsgb.天然再生材質(zhì)專業(yè)協(xié)會e. V.，Giilzow，和KTBL主頁，www. ktbl. de)。通過所述參考 數(shù)據(jù)計算以[Nl/d]計的理論氣體產(chǎn)量的時間曲線，其中在所有試驗(yàn)中，非常高的理論氣體 產(chǎn)量值為663Nl/kg oTS.對于使用的玉米青貯的oTS含量，實(shí)際測得的值取決于在30%至 40% oTS范圍內(nèi)變化的負(fù)載。除了氣體產(chǎn)量和容積負(fù)荷之外，測量發(fā)酵過程的一系列其他表征參數(shù)，例如發(fā)酵 罐內(nèi)容物的干物質(zhì)含量、PH值、酸濃度(例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、乙酸當(dāng)量)、溫度、氣體 比產(chǎn)量、沼氣組成、粘度、傳導(dǎo)率、氧化還原電位和營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素的濃度。^h 4 m^mm^mwmmmm^.m sbgs m^mm工藝裝置為容積為150升的水平式長方體活塞流發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐作為一級發(fā)酵 罐操作。圖2顯示了在添加和不添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的情況下，在試驗(yàn)發(fā)酵罐中 的發(fā)酵過程中不同表征參數(shù)的測量結(jié)果。使用附圖標(biāo)記10標(biāo)明的曲線表示以千克有機(jī)干 物質(zhì)每立方米每天(kg oTS/m3d)計的發(fā)酵罐容積負(fù)荷的時間曲線，使用附圖標(biāo)記20標(biāo)明的 曲線為測得的每五天取平均值的時空產(chǎn)量(N1/1)的時間曲線。附圖標(biāo)記30標(biāo)明了以[Ni/ 1]計的理論氣體產(chǎn)量的時間曲線。在不添加微生物的情況下操作裝置直至第246天。在穩(wěn)定的發(fā)酵過程中，該裝置 可以達(dá)到6至7kg oTS/m3d的相當(dāng)高的容積負(fù)荷，其中實(shí)際氣體產(chǎn)量略低于理論值。從第232天(星號)開始嘗試將容積負(fù)荷升高至IOkg oTS/m3d，這導(dǎo)致立即形成 沼氣。使容積負(fù)荷再次返回至約6kg oTS/m3d的值之后，從第246天開始每周添加兩次球孢 梭菌菌株微生物SBG3的培養(yǎng)物(每次以30毫升至20毫升的體積添加5x IO10至2x IO11 個細(xì)胞)。通過X軸上的散列符號40標(biāo)明添加球孢梭菌SBG3的時間點(diǎn)。然后，實(shí)際氣體產(chǎn)量在理論計算值之上持續(xù)升高。容積負(fù)荷可以在穩(wěn)定發(fā)酵過程 中持續(xù)升高，到第360天增至9kg oTS/m3d的值。因此，時空產(chǎn)量也從初始的4N1/1升高至 6N1/1。第360天之后(箭頭)，由于操作暫停，停止基質(zhì)供應(yīng)并不再進(jìn)一步添加微生物。氣 體生產(chǎn)完全停頓。從第384天開始，在不添加新微生物的情況下，裝置的容積負(fù)荷在一天之內(nèi)增至 5kg oTS/m3d。大約到第415天時，容積負(fù)荷升高至7kg oTS/m3d的值，然后持續(xù)保持在7至 8kg oTS/m3d的高值。因此，氣體生產(chǎn)再次以高效率進(jìn)行，并且在整個觀察時間段內(nèi)保持在 理論預(yù)計的氣體產(chǎn)量范圍內(nèi)或者高于理論預(yù)計的氣體產(chǎn)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在停頓數(shù)周之后無困難地啟動裝置是非常特別的。重新啟 動裝置之后，使用針對球孢梭菌SBG3的寡核苷酸探針的“釣魚”實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵罐中產(chǎn)生有 機(jī)體，并且該有機(jī)體以發(fā)酵罐內(nèi)容物中檢測到的細(xì)菌總量的約0.5%的濃度存在。這也解釋 了在定期添加球孢梭菌微生物SBG3的情況下早已觀察到升高的容積負(fù)荷、氣體產(chǎn)量以及 發(fā)酵過程穩(wěn)定性的積極效果的原因。在1型發(fā)酵罐中添加球孢梭菌微生物SBG3和添加球孢梭菌SBG3、煎盤梭菌SBGla
