相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年11月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/077,312號(hào)和2015年11月5日提交的美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)第14/934,140號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明涉及光動(dòng)力治療(photodynamictherapy，pdt)的新形式，其通過本發(fā)明的真正的雙功能——pdt和成像——釓絡(luò)合物(gd-n)的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)，其能夠特異性地靶向癌癥細(xì)胞。本發(fā)明提供了可以特異性地定位于癌細(xì)胞的陰離子細(xì)胞膜的pdt藥物，其中可以監(jiān)測(cè)其激光激發(fā)的光發(fā)射信號(hào)，而不會(huì)在預(yù)期激發(fā)(dueexcitation)之前引起活性氧——單線態(tài)氧(singletoxygen)——的光毒性產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了gd-n作為腫瘤選擇性pdt光敏劑形式的用途。

背景技術(shù)：

科學(xué)家在開發(fā)光動(dòng)力治療(pdt)作為癌癥的可靠臨床治療中面臨腫瘤細(xì)胞識(shí)別、深度光穿透和原位監(jiān)測(cè)的重大挑戰(zhàn)。為了解決穿透深度和分子成像問題，使用近紅外(nir)激發(fā)(通過多光子/上轉(zhuǎn)換過程)和“生物窗口”(例如第1窗口：600-950nm，第2窗口：1-1.35μm，第3窗口：1.5-1.8μm)內(nèi)的發(fā)射提供了令人滿意的分辨率，這是因?yàn)閚ir光子可以深入穿透到組織中并且急劇重新發(fā)射，即使在血液介質(zhì)中也不會(huì)被細(xì)胞吸收以及引起損傷?？梢垣@得清晰的圖像，然后與通常的生物自發(fā)熒光背景區(qū)分。近來，雙光子吸收光動(dòng)力治療(tpa-pdt)受到越來越多的關(guān)注?；谶策墓饷魟┍徽J(rèn)為是主要的候選物，因?yàn)槠潆p光子(tp)誘導(dǎo)的單線態(tài)氧(¹o2)產(chǎn)生和紅/近紅外發(fā)射(～650和～750nm)非常地有效和強(qiáng)烈。已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道了用于tpa-pdt光敏劑的多種設(shè)計(jì)策略，但是這些化合物中僅有極少數(shù)是腫瘤細(xì)胞特異性的或已在體外和體內(nèi)研究，特別關(guān)于卟啉和鑭系元素。例如，最近已經(jīng)證明了使用大tp吸收截面的卟啉二聚體通過體內(nèi)雙光子激發(fā)pdt選擇性關(guān)閉血管；還發(fā)現(xiàn)兩親性光敏劑的腫瘤選擇性與其和負(fù)責(zé)將卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤組織的低密度脂蛋白有效結(jié)合相關(guān)。基本上，高分子量卟啉優(yōu)先在實(shí)體瘤上積聚，并預(yù)期被內(nèi)化到膜限制的細(xì)胞器中，從而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞間隔室的受控定位。然而，對(duì)于pdt探針與癌細(xì)胞接觸仍然很困難，尤其與光動(dòng)力治療的市售或文獻(xiàn)報(bào)道的光敏劑有關(guān)的兩個(gè)主要問題是：(i)癌細(xì)胞的識(shí)別和(ii)其有效性的監(jiān)測(cè)。在這方面，本發(fā)明的申請(qǐng)人之前在zhangt,chancf,haojh,lawgl,wongwk和wongkl(2013).fastuptake,water-soluble,mitochondria-specificerbiumcomplexfordualfunctionmolecularprobe-imagingandphotodynamictherapy.rscadv3,382-385中報(bào)道了一種特異性磷脂標(biāo)記——鐿-卟啉絡(luò)合物(yb-n)，其與溶液中的陰離子磷脂物質(zhì)具有很強(qiáng)的結(jié)合，并且可以通過長(zhǎng)壽命的可見至nir鑭系元素發(fā)光來鑒定多種癌細(xì)胞中的多種陰離子磷脂物質(zhì)。這種絡(luò)合物的限制是其不能光產(chǎn)生¹o2。沒有在對(duì)于癌癥的干細(xì)胞和基因治療中達(dá)到100％效率，為了人類福利，必須探索任何潛在的替代方法。

本發(fā)明的目的是提供解決以下三個(gè)問題的pdt探針，即(i)癌細(xì)胞的識(shí)別；(ii)其有效性的監(jiān)測(cè)和(iii)光產(chǎn)生¹o2——單線態(tài)氧。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于癌細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)治療和成像的組合物，其包含具有以下分子式的釓絡(luò)合物：

其中l(wèi)n是gd或卟啉釓(gd-n)或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在本發(fā)明第一方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于癌細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)治療和成像的組合物，其中所述癌細(xì)胞具有陰離子細(xì)胞膜。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種使用根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的癌細(xì)胞的光動(dòng)力治療和成像的方法，其中向有需要的受試者施用所述組合物并且使用輻射源照射有需要的受試者中的癌細(xì)胞。

在本發(fā)明第二方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物在制備用于受試者中的癌細(xì)胞的光動(dòng)力治療和成像的藥物或試劑中的用途，其中所述藥物或試劑的施用是在所述受試者中經(jīng)靜脈內(nèi)進(jìn)行或通過注射至所述癌細(xì)胞的部位進(jìn)行。

在本發(fā)明第二方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物在制備用于受試者中的癌細(xì)胞的光動(dòng)力治療和成像的藥物或試劑中的用途，其中在施用所述藥物或試劑之后施加輻射源，并且所述輻射源是波長(zhǎng)約860nm的光源。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種合成根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的方法，其包括根據(jù)方案1的步驟：

a)(i)gd[n(sime3)2]3-[licl(thf)3]x,甲苯,回流,12h；(ii)na{η⁵-c5h5)co[p(＝o)(ome)2]3},甲苯,rt,1h；b)(i)tbaf(tfif,1m),ch2cl2,rt,30min；(ii)a)4-碘苯酚,pd(pph3)4,cui,thf,net3,40℃,12h；c)四甘醇二碘化物,dmf,k2co3,80℃,8h；d)三乙胺,dmf,85℃,24h.

方案1

其中

步驟a)：從gd[n(sime3)2]3·[li(thf)3cl]x的溶液中除去溶劑以形成licl沉淀；將二氯甲烷(ch2cl2)加入到所述licl沉淀中以形成第一混合物，其中將所述第一混合物離心分離以從所述第一混合物中分離澄清層；將所述澄清層轉(zhuǎn)移到溶解在甲苯溶液中的卟啉游離堿tfp-tms中以形成第二混合物；回流所述第二混合物，直到大部分所述游離堿與金屬離子配位，以形成經(jīng)回流的第二混合物；將所述經(jīng)回流的第二混合物冷卻至室溫以形成冷卻的經(jīng)回流的第二混合物；將無水na{(η⁵-c5h5)co[p(＝o)(ome)2]3}加入到所述冷卻的經(jīng)回流的第二混合物中以形成第三混合物；攪拌所述第三混合物；從所述第三混合物中除去溶劑以形成第一殘余物；將所述第一殘余物溶解在ch2cl2中以形成第四混合物；過濾所述第四混合物并使用ch2cl2/己烷作為洗脫液對(duì)其進(jìn)行柱色譜分離以產(chǎn)生gd-tms；

步驟b)：將四丁基氟化銨加入到gd-tms在ch2cl2中的溶液中，并攪拌溶液以產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)；在所述化學(xué)反應(yīng)完成后，使所述溶液通過柱色譜以形成第五混合物；'從所述第五混合物中除去溶劑，得到中間體；將所述中間體和4-碘苯酚溶解在無水四氫呋喃和三乙胺中以形成第六混合物；將所述第六混合物與氮混合以形成氮化的第六混合物；將pd(pph3)4和cui加入所述氮化的第六混合物中以形成第七混合物；將所述第七混合物在氮?dú)夥障略谥辽?5℃下攪拌至少10小時(shí)以產(chǎn)生經(jīng)攪拌的第七混合物；從所述經(jīng)攪拌的第七混合物中除去溶劑以產(chǎn)生第二殘余物；使用以ch2cl2/甲醇作為洗脫液的柱色譜純化所述第二殘余物，以產(chǎn)生gd-oh；

步驟c)：將無水k2co3加入到gd-oh和四甘醇二碘化物在無水n,n-二甲基甲酰胺中的溶液中以形成第八混合物；將所述第八混合物在氮?dú)夥障录訜嶂林辽?0℃并持續(xù)至少8小時(shí)以形成經(jīng)加熱的第八混合物；從所述經(jīng)加熱的第八混合物中除去溶劑以形成第一粗產(chǎn)物；使用通過ch2cl2/ch3oh洗脫的柱色譜純化所述第一粗產(chǎn)物以產(chǎn)生gd-i，以及

步驟d)：將無水net3加入到gd-i在無水dmf中的溶液中以形成第九混合物；將所述第九混合物在氮?dú)夥障录訜嶂林辽?5℃并持續(xù)至少24小時(shí)以形成經(jīng)加熱的第九混合物；從所述經(jīng)加熱的第九混合物中除去溶劑，得到第二粗產(chǎn)物；使用以ch2cl2/ch3oh作為洗脫液的第一柱色譜純化所述第二粗產(chǎn)物，以除去未反應(yīng)的gd-i和其他雜質(zhì)，然后使用以ch2cl2/ch3oh作為洗脫液的第二柱色譜進(jìn)一步純化，得到gd-n。

在本發(fā)明第三方面的第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種合成根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的方法，其中在真空中進(jìn)行從給定混合物或溶液中除去溶劑的步驟。

在本發(fā)明第三方面的第二個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種合成根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的方法，其中步驟b)中將所述第六混合物與氮混合以形成氮化的第六混合物的過程為通過在所述第六混合物中氮?dú)夤呐葜辽?0分鐘。

在本發(fā)明第三方面的第三個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種合成根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的方法，其中步驟a)至d)中使用柱色譜的過程是硅膠上的柱色譜。

在本發(fā)明第三方面的第四個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種合成根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物的方法，其中步驟d)中利用ch2cl2/ch3oh的柱色譜的體積/體積為80:1，接著10:1。

結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣?、整體、特性、化合物、化學(xué)部分或基團(tuán)應(yīng)理解為適用于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與其不相容。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，除了具體描述的那些之外，易于對(duì)本文描述的本發(fā)明進(jìn)行變化和修改。

本發(fā)明包括所有這些變化和修改。本發(fā)明還包括在說明書中單獨(dú)地或集體地提及或指示的所有步驟和特征，以及任何和所有組合或任何兩個(gè)或多個(gè)步驟或特征。

在整個(gè)本說明書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包括(comprises)”或諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的變體應(yīng)理解為暗示包括指出的整體或整體的組，但不排除任何其他整體或整體的組。還要指出的是，在本公開中，特別是在權(quán)利要求和/或段落中，諸如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”等的術(shù)語可以具有在美國(guó)專利法中賦予其的含義；例如其可以意指“包含(includes)”、“包含(included)”、“包含(including”)”等等；諸如“基本上由...組成(consistingessentiallyof)”和“基本上由...組成(consistsessentiallyof)”的術(shù)語具有美國(guó)專利法中賦予其的含義，例如，其允許沒有明確敘述的元素，但是排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明的基本或新特征的元素。

此外，在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(include)”或諸如“包含(includes)”或“包含(including)”的變體應(yīng)理解為暗示包括指出的整體或整體的組，但不排除任何其他整體或整體的組。

本文使用的所選術(shù)語的其他定義可以在本發(fā)明的詳細(xì)描述內(nèi)找到并且在全文適用。除非另有定義，否則本文使用的所有其他技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

通過回顧以下描述，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。

附圖說明

結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述和其他目的和特征將從以下對(duì)本發(fā)明的描述中變得明顯，其中：

圖1示出了a)智能癌細(xì)胞特異性光動(dòng)力治療劑(gd-n)及其對(duì)照類似物yb-n和gd-rhb的分子結(jié)構(gòu)；b)在hela細(xì)胞中孵育15小時(shí)后，gd-n的3d體外成像；c)和d)gd-n在癌細(xì)胞(hela)和正常細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位的差異。(wpmy-1)。

圖2示出了gd-n(hepes緩沖溶液，10μm，λex＝430nm，ph＝7.4)的發(fā)射光譜和¹o2量子產(chǎn)率測(cè)量(¹o2chcl3的近紅外磷光譜，10μm，λex＝430nm，abs(λex)＝0.03)。yb-n和h2tpp類似測(cè)量作為對(duì)照。