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工藝裝置為容積為150升的水平式長方體活塞流發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐作為二級發(fā)酵 罐操作，因?yàn)橥ㄟ^附加的具有用于基質(zhì)流的小孔的壁在結(jié)構(gòu)上分割了發(fā)酵罐空間。因此發(fā) 酵罐空間在一定程度上被分割成兩個反應(yīng)室，兩個反應(yīng)室的容積比為1 3，其中基質(zhì)進(jìn)料 管后方的空間較小而孔板后方的空間較大。發(fā)酵過程的表征參數(shù)測量值表明，在兩個反應(yīng) 室中形成部分不同的數(shù)值，由此可以推斷，優(yōu)選在一個或另一個反應(yīng)室中進(jìn)行不同的基質(zhì) 轉(zhuǎn)換。圖3顯示了在1型試驗(yàn)發(fā)酵罐中添加微生物的混合物或球孢梭菌菌株微生物SBG3 的情況下，發(fā)酵過程中不同表征參數(shù)的測量結(jié)果。用附圖標(biāo)記10標(biāo)明的曲線表示以千克有 機(jī)干物質(zhì)每立方米每天(kgoTS/m3d)計的發(fā)酵罐容積負(fù)荷的時間曲線，用附圖標(biāo)記20標(biāo)明 的曲線表示測得的每五天取平均值的時空產(chǎn)量(N1/1)的時間曲線。附圖標(biāo)記30標(biāo)明了以 [N1/1]計的理論氣體產(chǎn)量的時間曲線。重新裝載該裝置。一周之后，每周添加2至5次由大約相同含量的球孢梭菌菌株 微生物SBG3、煎盤梭菌菌株微生物SBGla和浸麻類芽孢桿菌菌株微生物SBG2組成的混合 培養(yǎng)物。用附圖標(biāo)記50標(biāo)明添加的時間點(diǎn)。每次添加約3克含有約IO12個細(xì)胞的細(xì)胞球。 在穩(wěn)定的發(fā)酵過程中，容積負(fù)荷可以逐漸升高至約6kg oTS/m3d的值。獲得的氣體產(chǎn)量通 常對應(yīng)于理論預(yù)計的氣體產(chǎn)量或稍高于理論預(yù)計的氣體產(chǎn)量。從第106天開始，每周添加5次球孢梭菌菌株SBG3的純培養(yǎng)物(同樣為約3克含 有約IO12個細(xì)胞的細(xì)胞球)以代替混合培養(yǎng)物。用附圖標(biāo)記60標(biāo)明添加的時間點(diǎn)。直到 觀測時期結(jié)束，容積負(fù)荷一直保持在6至7kg oTS/m3d的高水平，并且測得的酸濃度沒有達(dá) 到臨界范圍。測得的有機(jī)干物質(zhì)在發(fā)酵罐內(nèi)容物中的含量從未超過12% oTS的值，因此在 較高的容積負(fù)荷也可以良好攪拌，并且在發(fā)酵罐中未出現(xiàn)粘性物質(zhì)。在未添加微生物的對 比實(shí)施例中，該類型的發(fā)酵罐無法在大于5kg oTS/m3d的容積負(fù)荷下運(yùn)轉(zhuǎn)。當(dāng)添加球孢梭菌菌株SBG3的純培養(yǎng)物時，實(shí)際測得的氣體產(chǎn)量與添加混合培養(yǎng) 物的時間段相比顯著升高。對于每周添加5次混合培養(yǎng)物的時間段，測得4. 1N1/1的平均 氣體產(chǎn)量，而在添加球孢梭菌SBG3的純培養(yǎng)物之后，測得4. 6N1/1的平均氣體產(chǎn)量，其升高 了 12%，并且在經(jīng)濟(jì)上具有重大意義。該實(shí)施例還表明，在添加球孢梭菌菌株SBG3的純培 養(yǎng)物時，沼氣比產(chǎn)量(Nm3/t)升高，由于在相同的容積負(fù)荷下氣體產(chǎn)量升高，因此添加的基 質(zhì)也被更有效地利用。在3型發(fā)酵罐中添加球孢梭菌微生物SBG3的長期發(fā)酵試驗(yàn)裝置為容積為30立方米的中試規(guī)模的大型試驗(yàn)裝置，其結(jié)構(gòu)為水平式圓柱 體形狀的活塞流發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐作為一級發(fā)酵罐操作，圖4顯示了在3型試驗(yàn)發(fā)酵罐中添加煎盤梭菌菌株微生物SBGla或球孢梭菌菌株 微生物SBG3的情況下，發(fā)酵過程中不同表征參數(shù)的測量結(jié)果。用附圖標(biāo)記10標(biāo)明的曲線表 示以千克有機(jī)干物質(zhì)每立方米每天(kg oTS/m3d)計的發(fā)酵罐容積負(fù)荷的時間曲線，用附圖 標(biāo)記20標(biāo)明的曲線表示測得的時空產(chǎn)量的時間曲線。該時空產(chǎn)量以每5天取平均值(Ni/ 1)并用附圖標(biāo)記70標(biāo)明。附圖標(biāo)記30標(biāo)明了以[N1/1]計的理論氣體產(chǎn)量的時間曲線。用附圖標(biāo)記90標(biāo)明添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的時間點(diǎn)。用附圖標(biāo)記80標(biāo) 明添加煎盤梭菌菌株微生物SBGla的時間點(diǎn)。箭頭標(biāo)明了發(fā)酵罐“崩潰”的起點(diǎn)。從第184天開始，以4至5kg oTS/m3d的容積負(fù)荷操作該沼氣裝置。正如圖4中所示，該試驗(yàn)中獲得的沼氣時空產(chǎn)量顯著高于理論預(yù)計的值。為了將該過程保持在所述的高 水平，從第207天開始添加煎盤梭菌菌株微生物SBGla的純培養(yǎng)物(每周添加4至5次，每 次為來自100至200升培養(yǎng)基的約100克濕潤細(xì)胞球，對應(yīng)于約4至8x IO13個細(xì)胞)。因 此，該過程可以以所述高水平(時空產(chǎn)量為3. 5至4N1/1，比理論預(yù)計的氣體產(chǎn)量高約15% 至30%)保持超過2周。然而，從第227天開始，氣體產(chǎn)量突然下降，同時容積負(fù)荷迅速降 低至僅略大于Ikg oTS/m3d的值，這就是“發(fā)酵罐崩潰”。人們也可以通過其他測量參數(shù)，例 如PH值(在第229天時pH值從約7. 7至7. 8下降至6. 0)，以及自發(fā)積累的游離脂肪酸的 測量值(針對乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和乙酸當(dāng)量的顯著升高的值)觀察到發(fā)酵過程失去平 衡。為了再次穩(wěn)定發(fā)酵過程，從第228天開始每次添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的純培養(yǎng) 物(每周添加4至5次，來自100至200升培養(yǎng)基的約100克濕潤細(xì)胞球)。在崩潰期間， 獲得的氣體產(chǎn)量僅僅達(dá)到理論預(yù)計的值(參見附圖標(biāo)記20和30標(biāo)明的測量數(shù)據(jù))，但是從 第230天開始，即添加球孢梭菌菌株微生物SBG3的第一個培養(yǎng)物2天后，測得的氣體產(chǎn)量 再次超過理論預(yù)計的值。從第238天開始，容積負(fù)荷的升高伴隨著連續(xù)升高的氣體產(chǎn)量成 為可能。球孢梭菌菌株微生物SBG3的添加持續(xù)至第257天。在該時間點(diǎn)，容積負(fù)荷達(dá)到約 4kg oTS/m3d，并且獲得的氣體產(chǎn)量始終顯著高于理論計算的值，但是效率水平還總是低于 崩潰之前的效率水平。接著停止添加球孢梭菌菌株微生物SBG3，并且從第260天開始重新 添加煎盤梭菌菌株微生物SBGla (每周添加4至5次，每次為來自100至200升培養(yǎng)基的約 100克濕潤細(xì)胞球)。發(fā)現(xiàn)，由此可以容易地使空間產(chǎn)量(Raumausbeute)再次升高到4. 5 至5kg oTS/m3d的值，并且可以再次觀察到氣體盈余，其達(dá)到了發(fā)酵罐崩潰之前的水平。根 據(jù)本發(fā)明，添加球孢梭菌菌株微生物SBG3被證明適用于在崩潰期間穩(wěn)定發(fā)酵罐，使得沼氣 生產(chǎn)再次有效地繼續(xù)進(jìn)行。通過添加球孢梭菌SBG3的純培養(yǎng)物，發(fā)酵過程中的容積負(fù)荷可以升高至約9kg oTS/m3d的最大值。在容積負(fù)荷升高的同時，可以觀察到沼氣產(chǎn)量的升高。此時觀察到與以標(biāo)準(zhǔn)升/ 天[Nl/d]計的理論氣體產(chǎn)量一致的以標(biāo)準(zhǔn)升/天[Nl/d]計的產(chǎn)生的沼氣量，或者高于理 論氣體產(chǎn)量的氣體產(chǎn)量。添加球孢梭菌SBG3可以導(dǎo)致裝置的容積負(fù)荷升高。此時干物質(zhì)或有機(jī)干物質(zhì)的 百分比含量幾乎保持恒定。該觀察結(jié)果表明，在發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵過程中，未發(fā)酵的有機(jī)干物 質(zhì)沒有產(chǎn)生積累。添加球孢梭菌SBG3的純培養(yǎng)物有助于促進(jìn)發(fā)酵基質(zhì)中包含的干物質(zhì)的 連續(xù)轉(zhuǎn)化，這再次導(dǎo)致連續(xù)的發(fā)酵，從而避免了干物質(zhì)的積累。在沼氣裝置以恒定容積負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)的階段中，甚至觀察到干物質(zhì)的減少，這意味著 球孢梭菌微生物SBG3通過其水解代謝活性不僅避免了發(fā)酵罐中干物質(zhì)的積累，而且提高 了干物質(zhì)的水解轉(zhuǎn)換。在所述的具體實(shí)施例中，也可以使用含有球孢梭菌的混合培養(yǎng)物代替球孢梭菌的 純培養(yǎng)物。特別的，可以添加由選自浸麻類芽孢桿菌、煎盤梭菌或球孢梭菌的兩種或三種微 生物組成的混合培養(yǎng)物。添加具有水解活性的發(fā)酵球孢梭菌微生物SBG3顯示出對于有機(jī)干物質(zhì)水解的積 極效果。在相同條件下，通過添加球孢梭菌微生物可以使發(fā)酵罐的容積負(fù)荷從約4至5kg oTS/m3d升高至約6至9kgoTS/m3d，并且不會導(dǎo)致發(fā)酵過程的不穩(wěn)定性。在升高的容積負(fù)荷的同時，形成的沼氣量顯著增加。此外，沼氣比產(chǎn)量升高，因?yàn)榕c不添加球孢梭菌微生物的 情況相比，更多的有機(jī)干物質(zhì)被分解。使用球孢梭菌微生物使得沼氣裝置的效率和生產(chǎn)率 明顯改善。
權(quán)利要求