圖3示出了在2小時(shí)孵育后，腫瘤細(xì)胞hela和正常細(xì)胞mrc5(作為對(duì)照)中g(shù)d-n和gd-rhb的體外成像。在860nm激發(fā)后引起pdt效應(yīng)。a)hela中的gd-rhb；b)mrc-5中的gd-rhb；c)hela中的gd-n；d)mrc-5中的gd-n(1μm)。

圖4示出了gd-n、gd-rhb(對(duì)照)和yb-n(對(duì)照)對(duì)(a)癌細(xì)胞(hela)和(b)正常細(xì)胞(qsg7701)的光細(xì)胞毒性。gd-n(¹o2可獲得，腫瘤特異性，在癌細(xì)胞中強(qiáng)的光細(xì)胞毒性，但在正常細(xì)胞中無光細(xì)胞毒性)，gd-rhb(對(duì)照-¹o2可獲得，無腫瘤特異性，強(qiáng)的癌癥和正常細(xì)胞光細(xì)胞毒性)和yb-n(對(duì)照，¹o2不可獲得，在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞兩者中均無光細(xì)胞毒性)。使用1μm綴合物和0至1j/cm²的各種光劑量獲得光細(xì)胞毒性曲線；孵育24小時(shí)后進(jìn)行mtt測(cè)定。(37℃，5％二氧化碳)。

圖5示出了四種腫瘤細(xì)胞系(hela、sk-n-sh、hk-1和a549)中和三種正常細(xì)胞系(qsg7701、mrc-5、wpmy-1)中腫瘤特異性gd-n以及兩種對(duì)照yb-n和gd-rhb的體外光細(xì)胞毒性測(cè)定(λex＝430nm)。

圖6示出了gd-n作為癌細(xì)胞特異性pdt劑的體內(nèi)研究。a)使用860nm激光進(jìn)行激發(fā)的pdt后腫瘤的代表性總體圖像，候選物分為四組(組1：yb-n；組2：gd-n；組3：yb-rhb；組4：gd-rhb)；b)a)中腫瘤體積的測(cè)量；c)通過icp-ms研究的gd-n的體內(nèi)生物分布；d)c)中腫瘤樣品的雙光子顯微鏡圖像；e)gd-n的體內(nèi)腫瘤抑制測(cè)定；f)通過尾靜脈注射的gd-n誘導(dǎo)¹o2的體內(nèi)腫瘤抑制。

圖7示出了gd-n和gd-rhb誘導(dǎo)的¹o2激活凋亡蛋白家族和mtor途徑的抑制劑。a-收集用1μmgd-n或gd-rhb給藥并用0.5j/cm²照射的hela細(xì)胞用于western印跡。未處理或不含化學(xué)品的樣品作為對(duì)照。b-a中western印跡帶的使用gel-proanalyzer軟件對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)變化進(jìn)行半定量測(cè)定，并表示為與β-肌動(dòng)蛋白的比例(總蛋白的負(fù)載對(duì)照)。在未處理和gd-n或gd-rhb加激光組之間通過單因素方差分析計(jì)算p值。

圖8示出了a)gd-n的高分辨率maldi-tof質(zhì)譜；b)分子離子的同位素圖譜；c)分子離子gd-n的計(jì)算的ms圖譜(使用軟件：isopro3.0)。

圖9示出了gd-n和gd-rhb的吸收光譜。

圖10示出了(a)卟啉釓絡(luò)合物(gd-n)和(b)卟啉鐿絡(luò)合物(yb-n)中的能量吸收、遷移和發(fā)射(通過指示)過程的示意圖。

圖11示出了在dmso(5μm)中在800nm激發(fā)的gd-n(351gm)和gd-rhb(418gm)的開孔z掃描跡線。激光束的平均功率為0.271mw。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明不限于本文所述的任何具體實(shí)施方案的范圍。以下實(shí)施方案僅用于舉例說明。

不希望受理論約束，本發(fā)明的申請(qǐng)人開發(fā)了卟啉釓(gd-n)，其為在yb-n的基礎(chǔ)上合成的pdt試劑，其表現(xiàn)出51％單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，在光激發(fā)后具有卟啉的特征nir發(fā)射。(圖1a)其綜合研究表明，gd-n可以在前6個(gè)給藥小時(shí)內(nèi)通過陰離子磷脂酰絲氨酸膜識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并且在給予一定波長(zhǎng)的激光照射后，除了表現(xiàn)出tp誘導(dǎo)的nir發(fā)射外，還可以進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生¹o2。體內(nèi)小鼠模型和生物分布測(cè)定的結(jié)果進(jìn)一步說明，在將gd-n簡(jiǎn)單注射到血管中后，發(fā)現(xiàn)gd-n位于腫瘤中。在從卟啉中釋放出¹o2后，發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤在24小時(shí)治療后減小。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中目前的知識(shí)，在文獻(xiàn)中缺少體內(nèi)基于鑭系元素的pdt試劑的實(shí)例。因此，本發(fā)明的gd-n可以作為開發(fā)下一代智能pdt試劑的好的藍(lán)圖，其使用鑭系元素卟啉化物用于實(shí)際的癌癥跟蹤、成像和殺滅。

結(jié)果和討論

gd-n具有在本發(fā)明人之前工作中報(bào)道的鐿絡(luò)合物(yb-n)的基序結(jié)構(gòu)，其詳細(xì)合成和表征可以參考方案1和圖8中提供的信息。gd-n和yb-n在結(jié)構(gòu)上或多或少相同(與gd-n結(jié)合載體也與yb-n相同)，只是絡(luò)合物中存在所述鑭系離子。不言而喻的是，卟啉與不同鑭系元素的配位不僅可以引起自身的nir發(fā)射中的變化，而且同時(shí)還有¹o2產(chǎn)生中的變化。(圖2和圖9)原則上這種現(xiàn)象是因?yàn)榻饘僦行暮团潴w之間更好的軌道重疊導(dǎo)致更好的能量轉(zhuǎn)移的事實(shí)(即，由比gd更小的原子半徑組成的yb的鍵合軌道因此與卟啉的軌道更優(yōu)選和相容地重疊)。鑭系元素引起的重原子效應(yīng)也可以增加三線態(tài)衰變速率，并導(dǎo)致卟啉體系的更高三線態(tài)量子產(chǎn)率。根據(jù)光譜研究，yb-n的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率測(cè)定為0％，gd-n測(cè)定為51％。計(jì)算基于(i)由兩種絡(luò)合物產(chǎn)生的¹o2的nir磷光強(qiáng)度(在1270nm)和(ii)鐿²f5/2(～10200cm^-1)和釓⁶p7/2(～32000cm^-1)各自的最低激發(fā)態(tài)。應(yīng)該注意的是，⁶p7/2的后一能級(jí)遠(yuǎn)高于卟啉單元的單/三線態(tài)水平(單線態(tài)＝～23200和15300cm^-1；三線態(tài)＝12500cm^-1)。假設(shè)對(duì)于卟啉和gd之間的這種大的能隙，沒有能量從卟啉轉(zhuǎn)移到gd；所獲得的能量可以純粹以光的形式消散或用于形成單線態(tài)氧，使得直接決定了可用的¹o2量子產(chǎn)率。(圖10a)yb則完全不一樣。由于卟啉和yb之間的能隙較小，卟啉單元吸收的大部分能量只能簡(jiǎn)單地有效轉(zhuǎn)移到鐿中(通過重原子效應(yīng))，并且僅提供特征f-f發(fā)射。(圖10b)這兩個(gè)百分比已經(jīng)清楚地表明，gd-n的卟啉吸收的能量的近半部分將參與¹o2產(chǎn)生，而其余部分通常用于卟啉的nir發(fā)射；相比之下，對(duì)于yb-n，在相同光激發(fā)下1.08μm處的鐿的f-f發(fā)光是主要的能量消耗過程。(分別在430nm和860nm處的線性和雙光子激發(fā)；gd-n和yb-n的雙光子吸收截面近似于～351gm(圖11)。關(guān)于圖10中的測(cè)量，采用以下方法：“根據(jù)光譜研究，yb-n的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率測(cè)定為0％，gd-n測(cè)定為51％。計(jì)算基于(i)由兩種絡(luò)合物產(chǎn)生的¹o2的nir磷光強(qiáng)度(在1270nm)和(ii)鐿²f5/2(～10200cm^-1)和釓⁶p7/2(～32000cm^-1)各自的最低激發(fā)態(tài)。應(yīng)該注意的是，⁶p7/2的后一能級(jí)遠(yuǎn)高于卟啉單元的單/三線態(tài)(單線態(tài)＝～23200和15300cm^-1；三線態(tài)＝12500cm^-1)。假設(shè)對(duì)于卟啉和gd之間的這種大的能隙，沒有可用的能量轉(zhuǎn)換；所獲得的能量可以純粹以光的形式消散或用于形成單線態(tài)氧，使得直接決定了可用的¹o2量子產(chǎn)率。(圖10a)yb則完全不一樣，卟啉單元吸收的大部分能量只能簡(jiǎn)單地有效轉(zhuǎn)移到鐿中(通過重原子效應(yīng))，并且僅提供特征f-f發(fā)射。(圖10b)這兩個(gè)百分比已經(jīng)清楚地表明，gd-n卟啉吸收的能量的近半部分將參與¹o2產(chǎn)生，而其余部分通常用于卟啉的nir發(fā)射；相比之下，對(duì)于yb-n，在相同光激發(fā)下1.08μm處的鐿的f-f發(fā)光是主要的能量消耗過程。”

在腫瘤選擇性、細(xì)胞毒性和光細(xì)胞毒性、成像、pdt效率以及生物分布方面，已經(jīng)完成了與體外和特別是體內(nèi)gd-n的實(shí)際pdt應(yīng)用相關(guān)的研究。gd-n對(duì)腫瘤和正常細(xì)胞的選擇性優(yōu)異。如圖1b)-d)所示，在hela癌細(xì)胞中，在孵育2小時(shí)后，可以在周邊，即膜表面觀察到來自gd-n的卟啉的強(qiáng)紅色發(fā)射；在孵育超過15小時(shí)后，多個(gè)紅色發(fā)射甚至可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并且在內(nèi)部散射。然而，在正常細(xì)胞mrc-5中，即使在孵育12小時(shí)后，也不能在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到發(fā)射。為了公平比較，合成gd-rhb用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。羅丹明b(rhb)是通常用于綴合的周知的線粒體載體。在相同的實(shí)驗(yàn)條件(孵育時(shí)間、濃度、細(xì)胞系和激光功率)下，申請(qǐng)人可以在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的線粒體中發(fā)現(xiàn)gd-rhb的發(fā)射，這一觀察結(jié)果成為gd-n的腫瘤特異性的明確的、認(rèn)可的和令人信服的證據(jù)。(圖3)通過mtt測(cè)定，可以隨后確定在黑暗中三種絡(luò)合物gd-n、yb-n和gd-rhb對(duì)于兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。癌細(xì)胞(hela)中其ic50值分別為0.78、0.80和0.65mm，正常細(xì)胞(mrc-5)中分別為0.70、0.70和0.45mm。與其他兩種相比，gd-rhb在黑暗中對(duì)于癌細(xì)胞/正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性的巨大差異的根本原因可能在很大程度上是由于其非選擇性。再一次，本發(fā)明的gd-n的一個(gè)實(shí)施方案的特征是可以表現(xiàn)出關(guān)鍵的腫瘤選擇性。使用體外共焦顯微鏡和光細(xì)胞毒性測(cè)定評(píng)估三種絡(luò)合物的體外pdt作用。將gd-n、yb-n和gd-rhb絡(luò)合物在hela細(xì)胞和mrc-5細(xì)胞中給藥6小時(shí)，然后在860nm進(jìn)行激發(fā)以引起任何pdt效應(yīng)。(三種絡(luò)合物都可用于tp誘導(dǎo)的體外成像，tp橫截面為～351gm；鑒于共焦分光鏡的限制，僅監(jiān)測(cè)600nm到750nm的卟啉的發(fā)射)。在圖3中，在線粒體中可以注意到gd-rhb的發(fā)射。在合適的激光誘導(dǎo)下，僅產(chǎn)生少量的¹o2，但可以在幾分鐘內(nèi)殺死癌細(xì)胞；實(shí)際上，在相同條件下也可以快速殺死正常細(xì)胞。因此，gd-rhb的pdt效應(yīng)是充分有效的，但是明顯不合需要；其可以積累在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的線粒體內(nèi)，沒有選擇性地消滅它們。雖然yb-n是癌癥特異性的，但是其不能產(chǎn)生任何¹o2導(dǎo)致了其任何pdt實(shí)踐的限制。令人驚訝的是，當(dāng)提到紅色發(fā)射gd-n時(shí)，其不僅可以識(shí)別和定位在腫瘤細(xì)胞的陰離子膜上，而且還可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的某些部分并且在9分鐘光劑量閃爍(每分鐘5秒)后通過¹o2誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)然，在確定的激光照射后，需要更多的時(shí)間來觸發(fā)gd-n導(dǎo)致的癌細(xì)胞死亡；然而，在正常細(xì)胞中沒有明顯的細(xì)胞死亡，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其緩慢反應(yīng)的缺陷。