一種處理生物質(zhì)的方法，其特征在于，在所述生物質(zhì)中添加球孢梭菌微生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其是液化生物質(zhì)的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其是由生物質(zhì)形成沼氣的方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，以微生物培養(yǎng)物的形式添加所 述球孢梭菌微生物，其中所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少10_4%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在微生物培養(yǎng)物中，所述球孢梭菌微生物 占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在微生物培養(yǎng)物中，所述球孢梭菌微生物 占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少50%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在微生物培養(yǎng)物中，所述球孢梭菌微生物 占培養(yǎng)物中存在的微生物總量的至少90%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項所述的方法，其特征在于，添加球孢梭菌微生物的純培養(yǎng)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8任一項所述的方法，其特征在于，在生物質(zhì)中添加球孢梭菌微生 物作為至少一種固定化微生物培養(yǎng)物的組成部分。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項所述的方法，其特征在于，在添加球孢梭菌微生物的同 時向發(fā)酵反應(yīng)器中添加額外的生物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的方法，其特征在于，通過連續(xù)添加生物質(zhì)連續(xù)升 高發(fā)酵反應(yīng)器容積負(fù)荷。
12.根據(jù)權(quán)利要求3至11任一項所述的方法，其特征在于，在>0.5kg oTS/m3d，優(yōu)選 彡4. Okg oTS/m3d，特別優(yōu)選彡8. Okg oTS/m3d的容積負(fù)荷下由生物質(zhì)形成沼氣。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項所述的方法，其特征在于，添加基質(zhì)和添加球孢梭菌微 生物連續(xù)進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的方法，其特征在于，將一定量的球孢梭菌微生物 添加至發(fā)酵基質(zhì)中，使得在添加之后球孢梭菌微生物含量占發(fā)酵基質(zhì)中存在的微生物總量 的 IO"8%M 50%。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，將一定量的球孢梭菌微生物添加至發(fā) 酵基質(zhì)中，使得在添加之后球孢梭菌微生物含量占發(fā)酵基質(zhì)中存在的微生物總量的10_3% 至1%。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的方法，其特征在于，添加額外的煎盤梭菌微生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，其涉及煎盤梭菌菌株SBGla微生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17任一項所述的方法，其特征在于，添加額外的浸麻類芽孢桿菌 微生物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其涉及浸麻類芽孢桿菌菌株SBG2微生物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19任一項所述的方法，其特征在于，球孢梭菌微生物是梭菌屬克 隆1099982248072菌株的微生物。
21.球孢梭菌微生物用于處理生物質(zhì)的用途。
22.球孢梭菌微生物用于液化生物質(zhì)的用途。
23.球孢梭菌微生物用于由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項所述的用途，其特征在于，球孢梭菌微生物是梭菌屬 克隆1099982248072菌株的微生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所述的方法獲得的液化生物質(zhì)用于制備生物燃料的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其特征在于，使用所述液化生物質(zhì)制備生物乙醇。
27.球孢梭菌微生物菌株SBG3，其在德國微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為 No.22577。
28.煎盤梭菌微生物菌株SBGla，其在德國微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為 No.22578。