作為任何新一代pdt劑，還已經(jīng)在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中在0.25至1j/cm²的不同光劑量下測(cè)量了gd-n、yb-n和gd-rhb的濃度依賴性光細(xì)胞毒性。獲得的光劑量-反應(yīng)曲線示出在圖4a中。在hela癌細(xì)胞中，gd-rhb和gd-n具有強(qiáng)烈的光細(xì)胞毒性，而yb-n(無單線態(tài)氧)沒有光細(xì)胞毒性。從圖4b可以看出，在正常細(xì)胞qsg7701中，未發(fā)現(xiàn)來自gd-n的光細(xì)胞毒性，而gd-rhb給出了與其在癌細(xì)胞中的表現(xiàn)非常類似isi的結(jié)果。這種趨勢(shì)似乎與癌細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)gd-n的選擇性細(xì)胞攝取有關(guān)。申請(qǐng)人通過使用更多的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞系擴(kuò)展了研究，結(jié)果如圖5所示——gd-n可以對(duì)總共7個(gè)細(xì)胞系(四個(gè)癌細(xì)胞和三個(gè)正常細(xì)胞)保持良好的腫瘤選擇性，從而充當(dāng)了杰出和特異性pdt試劑。

為了更多地了解本發(fā)明絡(luò)合物的體內(nèi)攝取，已經(jīng)通過異種移植小鼠模型和icp-ms進(jìn)行了對(duì)這些絡(luò)合物對(duì)特定器官感染的特異性的生物分布的研究。在第一個(gè)概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，將四種絡(luò)合物分為四組。將分別與gd-n、yb-n、gd-rhb和yb-rhb預(yù)孵育的hela細(xì)胞皮下注射到balb/c裸小鼠中，然后用860nm激光照射注射部位。兩周后，對(duì)小鼠照相，測(cè)量腫瘤體積(其中小鼠圖像和腫瘤體積的測(cè)量分別示出在圖6a和6b中)，并且發(fā)現(xiàn)與其對(duì)應(yīng)物的yb-n和yb-rhb相比，在gd-n和gd-rhb組中發(fā)現(xiàn)腫瘤被有效抑制；在四種絡(luò)合物中，gd-n是最佳的體內(nèi)pdt試劑，其可以以100％效率破壞腫瘤。以生物分布研究的方式，對(duì)具有達(dá)到約0.1cm³的腫瘤異種移植物的balb/c裸小鼠尾靜脈注射gd-n(1.0mg/kg)。化學(xué)品施用兩天后，使用icp-ms檢測(cè)不同組織或循環(huán)血液中的濃度。如圖6c所示，腫瘤具有最大的gd-n富集(4.84ppm/g)，這表明gd-n對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別。

通過從施用gd-n的balb/c裸小鼠提取的腫瘤組織的雙光子顯微鏡成像也證實(shí)了該結(jié)果。具有來自gd-n的明顯的雙光子顯微信號(hào)(gd-n的圖像，圓圈點(diǎn))，而對(duì)照?qǐng)D像(顯示為背景，通過亮場(chǎng)成像)未顯示特定信號(hào)。合并圖像是背景和gd-n的重疊光子，其示出在圖6d中。通過分別用gd-n(2.0mg/kg)、gd-rhb(2.0mg/kg)和ala(60mg/kg)(5-氨基乙酰丙酸，其可以在活細(xì)胞中產(chǎn)生原卟啉，并且在這里用作對(duì)照pdt化學(xué)品)瘤內(nèi)注射約0.3cm³的hela異種移植腫瘤的balb/c裸小鼠并且在絡(luò)合物注射后用860nm光照射3小時(shí)，來進(jìn)一步驗(yàn)證gd-n和gd-rhb對(duì)荷瘤小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。腫瘤總光劑量為50j/cm²。然后允許腫瘤生長(zhǎng)另外7天，并進(jìn)行最終提取和拍照。如圖6e所示，這些研究的結(jié)果確實(shí)表明，gd-n能夠在短時(shí)間內(nèi)極大地抑制實(shí)體腫瘤，甚至將實(shí)體腫瘤的尺寸從2cm減小到1cm。

或者，向具有異種移植腫瘤的小鼠尾靜脈注射gd-n和gd-rhb(2.0mg/kg體重)，并允許全循環(huán)6小時(shí)。然后與上述類似地用860nm的光照射腫瘤。對(duì)側(cè)的腫瘤作為對(duì)照(未光處理)。在接下來的幾天內(nèi)，以每天一次的方式重復(fù)處理三次。一致地，發(fā)現(xiàn)與其對(duì)側(cè)腫瘤對(duì)照或gd-rhb組相比，gd-n加光處理的腫瘤被抑制。藥代動(dòng)力學(xué)分析顯示，gd-n在動(dòng)物中以較大mrt(平均停留時(shí)間(meanresistancetime))值持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間(12.50小時(shí))，而gd-rhb被快速清除(mrt為5.04小時(shí))(結(jié)果示出在圖6f和表1中)。

表1.分別向balb/c裸小鼠(n＝3)尾靜脈注射20nmol的gd-n(37.34μg)或gd-rhb(44.28μg)后血漿中g(shù)d-n和gd-rhb的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。auc，濃度-時(shí)間曲線下面積；平均停留時(shí)間；t1/2，統(tǒng)計(jì)半衰期；vd，分布體積。

關(guān)于pdt的分子機(jī)制，還研究了pdt處理的hela細(xì)胞的蛋白質(zhì)裂解物中細(xì)胞存活素和凋亡蛋白家族抑制劑(iap)的蛋白質(zhì)水平。正如提出的，在gd-n加激光處理樣品中，存活素和iap家族成員c-iap1、c-iap2和xiap都顯著表達(dá)。此外，驚奇地發(fā)現(xiàn)mtor途徑可能參與對(duì)癌細(xì)胞的pdt治療的反應(yīng)。在gd-n或gd-rhb誘導(dǎo)的¹o2應(yīng)激刺激下，兩種關(guān)鍵成員mtor和gβl的水平明顯升高。這些結(jié)果表明gd-n的成功細(xì)胞殺傷作用在分子水平促進(jìn)光動(dòng)力治療，也可以揭示當(dāng)前pdt藥物的設(shè)計(jì)和改進(jìn)的新前景。(圖7)

結(jié)論

本發(fā)明提供用作抗癌武器的治療診斷性釓絡(luò)合物gd-n，其配備有用于成像的可見至nir發(fā)射、腫瘤細(xì)胞選擇性和¹o2產(chǎn)生。通過一系列體外和體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明gd-n的有效性和優(yōu)點(diǎn)得到充分證實(shí)，并證明了本發(fā)明的gd-n是下一代智能雙功能pdt劑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是使用本發(fā)明的gd-n以及選擇性光動(dòng)力學(xué)治療來追蹤和成像長(zhǎng)期活癌細(xì)胞的方法。

實(shí)驗(yàn)方法

線性誘導(dǎo)的光物理性質(zhì)

申請(qǐng)人已經(jīng)分別用hpuv-8453分光光度計(jì)和配備有在氮流冷卻的殼體內(nèi)的uv至可見靈敏光電倍增管的愛丁堡儀器fls920組合熒光壽命和穩(wěn)態(tài)分光光度計(jì)(edinburghinstrumentfls920combinedfluorescencelifetimeandsteadystatespectrophotometer)記錄了所有本發(fā)明絡(luò)合物的uv-可見吸收光譜(范圍從200至1100nm)和單光子發(fā)光光譜。申請(qǐng)人已經(jīng)校正了來自檢測(cè)器響應(yīng)和雜散背景光磷光的所有光譜，通過在愛丁堡儀器fls920中提供有兩個(gè)進(jìn)入端口的可拆卸的142mm(內(nèi))直徑的硫化鋇涂覆的積分球來測(cè)量鑭系元素絡(luò)合物的量子產(chǎn)率。

單線態(tài)氧量子產(chǎn)率

對(duì)于1270nm的磷光，申請(qǐng)人已經(jīng)在ptiqm4發(fā)光分光計(jì)上用ingaas檢測(cè)器檢測(cè)了單線態(tài)氧，并且通過將樣品溶液的¹o2發(fā)射強(qiáng)度與參考材料^[4](h2tpp,chcl3中φδ＝0.55)相比較確定了chcl3中所有化合物的量子產(chǎn)率(фδ)，如下式所示：

其中фδ表示單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，gδ表示積分發(fā)射強(qiáng)度，a表示操作激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度，n表示溶劑的折射率，已知上標(biāo)ref和s分別表示參考和樣品。在所有情況下，申請(qǐng)人已經(jīng)測(cè)量了正常激發(fā)時(shí)的¹o2發(fā)射光譜。為了減少發(fā)射光的再吸收的影響，所有吸光度也設(shè)定為0.05。

細(xì)胞培養(yǎng)

人hela(宮頸癌)和wpmy-1(正常前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞)細(xì)胞生長(zhǎng)在dmem培養(yǎng)基中；a549(肺腺瘤)保持在ham'sf12k培養(yǎng)基和l-谷氨酰胺(n3520,sigma,st.louis,mo,usa)的混合物中；qsg7701(正常肝細(xì)胞)、hk-1、hone1(鼻咽癌)生長(zhǎng)在rmpi-1640培養(yǎng)基中；mrc-5(正常肺成纖維細(xì)胞)和sk-n-sh(神經(jīng)母細(xì)胞瘤)細(xì)胞生長(zhǎng)在mem培養(yǎng)基中。還添加了(i)10％(v/v)胎牛血清(fbs)，(ii)100μg/ml鏈霉素，和(iii)100單位/ml青霉素。

體外成像

為了測(cè)試本發(fā)明的水溶性絡(luò)合物作為生物探針的適用性，申請(qǐng)人使用商業(yè)共聚焦激光掃描顯微鏡——配備有ti:藍(lán)寶石激光(libraii，coherent)的leicatcssp5以及用于激發(fā)的980nm波長(zhǎng)激光，對(duì)與本發(fā)明的五種絡(luò)合物孵育的hela/wpmy-1/mrc-5細(xì)胞進(jìn)行體外成像。

mtt細(xì)胞活力測(cè)定

24小時(shí)后，將水溶性絡(luò)合物和處理的靶細(xì)胞與3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(0.5mg/ml)(也稱為mtt)進(jìn)一步溫育續(xù)4小時(shí)，使得隨著細(xì)胞的代謝途徑形成甲臜(formazan)。然后，申請(qǐng)人提取甲臜并用二甲基亞砜(dmso)溶解，隨后在bio-radimark酶標(biāo)儀(490nm)中測(cè)量溶液的吸光度。一式四份進(jìn)行，并且申請(qǐng)人通過使用graphpadprism5軟件繪圖來解釋和分析數(shù)據(jù)。

光動(dòng)力學(xué)治療(pdt)測(cè)定

首先在96孔板上將癌細(xì)胞(2×10⁴/孔)孵育過夜，然后用本發(fā)明的絡(luò)合物和對(duì)照類似物在黑暗中處理接下來的6小時(shí)。在將舊培養(yǎng)基替換成新鮮培養(yǎng)基之后，將細(xì)胞相應(yīng)在mw/cm2流暢度下暴露于配備有隔熱濾波器和500nm暢通濾波器的400w鎢燈產(chǎn)生的黃光(1-8j/cm²)。之后，申請(qǐng)人在24小時(shí)后通過mtt測(cè)定檢查了pdt后細(xì)胞活力。申請(qǐng)人用pbs沖洗細(xì)胞單層，之后與250μg/mlmtt溶液在37℃下孵育3小時(shí)。然后通過96孔板讀數(shù)器(elx800吸光度微板讀數(shù)器)在540和690nm對(duì)形成并且溶解在dmso中的甲臜進(jìn)行吸光度測(cè)量。