29.一種含有核酸的微生物，所述核酸具有核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列 包含一個序列區(qū)，該序列區(qū)與核苷酸序列SEQ IDNo. 1的序列同一性大于96. 57%。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該 序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于97. 0%。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該 序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于98. 0%。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該 序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 0%。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該 序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1的序列同一性大于99. 5%。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的微生物，其特征在于，所述核苷酸序列包含一個序列區(qū)，該 序列區(qū)與核苷酸序列SEQ ID No. 1完全相同。
35.一種適用于處理生物質(zhì)的方法的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，在所述微生物培養(yǎng)物 中存在根據(jù)權(quán)利要求29至34所述的球孢梭菌微生物，其中所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng)物 中存在的微生物總量的至少10_4%。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng) 物中存在的微生物總量的至少1%。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng) 物中存在的微生物總量的至少25%。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng) 物中存在的微生物總量的至少50%。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，所述球孢梭菌微生物占培養(yǎng) 物中存在的微生物總量的至少90%。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，其是球孢梭菌微生物的純培 養(yǎng)物。
41.根據(jù)權(quán)利要求35至40任一項所述的微生物培養(yǎng)物，其特征在于，其是固定化的微 生物培養(yǎng)物。
42.根據(jù)權(quán)利要求27至34任一項所述的微生物用于處理生物質(zhì)的用途。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所 述的處理生物質(zhì)的方法。
44.根據(jù)權(quán)利要求27至34任一項所述的微生物用于液化生物質(zhì)的用途。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求2至20任一項所 述的液化生物質(zhì)的方法。
46.根據(jù)權(quán)利要求27至34任一項所述的微生物用于由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的用途。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求3至20任一項所 述的由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法。
48.根據(jù)權(quán)利要求35至41任一項所述的微生物培養(yǎng)物用于處理生物質(zhì)的用途。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所 述的處理生物質(zhì)的方法。
50.根據(jù)權(quán)利要求35至41任一項所述的微生物培養(yǎng)物用于液化生物質(zhì)的用途。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求2至20任一項所 述的液化生物質(zhì)的方法。
52.根據(jù)權(quán)利要求35至41任一項所述的微生物培養(yǎng)物用于由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的 用途。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，其涉及根據(jù)權(quán)利要求3至20任一項所 述的由生物質(zhì)發(fā)酵形成沼氣的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種處理生物質(zhì)的方法，其中在所述生物質(zhì)中添加球孢梭菌微生物。
文檔編號C02F11/04GK101918569SQ200980101737
公開日2010年12月15日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者D·法特, M·羅伊特, V·杜霍 申請人:史馬克沼氣股份有限公司