動(dòng)物：申請(qǐng)人在獲自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)：scxk-2008-0002)的無胸腺裸小鼠(balb/c-nu/nu)上進(jìn)行了所有需要?jiǎng)游锬Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)。根據(jù)“國(guó)家動(dòng)物管理和使用程序標(biāo)準(zhǔn)”(20080820)的嚴(yán)格議定書養(yǎng)育和操作小鼠。

藥代動(dòng)力學(xué)分析：將gd-n和gd-rhb(各1.0μmol/kg體重)經(jīng)尾靜脈注射到小鼠中。然后在如所示的0-20小時(shí)的不同時(shí)間點(diǎn)收集血清。通過perkinelmerenvisionmultilabelreader2104在570nm處測(cè)量gd-n和gd-rhb的濃度，并通過濃度曲線使用標(biāo)準(zhǔn)吸收進(jìn)行計(jì)算。通過與單室模型擬合計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(t1/2、vd、mrt、auc)。

通過icp-ms的體內(nèi)生物分布

為了更好地理解本發(fā)明絡(luò)合物的體內(nèi)攝取，通過icp-ms進(jìn)行對(duì)特定器官/細(xì)菌感染具有特異性的絡(luò)合物的體內(nèi)分布研究。當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤異種移植物已經(jīng)達(dá)到大約0.1cm³的大小時(shí)，申請(qǐng)人以1.0μmol/kg體重的劑量向小鼠施用gd-n和gd-phb。兩天后，收集腫瘤、肝、肺、腎、脾、腦、前列腺和皮膚中約0.02-0.04克樣品組織；血液(80-90μl)也不例外。申請(qǐng)人將所有樣品與500μl硝酸一起在37℃孵育，除了溶解干擾性有機(jī)分子外，用于還釋放金屬離子用于進(jìn)一步icp-ms檢查。

體內(nèi)光動(dòng)力治療研究

為了建立小鼠腫瘤異種移植模式，將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，收獲并懸浮在培養(yǎng)基中。申請(qǐng)人將100μl體積中的1×10⁶個(gè)細(xì)胞皮下(s.c.)注射到雌性無胸腺裸小鼠(5周齡)的側(cè)面，并等待10-15天。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm³的大小時(shí)，申請(qǐng)人將動(dòng)物隨機(jī)分成不同的組用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。用卡尺(精度為0.02mm)測(cè)量腫瘤體積，然后根據(jù)等式v＝(l×w²)/2獨(dú)立計(jì)算，其中l(wèi)和w分別對(duì)應(yīng)于較大和較小尺寸。通過graphpadprism5.0軟件評(píng)估組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的單因素方差分析。

材料和方法

使用的所有化學(xué)品均為試劑級(jí)，并購自sigma-aldrich，不經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。中間體yb[n(sime3)2]3·[licl(thf)3]¹和起始卟啉游離堿tfp-tms²的制備根據(jù)文獻(xiàn)程序進(jìn)行。³對(duì)照化合物gd-rhb、yb-rhb⁴和yb-n⁵的制備分別根據(jù)本發(fā)明人之前的程序完成。所有分析級(jí)溶劑在使用前通過標(biāo)準(zhǔn)程序干燥、蒸餾和脫氣。在brukerautoflexmaldi-tof質(zhì)譜儀上獲得報(bào)告為m/z的高分辨率質(zhì)譜。元素分析在中國(guó)西北大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院進(jìn)行。中間體和gd-n的合成路線如方案1所示：

a)(i)gd[n(sime3)2]3-[licl(thf)3]x,甲苯,回流,12h；(ii)na{η⁵-c5h5)co[p(＝o)(ome)2]3},甲苯,rt,1h；b)(i)tbaf(tfif,1m),ch2cl2,rt,30min；(ii)a)4-碘苯酚,pd(pph3)4,cui,thf,net3,40℃,12h；c)甘醇二碘化物,dmf,k2co3,80℃,8h；d)三乙胺,dmf,85℃,24h.

方案1.gd-ngd-tms的合成路線：將gd[n(sime3)2]3·[li(thf)3cl]x(5.0ml，0.6mmolgd)的溶液轉(zhuǎn)移到schlenk燒瓶中并在真空下除去溶劑。然后加入10ml二氯甲烷(ch2cl2)用于沉淀出licl。將混合物離心分離，將澄清層轉(zhuǎn)移到具有溶解在20ml甲苯中的卟啉游離堿tfp-tms(196mg，0.2mmol)的另一schlenk燒瓶中。將所得溶液回流12小時(shí)，直到大部分游離堿與金屬離子配位。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫。然后向混合物中加入無水na{(η⁵-c5h5)co[p(＝o)(ome)2]3}(104mg，0.22mmol)，將其再磁力攪拌1小時(shí)。反應(yīng)完成后，在真空下除去溶劑，將殘余物溶解在ch2cl2中，過濾并使用ch2cl2/己烷作為洗脫液在硅膠上進(jìn)行色譜分離，得到作為紅色固體的純產(chǎn)物。產(chǎn)率：86％；maldi-tofms:[m⁺]的計(jì)算值:m.p.>300℃；1587.1965,實(shí)測(cè)值:1587.2154；[c60h44cof15n4o9p3sigd]的分析計(jì)算值:c,45.40；h,2.79；n,3.53％,實(shí)測(cè)值:c,45.46；h,2.83；n,3.51％；uv/vis(dmso,25℃):λmax(logε)＝427(5.68),558(4.34),597(3.29dm³mol^–1cm^–1)。

gd-oh：將四丁基氟化銨(tbaf，thf中1.0m，200μl，0.2mmol)加入到gd-tms(182mg，0.1mmol)在10mlch2cl2中的溶液中，并將溶液攪拌30分鐘。通過tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完成后，使混合物通過硅膠短柱。除去溶劑后，獲得中間體，其用于下一步驟而不需進(jìn)一步純化。然后將得到的中間體和4-碘苯酚(33mg，0.15mmol)溶解在無水四氫呋喃(thf，15ml)和三乙胺(net3，5ml)中，并將混合物用氮?dú)夤呐?0分鐘。之后，向上述溶液中加入pd(pph3)4(12mg0.01mmol)和cui(3.8mg，0.02mmol)。將反應(yīng)混合物在氮?dú)夥障略谥辽?5℃下攪拌至少10小時(shí)。然后減壓下除去溶劑。將殘余物使用ch2cl2/甲醇(50:1)作為洗脫液在硅膠上進(jìn)行色譜分離，得到作為紅色固體的純產(chǎn)物。產(chǎn)率：73％(表2)；m.p.>300℃；maldi-tofms:[m⁺]的計(jì)算值:1607.0291,實(shí)測(cè)值:1608.0308；[c63h40cof15n4o10p3gd]的分析計(jì)算值:c,47.08；h,2.51；n,3.49％,實(shí)測(cè)值:c,47.10；h,2.49；n,3.51％；uv/vis(dmso,25℃):λmax(logε)＝426(5.70),555nm(4.48dm³mol^–1cm^–1)。

表2不同交聯(lián)反應(yīng)條件下的產(chǎn)率(％)?？紤]時(shí)間和溫度，選擇40℃和12小時(shí)作為主要反應(yīng)條件。

gd-i：向gd-oh(161mg，0.1mmol)和四甘醇二碘化物(207mg，0.5mmol)在無水n，n-二甲基甲酰胺(dmf，10ml)中的溶液中加入無水k2co3(69mg，0.5mmol)，并將混合物在氮?dú)夥障录訜嶂?0℃并持續(xù)8小時(shí)。然后在減壓下除去溶劑。將粗產(chǎn)物在通過ch2cl2/ch3oh(v/v,100:1)洗脫的硅膠上通過柱色譜純化，得到作為紅色固體的純產(chǎn)物。產(chǎn)率：82％；m.p.>300℃；maldi-tofms:[m⁺]的計(jì)算值:1893.2210,實(shí)測(cè)值1893.1038；[c71h55cof15in4o13p3gd]的分析計(jì)算值:c,45.04；h,2.94；n,3.11％,實(shí)測(cè)值:c,45.21；h,2.99；n,3.06％；uv/vis(dmso,25℃):λmax(logε)＝425(5.71),555nm(4.50dm³mol^–1cm^–1)。

gd-n：向gd-i(95mg，0.05mmol)在無水dmf(10ml)中的溶液中加入無水net3(1ml，過量)，將混合物在氮?dú)夥障录訜嶂?5℃并持續(xù)24小時(shí)。然后在減壓下除去溶劑。將所得粗產(chǎn)物使用ch2cl2/ch3oh(v/v，80:1)作為洗脫液通過硅膠柱色譜法純化，以除去未反應(yīng)的gd-1和其他雜質(zhì)，然后使用ch2cl2/ch3oh(v/v,10:1)，得到作為紅色固體的純產(chǎn)物。產(chǎn)率：80％；m.p.>300℃；maldi-tofms:[m⁺]的計(jì)算值:1867.5095,1867.2538實(shí)測(cè)值；[c99h85cof15n6o16p3gd]的分析計(jì)算值:c,46.37；h,3.54；n,3.51％,實(shí)測(cè)值:c,46.40；h,3.59；n,3.48％；uv/vis(dmso,25℃):λmax(logε)＝426(5.74),555nm(4.53dm³mol^–1cm^–1)。

雙光子吸收測(cè)量

通過開孔z掃描方法在800nm處測(cè)量雙光子吸收光譜(即，z掃描跡線)，所述方法使用來自在ti:藍(lán)寶石再生放大器系統(tǒng)產(chǎn)生的1khz重復(fù)率下操作的光學(xué)參數(shù)放大器的峰值功率為276gwcm^–2的100fs激光脈沖。激光束被分束器分成兩部分。一個(gè)通過光電二極管(d1)監(jiān)測(cè)為入射強(qiáng)度參考i0，另一個(gè)通過另一個(gè)光電二極管(d2)檢測(cè)為透射強(qiáng)度。在通過f＝20cm的透鏡后，激光束聚焦并通過石英池。樣品池z的位置通過計(jì)算機(jī)控制的可平移表沿著激光束的方向(z軸)移動(dòng)，使得可以在恒定的入射強(qiáng)度激光功率水平下改變樣品室內(nèi)的局部功率密度。最后，通過光電二極管d2檢測(cè)來自樣品池的透射強(qiáng)度。光電二極管d2與計(jì)算機(jī)接口，用于信號(hào)采集和平均。每個(gè)透射強(qiáng)度數(shù)據(jù)代表超過100次測(cè)量的平均值。假設(shè)高斯光束剖面，可以通過使用方程式(1)⁶曲線擬合到觀察到的開孔軌跡t(z)，得到非線性吸收系數(shù)β，其中a0是線性吸收系數(shù)，l是樣品長(zhǎng)度(1mm石英池)，z0是入射光束的衍射長(zhǎng)度。獲得非線性吸收系數(shù)β后，可以通過使用等式(2)確定樣品分子的2pa橫截面σ⁽²⁾(以1gm＝10^–50cm⁴光子^-1為單位)，其中na是阿伏伽德羅常數(shù)(avogadro’sconstant)，d是溶液中樣品化合物的濃度，h是普朗克常數(shù)(planck’sconstant)，v是入射激光束的頻率

(1)

(2)

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明公開了光動(dòng)力治療(photodynamictherapy，pdt)的新形式，其通過本發(fā)明的真正的雙功能——pdt和成像——釓絡(luò)合物(gd-n)的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)，其能夠細(xì)胞特異性地靶向癌癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了可以特異性定位于癌細(xì)胞的陰離子細(xì)胞膜的pdt藥物，其中可以監(jiān)測(cè)其激光激發(fā)的光發(fā)射信號(hào)，而不會(huì)在預(yù)期激發(fā)之前引起活性氧——單線態(tài)氧——的光毒性產(chǎn)生。已經(jīng)進(jìn)行了全面的體外和體內(nèi)研究，以證實(shí)gd-n作為抗腫瘤治療的新的腫瘤選擇性pdt光敏劑形態(tài)的有效性。

如果需要，本文討論的不同功能彼此可以以不同的順序和/或同時(shí)執(zhí)行。此外，如果需要，上述功能中的一個(gè)或多個(gè)可以是可選的或可以組合。

雖然已經(jīng)關(guān)于多個(gè)實(shí)施方案和實(shí)施例描述了前述發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，其他實(shí)施方案也在所附權(quán)利要求及其等同物中表示的本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，上述具體實(shí)施例將解釋為僅僅是說明性的，而不是以任何方式限制本公開的其余部分。無需進(jìn)一步的闡述，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本文的描述最大程度地利用本發(fā)明。本文所述的所有出版物的全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。